Zur Therapie von Schmerzen stehen unterschiedliche Arzneimittel zur Verfügung, wie z. B. Acetylsalicylsäure, Paracetamol, Dipyrone, Tramadol, Morphin und Fen- tanyl, aber auch Substanzen wie Amitryptilin und Ketamin kommen zur Behand- lung von Schmerzpatienten zum Einsatz. Trotz zunehmend verfeinerter Therapie- schemata kann jedoch insbesondere bei chronischen Schmerzzuständen oft kei- ne dauerhafte Verbesserung für die Patienten erzielt werden. Hierfür ist unter an- derem auch die Tatsache verantworttich, dass es beim chronischen Schmerz zu dauerhaften Veränderungen beteiligter Nervenzellen kommt.

Die Schmerzforschung der letzten Jahre erbrachte die grundlegende Erkenntnis, dass der Entwicklung gerade chronischer Schmerzzustände plastische Verände- rungen des Nervensystems, insbesondere in den nozizeptiven Neuronen der Hin- terwurzelganglien (engl. 9, dorsal root ganglia", DRG) und der Neurone im Bereich der Dorsalhörner des Rückenmarks, zugrunde liegen (vgl. Coderre et al., 1993 ; Zimmermann & Herdegen, 1996). Die neuronale Plastizität geht einher mit Verën- derungen in der Expression bestimmter Gene und führt zu langanhaltenden Ver- änderungen des Phänotyps der betroffenen Neuronen. Das Konzept der neurona- Ien Plastizität wurde bisher vor allem auf Entwicklungs-, Lern- und Regenerati- onsprozesse angewandt, doch die neueren Befunde aus der Schmerzforschung zeigen, dass dieses Konzept auch bei pathophysiologischen Vorgängen greift (Tölle, 1997).

Die Chronofizierung des Schmerzes ist tierexperimentell auf phänomenologischer Ebene bereits relativ gut charakterisiert. Bei der Induktion chronischer Schmerz- zustände wurden bspw. eine erhöhte Empfindlichkeit und verringerte Reizschwel- le peripherer Nozizeptoren, eine Aktivierung sog. stiller Nozizeptoren, eine Reor- ganisation rezeptiver Felder und eine Erregbarkeitszunahme im Rückenmark festgestellt.

Neben der Analyse von Genen, die in Schmerzmodellen differenziell reguliert werden, stellt die Identifizierung von Genen, die selektiv in schmerzreievänten Neuronen exprimiert werden, eine vielversprechende Strategie dar, um neue se- lektive Analgetika bereitzustellen. Vor allem die in den Spinalganglien vorhande- nen Neurone und hier besonders die C-Faser-Neurone und die AS-Faser-Neurone sind Gegenstand intensiver Forschung, da eine Reihe von Anhaltspunkten für eine derartige Vorgehensweise sprechen. So stellen die Nozizeptoren das erste Glied in der Kette der Schmerzwahrnehmung dar. Daher können Schmerzen durch Modulation derartiger Nozizeptoren an der Quelle bekämpft werden. Wei- terhin spielen die Nozizeptoren besonders bei chronischem Schmerz eine ent- scheidende Rolle, da die Chronifizierung zu einem GroMeii auf dynamische Ver- änderungen in den Spina ! gangiienneuronen (z. B. eine periphere Sensitivierung) zurückzuführen sind. Aufgrund der spezifischen Aufgabe a) s Detektoren nozizep- tiver Reize exprimieren die Nozizeptoren ein einzigartiges Repertoire an lonenka- nälen und Rezeptoren, die nur in diesen Neuronen vorkommen und daher bei ei- ner pharmakologischen Intervention eine nebenwirkungsarme Therapie erwarten lassen. Weiterhin gibt es eine Reihe von Beispielen für-Gene, die ausschließlich oder überwiegend in den DRG-Neuronen exprimiert werden und als interessante molekulare Angriffspunkte für Analgetika Gegenstand intensiver Forschungsbe- mühungen sind (z. B. der Capsaicin-Rezeptor TrpV1, der purinerge Rezeptor P2X3, der Tetrodotoxin-resistente Natriumkanal Nav1.8, der Kainat-Rezeptor GluR5, der NGF-Rezeptor TrkA, das Neurotrophin GDNF, das Neuropeptid CGRP usw.). Des Weiteren bieten die Spina) gang) ien ais Angriffspunkt potentiei- ler Analgetika den Vorteil, dass sie außerhalb der Blut-Hirn-Schranke liegen und somit leichter für Medikamente zugänglich sind und auch eine Abtrennung von möglichen ZNS-Nebenwirkungen erlauben. Schließlich entfaltet eine Reihe kli- nisch relevanter Schmerzmittel ihre Wirkung zu einem Großteil über die Hem- mung primärer Afferenzen, wie die folgende Tabelle zeigt : Wirkstoff Wirkung auf Nozizeptoren Opioide Hemmung der Freisetzung exzitatori- scher Neurotransmitter im Dorsalhorn durch Aktivierung präsynaptisch gele- gener Opioid-Rezeptoren Cannabinoide Hemmung der Freisetzung exzitatori- scher Neurotransmitter im Dorsalhorn durch Aktivierung präsynaptisch gele- gener Cannabinoid-Rezeptoren Gabapentin Hemmung des Ca2+-Einstroms in Nozi- zeptoren aufgrund der Bindung an die α2#-Untereinheit Kürzlich wurden einige Mitglieder der Familie der"sensory neuron specific recep- tors" (SNSR)/Mas-related genes type X (MRGX) beschrieben (Dong et al., 2001 ; Lembo et al., 2002). Mit Gensonden wurde sowohl in Mäusen (Dong et al., 2001) als auch in Ratten und Menschen (Lembo et al., 2002) die Gewebeexpression untersucht und in allen drei Spezies eine ausschließliche Expression in dorsalen Spinalganglien und trigeminalen Ganglien nachgewiesen. Vertiefte Analysen zeig- ten, dass die SNSR nur in den IB4-positiven kleinen nozizeptiven Neuronen expri- miert werden (Dong et al., 2001 ; Lembo et al., 2002).

Des Weiteren wurde ein endogenes Neuropeptid"Bovine Adrenomedullary pepti- de 22" (BAM22) als hochaffiner Agonist der Rezeptoren hSNSR4 (EC50=16 nM) und hSNSR3 (EC50=13 nM) beschrieben (Lembo et al., 2002). BAM22 ist ein Abbauprodukt des schmerzrelevanten Proproteins Proenkephalin und kann daher als weiterer Hinweis darauf gesehen werden, dass die Rezeptoren der SNSR- Familie bei der endogenen Modulation der Schmerzempfindung eine Rolle spie- len. Bei den Rezeptoren der SNSR-Familie handelt es sich um G-Protein gekop- pelte Rezeptoren. Nahezu die Hälfte aller auf dem Markt befindlichen Medikamen- te sind Liganden für G-Protein gekoppelte Rezeptoren (engl."G protein-coupled receptor"GPCR). Die Größe der SNSR-Genfamilie ist in den bisher analysierten Spezies Mensch, Maus und Ratte erstaunlich divergent. In Lembo et al. (2002) werden sechs humane Mitglieder der Familie beschrieben und als SNSR1-6 be- zeichnet. In Dong et al. (2001) sind vier humane Proteine der SNSR-Familie be- schrieben und werden dort als MRGX1-4 bezeichnet. Die in den genannten Publi- kationen beschriebenen sechs SNSR-Sequenzen und vier MRGX-Sequenzen sind nicht vollständig identisch, obwohl teilweise sehr ähnlich. In Dong et al.

(2001) werden weiterhin 17 murine MRGX-Gene nebst weiteren 33 Pseudogenen beschrieben. Lembo et al. (2002) beschreiben lediglich ein SNSR bei der Ratte.

Trotz wiederholter Versuche wurden keine weiteren Rezeptoren in der Ratte iden- tifiziert.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, weitere Mitglieder der SlNSR-Genfamilie bereitzustellen, insbesondere, um sie so als Angriffsziele schmerztherapeutischer Wirkstoffe zugänglich zu machen. Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungs- formen der vorliegenden Erfindung gelöst. insbesondere wird ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, insbeson- dere schmerzreievanter Verbindungen bereitgestellt, welche die extra-und/oder intrazelluläre Funktion von SNSR-Rezeptoren, insbesondere des SNSR-L2- und/oder des SNSR-L3-Rezeptors der Ratte, modulieren, umfassend die Schritte : (a) Bereitstellen eines Zellsystems, in weichem ein mindestens 10 Aminosäu- ren umfassender Abschnitt mindestens eines Polypeptids exprimiert wird, ausgewählt aus Polypeptiden, die durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 179475 bis 180485 (bzw. 180488 einschließlich Stop-Codon) der Fig. 2 (genomische Sequenz des bisher bekannten SNSR der Ratte), durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 132249 bis 133316 (bzw.

133319 einschließlich Stop-Codon) der Fig. 2 (genomische Sequenz des SNSR-L2 der Ratte), durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop-Codon) der Fig. 2 (genomische Sequenz des SNSR-L3 der Ratte, inverse Orientierung), durch die Nukleotidsequenz gemäß Fig. 3 (cDNA von SNSR-L2) oder durch die Nukleotidsequenz gemäß Fig. 4 (cDNA von SNSR-L3), einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente, Allele dieser Sequenzen oder mit diesen Nukleotidsequenzen unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenzen, codiert werden, (b) Inkontaktbringen des Zellsystems mit einer Testverbindung und (c) Messen mindestens eines durch Wechselwirkung und/oder indirekte Beein- flussung des (der) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitts (Abschnitte) des Polypeptids (der Polypeptide) veränderlichen Parameters im Vergleich zur Kontrolle ohne inkontaktbringen des Zellsystems mit der Testverbindung.

Erfindungsgemäß wird ein Screening-Verfahren bereitgestellt, das aufgrund der Identifizierung von Verbindungen, welche die extra-und/oder Intrazelluläre Funk- tion von SNSR-Rezeptoren, bspw. SNSR-L2-und/oder SNSR-L3, beeinflussen, der Identifizierung von Substanzen dient, welche eine potentielle Schmerzwirk- samkeit aufweisen. Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert daher dass sine potentielle Schmerzwirksamkeit einer Substanz bzw.

Verbindung über ihre Wechselwirkung mit den erfindungsgemäß als schrerzrele- <BR> <BR> <BR> <BR> vanten Peptid-oder Proteinstrukfiuren, welche einem Abschnitt von. oder einem vollständigen SNSR-Rezeptor, insbesondere SNSR-L2-und/oder SNSR-L3- Rezeptor (en), entsprechen, aufgefunden werden kann.

Der Begriff"Substanz"umfaßt jede chemische Verbindung, insbesondere solche, die als Arzneimittel-Wirkstoff geeignet sind. Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung ist bspw. eine organisch-chemische Verbindung, insbesondere eine niedermolekulare Spezies, z. B. mit einem Molekulargewicht von <5000, insbe- sondere <3000, vor allem <1500 und ist typischerweise physiologisch gut verträg- lich. Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammensetzung mit mindestens einem weis teren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs-und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erFin- dungsgemäßes Protein mindestens 107 mol~1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, dass sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra) membranöse Transport- proteine. Weitere erfindungsgemäße Substanzen sind biologisch-chemische Ver- bindungen wie Nukleinsäuren, insbesondere DNA oder RNA und deren jeweilige Bausteine, Fette, und deren Bestandteile, Zucker, seien es Mono-, Oligo-oder Polysaccharide, Peptide, insbesondere Oilgo-oder Polypeptide, oder Proteine wie Enzyme, Antikörper usw. Des weiteren kann eine"Substanz"im Sinne der vorliegenden Erfindung selbstverständlich aus mehreren gleichen oder verschie- denen der vorgenannten Spezies zusammengesetzt sein oder ein Gemisch der- selben darstellen.

Vorzugsweise werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere parallele Versuche mit ansteigenden Konzentrationen der Testsubstanz angesetzt, um im Falle einer pharmazeutischen Wirksamkeit, bspw. eine analgetische Wirkung, der Testsubstanz deren ID50-Wert bestimmen zu können.

Die Modulation der extra- bzw. intrazellulëren Funktion der erfindungsgemëßen SNSR-Rezeptoren, insbesondere SNSR-L2 bzw. SNSR-L3, kann dabei eine Ver- stärkung als auch eine Verminderung bis zur vollständigen Ausschaltung der ge- nannten Funktionen sein. Somit können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere vollständige oder partielle Agonisten, Antagonisten, inverse Ago- nisten und allosterische Modulatoren der SNSR-Rezeptoren identifiziert werden.

Das"Zellsystem", in dem ein erfindungsgemäßes Polypeptid bzw. ein Abschnitt davon exprimiert wird, kann einerseits eine intakte Zelle sein, bspw. aus gegebe- nenfalls immortalisierten Zelilinien, Primärzelllinien oder anderen Zelilinien oder die Zelle kann nativ aus einem Gewebe stammen, wobei der Zellverband zur Iso- lierung der Zellen meist aufgelöst ist. Des Weiteren kann das Zellsystem im erfin- dungsgemäßen Verfahren ein aus einer ursprünglich intakten Zelle hervorgegan- genes System sein, wobei es sich hierbei üblicherweise um eine entsprechende Präparation aus Zellen handeln wird. Die"Präparation"umfaßt insbesondere Ho- mogenate von Zellen, bspw. entsprechende Zellysate, z. B. das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen usw.

Im Schritt (b) des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens wird das Zellsys- tem mit einer Testsubstanz in Kontakt gebracht, was im allgemeinen eine ent- sprechende Inkubation des Zellsystems in Anwesenheit der Testverbindung ein- schließt. Das Inkontaktbringen bzw. die Inkubation erfolgt dabei typischerweise in einem wässrigen Medium über eine definierte Zeit, so dass die Testsubstanz ge- gebenenfalls mit den bzw. dem gemäß Schritt (a) von dem Zellsystem exprimier- ten Polypeptid (en) bzw. Peptid (en) reagieren kann bzw. in irgendeiner Weise die extra- oder intrazellulëre Funktion der exprimierten Peptide bzw. Polypeptide beeinflußt, d. h. modulieren kann.

Bei einer derartigen Inkubation im Rahmen des Inkontaktbringens der Testverbin- dung mit dem Zellsystem kann das vorzugsweise wässrige Medium temperiert werden, bspw. zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Dauer des Inkontaktbringens, d. h. die Inkubationszeit, kann zwi- schen wenigen Sekunden und mehreren Stunden, aber auch bis zu mehreren Tagen oder sogar Wochen, variiert werden, wobei hier die Art und Weise der Wechselwirkung der Substanz mit dem Zellsystem, insbesondere dem bzw. den darin exprimierten erfindungsgemäßem Peptid (en) oder Protein (en) zu berück- sichtigen sein wird. Bevorzugte Inkubationszeiten sind bspw. zwischen 1 min und 60 min. Das Medium, insbesondere das wässrige Medium, kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so dass bei der Inkubation bspw. ein pH zwi- schen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0 bis 7,5 im Medium herrscht. Geeignete Puf- fersysteme sind bspw. Acetat-, Phosphat-und Tris-HCI-Puffer, denen üblicher- weise zur Einstellung einer geeigneten lonenstärke Salze, insbesondere NaCl, KCI, Cal2, MgCl2 usw. zugefügt werden. Bevorzugt verwendete Puffersysteme sind bspw. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder Tris-gepufferte Salzlö- sung (TBS). Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe, Wachstumsfaktoren usw. beigefügt werden. Die geeigneten Bedin- gungen können von einem Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem bzw. den Peptid (en) oder Protein (en) bzw. in Abhängigkeit von der Art der Modulation des Peptids oder Proteins bzw. der Peptide oder Proteine anhand der Literatur und/oder weniger, einfacher Vorver- suche leicht festgelegt werden, um im erfindungsgemäßen Verfahren im Schritt (c) einen möglichst eindeutigen Meßwert zu erhalten.

Die im Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens im Zellsystem exprimierten Proteine bzw. Abschnitte davon spielen aufgrund ihrer Zugehörigkeit zur SNSR- Familie, deren Mitglieder überwiegend oder ausschließlich in dorsalen Spinal- ganglien und trigeminalen Ganglien, insbesondere den 14-psitiaen kleinen nozi- zeptiven Neuronen, exprimiert werden, bei der endogen Modulation der Schmerzempfindung eine Rolle. Daher sind sie als Angriffspunkt für potentiell an- algetisch wirksame Substanzen besonders interessant.

Da im erfindungsgemäßen Verfahren die Wechselwirkung von Substanzen mit im Schmerzbereich bisher nicht verwendeten Proteinen und Peptiden als Maßstab für das Auffinden schmerzregutierender Substanzen ermöglicht wird, können mit dem Verfahren der vorlegenden Erfindung schmrzrelvant Substanzen auge- funden werden, die bei den im Stand der Technik bisher bekannten Verfahren, insbesondere mit anderen Peptiden oder Proteinen, nicht identifiziert werden kön- nen, was einen erheblichen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminsäuresequenz gemäß Fig. 4 und/oder ein Polypeptid mit einer Aminosäure- sequenz gemäß Fig. 6 bzw. ein Polypeptid, welches von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß Fig. 3 codiert wird und/oder ein Polypeptid, wel- ches von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß Fig. 5 codiert wird, exprimiert. Erfindungsgemäß sind jedoch Abschnitte von für entsprechende Polypeptide bzw. Proteine codierende Nukleotidsequenzen verwendbar, wobei es sich dabei aber mindestens um einen für mindestens 10, vorzugsweise 20, mehr bevorzugt mindestens 40, am meisten bevorzugt mindestens 60 Aminosäuren des Polypeptids bzw. Proteins codierenden Abschnitt handeln sollte. Dement- sprechend sind für ein Screeningverfahren auch nur Teilabschnitte eines der er- findungsgemäßen Polypeptide von mindestens 10, vorzugsweise 20, mehr bevor- zugt mindestens 40, am meisten bevorzugt mindestens 60 Aminosäuren ver- wendbar. Zum Einsatz kommen können auch Peptide und Proteine, für die eine Nukleotidsequenz codiert, die ein Fragment, ein Derivat oder ein Allel bzw. eine Mutante der für die vorstehend genannten Polypeptide codierenden oder der in den vorstehend genannten Figuren gezeigten Sequenzen darstellt. Eine Mutante bzw. ein Allel oder auch ein Derivat einer erfindungsgemäßen Sequenz geht da- bei insbesondere durch Deletion, Addition, Insertion und/oder Substitution eines oder mehrere Nukleotide der jeweiligen Wildtyp-Sequenz aus dieser hervor. Vor- zugsweise sind derartige Fragmente, Derivate oder Allele einer der abgebildeten Sequenzen zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 80%, mehr bevor- zugt zu mindestens 90% und am stärksten bevozugt zu mindestens 95% homolog ist. Wesentlich hierbei ist, dass die Sequenzveränderung derart ist, dass die Wechselwirkung mit dem/den im Zellsystem exprimierten Peptid (en) oder Prote- in (en) und damit die Funktion des Verfahrens nicht beeinflusst wird. Dabei ver- steht man unter x % Homologie eine x %-ige Übereinstimmung der Basenfoige (Sequenzidentität) im kodierenden Bereich des Polynukleotids. Weitere Ausfüh- rungen hinsichtlich funktionshomologen Derivaten, Fragmenten und Allelen (Allel- varianten) erfindungsgemäß verwendbarer Sequenzen sind nachstehend ange- geben.

Die Proteine bzw. (Poly-) Peptide können auch ausgewählt sein aus solchen funk- tionshomologen Spezies, die durch eine Nukleinsäure codiert werden, die unter Standardbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen (d. h. Bedin- gungen, unter denen nur perfekt basengepaarte Nukleinsäure-Stränge gebildet werden und stabil bleiben), an eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz ge- mäß Positionen 179475 bis 180485 (bzw. 180488 einschließlich Stop-Codon) der Fig. 2, gemäß Positionen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop- Codon) der Fig. 2, gemäß Positionen 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop-Codon) der Fig. 2, gemäß der Fig. 3 oder gemäß der Fig. 5 oder deren Anti- sense-Polynukleotid bzw. Antisense-Nukleinsäure binden.

In Hinblick auf die Hybridisierungsbedingungen wird im einzelnen offenbart, dass homologe oder sequenzverwandte Nukleotidsequenzen aus allen Säugerspezies, einschließlich Mensch, nach gängigen Verfahren durch Homologie-Screening durch Hybridisierung mit einer Probe der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenzen oder Teilen davon isoliert werden. Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe der nativen Sequenzen, bspw. der in vorstehenden Sequenzen, beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nicht-codierenden DNA- Sequenz zu verstehen.

Zur Hybridisierung können z. B. kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche, die auf dem Fachmann bekannte Weise ermittelt werden können, verwendet wer- den. ! n jedem Fait wird die Verwendung und Funktion von mindestens 10, vor- zugsweise mindestens 20 Aminosäure langen Nukleotidabschnitten (auch als sol- che offenbart) der in erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen als Primer für PCR-Reaktionen oder als Oligonukleotide auf DNA-Chips, insbesondere in Form von Mikroarrays offenbart. Es können aber auch längere Fragmente der erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridi- sierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure-Sequenz (Oli- gonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung verwendet wer- den, varieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelz- temperaturen für DNA : DNA-Hybride ca. 10 °C niedriger als die von DNA : RNA- Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind beispielsweise, je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Puf- ferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% For- mamid, wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid, zu verstehen. Vor- teilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedin- gungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmeiztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C- Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingun- gen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln, beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridi- sierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen : Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York ; Hames and Higgins (eds), 1985, Nlucleic Acids Hybridization : A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford ; Brown (ed), 1991, Es- sential Molecular Biology : A Practical Approcah, IRL Press at Oxford University Press, Oxford. <BR> <BR> <P>Ein #Antisense-Polynukleotid" bzw. eine #Antisense-Nukleinsäure" gemäß der vor- liegenden Erfindung ist ein aus mehreren natürlichen oder modifizierten Nuklein- säurebausteinen bestehendes Molekül, dessen Basenabfolge mindestens teil- bzw. bereichsweise komplementär zur Basenabfolge eines Teilbereiches einer in der Natur vorkommenden Spezies, bspw. der in der Natur vorkommenden mRNA, ist. Augrund der Komplementarität ist das erfindungsgemäße Antisense- Polynukleotid bzw. die erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure unter Stan- dardhybridisierungen, wie oben definiert, vorzugsweise unter stringenten Bedin- gungen gemäß obiger Definition, mit dem Zielmolekül befähigt.

Grundsätzlich kann es für das erfindungsgemäße Verfahren genügen, wenn ein mindestens 10 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide verwendet wird, da bereits 10 Aminosäuren, vorzugsweise 15, insbesondere 20 Aminosäuren völlig spezifisch sind oder sein können.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Zellsystem bzw. die Zelle, aus welchem das Zellsystem, insbesondere eine entsprechende Zell- präparation, des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens hervorgeht, zur Expression des (der) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt (e) des Polypeptids (der Polypeptide) und/oder zur Messung des mindestens einen Pa- rameters gentechnisch manipuliert. Dabei wird genetisches Material in die Zelle bzw. das Zellsystem eingebracht, insbesondere eine oder mehrere Polynukleotid- sequenzen. Vorzugsweise wird dabei die Zelle e bzw. das Zollsystem mit einem oder mehreren Vektor (en), vorzugsweise Expressionvektor (en), transfiziert, der (die) für die vorstehend definierten Polypeptide oder Abschnitte davon und/oder (mindestens) ein G-Protein und/oder (mindestens) ein Reportergen codiert.

In einer weiter bevorzugten Variante dieser Ausführungsform erlaubt die gentech- nische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktioneiien Parameter. ! n dieser Ausführungsform werden durch gentechnische Manipulation Voraussetzungen geschaffen, unter denen die Ver- änderung eines funktionellen Parameters überhaupt oder verbessert gemessen werden kann. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, dass durch die gentechnische Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird. Darunter ist insbesondere die gentechnische Einführung eines endogen nicht vorhandenen oder physiologisch nicht exprimierten G-Proteins (GTP-bindenden Proteins) in die Zelle zu verstehen, beispielsweise die Einführung eines chimären G-Proteins, das eine Veränderung des Signalweges erlaubt oder eines promiskuitiven G-Proteins, das sehr bin- dungsfreudig ist. Die Einführung eines Reportergens wiederum erlaubt die Mes- sung einer (extrazellulär ausgelösten) induzierten Expression des Genproduktes.

Somit kann durch Transfektion der Zelle mit einer für eines der vorstehend defi- nierten Polypeptide oder einen Abschnitt davon codierenden Nukleinsäure (Poly- nukleotid) bspw. erreicht werden, dass ein Peptid oder Protein, das in der im Ver- fahren verwendeten Zelle oder Präparation nicht endogen exprimiert wird, von der Zelle synthetisiert wird. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn das Poly- nukleotid in einem rekombinanten DNA-Konstrukt enthalten ist. Unter einem (re- kombinanten) DNA-Konstrukt versteht man ein in vitro hergestelltes DNA-Molekül, insbesondere einen entsprechenden Vektor, vorzugsweise Expressionsvektor.

Wenn beim erfindungsgemäßen Verfahren im Schritt (a) die Zelle gentechnisch manipuliert wird, ist es bevorzugt, dass die Zelle nach der gentechnischen Mani- pulation unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gege- benenfalls unter Selektionsdruck. Unter"kultivieren"versteht man, Zellen oder Gewebe bei Bedingungen, die ein Überleben der Zellen, bzw. deren Nachfotge- generation sichern, zu halten. Dabei sollten die Bedingungen hier so gewählt werden, dass eine Expression des durch die gentechnische Manipulation einge- fügten Materials ermöglicht wird. Dazu sollten pH, Sauerstoffgehalt und Tempera- tur physiologisch gehalten sein und ausreichend Nährstoffe und notendige Cork- toren beigefügt sein. Der Seiektionsdruck ertaubt, nur die Zeiten weiter zu kultivie- ren, bei denen die gentechnische Manipulation zumindest teilweise erfolgreich war. Dazu gehört beispielsweise die Einführung einer Antibiotikaresistenz über ein DNA-Konstrukt.

Es ist beim erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt, wenn die ver- wendet@ Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, lnsektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist bzw. das Zellsystem aus einer derartigen Zelle hervorgeht. Beispiele für Amphibienzellen sind Xenopus-Oocyten, für Bakterienzellen E. coli-Zellen, für Hefezellen solche von Saccharomyces cere- visiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris usw., für Insektenzellen Sf9- Zellen, für immortalisierte Säugetierzelle HeLa-Zellen und für native Säugetierzel- len die CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zelle. Hinsichtlich weiterer geeigneter Zell- und Vektorsysteme für das erfindungsgemäße Screeningverfahren wird auf die diesbezüglichen Ausführungen unter dem Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Vektors und der erfindungsgemäßen Wirtszelle verwiesen.

Bei einer bevorzugten Messmethode zur Feststellung der Wechselwirkung der Substanz mit dem erfindungsgemäßen Peptid oder Protein erfolgt die Messung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden vom Peptid oder Protein und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsub- stanz. Dabei ist ein Ligand ein mit ausreichender, insbesondere hoher Spezifität an das Protein oder Peptid bindendes Molekül, das aus der Bindungsstelle ver- drängt wird, wenn eine Testsubstanz ebenfalls an dieser Bindungsstelle bindet, möglicherweise jedoch unter Konformationsumwandlung des Peptids bzw. Prote- ins an einer anderen Stelle mit diesem wechseiwirkt, so dass der bekannte Ligand freigesetzt wird. Unter Markierung ist eine den Nachweis erleichternde oder er- möglichende chemische Modifikation des Moleküls zu verstehen. Beispiele sind radioaktive oder lumineszierende, insbesondere fluoreszierende Markierungen.

Wird das Identifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung derart durchgeführt, dass eine Modulation der SNSR-Rezeptoren auf Basis einer Wechselwirkung der Testsubstanz mit diesen Rezeptoren (oder Abschnitten davon) festgestellt wird, so ist es bevorzugt, wenn in einem weiteren Schritt (c) der Bindungsplatz der Testsubstanz auf dem (den) Poiypeptid (en) bzw. einem entsprechenden Abschnitt davon, umfassend minoest@ns 10 Aminosäuren, ermittelt wird. Dies @rMlgt übli- cherweise durch ein geeignetes strukturbio ! ogisches Verfahren, insbesondere durch röntgenkristallographische Analysen und/oder NMR-Untersuchungen. Al- lerdings kann auch mit Hilfe einem Fachmann bekannter Mutationsanalysen, ins- besondere der zielgerichteten Mutagenese, der Herstellung entsprechender Dele- tionsmutanten des ursprünglich im Identifizierungsverfahren eingesetzten Poly- peptids oder des Abschnitts davon usw., der Bindungsplatz der im Test als positiv bzgl. der Wechselwirkung erkannten Substanz eingegrenzt und bei entsprechend genauer Mutationsanalyse die für die Wechselwirkung essentiellen Aminosäuren bestimmt werden. Hinsichtlich im Stand der Technik weit verbreiteter Mutagene- se-Techniken wird bspw. auf den diesbezüglichen Offenbarungsgehalt in Sambrook et al. 1989 und 2001, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, verwiesen.

Bei einer anderen bevorzugten Messmethode zur Feststellung der durch die Wechselwirkung, insbesondere Bindung der Substanz an ein Peptid oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren ausgelösten Veränderung der funktionellen Pa- rameter, erfolgt die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz ver- änderten funktionellen Parameter über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, lonenkanälen und/oder Enzymen, insbe- sondere über Messung der Veränderung der Genexpression, des lonenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung der Enzymaktivität und/oder der Konzentration der 2nd Messenger. Damit ist auf der einen Seite di- reld die Messung der Wirkung der Substanz über die Beeinflussung von (ande- ren) Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfasst, auf der anderen Seite als bevorzugt zu messende Beispiele sich ändernder Parameter wie Genexpres- sion, lonenmilieu, pH, Membranpotential, Enzymaktivität oder Konzentration der 2nd Messenger. Dabei versteht man unter lonenmilieu insbesondere die Konzent- ration eines oder mehrer lonen in einem Zellkompartiment, insbesondere dem Cytosol, unter iViembranpotentiai die Ladungsdiffferenz zwischen zwei Seiten ei- ner Biomembran und unter einem 2 d Messenqer einen Botenstoff, eines <BR> <BR> <BR> intrazellulären Signalwegs, wie æB. zyklisches AMP (cAMP), Inosibltriphosphat (IP3) oder Diacylglycerol (DAG).

Die Kenntnis der Primärsequenz der erfindungsgemäßen Rezeptoren der SNSR- <BR> <BR> <BR> Familie kann benutzt werden, um rekombinante Konstrukte herzustellen, die die Eigenschaften schon charakterisierter und nach dem Stand der Technik bekann- ter SNSRs ausnutzen. So können z. B. bestimmte Sequenzbereiche von erfin- dungsgemäßen SNSR-Proteinen gegen bestimmte Sequenzbereiche eines be- kannten, gut charakterisierten SNSRs ausgetauscht werden. Das resultierende Konstrukt kann herangezogen werden, um mit bekannten Liganden oder Ago- nisten, die G-Protein-Kopplung, und die benutzten 2nd Messenger-Systeme zu identifizieren, oder bekannte G-Protein-Kopplung für die Auffindung von Liganden, insbesondere Agonisten (vollständig, partiell, invers usw. ) oder Antagonisten so- wie allosterischen Modulatoren, zu benutzen. Die Herstellung chimärer erfin- dungsgemäßer Rezeptoren bspw. zu den vorgenannten Verwendungen kann bspw. nach einem Verfahren, wie von Kobilka et al. beschrieben (und zur Offen- barung der vorliegenden Erfindung gehörig), durchgeführt werden (Kobilka BK, Kobilka TS, Daniel K, Regan JW, Caron MG, Lefkowitz RJ (1988) Chimeric alpha 2-, beta 2-adrenergic receptors : delineation of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity. Science 240 : 1310-1316).

Im vorstehend definierten Identifizierungsverfahren können erfindungsgemäß konstitutiv aktive Rezeptormutanten der SNSR-Familie zur Charakterisierung der Wirkung dieser Rezeptoren auf Signaltranscduktionswege und zum #Screening" nach Liganden eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Rezeptoren als Vertreter der G-Protein gekoppelten Rezeptoren können auf bestimmte Weise mutiert wer- den, um Veränderungen des physiologischen und pharmakologischen Verhaltens dieser Rezeptoren hervorzurufen. Dies kann beispielsweise dazu benutzt werden, intrazelluläre Signalwege zu identifizieren, wenn der natürliche Ligand oder ein Agonist unbekannt sind. <BR> <BR> <P>Alternativ kann zur Identifiation von endogenen oder surrogaten Liganden eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden, die auf der Ver- wendung immobilisierter funktioneller erfindungsgemäßer Rezeptoren beruht. Er- findungsgemäße ße Rezeptoren der SNSR-Familie können hierbei als Fusionsprote- ine mit GST, dem Flag-Tag od@r dem TAP-Tag exprimiert werden. Die entspre- chenden Zellen werden entweder nach gängigen Methoden zu Membranen ver- arbeitet oder direkt zur Solubilisation eingesetzt. Mit geeigneten Detergenzien, z. B. Dodecylmaltosid, Digitonin, Cholat oder Detergenzmischungen, werden die Rezeptoren solubilisiert und an die entsprechenden Affinitätsmatritzen wie GST- Sepharose, Anti-Flag-M2-Agarose oder IgG-Sepharose etc. gebunden. Nach Wa- schen der Matritzen werden sie mit Gewebsextrakten oder Zellüberständen inku- biert und wieder gewaschen. Enthält der Extrakt einen aktiven Liganden, z. B. ein Peptid, so bindet dieser an den immobiliserten Rezeptor und kann nach Elution durch analytische Methoden identifiziert werden, z. B. mittels Massenspektro- metrie.

Sog. Internalisierungstests stellen erfindungsgemäß eine weitere Ausführungs- form des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens dar, um natürlichen oder insbesondere Surrogatliganden für erfindungsgemäße Rezeptoren, insbesondere SNSR-L2 bzw. -L3, identifizieren zu können. Hierbei werden ebnfalls die unter- schiedlichen Eigenschaften eines Proteins der GPCR-Klasse ausgenutzt. Bspw. kann das Internalisierungsverhalten von Proteinen der GPCR-Klasse herangezo- gen werden. Dies ist als Regulationsmechanismus nach Aktivierung des Rezep- tors zu vertehen. Der Vorteil einer"Screening"-Methode die auf diesem Verhalten aufbaut, ist, dass eine genauere Kenntnis der Physiologie des jeweiligen Rezep- tors nicht nötig ist. Insbesondere muß keine Kenntnis über die koppelnden G- Proteine, und die benutzten Signaitransduktionswege vorhanden sein.

Ein solcher Test wird z. B. von Lenkei et al. (2000, J Histochem Cytochem, 48, 1553-64) beschrieben und kann erfindungsgemäß analog bei den erfindungsge- mäßen Rezeptoren eingesetzt werden. Hierzu wird erfindungsgemäß zunächst ein C-terminales Fusionskonstrukt erfindungsgemäßen Proteins mit EGFP her- gestellt. Danach werden stabile CHO-Zellen nach Standardverfahren hergestellt.

Stabile Klone werden mit Hilfe eines FACS-Sorters nach EGFP-Fluoreszenz se- iektiert. Die endgültige Auswahl erfo ! gte mit Hiife ftuoreszenzmikroskopischer Be- urteilung hinsichtlich der Oberfiächenexpression. Die Zellen werden danach mit HPLC-Fraktionen von Gewebeextrakten inkubiert, und die Internalisierung mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops bestimmt. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe morphometrischer Software (NIH Image) nach dem Prinzip der Distanz flores- zenter Signale vom Zellmittelpunkt. Eine Häufigkeits/Distanzverteilung ergibt eine gute Diskrimination für die Internalisierung.

Zur Auffindung unbekannter Liganden werden vorteilhafter Weise sukzessive Fraktionierungen durchgeführt, um bspw. ein entsprechend wechselwirkendes oder den erfindungsgemäßen Rezeptor der SNSR-Familie anderweitig (d. h. indi- rekt) beeinflussendes (bspw. die Expression usw. beeinflussendes) Peptid oder Protein bis zur Reinheit zu isolieren, und danach bspw. durch Sequenzierung oder MALDI-TOF zu identifizieren. Eine andere Anwendung des prinzipiell glei- chen Verfahrens wird von Ghosh et al. (2000, Biotechniques, 29,170-5 ; Conway et al., 1999, J Biomol Screen, 4,75-86) beschrieben, die beide vollinhaltlich Be- standteil der vorliegenden Offenbarung sind.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Identifizierungs-bzw. Screeningverfahrens wird ein funktioneller Ca-Test heran- gezogen, der darüber hinaus auch zur Charakterisierung erfindungsgemäßer Re- zeptoren verwendbar ist. Hierbei macht man sich erfindungsgemäß zunutze, dass eine Vielzahl von 7TM-Rezeptoren (Rezeptoren mit 7 Transmembran-Domänen), die in HEK293 Zellen, in CHO Zellen oder anderen Zellen produziert werden, über die Kopplung an G-Proteine der Gq-Klasse zur Aktivierung der PLC und zur Mobi- lisation von intrazellulärem Ca2+ führen. Für den Fall, dass gewisse erfindungs- gemäße Rezeptoren nicht an G-Proteine der Gq-Klasse koppeln sollten, können diese durch Co-Expression von chimären G-Proteinen oder den relativ unspezi- <BR> <BR> <BR> <BR> fisch mit Rezeptoren koppelnden G-Proteinen Gα 15 oder Gα 16 zur Signaltrans- Funktion über PLC, d. h. zur Ca2+-Freisetzung, gezwungen werden. Die erfindungsgemäßen Rezeptoren der SNSR-familie können bspw. in HEK293- und in CHO-Zellen sowohl stabil als auch transient allein und zusammen mit dem chimären G-Protein Gqi5 und alternativ mit dem G-Protein G exprimiert werden. Die Zellen werden dann vorzugsweise mit einem membranpermeablen Ca2+-bindenden Fluoreszenzfarbstoff, z. B. Fura-2 oder Fluo-3 bzw.-4 (diese und weitere geeignete Fluoreszenzfarbstoffe sind bspw. bei Molecular Probes erhätlich) beladen und nach dem Waschen der Zellen mit verschiedenen Testsubstanzen versetzt und gleichzeitig die Ca2+-Freisetzung, d. h. die intrazelluläre Ca2+-Konzentration, gemessen, z. B. mit einem FLIPR-Gerät der Firma Molecular Devices. Testsubstanzen, die ein positives Signal ergeben, werden schließlich vorzugsweise in Kontrolizellen (nur mit dem Vektor transfiziert) getestet, und wenn das Signal sich als spezifisch herausstellt, pharmakologisch, d. h. mit Konzentrations-Response-Kurven, charakterisiert.

Alternativ kann jedoch die durch eine Testsubstanz hervorgerufene Ca2+-Antwort auch durch andere Ca 2+-Detektoren gemessen werden, z. B. über AequoScreen von Euroscreen (rüssel, Belgien ; siehe z. B. http ://www. pharmaceutical- technology. com/contractors/compound_man/euroscreen/). Dabei werden Zellen eingesetzt, die das Gen des Proteins Apoaequorin exprimieren. Nach Beladung der Zellen mit Coelenterazin, das an Apoaequorin bindet, entsteht Aequorin. Wird durch eine Testsubstanz Ca2+ freigesetzt, wodurch sich die intrazelluläre Ca2+- Konzentration erhöht, aktiviert das Ca2+ das Aequorin zur Oxidation von Coelente- razin, wodurch Licht freigesetzt wird. Die Intensität der Lichtemission ist der Erhö- hung der intrazellulären Ca2+-Konzentration proportional und damit ein Maß für die Aktivität der als Ligand identifizierten Testsubstanz (unter Berücksichtigung der entsprechenden Kontrotten).

Um erfindungsgemäße Antagonisten zu identifizieren, werden die Rezeptoren in Gegenwart genügend hoher Konzentrationen verschiedenster Testsubstanzen mit einem bekannten Agonist, bspw. BAM22-6, Neuropeptid FF (MPFF) oder Neuro- peptid AF (PAF), stimuliert. Ein gegenüber der Kontrolle (nur Agonist, ohne wei- tere Testsubstanz) verändertes Signal, bspw. ein niedrigeres Ca2+-Signal, deutet auf einen kompetitiven Antagonisten hin.

Weiterhin können auch cAMP-Tests zur Charakterisierung der erfindungsgemä- ßen Rezeptoren der SNSR-Familie, insbesondere zur Identifikation von Liganden dienen. Hintergrund dieses erfindungsgemäßen Ansatzes zur Identifizierung von Liganden (Agonisten oder Antagonisten) aber auch zur pharmakologischen Cha- rakterisierung von Rezeptoren der SNSR-Familie ist die Eigenschaft von Rezepto- ren der Klasse der GPCRs, bspw. also von erfindungsgemäßen Proteinen, ent- weder stimulierend oder inhibierend auf Adenylatcyclasen wirken zu können, in der Regel durch Aktivierung von sog. stimulierenden Gs-oder inhibierenden Gi- Proteinen. Abhängig von der Wirkung von Testsubstanzen, bspw. in einem Hoch- durchsatz-Screening (engl."high throughput screening, HTS), kann über direkte oder indirekte Messungen die damit verbundene Änderung des cAMP-Spiegels in der Zelle untersucht werden werden. Die Rezeptorgene oder Teile davon werden hierbei stabil oder transient in Säugerzellen exprimiert. Bei GPCRs, die Adenylat- cyclasen aktivieren, wodurch der cAMP-Spiegel in der Zelle steigt, wird ein poten- tieller Agonist unter den Testsubstanzen durch eine gegenüber Kontrolizellen er- höhte cAMP-Konzentration identifiziert. Antagonisten unter den Testsubstanzen, bspw. in einem HTS-Ansatz, werden durch ihre Blockierung der durch einen Ago- nisten hervorgerufenen Erhöhung der cAMP-Konzentration identifiziert. Bei Gi- gekoppelten erfindungsgemäßen SNSRs wird im Test die Adenylatcyclase ent- weder direkt mit Forskolin oder durch Aktivierung eines Gs-gekopplten Rezep- tors stimuliert, wodurch der cAMP-Spiegel steigt. Ein Agonist des Gi-gekoppelten Rezeptor$ hemmt diesen Anstieg. Für direkte cAMP-Messungen können eine An- zahl im Handel erhältlicher Tests, wie bspw. des cAMP[3H]-Test-Systems der Fa.

Amersham, verwendet werden, die z. B. auf dem Prinzip der kompetitiven Ver- drängung von endogen gebildetem cAMP durch zugegebenes radioaktiv markier- tes (Tritium) cAMP beruhen. Indirekte cAMP-Messungen werden in der Regel durch Reporter-Tests durchgeführt. Dazu werden die Rezeptoren in Zellinie <BR> <BR> <BR> <BR> e rimiert, die Repo me enthalE. B. das CRE-Lu @-S m. cAMP aktiviert die Expression der Luziferase, deren Aktivität durch Umsetzung entsprechender Substrate und luminometrische Messung der Produkte gemessen wird. Reporter-Tests eignen sich ganz besonders für Massen-Screening- Methoden.

Schließlich sind-neben den vorangehend beschriebenen Tests-erfindungsge- mäß auch die folgenden Test-Systeme zur Identifizierung von Liganden erfin- dungsgemäßer SNSR-Proteine bzw. zur Charakterisierung von 2nd Messenger- Systemen dieser Rezeptoren möglich, erfindungsgemäß insbesondere zur Be- stimmung der Adenylatcyclase-Aktivität in Zellen oder Membranen nach Salomon (Salomon et al. (1979) Adv. Cyclic Nucleotide Res. 10 : 35-55), zur Bestimmung der Inositol-3-phosphat-Konzentration oder zur Messung einer veränderten Ara- chidonsäurefreisetzung. Beispielsweise können die SNSR-Proteine in gängigen Zellinie überexprimiert werden, und nach Aktivierung durch Gewebeextrakte kann die Aktivität der o. a. 2nd Messenger-Systeme bestimmt werden. Im einzelnen sind Tests für 2nd Messenger-Systemen von Rezeptoren der GPCR-Klasse einem Fachmann bekannt, und im Einzelfall der Literatur zu entnehmen (vgl. z. B. Signal Transduction : A practical approach, G. Milligan, Ed. Oxford University Press, Ox- ford, England). Weitere Reporter-Tests für das erfindungsgemäße Screeningver- fahren umfassen MAP-Kinase/Luziferase-und NFAT-Luziferase-Systeme.

Wie oben erwähnt, dient die Aktivierung von 2nd Messengern erfindungsgemäß zur Identifikation von Liganden, insbesondere Agonisten oder Antagonisten, die an erfindungsgemäße Rezeptoren binden und derart ihre agonistische und/oder antagonistische Wirkung für die Reizentstehung bzw. -weiterleitung im Zusam- menhang mit Schmerzen entfalten können. Bspw. können Microphysiometern zur Identifikation von Liganden eingesetzt werden. Durch Ligandenbindung an einen Rezeptor der SNSR-Familie ausgelöste Signale stellen energieverbrauchende Prozesse dar. Deshalb gehen derartige Vorgänge im allgemeinen mit geringen metabolischen Veränderungen, unter anderem einer geringen pH Verschiebung, einher. Diese können extrazetiuiär von bspw. einem Microphysiometer (Cytosen- sor, Molecular Devices) erfaßt werden.

Nach Identifizierung von Liganden, insbesondere Agonisten oder Antagonisten, mit Bindungspotential an erfindungsgemäße Proteine der SlMSE-Familie können <BR> <BR> <BR> <BR> erfindungsgemäß zu deren näherer Charakterisierung Ligandenbindungstests durchgeführt werden. Ligandenbindungstests ermöglichen in direkter Weise die Pharmakologie eines Rezeptors, d. h. die Affinität verschiedenster Liganden für diesen Rezeptor, zu messen. Für Bindungsstudien wird hierbei typischerweise ein nach einem der vorgenannten Verfahren identifizierter oder auf andere Weise be- kannter chemisch reiner Ligand mit einer hohen spezifischen Aktivität (30-2000 Ci/mmol) radioaktiv markiert, so dass die radioaktive Markierung die Aktivität des Liganden bezüglich des Rezeptors nicht verringert. Die Testbedingungen werden sowohl für die Verwendung von den Rezeptor exprimierenden Zellen wie auch von daraus hergestellten Membranen bezüglich Pufferzusammensetzung, Salz, Modulatoren wie z. B. Nukleotiden oder Stabilisatoren, wie z. B. Glyzerin, so opti- miert, dass die Messung ein brauchbares Signal/Hintergrund-Verhältnis ergibt.

Für diese Bindungstests wird die spezifische Rezeptorbindung definiert als die Differenz von der gesamten mit der Rezeptorpräparation (Zellen oder Membra- nen) assoziierten Radioaktivität, d. h. gemessen in Gegenwart von nur einem spe- zifischen, nämlich des Radioliganden und der Radioaktivität, die in Gegenwart sowohl des Radioliganden als auch eines Überschusses an nicht radioaktiv mar- kiertem Ligand gemessen wird. Der nicht markierte Ligand verdrängt dabei kom- petitiv den Radioligand. Wenn möglich, werden mindestens zwei chemisch ver- schiedene kompetitierende Liganden verwendet, um die unspezifische Bindung festzulegen. Eine spezifische Bindung, die mindestens 50% der Gesamtbindung beträgt, ist optimal. Der Bindungstest wird entweder inhomogen als Filtrationstest durchgeführt oder homogen als sog."Scintillation Proximity Test"oder"Flash- plate-Test".

Im ersten Fall wird die den Rezeptor enthaltende Präparation (Zellen oder Memb- ranen) mit den Liganden in einer geeigneten Pufferlösung inkubiert, bis sich das Bindungsgleichgewicht eingestellt hat, typischweise 1 h bei RT oder bei 4°C über Nacht, und dann über geeignete Filter, z. B. Whatman oder Schleicher 3 Schuell Glasfaserfilter, die gegebenenfalls vorbehandelt wurden, z. B. mit PolyAhylenimin, abfiltriert, um den nicht-gebundenen von dem gebundenen Radioliganden zu trennen. Nach Waschen der Filter werden diese getrocknet oder feucht mit geeig- netem Szintillator versetzt und nach eventuell nötiger Inkubation im Szintillations- zähler die enthaltene Radioaktivität gemessen. Beim"Scintillation Pro<imity Test" werden geeignete Szintillation-Kügelchen, z. B. WGA-Kügelchen, mit den Ligan- den und Rezeptor enthaltenden Membranen in geeigneter Pufferlösung inkubiert, bis sich das Bindungsgleichgewicht eingestellt hat, und dann die Radioaktivität in einem geeigneten Szintillationszähler gemessen. Beide Bindungstests sind im HTS-Format durchführbar.

Solubiliserte oder gereinigte Rezeptoren können mit dem"Scintillation Proximity Test"oder mit gängigen inhomogenen Tests wie dem Filtrationstest nach PEG- Fällung, dem Adsorptions-oder dem Gelfiltrationstest gemessen werden (Hulme E, Birdsall N (1986) Distinctions in acetylcholine receptor activity. Nature 323 : 396-397).

Anstelle eines Radioliganden kann auch ein fluoreszierender Ligand, z. B. ein Li- gand, der kovalent einen fluoreszierenden Farbstoff wie BODIPY gebunden hat, eingesetzt werden. Die Bindung des fluoreszierenden Liganden an den Rezeptor wird mittels Fluoreszenzpolarisation gemessen. Die Methode eignet sich sowohl für primäre Screenings im HTS-Format wie auch in Sekundärtests.

Nach Identifizierung hochaffiner, seleliver Substanzen nach vorgenannten erfin- dungsgemäßen Verfahren werden diese auf ihre Verwendung als Medikamente gegen Schmerzen getestet. Darüber hinaus können die Bindungsplätze der identi- fizierten und pharmakologisch wirksamen Substanzen an die erfindungsgemäßen SNSR-Genprodukte, insbesondere den Sequenzen gemäß den Figuren 4 und 6, mit Hilfe des Yeast-Two-Hybrid-Systems oder anderen Tests ermittelt werden, d. h., dass die für die Interaktion, bspw. auch für die Interaktion zwischen nativen Proteinen, verantwortlichen Aminosäuren, wie bereits vorstehend erwähnt, einge- grenzt werden. In einem nächsten Schritt können hochaffine Substanzen (Surro- gatliganden), die speziell die zuvor identifizierten für die Bindung der nativen In- teraktionspartner verantwortlichen Aminosäuren (Strukturbereiche) aufweisen, durch die in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen Screeningverfah- ren identifiziert werden. Auf diese Weise können auch Substanzen aufgefunden werden, mit denen die Interaktion zwischen erfindungsgemäßen Polypeptiden und etwaigen nativen intrazellulären Interaktionspartnern derselben beeinflußt, bspw. inhibiert, werden können. Hierdurch wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsge- mäßen Protein offenbart. Insbesondere wird in diesem Zusammenhang auf Ver- fahren, wie bei Klein et al. (1998, Nat Biotechnol, 16,1334-7) beschrieben, ver- wiesen. Die bekannten Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Proteins, das zur Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehört (Kopplung an G-Proteine, Signalweitergabe), können zudem benutzt werden, um erfindungsgemäß Inhibit- ren zu identifizieren.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, enthal- tend eine Nukleotidsequenz, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für ein Poly- peptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder einen mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt davon und/oder die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 6 oder einen mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt davon codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele. Weiterhin bevorzugt sind solche Nukleinsäure- Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz eines Proteins der Mitglieder SNSR-L2 oder-L3 der SNSR-Familie codiert, wobei insbesondere der C- terminale (intrazelluläre) Abschnitt eines erfindungsgemäßen Proteins oder ein Fragment desselben (vorzugsweise mindestens von einer Länge von 25 Amino- säure) eingeschlossen sein sollte. Insbesondere sind alle Nukleinsäure- Sequenzen offenbarungsgerecht mitumfaßt, die mit den erfindungsgemäßen Se- quenzen unter Standardbedinungen, wie vorstehend definiert, hybridisieren, ein- schließlich der jeweils im Doppelstrang komplementären Sequenzen. <BR> <BR> <P>) n einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA-Sequenzen offen- bart, deren Genprodukt für ein Polypeptid codiert, wie in einer der Figuren 4 oder 6 wiedergegeben, einschließlich aller unktionshomologen Derivate, Ai ! eie oder Fragmente einer solchen DNA-Sequenz und auch infunktioneller Derivate, Allele, Analoga oder Fragmente (bspw. DN-Varianten), die die physiologische Funktion inhibieren können. Auch mit diesen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridi- sierende DNA-Sequenzen (einschließlich der Sequenzen des komplementären DNA-Stranges) sind mitoffenbart. Vorzugsweise bleibt bei den Derivaten, Allelen, Fragmenten oder Analoga der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen ge- mäß den Figuren 4 und 6 bzw. weiteren nativen Mitgliedern der SNSR-Familie mindestens eine biologische Eigenschaft erhalten. Die Herstellung derartiger De- rivate, Analoga, Fragmente oder Allele geschieht durch Standardverfahren (Sambrook et al. 1989 und 2001, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Hierbei werden bei den erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen, gehörend zur SNSR-Familie, insbesondere gemäß Figuren 3 und 5, ein oder mehrere Codon (s) insertiert, deletiert oder substituiert, um nach Transkription und Translation ein Polypeptid zu erhalten, das einen Unterschied in bezug auf mindestens eine Aminosäure gegenüber den dazugehörigen nativen SNSR-Proteinen der Erfindung, insbesondere den in den Figuren 4 oder 6 darge- stellten Sequenzen aufweist.

Zum Erfindungsgegenstand der vorliegenden Anmeldung gehören auch Teilse- quenzen der erfindungsgemäßen nativen SNSR-Sequenzen, insbesondere der in der Fig. 3 oder 5 dargestellten Sequenz. Diese Teiisequenzen enthalten typi- scherweise mindestens 30, mehr bevorzugt 60, stärker bevorzugt mindestens 150 und noch stärker bevorzugt mindestens 250 Nukieotide umfassende Fragmente der in den Figur 3 und 5 dargestellten Nukleotidsequenzen. Mitoffenbart sind alle Derivate, Analoga oder Allele der vorgenannten offenbarten Teilsequenzen. Auch die sich aus diesen erfindungsgemäßen Teilsequenzen ergebenden Aminosäure- sequenzen sind als solche oder als Bestandteil in größeren rekombinanten Prote- inen mitoffenbart. Insbesondere sind auch alle denkbaren bzw. nativ auftretenden Spleißvarianten der erfindungsgemäßen Sequenzen Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.

Weiterhin bevorzugt sind Nukieinsäuresequenzen, insbesondere DNA- Sequenzen, die für ein Protein codieren, das mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80%, mehr bevorzugt mindestens 90% und noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität (Homologie) mit den Sequenzen gemäß den Figuren 4 bzw. 6 aufweist. Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfin- dungsgemäßen Nukleotidsequenzen, insbesondere gemäß Fig. 3 oder 5, oder deren funktionelle oder infunktionelle Äquivalente, wie z. B. Allelvarianten oder Isoformen, erhältlich. Unter Allelvarianten werden im Sinne der vorliegenden Er- findung Varianten verstanden, die 60 bis 100 % Homologie auf Aminosäureebe- ne, bevorzugt 70 bis 100 %, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100 % aufweisen.

Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen oder infunktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus nativen SNSR-Sequenzen, bspw. den erfindungsgemäßen SNSR-L2-oder SNSR-L3-Sequenzen, erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentli- chen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt.

Hinsichtlich der Isolierung und Definituion funktionshomologer Äquivalente, Deri- vate, Fragmente, Allele, Mutanten, unter Standard-bzw. stringenten Bedingungen hybridisierender Sequenzen usw. wird auf die entsprechenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahren verwie- sen.

Zu Äquivalenten von erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen gehören ins- besondere auch Derivate der in den Figuren 3 und 5 dargestellten Sequenzen, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion (en) und/oder Deletion (en) verändert sein, wobei die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren erhal- ten bleiben oder, je nach Bedarf, verändert werden kann. So können die Promoto- ren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komptett durch wirksamere Promotoren auch artfremde Organismen ausgetauscht wer- den. Unter Derivaten sind erfindungsgemäß auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -1000 vor dem Startkodon so verändert wur- den, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevor- zugt erhöht, wird.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die vorzugsweise am 3'-Ende verändert wurden. Als solche"Tags"sind in der Literatur z. B. Hexa- Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (z. B. auch der Flag-Tag) (Studier et al., Meth. Enzymol., 185,1990 : 60-89 und Ausubel et al. (eds. ) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). und/oder mindestens eine Signalsequenz zum Transport des translatierten Proteins, bspw. in eine bestimmte Zellorganelle oder in den exträzellulären Raum.

Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bspw. gemäß Fig. 3 oder 5, bzw. deren Deriva- te, Varianten, Homologe oder insbesondere Fragmente auch in therapeutisch o- der diagnostisch geeigneter Form exprimiert werden. Zur Generierung des re- kombinanten Proteins können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die bspw. einer einfacheren Reinigung dienen, insbesondere wird hierbei auch auf die Verlängerung durch die oben beschriebenen Tag-Sequenzen verwiesen. <BR> <BR> <P>Bevorzugt sind weiterhin Nukleinsäuren, die () DNA-Sequenzen eiindungsge- mäßer genomischer Nukleotidsequenzen, insbesondere Positionen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop-Codon) der Fig. 2 oder Positionen 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop-Codon) der Fig. 2, enthalten oder diesen entsprechen.

Weiterhin werden erfindungsgemäß sorzugsweise all@ D-Sequenzen mitoffen- bart, die für ein Protein codieren, das im wesentlichen der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder 6 entspricht. Diese DNA-Sequenzen enthalten nur eine gerin- ge Zahl an Veränderungen gegenüber der in den vorgenannten Figuren angege- benen Sequenzen, bspw. kann es sich um Isoformen handeln. Die Zahl der Se- quenzveränderungen wird typischerweise nicht größer als 10 sein. Derartige im wesentlichen mit den für die Proteine mit den Aminosäuresequenzen gemäß den Figuren 4 bzw. 6 codierenden DNA-Sequenzen entsprechenden DNA- Sequenzen, die gleichfalls für ein biologisch aktives Protein codieren, können durch allgemein bekannte Mutagenese-Verfahren erhalten und die biologische Aktivität der durch die Mutanten codierten Proteine durch Screening-Verfahren, bspw. Bindungsstudien oder die Fähigkeit zur Ausprägung der biologischen Funk- tion, bspw. im Zusammenhang mit neuronalen Vorgängen oder der Apoptose, identifiziert werden. Zu den entsprechenden Mutagenese-Verfahren gehören die "site-directed"-Mutagenese, die die automatisch durchgeführte Synthese eines Primers mit mindestens einer Basenveränderung vorsieht. Nach der Polymersie- rungsreaktion wird der Heteroduplex-Vektor in einen geeignetes Zellsystem trans- feriert (z. B. E. colt) und entsprechend transformierte Klone isoliert.

Darüber hinaus kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden für die Her- stellung, Modifikation und/oder Detektion von erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen, die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können in Betracht (PCR (Innis et al. PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications) oder chemische Synthese). Durch entsprechende PCR-Primer können bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz eingeführt werden, wie z. B.

Restriktionsschnittstellen, Terminationscodons. Hierdurch können erfindungsge- mäße Sequenzen für den Transfer in K ! onierungsvektoren entsprechend entwor- fen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, d. h. ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, das eine, wie oben beschrieben, erfin- dungsgemäße Nukleinsäuresequenz, typischerweise eine DNA-Sequenz enthät.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem erfidungsgemäßen Vektor um einen Ex- pressionsveleor. Vorteilhafterweise werden hierbei die erfindungsgemäßen Nuk- Ieinsäuresequenzen mit mindestens einem genetischen Reguiationseiement, wie bspw. Transkriptions-und Translationssignalen, funktionell verknüpft. Diese Ver- knüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer nativen Expressionsrate oder auch zu einer Erhöhung bzw. Erniedrigung der nativen Genexpression füh- ren. Mit den solchermaßen hergestellten Expressionsvektoren können anschlie- ßend Wirtsorganismen bzw. Wirtszellen transformiert werden, z. B. Zellkulturen aus Säugetierzellen.

Bei dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor wird (werden) typischerweise das (die) native (n) Regulationselement (e) eingesetzt werden, d. h. die bspw. Promotor und/oder Enhancer-Region des Gens für ein erfindungsgemäßes Protein aus der SNSR-Familie, insbesondere für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß der Figur 4 oder 6, insbesondere entsprechende Regulationssequenzen aus der Ratte. Ggf. können diese nativen oben bezeichneten Regulationssequenzen auch genetisch verändert sein, um eine veränderte Expressionsintensität hervorzuru- fen. Zusätzlich zu diesen nativen vorbezeichneten Regulationssequenzen oder anstelle dieser nativen Regulationssequenzen können für andere Gene native Regulationselemente erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vor-und/oder nach- geschaltet (5'-oder 3'-Regulationssequenzen) sein und gegebenenfalls auch ge- netisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation unter der Kon- trolle der vorbezeichneten nativen Regulationssequenzen ausgeschaltet ist und die Expression der Gene-je nach Wunsch-hierdurch erhöht oder erniedrigt wer- den kann.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für den erfindungsgemäßen Vektor, der ins- besondere im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar ist, sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3- , gal-, trc-, ara-, SP6-, I-PR- oder im l-PL-Promotor enthalten, die vorteilhaRerwei- se in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulati- onssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren wie amy und SP02, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie Caik-Kinasell, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxyiase, Kainat-Rezeptor- Untereinheit 1, Glutamat-Rezeptor-Untereinheit B enthalten. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die bspw. oben genannten für einen erfindungsgemäße Expressionsvektor verwendet werden.

Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet wer- den. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstär- kung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder"Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation mög- lich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Regulationssequenzen werden alle dem Fachmann geläufigen Elemente be- zeichnet, die auf der Transkriptions-und/oder Translationsebene die Expression der erfindungsgemäßen Sequenzen beeinflussen können. Insbesondere sind da- bei neben Promotorsequenzen sog."Enhancer"-Sequenzen hervorzuheben, die über eine verbesserte Wechseiwirkung zwischen RNA-Poiymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken können. Als weitere Reguiationssequenzen seien beispielhaft die sog."Locus Controi Regions","Silencr"oder jeweilige Teilse- quenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebe- spezifische Expression verwendet werden. Auch sog. Terminatorsequenzen wer- den vorteilhafterweise in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor vorhan- den sein und erfindungsgemäß unter den Terminus"Reguiationssequenz"sub- sumiert.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukieinsäure mit einem Promotor, wobei der Promotor typisch 5' "upstream" von einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz zu liegen kommt. Weitere Regulationssignale, wie bspw. 3'-gelegene Terminatoren, Polya- denylierungssignale oder Enhancer, können funktionell in dem Expressionsvektor enthalten sein. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Nukleinsäuresequen- zen, insbesondere für die Sequenzen gemäß Figuren 3 und 5 bzw. für die ent- sprechenden Proteine, in einer oder mehreren Kopien in einem Genkonstrukt nach dieser Erfindung enthalten sein, oder ggf. auch auf getrennten Genkonstruk- ten lokalisiert sein.

Unter den Begriff"Expressionsvektor"fallen sowohl rekombinante Nukleinsäure- konstrukte bzw. Genkonstrukte, wie zuvor beschrieben, als auch komplette Vek- torkonstrukte, die neben erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und etwaigen Re- gulationssequenzen typischerweise auch weitere Elemente enthalten. Diese Vek- torkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeigneten Wirtsor- gänismus verwendet. Vorteilhafterweise wird mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, bspw. ein Gen der Ratte aus der SNSR-Familie, insbesondere SNSR-L2 oder-L3, oder bspw. eine Teilsequenz eines solchen Gens, in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus"Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Unter Vektoren sind außer Plasmide auch alle anderen dem Fachmann bekann- ten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, A- denovirus, Sindbisvirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können auto- nom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mamrnalia wird typischerweise lineare DNA verwendet.

Die Expression erfindungsgemäßer Nukieinsäuresequenzen kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung reguiatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionse- bene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale, wie Promotoren und Enhan- cer, verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert oder die Able- seeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird. Zur Erhöhung der Gen- kopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispiels- weise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequen- zen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für inter- agierende oder für potentiell interagierende Proteine kodierenden Sequenzen in einen einzelnen Vektor kloniert werden und anschließend in vitro in einer Wirtszel- le oder in vivo in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der potentiell interagierenden Nukleinsäuresequenzen und die erfindungs- gemäßen kodierenden Sequenzen aus der SNSR-Familie in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden, wie bspw. Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun verbracht werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann mindestens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene und/oder Gene, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren, insbesondere GFP) in einem erfindungsgemäßen Expressions- vektor, insbesondere einem kompletten Vektorkonstrukt, enthalten sein. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder einem erfindungsgemäßen Ex- pressionsvektor, insbesondere einem Vektorkonstrukt transformiert sind. Als Wirtszellen sind prinzipiell alle Zellen geeignet, die eine Expression rfiindungs- gemäßer Nukleotidsequenzen (wodurch als Derivate bspw. auch ihre Allele oder funktionelle Äquivalente eingeschlossen sind) allein oder im Verbund mit weiteren Sequenzen, insbesondere Regulationssequenzen, gestatten. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro-oder eukaryontischer Natur in Betracht, beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen. Bevorzugte Wirtszellen sind Bakterien, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Aspergillus oder Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature, 282 : 39, (1997)). Ins- besondere um größere Mengen an erfindungsgemäßen Proteinen herstellen zu können, eignen sich vorteilhafterweise methylotrophe Hefen, insbesondere Pichia pastors. Die Rezeptoren werden dazu in geeignete Expressionsvektoren kloniert, die z. B. auch die Expression als Fusionsprotein mit zur Reinigung geeigneten "Tag"-Sequenzen erlauben. Nach Elektroporation der Hefen werden schließlich stabile Klone selektiert. Eine gute Beschreibung der Methode sowie alle dafür nö- tigen Mittel werden von der Firma Invitrogen angeboten. Anschließend können die Expressionsprodukte funktionell charakterisiert und ggf. für erfindungsgemäße "Screening"-Verfahren eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Expression von erfin- dungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizellulären Organismen gewählt.

Dies geschieht auch vor dem Hintergrund einer möglicherweise erforderlichen Gly- kosylierung (N-und/oder 0-gekoppelt) der codierten Proteine. Diese Funktion kann in höheren Eukaryotenzellen-im Vergleich zu Prokaryotenzellen-in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugem, beispielsweise Affen, Ratten, Hamsters oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinie bekannt. In einer keineswegs abschließenden Auf- zählung werden die folgenden Zellinie genannt : 293T (Embryonennierenzellinie), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36 : 59 (1997)), BHK (Babyhamsternierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien), (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77 : 4216, (1980)), HeLa (humane Cervixkarzinomzellen) und weitere - insbesondere für den Laboreinsatz etablierte - Zellinien, wie bspw. CHO-, HeLa-, HEK293-, Sf9- oder COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere Zellen des Immunsystems oder adulte Stammzellen, bspw. Stammzellen des Blut bilden- den Systems (aus dem Knochenmark). Erfindungsgemäß können die Zeilen bzw.

Zeilinien die erfindungsgemäßen SNSR-Rezeptoren endogen als auch exogen exprimieren. Humane erfindungsgemäße transformierte Zellen, insbesondere au- tologe Zellen des Patienten, eignen sich nach (vor allem ex vivo) Transformation mit erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder erfindungsgemäßen Express- onsvektoren, ganz besonders als Arzneimittel für bspw. gentherapeutische Zwe- cke, also nach Durchführung einer Zellentnahme, ggf. ex vivo Expansion, Trans- formation, Selektion und abschließender Retransplantation.

Erfindungsgemäß werden insbesondere vorteilhafterweise erfindungsgemäße Proteine der SNSR-Familie heterolog in Insektenzellen zur funktionellen Charak- terisierung und zum Einsatz für erfindungsgemäße"Screening"-Verfahren herge- stellt werden. Da die Konzentration endogener G-Proteine in Insektenzellen relativ niedrig ist, so sind z. B. Gi-Proteine im"Western Blot"nicht nachzuweisen, und Insektenzellen den zu untersuchenden Rezeptor in der Regel nicht exprimieren, sind sie zur in vivo Rekonstitution von Signaltransduktionswegen erfindungsge- mäßer Rezeptoren der SNSR-Familie besonders geeignet. Die Rezeptoren der SNSR-Familie werden in diesem Fall mittels des Baculovirus-Expressionssystems in verschiedenen Insektenzellinien, z. B. Sf9, Sf21, Tn 368 oderTn High Five, oder MB-Zellen exprimiert. Dazu werden z. B. mit dem BaculoGold Kit von Pharmingen rekombinante Baculoviren hergestellt und die obengenannten tnsektenzettinien infiziert. Um erfindungsgemäß die Kopplung an G-Proteine zu untersuchen, wer- den Ko-Infektionen durchgeführt. Dazu werden die Zellen mit dem Rezeptorvirus und zusätzlich noch mit den die drei G-Protein-Untereinheiten exprimierenden Viren infiziert und entsprechende Tests, z. B. cAMP-Tests durchgeführt. So kann der Einfluß verschiedener G-Protein-Untereinheiten auf die Aktivität des Rezep- tors untersucht werden. Insektenzellen die Rezeptoren exprimieren oder deren Membranen können ebenfalls in Screening-Tets eingesetzt werden. Insektenzel- len können leicht in großen Mengen sowohl in Fermentern als auch in Schüttel- kolben vermehrt werden und sind damit geeignetes Ausgangsmaterial, um re- <BR> <BR> <BR> <BR> kombinantes Lell-oder Membranmaterial sowohl für"Screening6'-VerShren als auch für Rezeptorreinigungen bereitzustellen.

Die Kombination aus einer Wirtszelle und einem zu den Wirtszellen passenden erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen I, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons, und/oder weiteren vor- teilhaften regulatorischen Sequenzen, bilden eine erfindungsgemäße Wirtszelle, die als Expressionssystem dienen kann. Bevorzugte erfindungsgemäße Expres- sionssysteme auf der Basis erfindungsgemäßer Wirtszellen sind beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen, wie bspw. CHO-Zellen, und Vektoren, wie bspw. pcDNA3neo-Vektor, oder bspw. HEK293-Zellen und CMV-Vektor, die für Säugetierzellen besonders geeignet sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die von der erfindungsgemä- ßen Nukleinsäure codierten Genprodukte. Unter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfindung sowohl Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Proteine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufgereinigter Form. Diese Proteine regulieren oder transportieren insbesondere mit Schmerzen in Zusammen- hang stehende Signale. Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt dann, wenn es ein funktionshomologes oder die Funktion inhibierendes (infunktionelles) Allel, Fragment, Analoges oder Derivat dieser Sequenz enthält oder typischerweise aus einer solchen Aminosäuresequenz besteht. Funktionshomologie wird im Sinne der vorliegenden Erfindung so definiert, dass mindestens noch eine der wesentli- chen funktionetien Eigenschaften der gemäß Figuren 4 bzw. 6 dargestellten Proteine erhalten bleibt. Typischerwiis werden fuarrlctionshomologe erfindungsge- mäße Proteine insbesondere eine charakteristische, bspw. mindestens 60% ige, vorzugsweise mindestens 80% ige, mehr bevorzugt mindestens 90% ige Sequenz- identität mit den biologisch funktionellen Abschnitten der erfindungsgemäßen Pro- teine, die bspw. Protein-Interaktionsdomänen darstellen, aufweisen.

Unter einem Derivat werden dabei insbesondere solche Aminosäuresequenzen verstanden, die durch Modifikationen ihrer Seitenketten verändert sind. Bspw. durch Konjugation eines Antikörpers, Enzyms oder Rezeptors an eine erfindungs- <BR> <BR> <BR> gemäße Aminosäuresequenz. Derivate können aber auch die Kopptung eines Zuckers (über eine N-oder 0-glykosidische Bindung) oder Fett (säure)-restes (bspw. Myristylsäure), einer oder auch mehrerer Phosphatgruppe (n) und/oder jeder beliebigen Modifikation einer Seitenkette, insbesondere einer freien OH- Gruppe oder NH2-Gruppe oder am N-oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Oligo-oder Polypeptids. Darüber hinaus schließt der Begriff"Derivat"auch Fusi- onsproteine ein, bei denen also eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz an beliebige Oligo oder Polypeptide gekoppelt ist.

Als"Analoge"werden Sequenzen bezeichnet, die sich durch mindestens eine Aminosäure-Veränderung gegenüber der nativen Sequenz auszeichnen (Inserti- on, Substitution). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind solche konservati- ven Substitutionen bevorzugt, bei denen der physikochemische Charakter (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) der ausgetauschten Aminosäure erhalten bleibt (polare Aminosäure, lange aliphatische Kette, kurze aliphatische Kette, negativ oder positiv geladene Aminosäure, Aminosäure mit aromatischer Gruppe). Die Substitutionen können biologisch funktionelle, tw. Funktionelle oder biologisch infunktionelle Sequenzen ergeben. Beispielsweise können Argininreste gegen Lysinreste, Valinrest gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste ge- gen Glutaminsäurereste ausgetauscht werden. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermaßen gegenüber den nativen SNSR-Proteinen, insbesonde- re gegenüber den gemäß Figuren 4 oder 6 veränderten Proteine besitzen typi- scherweise wenigstens 60%, bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevor- zugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in den vorgenannten Figuren, berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al. (J. Mol. Viol., 215, 403-410, 1990). Das isolierte Protein lässt sich vorteilhafterweise aus den dorsa- len Sinalganglien sowie trigeminalen Ganglien von Mammalia, insbesondere Rat- tus noregicus, isolir@n. Auch Homologe aus andren Mammalia sind unter funk- tionellen Varianten zu verstehen.

Bevorzugt sind erfindungsgemäß Analoge dann, wenn die Sekundärstruktur, wie sie in der nativen Sequenz auftritt, auch bei ihnen erhalten bleibt. Neben konser- vative Substitutionen können auch weniger konservative Aminosäure-Variationen erfindungsgemäß in die native Sequenz eingeführt werden. Dabei behalten sie typischerweise ihre biologische Funktion, insbesondere als Transduktor eines schmerzrelevanten Signals, bei. Der Effekt einer Substitution oder Deletion kann ohne weiteres durch entsprechende Untersuchungen, Bindungtests oder bspw. cytotoxische Tests, überprüft werden.

Gleichwohl werden erfindungsgemäß aber auch Sequenzen einbezogen, die ei- nen sogenannten dominant-negativen Effekt hervorrufen können, d. h. auf Grund ihre veränderten Primärsequenz zwar noch Bindungsaktivität an einen extrazellu- lären Liganden aufweisen, das Signal aber nicht stromabwärts, d. h. intrazellulär, weitergeben können. Derartige Analoge fungieren daher als Inhibitoren der biolo- gischen Funktion, insbesondere als Inhibitoren der Apoptose. Derartige Analoge werden durch gentechnische Maßnahmen hergestellt, und zwar typischerweise durch die sog. "site-directed"-Mutagenese einer Nukleotidsequenz, die für ein er- findungsgemäßes Protein (typischerweise Sequenzen gemäß der Fig. 3 oder 5), codiert. Hierdurch wird die dem Analogen zugrundliegende Nukleotidsequenz hergestellt, die schließlich das Protein in einer rekombinanten Zellkultur exprimie- ren kann (Sambrook et al., 1989, s. o.). Auch alle Derivate der vorbeschriebenen Analoge werden mitoffenbart, genauso wie die den vorbeschriebenen Aminosäu- sequenzen zugrundeliegenden Nukleotidsequenzen.

Weiterhin gehören auch Fragmente einer nativen erfindungsgemäßen Aminosäu- resequenz zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Fragmente zeichnen sich durch Dotationen aus (N-oder C-termina) oder auch intrasequentiett). Sie können einen dominant-negativen oder dominant-positiven Effekt haben.

Zu den erfindungsgemäßen Genprodukten (Proteinen) gehören aber auch all jene Genprodukte (Proteine), die sich von erfindungsgemäßen von Nukleinsäure- Derivaten,-Fragmenten oder-Allelen der in den Figuren angegebenen Nukleinsäu- re-Sequenzen nach Transkription und Translation abteilen.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine chemisch modifiziert sein.

So etwa kann eine Schutzgruppe am N-Terminus vorliegen. Es können Glyko- sylgruppen an Hydroxyl-oder Aminogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder Ace- tylgruppen und ähnliches. Auch beliebige chemische Substanzen, Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen Syntheseweg an das erfindungsgemä- ße Protein gebunden sein. Auch zusätzliche Aminosäuren, z. B. in Form einzelner Aminosäuren oder in Form von Peptiden oder in Form von Proteindomänen und ähnliches, können mit dem N-und/oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Pro- teins.

Insbesondere sind hier sogenannte Signal-oder"Leader"-Sequenzen am N- Terminus der Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Proteins bevorzugt, die das Peptid cotranslational oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) führen. Am N-oder am C-Terminus können auch Aminosäuresequenzen vorliegen, die als Antigen die Bin- dung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nen- nen ist hier insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstabencode der Aminosäuren lautet : DYKDDDDK. Oder auch ein His-Tag mit mindestens 3, <BR> <BR> <BR> <BR> vorzugsweis mindestens 6 Histidin-Resten. Diese Sequenzen haben stark ntige- ne Eigenschaften und erlauben somit eine schnelle Überprüfung und leichte Reini- gung des rekombinanten Proteins. Monoklonale Antikörper, die das Flag-Peptid bin- den, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhältlich.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner mindestens 10, vorzugsweise 20, stärker bevorzugt mindestens 30 und noch stärker bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren umfassende Teilabschnitte der nativen SMSR-Sequenzen, insbe- sondere den in den Figuren 4 und 6 offenbarten Sequenzen. Derartige Teiise- quenzen können nach dem Fachmann geläufigen Verfahren bspw. chemisch syn- thetisiert werden und können vorzugsweise ais Antigene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Vorzugsweise wird es sich bei diesen Teilab- schnitten bzw. deren Derivaten, Allelen oder Fragmenten um offenbarte Sequen- zen handeln, die im räumlichen Modell der Proteine solche Regionen bilden, die zumindest teilweise die Proteinoberfläche ausmachen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein transgener nicht- humaner Organismus, der genetisch dahingehend verändert ist, dass er eine im Vergleich zum normalen, d. h. nicht veränderten, Organismus, (spezifisch) verän- derte Menge mindestens einer erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz, insbe- sondere einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 und/oder Fig. 6, bzw. eine spezifisch gegenüber einer nativen SNSR-L2-und/oder SNSR-L3- Aminosäuresequenz, insbesondere einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 oder Fig. 6, veränderte erfindungsgemäße Aminosäuresequenz enthält, oder dass dem transgenen Organismus eine native SNSR-L2-und/oder SNSR-L3- Aminosäuresequenz fehlt, insbesondere eine Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 und/oder Fig. 6 der ein Teil davon fehlt oder verändert vorliegt. Somit ist im erfin- dungsgemäßen transgenen nicht-humanen Organismus eine veränderte Menge mindestens eines erfindungsgemäßen Genprodukts in mindestens einem Gewe- be enthalten bzw. darin exprimiert (bspw. durch Modifikation der Promotorbe- reichs eines erfindungsgemäßen Gens), oder es wird ein verändertes Genprodukt (bspw. ein erfindungsgemäßes Derivat eines Proteins der SNSR-Famitie, bspw. auch ein Fragment) in dem mindestens einem Gewebe enthalten oder wird darin exprimiert. Hierbei sind erfindungsgemäß auch solche Tiere eingeschlossen, die die nativ vorhandene erfindungsgemäße Nukleotidsequenz (a) auf der geneti- schen Ebene entweder teilweise oder vollständig nicht mehr aufweisen oder (b) zwar auf der genetischen Ebene erfindungsgemäße Sequenzen aufweisen, diese jedoch nicht transkribieren und/oder translatieren können und daher das Genpro- dukt nicht mehr enthalten. Darüber hinaus kann (können) bei einem transgenen Organismus, insbesondere einem transgenen Tier, die native erfindungsgemäßen Sequenz (en), also Sequenzen der SNSR-Familie, bspw. Sequenzen gemäß den Figuren 3 und 5, um mindestens eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz er- gänzt bzw. durch mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz substituiert sein. Insbesondere kann es sich bei der (den) substituierten und/oder ergänzten Sequenz (en) um erfindungsgemäße Sequenzen handeln, die nicht-nativer Natur sind.

Die Herstellung von in bezug auf erfindungsgemäße Sequenzen transgenen und/oder"knock-out"Tieren, insbesondere Mäusen, Ratten Schweinen, Rindern, Schafen, Fruchtfliegen (Drosophila), C. elegans oder Zebrafischen, erfolgt auf dem Fachmann geläufige Weise. Hierzu wird z. B. eine erfindungsgemäße cDNA Sequenz oder native oder nicht-native Variante in transgenen Mäusen exprimiert, z. B. unter einem NSE-Promotor in Neuronen, unter einem MBP-Promotor in Oli- godendrozyten etc.. Die genetisch veränderten Tiere können danach in unter- schiedlichen Krankheitsmodellen untersucht werden (z. B. experimentell herbeige- führtem Schlaganfall, MCAO). Die Herstellung von"knock-out"Tieren kann zu- dem Hinweise auf die Auswirkungen von Inhibitoren auf den Gesamtorganismen liefern, da ein"knock out Modell"insoweit der Inhibition erfindungsgemäßer nati- ver Sequenzen entspricht. Insoweit kann ein derartiges Verfahren bei einer präkli- nischen Prüfung von erfindungsgemäßen inhibitorischen Substanzen, z. B. erfin- dungsgemäße Peptide, Peptidanaloga oder andere kleine organische Verbindun- gen, zum Einsatz kommen.

Sämtliche multizellulären Organismen können erfindungsgemäß transgen aus- gestattet sein, insbesondere Säugetiere, bspw. Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder oder Schweine. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den trans- genen Organismen kann es sich auch um sogenannte"Knock-Out"-Tiere han- deln. Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funktionelles oder nicht funkti- onelles Nukleinsäurekonstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen oder nicht funktionellen Sequenz, die für erfindungsgemäße Proteine codiert, ent- halten. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beshriebenen transge- nen nicht-humanen Orgismen sind transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen oder in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die native (n) erfin- dungsgemäße (n) Nukleotidsequenz (en) SNSR-Familie, insbesondere der Se- quenzen gemäß den Figuren 3 oder 5), durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden. Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder Tei- len davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out- oder konditioneller oder regionenspezifischer knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen bei gentech- nisch veränderten Tieren (Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecu- lar Biology, John Wiley & Sons, New York und Torres et al., (eds.) 1997, Labora- tory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford).

Darüber hinaus können ebenso bestimmte Mutationen, bspw. Veränderungen der Promotoren oder Insertion von Enhancern, eingeführt werden, um beispielsweise konstitutiv aktive SNSR-Proteine in den transgenen Tieren zu erzeugen (knock- in"-Tiere). Auch derartige Tiere können bspw. erfindungsgemäß eingesetzt wer- den, um in praktischen Untersuchungen Analogiemodelle für potentielle Ago- nisten der SNSR-Proteinfunktion zu liefern.

Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Insertionen oder Veränderungen) durch homologe Re- kombination in embryonalen Stammzellen Crann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle weitere Informationen über die (Patho-)Physiologie der erfindungsge- mäßen Sequenzen liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können essen- tielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die bio- logische Funktion von erfindungsgemäßen Proteinen, insbesondere von Protei- nen mit einer der Sequenzen gemäß den Figuren 4 und 6, für neurale oder ande- re Prozesse beeinflussen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper, der gegen ein Epitop auf einem bereits a ! s vorstehend beschriebenes Genprodukt, insbesondere ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein, gerichtet ist.

Der Begriff"AntikörpeR'umfaßt i. S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklona- le Antikörper als auch monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfin- dungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikör- per auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)- Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungs- gemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionsproteinen werden typischer- weise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt. Als Antikör- per werden nach der vorliegenden Erfindung also sowohl polyklonale, monoklona- le, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente da- von, single chain Antikörper, bspw. scFv-Konstrukte, oder auch synthetische Anti- körper bezeichnet.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehören aber auch polylzlonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikör- per (bspw. über eine Säu) e, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops betaden sind) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen auf- weisen. Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekann- ten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975) ; US-Patent 4, 376, 110 ; Harlow und Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988) ; Ausubel et al., (eds), 1998, Curent Proto- cols in Molecular Biology, John Wiley a Sons, New York). Die in den vorgenann- ten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen.

Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druckschriften beschrieben herstellen. Kurz gesagt, werden dazu Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthio- cyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloro- form/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch"site directed mu- tagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren insertiert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden.

Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe-Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.

Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören : IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise gG1,) gG2, igG2a, ! gG2b,) gG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Ti- tern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimären Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäu- se-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines hu- manen Immunglobulins aufweisen). Chimäre Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die tmmunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z. B. ergeben mu- rine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zeiiinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so dass hu- man/murine chimäre Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden. Noch mehr be- vorzugt ist ein monoklonaler Antikörper, der die hypervariablen, Komplementari- täts-bestimmenden Regionen (CDR, engl."complementarity defining region") ei- nes murinen monoklonalen Antikörpers mit den übrigen Bereichen eines huma- nen Antikörpers in sich vereinigt. Ein derartiger Antikörper wird humanisierter An- tikörper genannt. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81 : 3273- 3277 (1984) ; Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81 : 6851-6855 (1984) ; Bou- lianne et al. Nature 312 643-646 (1984) ; Cabilly et al., EP-A-125023 ; Neuberger et al., Nature 314 : 268-270 (1985) ; Taniguchi et al., EP-A-171496 ; Morrion et al., EP-A-173494 ; Neuberger et al., WO 86/01533 ; Kudo et al., EP-A-184187 ; Saha- gan et al., J. Immunol. 137 : 1066-1074 (1986) ; Robinson et al., WO 87/02671 ; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84 : 3439-3443 (1987) ; Sun et al., Proc. Natl. A- cad. Sci USA 84 : 214218 (1987) ; Better et al., Science 240 : 1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, supra. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezogen.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei Antigen-komplementären Bindungsstel- len, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab-oder F (ab') 2-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrang- fragmente wie Fv-, Fab-oder F (ab') 2. Fab und F (ab') 2-Fragmente entbehren eines Fc-Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so dass sie im Blutkreislauf schneller transporiiee : werden können und vergleichsweise weniger nicht-spezifische Gewebsbindung a) s intakte Antikörper aufweisen. Solche Frag- mente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F (ab') 2, FragmenSn) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.

Es ist die besonders ausgewählte Form des Antikörpers, wenn er gegen ein Pep- tid oder Protein gerichtet ist, für das eine Nukleinsäure bzw. Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% homologes Polynukleotid gemäß Figuren 3 oder 5, oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% homologes Polynukleo- tid, das die Sequenz gemäß den Figuren 3 oder 5 enthält oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% homolo- ges Polynukleotid, das durch ein Herstellungsverfahren ausgehend von einem Genfragment gemäß einer der Figuren 3 oder 5, codiert.

Besonders bevorzugte Antikörper der vorliegenden Erfindung sind dabei gegen einen Sequenzabschnitt auf der extrazellulären Domäne von SNSR-L2 und/oder SNSR-L3 als Epitop gerichtet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antisense- Polynukleotid bzw. eine Antisense-Nukleinsäure, wobei es sich auch um eine PNIA handeln kann, das/die eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zu binden. Dabei versteht man unter PER (engl. #peptidic nucleic acid") eine peptidische Nukleinsäure, die zwar die Basenpaare trägt, aber dessen Rückrat peptidisch gebunden ist. Eine Antisense- Nukleinsäure zeigt die komplementäre Basenabfolge zu mindestens einem Teil einer Basis-Nukleinsäure. Die erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure ist vor- zugsweise Teil eines Ribozyms, insbesondere eines Hammerhead-Ribozyms, oder eines DNA-Enzyms oder einer sonstigen katalytischen RNA bzw. DNA. Un- ter Ribozym ist eine katalfisoh aktive Ribonuk) einsäure zu verstehen, unter DMA- Enzym ein entsprechende Desoxyribonukleinsäure, also katalytische RNA bzw. DNA. Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Antisense- Nukleinsäure bildet eine siRNA, die gegen eine der erfindungsgemäßen Gene gerichtet ist. Der Begriff #siRNA" ist erfindungsgernäß ein doppelsträngiges RNA- Molekül (dsRNA), das 19 bis 29 Bp, insbesondere 21 bis 23 Bp, umfasst und eine der mRNA der erfindungsgemäßen Gene komplementäre Sequenz aufweist. siR- NA-Moleküle können bei verschiedenen Anbieter, bspw. IBA GmbH (Göttingen, Deutschland), bezogen werden.

Die siRNA der vorliegenden Erfindung liegt gemäß bevorzugten Ausführungsfor- men chemisch modifiziert vor, insbesondere, wie nachstehend weiter ausgeführt, um einen vorzeitigen Abbau durch Nukleasen zu umgehen.

Ein"Antisense-Polynukleotid"bzw. eine"Antisense-Nukleinsäure"gemäß der vor- liegenden Erfindung ist somit ein aus mehreren natürlichen oder modifizierten Nukleinsäurebausteinen bestehendes Molekül, dessen Basenabfolge mindestens teil-bzw. bereichsweise komplementär zur Basenabfolge eines Teilbereiches ei- ner in der Natur vorkommenden Spezies, bspw. der in der Natur vorkommenden mRNA, ist. Augrund der Komplementarität ist das erfindungsgemäße Antisense- Polynukleotid bzw. die erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure unter Stan- dardbedinungen, wie oben definiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingun- gen, zur Hybridisierung mit dem Zielmolekül befähigt. Erfindungsgemäß umfasst die Antisense-Nukleinsäure bzw. das Antisense-Polynukleotid DNA-oder RNA- Spezies, die unmodifizierte oder modifizierte Nukleotide enthalten oder auch dar- aus bestehen können. Insbesondere bei RNA-Spezies, wie Antisense-RNA und siRNA, ist es außerdem bevorzugt, dass diese zur Stabilisierung gegenüber dem Abbau durch RNAsen mindestens ein Analoges natürlich vorkommender Nukleo- tide aufweist. Dies beruht auf der Tatsache, dass die in den Zellen vorkommen- den RNA-abbauenden Enzyme als Substrat vorzugsweise natürlich vorkommen- de Nukleotide erkennen. Durch Einfügen von Nukleotidanaloga kann daher der RNA-Abbau erschwert werden, wobei die Auswirkung auf die Translationseffi- zienz bei Einfügen von diesen Analoga, insbesondere in den codierenden Bereich der mRNA, einen positiven oder negativen Effekt auf die Translationseffizienz ha- ben kann.

Die Modifikation des Analogons gegenüber dem natürlich vorkommenden Nukleo- tid kann sowohl die Base als auch die Zucker-und/oder Phosphorsäure-Einheit des jeweiligen Nukleinsäurebausteins betreffen. In einer keineswegs abschlie- ßenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nukleo- tidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide (d. h. die Anti- sense-Nukleinsäure ist mindestens teilweise eine Peptidnukleisäure (engl."pepti- de nucleic acid"PNA)), Methylphosphonate, 7-Deazaguaonsin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden weiterhin Verfahren zur Expression von erfindungsgemäßen SNSR-Genprodukten, insbesondere also von Polypeptiden gemäß Figuren 4 oder 6, einschließlich aller Derivate, Analoge und Fragmente, of- fenbart, wobei hierfür Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert werden. Dieses Verfahren zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz beruhen, dient nicht dazu, das ent- sprechende Genprodukt zu konzentrieren und aufzureinigen, sondern vielmehr da- zu, den Zellstoffwechsel durch das Einführen der erfindungsgemäßen Nukleotidse- quenzen über die Expression des dazugehörigen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesondere an die Verwendung der mit Hilfe von Expressionsvektoren trans- formierten Wirtszellen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, ins- besondere zum Zwecke der Behandlung von Schmerzen, besonders chronischen Schmerzen, zu denken. Allgemein werden erfindungsgemäße Wirtszellen bei Er- Erkrankungen zur Verfügung gestellt, denen eine Fehlregulation der Schmerzentste- hung und/oder-weiterleitung zugrunde liegt. Die derart erfindungsgemäß ex vivo transformierten autologen oder allogenen Wirtszellen können dann Patienten trans- plantiert werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung von erfindungsgemäßen Genprodukten (vorzugsweise mit mindestens einer mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen), insbesondere der Se- quenzen gemäß den Figuren 4 oder 6, zumindest über eine Teilsequenz von min- destens 10, vorzugsweise 20, mehr bevorzugt mindestens 30 Aminosäuren homo- iogen Teitsequenz, wobei die (i) Wiftszetien mit einem erfindungsgemäßen Expres- sionsvektor transformiert und dann unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen, gegebenenfalls unter Selektionsdruck (vgl. hierzu die Ausführungen unter dem Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens) kulti- viert werden, so dass (ii) das Genprodukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt werden kann. Das erfindungsgemäße Genprodukt der erfindungsgemäßen Nukleo tidsequenz kann dabei, abhängig von dem Expressionssystem, aus einem Kultur- medium oder aus Zellextrakten isoliert werden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, dass die jeweiligen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Auf- reinigung des von einer erfindungsgemäßen DNA kodierten, rekombinanten Prote- ins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, abhängt. Zum Beispiel können Expressionssysteme einge- setzt werden, die zur Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle füh- ren. Das Kulturmedium muß in diesem Fall durch kommerziell erhältliche Protein- konzentrationsfilter, z. B. Amicon oder Millipore Pelicon, aufkonzentriert werden.

Nach dem Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen, z. B. ein Gel- filtrationsschritt oder eine Reinigung mit Hilfe von säulenchromatographische Me- thoden. Alternativ kann aber auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der eine Matrix mit DEAE aufweist.

Als Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung bekannten Materialien, z.B.

Acrylamid oder Agarose oder Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein Kationenaustauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise Carboxymethyl- Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Polypeptids können dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere Schritte handeln. Insbesondere wird die"Reversed-Phase"-Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz.

Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genprodukts können auch trans- formierte Hefezellen eingesetzt werden. In diesem Fall kann das translatierte Protein sekretiert werden, so dass die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes re- kombinantes Protein aus einer Hefewirtszelle kann durch Methoden erhalten wer- den, wie sie bei Urdal et al. (J. Chromato. 296 : 171 (1994)) offenbart sind und Be- standteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere erfindungsgemäße DNA, und/oder erfindungsgemäße Genprodukte können als Arzneimittel bzw. zur Her- stellung eines Arzneimittels Verwendung finden. Diese können als solche verab- reicht werden (bspw. bukkal, intravenös, oral, parenteral, nasal, subkutan) oder in Kombination mit weiteren Wirk-, Hilfs-oder arzneimitteltypischen Zusatzstoffen. Erfindungsgemäße Nukleinsäure kann als nackte Nukleinsäure, insbesondere intravenös, injiziert werden oder aber mit Hilfe von Vektoren dem Patienten verab- reicht werden. Bei diesen Vektoren kann es sich um Plasmide als solche handeln, aber auch um virale Vektoren, insbesondere retrovirale oder adenovirale Vekto- ren, oder auch um Liposomen, die nackte erfindungsgemäße DNA oder ein Plas- mid, das erfindungsgemäße DNA enthält, aufweisen können.

Die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere der Nukleo- tid-oder Aminosäuresequenzen der genannten Figuren bzw. deren Varianten, sowie erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon abgeleiteter erfin- dungsgemäßer Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) kommt somit für die Herstellung eines Arzneimittels zu therapeutischen Zwecken, d. h. zur Be- handlung von Erkrankungen, in Betracht. Ganz besonders bevorzugt ist dabei der therapeutische Einsatz zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerzen, insbesondere Erkrankungen oder pathophysio- logischen Zuständen, die auf fehigesteuerter Entstehung und/oder Weiterleitung von Schmerzen, vorzugsweise chronischer Art, beruhen.

Damit kommt die Verwendung erfindungsgemäßer Gegenstände, bspw. erfin- dungsgemäßer Nukleinsäuren, Antisense-Nukleinsäuren, Oligo- oder Polypeptide, Expressionsvektoren, Wirtszellen oder von Surrogatliganden, die sich an alle für die Regulation relevanten Positionen von erfindungsgemäßen Rezeptoren anla- gern können, insbesondere für die Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Schmerzen in Betracht.

Um auf auf der Basis molekularer Zusammenhänge zu weiteren Indikationen zu gelangen, erweisen sich erfindungsgemäß Zell-basierte HTS-Tests zur funktionel- len Rezeptor-Aktivierung, gemessen durch Enzymkomplementation, als geeignet.

Der Test basiert auf dem allgemeinen Regulationsmechanismus von GPCRs und mißt die Wechselwirkung zwischen dem aktivierten Rezeptor und ß-Arrestin. Dazu werden inaktive sich komplementierende ß-Galactosidasefragmente an den C- Terminus des Rezeptors und an ß-Arrestin fusioniert. Durch die Aktivierung des Rezeptors wird beta-Arrestin rekrutiert. Dadurch werden die zwei Hälften der be- ta-Galactosidase zusammengebracht so dass ein funktionierendes beta- Galactosidaseenzym entsteht, das entsprechende Substrat umsetzen kann, die als Meßsignal dienen (ICAST System). Prinzipiell kann dieser Test mit allen En- zymen durchgeführt werden, die als Fusionsproteine von zwei sich komplementie- renden Hälften exprimiert werden können und eine durch gängige Meßmethoden erfaßbare Substratreaktion durchführen.

Im Zusammenhang mit der therapeutischen Anwendung erfindungsgemäßer Se- quenzen steht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, nämlich die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder Proteinse- <BR> <BR> <BR> <BR> quenz, einschließlich aller Deriate, Al1ele, Fragmente usw., wie oben definier", zur Gentherapie bei Säugetieren, z. B. beim Menschen bzw. auch derartige gentherapeutische Verfahren. Gentherapie umfaßt dabei alle Therapieformen, die entweder erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen in den Körper oder Teile davon, bspw. einzelne Gewebe, einbringen, oder die Expression von erfindungsgemäßer Sequenzen beeinflussen. Dazu können alle dem Fachmann geläufigen Modifia- tionen im Rahmen der Gentherapie verwendet werden, bspw. Oligonukleotide, z. B. antisense-oder Hybrid-RNA-DNA Oligonukleotide, mit be ! iebigen Modifikati- onen, die erfindungsgemäße Sequenzen enthalten, benutzt werden. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Sequenzen (dies schließt alle Varianten, wie Fragmente, Isoformen, Allele, Derivate ein) benutzt werden. Auch entsprechende erfindungsgemäße nackte DMA-Sequenzen, zor- men im Rahmen der Gentherapie in Betracht. Ebenso können Nukieinsäurestü- cke mit enzymatischer Aktivität (z. B. Ribozyme) für gentherapeutische Zwecke benutzt werden.

Neben den therapeutischen Anwendungen kommen auch diagnostische Verwen- dungen erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypeptide, erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien (Oli- gonukleotide, Antikörper, Peptide) in Betracht, bspw. zur Diagnose von menschli- chen Erkrankungen oder von genetischen Prädispositionen, bspw. auch im Rah- men von Schwangerschaftsuntersuchungen. Bei diesen Erkrankungen oder Prä- dispositionen handelt es sich insbesondere um die oben im Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen, vor allem im Zusammenhang mit Schmerzen ste- hende, genannten Erkrankungen. Diese diagnostischen Verfahren können als in vivo, typischerweise jedoch ex vivo Verfahren ausgestaltet sein. Ex vivo wird eine typische Anwendung eines diagnostischen erfindungsgemäßen Verfahrens zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nuklein- säure in einer biologischen Probe dienen. Ein solches Verfahren umfaßt vorzugs- weise die folgenden Schritte : (A) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungs- gemäßen Nukieinsäure geeignet sind, (B) Nachweis der erfindungsgemäßen Nuk- <BR> <BR> <BR> leinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation, (C) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR-Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.

Erfindungsgemäße Sequenzen können in Verfahren zur Bestimmung von Poly- morphisme derselben z. B. bei Menschen verwendet werden. Auf diese ermittelte Polymorphismen erfindungsgemäßer Sequenzen unterfallen nicht nur der Offen- barung der vorliegenden Erfindung, sondern können auch prognostische Marker für die Diagnose bzw. für die Diagnose einer Prädisposition von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einer durch infunktionale Expression erfindungsgemä- ßer Sequenzen, durch Expression infunktionaler erfindungsgemäßer Sequenzen und/oder oder deren Überexpression dienen. Darüber hinaus ist erlauben erfin- dunsgemäße Sequenzen die Erforschung humaner Erbkrankheiten, und zwar so- wohl monogener als auch polygener Erkrankungen.

Neben therapeutischen und/oder diagnostischen Verwendungszwecken im Be- reich der Human-und/oder Tiermedizin kommt auch die Verwendung erfindungs- gemäßer Nukleinsäuren oder Polypeptide zum wissenschaftlichen Einsatz in Be- tracht. Insbesondere erlauben die erfindungsgemäßen Sequenzen auf dem Fachmann bekannte Weise, bspw. über cDNA-Bibliotheken verwandte Sequen- zen bei ein-oder mehrzelligen Organismen zu identifizieren oder aber im huma- nen Genom verwandte Sequenzen zu lokalisieren. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, insbesondere die Sequenzen gemäß den Figuren 3 und 5 (einschließl. aller Varianten), können also dazu verwendet werden, Gene für mRNAs, die für diese Nukleinsäuren oder deren funktionellen Äquivalente, Homo- loge oder Derivate kodieren, im bspw. murinen oder anderen Tiergenomen und im menschlichen Genom mit gängigen Methoden durch Homologiescreening zu iso- lieren, zu kartieren und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu korrelieren.

Mit Hi) fe erfindungsgemäßer Nukleinsäuren fassen sich damit insbesondere hu- <BR> <BR> <BR> <BR> mane Erbkrankheiten diagnostizieren, und zwar sowohl monogene als auch poly- gene Erkrankungen, weswegen sie als Marker Verwendung finden, wobei hieraus ein erfindungsgemäßes Diagnoseverfahren für erbliche Erkrankungen erwächst. Insbesondere wird erfindungsgemäß für die wissenschaftliche Anwendung ein Testsystem offenbart, das auf erfindungsgemäßen Aminosäure-und/oder Nukieo- tid-Sequenzen beruht. In diesem Zusammenhang können die cONS, die genomi- sehe DNA, die regulatorischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukieinsäure- sequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nicht-rekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Tastsystems verwendet werden. Ein so ! ches erfindungsgemäßes Testsystem ist insbesondere geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meßmethoden (kolori- metrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Ku- binyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen Bibliotheken nach Sub- stanzen, die hemmende oder aktivierende Wirkungen auf erfindungsgemäße Pro- teine, insbesondere der Sequenzen gemäß den Figuren 4 und 6 (bzw. deren De- rivate oder Fragmente), haben. Die Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die SNSR-assoziierte Signaltransduktion wirken. Insbesondere werden hierbei Testsysteme zur Verfügung gestellt, die die bekannten Eigen- schaften von G-Protein gekoppelten Proteinen benutzen, bspw. die weiter unten offenbarten Testsysteme.

Eine ggf. pathologisch gesteigerte Schmerzentstehung bzw.-weiterleitung, die auf einer entsprechenden Fehisteuerung erfindungsgemäßer Sequenzen beruht, kann auch durch Ribozym-Methoden therapiert werden. Hierzu werden Ribozyme verwendet, die eine Ziel-mRNA schneiden können. Im vorliegenden Fall werden daher Ribozyme offenbart und stellen einen Gegenstand der vorliegenden Erfin- dung dar, die native SNSR-mRNA, bspw. von SNSR-L2 oder SNSR-L3, spalten können. Erfindungsgemäße Ribozyme müssen dabei mit der erfindungsgemäßen Liel-mRNA interagieren können, bspw. über Basenpaarung, und anschließend die mRNA spalten, um die Translation von bspw. SNSR-L2 oder SNSR-L3 zu blockie- ren. Die erfindungsgemäßen Ribozyme werden über geeignete Vektoren in die Zielzellen geschleust (insbesondere Plasmide, modifizierte Tierviren, insbesonde- re Retroviren), wobei die Vektoren neben ggf. anderen Sequenzen eine cDNA- Sequenz für ein erfindungsgemäßes Ribozym aufweist).

Neben den vorgenannten Möglichkeiten zur Modulation der biologischen Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte, insbesondere der Genprodukte gemäß Figuren 3 und 5, typischerweise der Modulation der Funktion erfindungsgemäßer Genpro- dukte bei der abnormen Schmeraveiterleitung ist dies auch mit Hilfe eines weite- ren Gegenstands der vorliegenden Erfindung möglich. Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung wird die intra-und/oder extrazelluläre Funktion der erfin- dungsgemäßen Proteine der SNSR-Familie modulieren, typischerweise inhibieren oder auch aktivieren, oder auf der Ebene der zugrundeliegenden erfindungsge- mäßen DNA-Sequenzen, bspw. durch Bindung an die DNA (bspw. den Promotor- bereich) oder durch Bindung an einen der ein erfindungsgemäßes Gen steuern- den Transkriptionsfaktoren, die biologische Funktion beeinflussen. Erfindungsge- mäße Verbindungen werden typischerweise spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein, insbesondere an ein Protein mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß den Figuren 4 oder 6, bzw. an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, ins- besondere an eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß einer der Figuren 3 oder 5, binden und dadurch eine pharmakologische, insbesondere a- nalgetische Wirkung, hervorrufen. Erfindungsgemäße Verbindungen sind vorteil- hafter weise durch das vorstehend definierte Screeningverfahren erhältlich.

Daher werden erfindungsgemäß chemische Verbindungen offenbart, vorzugswei- se eine organisch-chemische Verbindung, mit einem Molekulargewicht von <5000, insbesondere <3000, vor allem <1500, die typischerweise physiologisch gut verträglich ist und vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs-und/oder Zusatzstoffen sein und als Arznei- mittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das organische Mo- lekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungs- gemäßes Protein, insbesondere an die cytosolische Domäne oder an die extrazel- luläre Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins, mindestens 107 mol~1 beträgt.

Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, dass sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra) membranöse Transportproteine, ggf. nach entsprechender Modifikation, bspw. mit einer angekoppelten Aminosäuresequenz. Weiterhin bevorzugt sind jene Verbindungen, die die tnteraktion von erfindungsgemäßen Proteinen der<BR> SMSR-Familie mit Bindungspartnern, insbesondere für die TransouMion eines Schmerzsignals, inhibiert oder verstärkt. Insbesondere besetzen derartige Ver- bindungen Positionen auf der Oberfläche erfindungsgemäßer Proteine oder rufen bei den erfindungsgemäßen Proteinen einen lokalen Konformationswechsel her- vor, so dass die Bindung eines nativen Bindungspartners an ein erfindungsgemä- ßes Protein verhindert wird.

Über Strukturanalysen eines erfindungsgemäßen Proteins lassen sich gezielt er- findungsgemäße Verbindungen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität auf- weisen (Rationales Drug Design (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg)). Hier wird die Struktur oder eine Teilstruktur, Deri- vat, Allel, Isoform oder ein Teil einer solchen von einem der erfindungsgemäßen Proteine, insbesondere von einem der Proteinen mit den Sequenzen gemäß einer der Figuren 4 und 6, über NMR-oder Röntgenkristallographie-Verfahren (nach entsprechender Kristallisierung, z. B. nach der Methode des"hängenden Trop- fens") ermittelt oder, sofern eine solche hochaufgelöste Struktur nicht vorliegt, mit Hilfe von Strukturvorhersage-Algorithmen ein Strukturmodell eines erfindungsge- mäßen Proteins, bspw. auch mit Hilfe von homologen bereits strukturell aufgeklär- ten Proteinen (z. B. von Rhodopsin), erstellt, und diese (s) benutzt, um mit Unter- stützung von Molecular Modelling Programmen Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten wirken können, zu identifizieren, für die sich eine hohe Affinität zum erfindungsgemäßen Protein vorhersagen läßt. Ggf. Lassen sich die oben bezeichneten Verfahren zur Strulduraufklärung auch miteinander kombinieren.

Geeignete Kraftfelder werden zur Simulation der Affinität einer potentiell affinen Verbindung an eine interessante Substrukur eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw. das aktive Zentrum, eine Bindungstasche oder eine"hinge"-Region, einge- setzt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und in geeigneten Testverfah- ren auf ihr Bindungsvermögen und ihre therapeutische Nutzbarkeit getestet. Der- artige in silico Verfahren zur Identifizierung potentieller Wirkstoffe, die ihre Wir- kung durch Bindung an erfindungsgemäße SNSR-Proteine entfalten, sind gleich- falls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen ein erfin- dungsgemäßes Protein der SNSR-Familie, bspw. SNSR-L2 oder SNSR-L3, ge- richteter Antikörper oder auch gegen die zugrundeliegenden mRNA gerichteter Antikörper, der ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch gentherapeuti- sche in vivo Verfahren in Wirtszellen eingeschleust wird und dort als"Intrabody" nicht sekretiert wird, sondern intrazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige erfindungsgemäße"Intrabodies"können die Zellen vor einer fehlgeleite- ten Schmerzreaktion, bspw. durch Überexpression eines erfindungsgemäßen Proteins, geschützt werden. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pathophysio- logisch verändertes Schmerzweiterleitungsverhalten zeigen, also insbesondere dorsale Spinalganglien und trigeminale Ganglien. Neben den Antikörpern oder Intrabodies sind auch derartig mit erfindungsgemäßen"Intrabodies"gentherapeu- tisch modifizierte Zellen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Eine erfindungsgemäße Verbindung mit der Funktion der Blockade, ggf. aber auch Aktivierung der biologischen Funktion von nativem erfindungsgemäßem SNSR-Protein, bspw. von Sequenzen gemäß den Figuren 4 und 6, oder entspre- chender nativer Allele oder nativer Spleißvarianten, bspw. der schmerzreievanten <BR> <BR> <BR> <BR> Funktion, kann ais Arzneimittel Verwendung finden. Hierbei sind ais Verbindun- gen alle vorgenannten Varianten eingeschlossen, also bspw. organisch- chemische Verbindungen, Antikörper, Anti-sense-Oligonukleotide, (Hammer- head-) Ribozyme, siRNA. Insbesondere ist eine erfindungsgemäße Verbindung (zur Herstellung eines Arzneimittels) zur Behandlung von Schmerzen, insbeson- dere solche chronischer Natur, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer Inhi- bitor (bspw. ein inhibitorisch wirkender Antikörper (insbesondere ein Intrabody), ein (Hammerhead-) Ribozym, Anti-sense RNA, insbesondere siRNA, dominant- negative Mutanten oder eine der vorgenannten ggf. inhibitorischen organisch- chemischen Verbindungen, vorzugsweise eine hochaffine Verbindung, bspw. er- hältlich aus einem der vorgenannten Verfahren) der ze) ! uiären Funktion eines er- findungsgemäßen nativen Proteins, insbesondere eines Proteins mit den Se- quenzen gemäß der Figuren 4 und 6, oder seiner nativen Varianten, also bspw. der chronischen Schmerzreaktion, als Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung von chronischen Schmerzen verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine erfindungsgemäße Antisense- Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein, einen erfindungsge- mäßen Vektor, einen erfindungsgemäßen Antikörper, eine erfindungsgemäße Wirtszelle und/oder eine erfindungsgemäße Verbindung sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs-, Träger-und/oder Zusatzstoffe. Vorzugsweise dient das erfin- dungsgemäße Arzneimittel der Behandlung von Schmerzen, insbesondere sol- cher chronischer Natur, die bspw. neuropathisch und/oder entzündungsbedingt sein können.

Entsprechende Wege zur geeigneten Formulierung und Herstellung derartiger Formulierungen sind bspw. bei"Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das vollinhaltlich Bestandteil der Offenba- rung der vorliegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung kommen als Hilfs-bzw. Zusatzstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösung, Polyal- kylenglykole, hydrierte Naphthalene und insbesondere biokompatibie Lactidpoiy- mere, Lactid/Glykolidcopolymere oder Polyoxyethylen-/Polyoxypropylen- copolymere in Betracht. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzun- gen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Laktose, mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z. B. Polyethylenglykol an erfin- dungsgemäße Nukleinsäuren, Proteine oder Antikörper, Komplexierung mit Metal- lionen oder Einschluß von Materialien in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindungen, wie z. B. Polylaldat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamerare oder multilamelare Vesikel, Erythrozyten-Fragmente oder Spheroblasten, enthalten. Die jeweiligen Ausfüh- rungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzungen werden abhängig vom physikalischen Verhalten, bspw. in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bio- <BR> <BR> <BR> verfügbarkeit oder Abbaubarkeit gewählt. Konirollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponenten schließt die Formulierung auf Ba- sis lipophiler Depots ein (z. B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vor- liegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zusammensetzungen bzw. Arzneimittel, enthaltend die therapeutisch wirksamen Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z. B. Polyoxamere oder Polyoxamine). Weiterhin können erfindungsgemäße therapeutisch wirksame Substanzen oder Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z. B. Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen. Bevorzugte Träger sind typischerweise wässrige Trägermaterialien, wobei Wasser zur Injektion (WFI) oder Wasser, gepuffert mit Phosphat, Zitrat, HEPES oder Acetat usw. verwendet wird und der pH typischerweise auf 5,0 bis 8,0 (vorzugsweise 6,5 bis 7,5) eingestellt wird. Der Träger bzw. das Vehikel wird zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, welche die Lösung bspw. isotonisch machen. Weiterhin kann der Träger bzw. das Vehikel neben den vorstehend genannten Bestandteilen zusätzliche Komponenten, wie humanes Serumalbumin (HSA), Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren usw., enthalten.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von injektions ! ösungen, Tropfen oder Säfte, ats haibfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemä- ßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls vorstehend genannte Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Men- gen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intra- venös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapsel, Granulaten, Tropfen, Säften und Siru- pen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspen- sionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungs- gemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind ge- eignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert frei- setzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Ab- hängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblichweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigs- tens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeig- nete Hilfs-oder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-Inhibitoren, RNAse-Inhibitoren etc.

Besonders bevorzugt ist weiterhin ein Arzneimittel, das die vorstehend aufgeführ- ten bevorzugten Formen oder die besonders ausgewählte Form (en) der Nuklein- säure (n), der Antisense-Nukleinsäure (n), Genprodukte (s), insbesondere der vor- stehenden Peptide oder Proteine, Vektoren, Antikörper, Wirtszellen, und/oder Verbindungen enthält.

Wie bereits vorstehend dargelegt, eignen sich die erfindungsgemäßen Gegens- tände, auch für diagnostische Anwendungen. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Diagnostikum bereit, enthaltend mindestens eine erfindungsgemä- <BR> <BR> <BR> <BR> ße Nuk ! einsäure, eine erfindungsgemäße Antisense-Nukieinsäure, ein erfin- dungsgemäßes Genprodukt, insbesondere ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein, einen erfindungsgemäßen Vektor, Antikörper oder Teile davon und/oder eine erfindungsgemäße Wirtszelle sowie gegebenenfalls geeignete Hilf-und/oder Zusatzstoffe. Dabei versteht man unter Diagnostikum ein Hilfsmittel zur Diagnose beispielsweise eines mit Schmerzen in Zusammenhang stehenden Krankheitsge- schehens.

Besonders bevorzugt ist ein Diagnostikum, das die vorstehend als besonders be- vorzugte Form der Nuk ! einsäuren, Antisense-Nuk ! einsäure (n), Genprodukte, ins- besondere Peptide oder Proteine oder eines Teiles davon, Vektoren, Antikörper und/oder der Wirtszelle enthält.

Besonders bevorzugt ist eine Form des Diagnostikums, das eine Antisense- Nukleinsäure enthält, die eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eine erfindungsgemäße Nukleinsäure zu binden.

Ferner werden erfindungsgemäß diagnostische in vitro Verfahren offenbart, die es erlauben, in einem Organismus, insbesondere beim Menschen, auf molekularer Grundlage der Ursache für auftretende krankhafte Schmerzzustände nachzuge- hen bzw. mit Schmerzen einhergehende Erkrankungen nachzuweisen (vgl. auch die vostehenden Ausführungen zu den verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten erfindungsgemäßer Gegenstände). Für derartige Verwendungszwecke eignen sich insbesondere PCR-Methoden, bspw. RT-PCR-Verfahren, also die Diagnose auf der Basis von mRNA, die in vitro entsprechend in cDNA übersetzt wird und dann mit Hilfe von herkömmlichen PCR-Verfahren vervielfältigt wird. Auch ent- sprechende Array-Techniken, die erfindungsgemäße Oligonukleotide auf einem Chip positionieren, erlauben die Diagnostik mit Hilfe von Hybridisierungsreaktio- nen. Hierbei wird die Patientenprobe gegen einen Array mit erfindungsgemäßen Oligonukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen repräsentieren, getes- tet. Entsprechend gegenüber einem Vergleichsexperiment mit einer Probe eines gesunden Organismus abweichende Signale auf dem Array bei Oligonukleotiden lassen daher eine entsprechende Diagnose zu. Selbstverständlich können derar- tige Diagnosen auf Nukleinsäure-Ebene auch mit klassischen Blot-Verfahren (Northern-und/oder Southern-Blot) durchgeführt werden.

In ähnlicher Weise eignen sich auch Tests mit (erfindungsgemäßen) Antikörpern gegen die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, um eine veränderte Ex- pression der erfindungsgtemäß mit der Schmerzregulation zusammenhängenden Proteine oder Peptide in einem kranken, d. h. mit akuten, vorzugsweise chroni- schen Schmerzen belasteten Organismus, insbesondere einem humanen Patien- ten, gegenüber einem gesunden Verg ! eichsorganismus nachzuweisen. Hierzu stehen einem Fachmann entsprechende Testformate, bspw. Radioimmunoas- says, ELISA-Test$ usw. zur Verfügung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsge- mäßen Gegenstands, bspw. einer Nukleinsäure, einer Antisense-Nukleinsäure, eines Genprodukts, insbesondere einer Peptids oder Proteins, Vektors, Antikör- pers, einer Wirtszelle und/oder einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimit- tels zur Behandlung von Schmerz bzw. als Arzneimittel bzw. zur Anwendung als Arzneimittel zur Behandlung von Schmerz.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung des chronischen, ins- besondere des neuropathisch oder entzündungsbedingten Schmerzes.

Die Figuren zeigen : Fig. 1 zeigt die genomische Organisation der drei SNSR-Gene der Ratte. Der Abstand zwischen dem SNSR-L3-und dem SNSR-L2-Gen beträgt etwa 100 kB, während der Abstand zwischen dem SNSR-L2-Gen und dem SNSR-Gen etwa 48 kB beträgt. Die Orientierung ist für jedes Gen mit einem Pfeil angegeben.

Fig. 2 zeigt die genomische Sequenz des SNSR-Genclusters der Ratte. Das SNSR-Gen umfasst die Positionen 179475 bis 180485 (bzw. 180488 einschließlich Stop-Codon). Das SNSR-L2-Gen umfasste die Positio- nen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop-Codon). Das SNSR-L3-Gen ist invers orientiert und umfasst die Positionen 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop-Codon).

Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz des SNSR-L2-Gens der Ratte (Nukleotide 250 bis 1317 (bzw. 1320 einschiießiich Stop-Codon)).

Fig. 4 zeigt die Aminosäuresequenz des Rezeptors SNSR-L2 der Ratte.

Fig. 5 zeigt die Nukleotidsequenz des SNSR-L3-Gens der Ratte (Nukleotide 1 bis 912 (bzw. 915 einschließlich Stop-Codon)).

Fig. 6 zeigt die Aminosäuresequenz des Rezeptors SNSR-L3 der Ratte.

Fig. 7 zeigt ein Dendrogramm zur Darstellung der Struktur der SNSR- Genfamilie. Dazu wurde ein Alignment der codierenden Bereiche der cDNA-Sequenzen der fünf humanen (MRGX1, Genbank- Zugriffsnummer AY042213 ; MRGX2, Genbank-Zugriffsnummer AY042214 ; MRGX3, Genbank-Zugriffsnummer AY042215 ; MRGX4, Genbank-Zugriffsnummer AY042216 ; SNSRneuHUMAN, Genbank- Zugriffsnummer AX282380) und der drei Ratten-Gene (SNSR (Ratte), Genbank-Zugriffsnummer AF474986 ; SNSR-L2, vgl. Fig. 3 ; SNSR-L3, vgl. Fig. 5 sowie Genbank-Zugriffsnummer AJ311952) sowie eines be- kanntermaßen außerhalb der SNSR-Familie liegenden Gens (humanes Mas, Genbank-Zugriffsnummer M13150 ;"outgroup") erstellt. Die Se- quenzunterschiede werden in einem phylogenetischen Baum darge- stellt. Es ist eindeutig zu erkennen, dass keine direkte Zuordnung von SNSR-Sequenzen der Ratte und des Menschen möglich ist. Die huma- nen SNSR-Gene sind untereinander enger verwandt als zu jedem der Ratten-Gene. Die Verwandtschaft der Ratten-Gene ist weniger stark ausgeprägt. Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher, ohne sie ein- zuschränken.

Beispiele Beispiel 1: Identifizierung neuer SNSR-Gene im Genom der Ratte <BR> <BR> Ausgehend von genomischen Datenbanken und EST-Daten wurden neue SNSR- Gene der Ratte identifiziert. Dazu wurden genomische Daten der Ratte aus öffent- lich geförderten Genomprojekten, wie sie in der"HTGS"-Sektion der EMBL/GenBank-Datenbank gespeichert sind, mit Hilfe des BLAST-Programms nach Sequenzen mit Ähnlichkeit zu humanen SNSR-Proteinen durchsucht. Die bei der Suche gefundenen Kandidaten wurden dann mit dem"ClustalW"Pro- gramm einem Alignment unterzogen und einer Dendrogramm-Analyse (s. u.) un- terworfen, um festzustellen, ob sie Mitlieder der inneren SNSR-Familie sind.

Die dabei gefundenen Kandidaten lagen alle auf einer zusammenhängenden ge- nomischen Region, die durch die EMBL/GenBank-Klone AC115232 und AC095926 repräsentiert wird. Zusätzlich wurden Suchen in der öffentlichen EST- Datenbank dbEST durchgeführt. Zwei dabei gefundene EST-Sequenzen (Al578247 und BF523870) bestätigten die aus der Genomsequenz abgeleitete SNSR-L2-Sequenz, ohne diese vollständig zu umfassen.

Ähnlich der Situation beim Menschen ist das bisher einzige bekannte SNSR-Gen der Ratte (Genbank-Zugriffsnummer AF474986) intronlos. Erfindungsgemäß wur- de jedoch festgestellt, dass es in einem genomischen Cluster aus mehreren mit- einander verwandten Genen liegt. Anhand einer genomischen Sequenz (Fig. 2), weiche das bekannte SNSR-Gen der Ratte enthält (Positionen 179475 bis 180485 (bzw. 180488 einschließlich Stop-Codon) der Sequenz gemäß Fig. 2), wurden zwei weitere SNSR-Gene (SNSR-L2 und SMSR-L3) identifiziert. Diese umfassen die Positionen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop- Codon) (SNSR-L2) bzw. 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop- Codon) (SNSR-L3, inverse Orientierung) der Sequenz gemäß Fig. 2. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass bislang unbekannte Teile des Rattengenoms weitere Gene der SESR-Famillie nthalten. Allerdings wird dr in Fig. 2 abg@bil- dete SNSR-Cluster mit drei SNSR-Genen von größeren DNA-Abschnitten flan- kiert, die keine SNSR-Sequenzen enthalten. Dies deutet darauf hin, dass die vor- liegend beschriebenen drei SNSR-Gene den kompletten Satz dieser Genfamilie in der Ratte darstellen. Das neu identifizierte SNSR-L2-Gen liegt dem bekannten SNSR-Gen benachbart. Das dritte SNSR-Gen der Ratte (SNSR-L3) befindet sich etwa 100 kB stromaufwärts vom SNSR-L2-Gen. Sowohl SNSR-L2 als SNSR-L3 gehören eindeutig zur SNSR-Familie.

Die genomische Organisation der SNSR-Gene der Ratte ist in der Fig. 1 schema- tisch dargestellt. Fig. 2 zeigt die Sequenz des SNSR-Clusters der Ratte. Fig. 3 zeigt die cDNA-Sequenz des neu identifizierten Rezeptors SNRS-L2 und Fig. 4 die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Fig. 5 zeigt die cDNA-Sequenz des weiteren identifizierten Rezeptors SNRS-L3 und Fig. 6 die davon abgeleitete Ami- nosäuresequenz.

Beispiel 2 Struktur der SNSR-Genfamilie In einer weiteren Analyse wurden die Verwandtschaftsverhältnisse der fünf hu- manen und der drei Ratten-Gene der SNSR-Familie aufgeklärt. Hierzu wurde ein Alignment der acht SNSR-Sequenzen und zusätzlich eines bekanntermaßen au- ßerhalb der SNRS-Familie befindlichen Gens (human Mas) als"Outgroup"mit Hilfe des Programms"ClustalW"erstellt. Das Ergebnis ist als Dendrogramm in Fig. 7 dargestellt.

Auf Aminosäure-Ebene wurden zwischen den neuen Ratten-Sequenzen SNSR- L2 und-L3 zu den humanen Mitgliedern der SNSR-Familie und dem bekannten SNSR der Ratte folgende paarweise Identitäten festgestellt : SNSR-L2 SNSR-L3 SNSR-Ratte 47,0% 47,6% MRGX1-human48, 7% 51, 9% MRGX2- human 51,1% 53,8% MRGX3- human 45,4% 51,8% MRGX4- human 48,3% 50,8% SNSRneu-human44, 1% 46, 6% Beispiel 3 : Beispiel für ein Arzneimittel enthaltend einen erfindungsgemäs- sen Wirkstoff-Tablettenformulierung Tabletten können durch direktes Verpressen von Mischungen des erfindungsge- mäßen Wirkstoffes mit entprechenden Hilfsstoffen oder durch Verpressen von wirkstoffhaltigen Granulaten (mit gegebenenfalls weiteren Hilfsstoffen) hergestellt werden. Die Granulate können dabei entweder durch Feuchtgranulation mit z. B. wäßrigen Granulierflüssigkeiten und anschließender Trocknung dieser Granulate oder durch Trockengranulation z. B. über Kompaktierung hergestellt werden.

Direktverpressung z. B. pro Tablette : 25 mg erfindungsgemäßer Wirkstoff 271 mg LudipressTM (Granulat zur Direkttablettie- rung aus Lactose monohydrat, Povidon K30 und Crospovidon) 4 mg Magnesiumstearat 300 mg Gesamt Homogene Mischung des Wirkstoffes mit den Hilfsstoffen herstellen und diese auf einer Tabieftenpresse zu Tabletten mit einem 0 von 10 mm verpressen.

Trockengranulation z. B. pro Tablette : 25 mg erfindungsgemäßer Wirkstoff 166 mg mg Microcristalline Cellulose 80 mg Niedrig substituierte Hydroxypropylcellu- lose (I-HPC LH 11) 5 mg Hochdisperses Siliziumdioxid 4 mg Magnesiumstearat 280 mg Gesamt Homogene Mischung des Wirkstoffes mit der Mikrokristallinen Cellulose und der I HPC herstellen und diese Kompaktieren. Nach dem Sieben der Komprimate wird das entstandene Granulat mit Magnesiumstearat und Siliziumdioxid gemischt und auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem 0 von 9 mm verpreßt.

Feuchtgranulation z. B. pro Tablette : 25 mg erfindungsgemäßer Wirkstoff 205 mg Mikrokristalline Cellulose 6 mg Povidon K30 10 mg Crospovidon 4 mg Magnesiumstearat 250 mg Gesamt Homogene Mischung des Wirkstoffes mit der Mikrokristallinen Cellulose und dem Crospovidon herstellen und diese in einem Granulator mit einer wässerigen Lö- sung des Povidons granulieren. Das feuchte Granulat wird anschließend nach- granuliert und nach der Trocknung im Trockenschrank (50°C) 10 h getrocknet.

Das trockene Granulat wird mit dem Magnesiumstearat zusammen gesiebt, end- <BR> <BR> <BR> <BR> gemischt und auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem # von 8 mrn ver- presst.

Beispiel 4 : Beispiel für ein Arzneimittel enthaltend einen erfindungsgema- ßen Wirkstoff - parenterale Lösung 1 g eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes wird in 1 I Wasser für Injektionszwecke bei Raumtemperatur gelöst und anschließend durch Zugabe von NaCl (Natrium- chlorid) auf isotone Bedingungen eingestellt.

Litsrahr Corderre et al. (1993) Pain 52 : 259-285 Dickenson (195) Pain Rev. 2 : 1-12 Dong et al. (2001) Cell 106 : 619-632 Lembo et al. (2002) Nature Neurosci. 5 : 201-209 Simonin & Kieffer (2002) Nature Neurosci. 5 : 185-186 Tölle (1997) Chronischer Schmerz. In : Herdegen et al. (Hrsg. ) Klinische Neurobio- logie, S. 307-336, Spektrum Verlag, Heidelberg Zimmermann & Herdegen (1996) Progr. Brain Res. 110 : 233-259