以下、本発明を実施例を挙げて具体的に� ��明するが、本発明は以下の実施例に限定さ� ��るものではない。なお、以下の実施例にお� ��て特に断りのない限り、以下に示す材料及� ��方法を用いた。

(マウス)
 C57BL/6及びBALB/cマウスは、SLC、ジャパンより 購入し、各種週令マウスを準備した。CB-17 SC IDマウスは、Cleaジャパンより購入した。
(ヒト単核球画分の調製)
 ヒト単核球画分は健常人ボランティアから� ��取した末梢血をFicoll-Paque Plus(アマーシャム バイオサイエンス)で遠心分離しPBSにて十分� �洗浄することにより回収した。
(抗体)
 全ての抗体は、商業的に入手した。
(フローサイトメトリー)
 分析用途にはFACSキャリバーフローサイトメ ーター(BDバイオサイエンス)を用い、セルソ� �ティング用途にはFACSヴァンテージセルソー� ��ー(BDバイオサイエンス)を用いた。
(磁性ビーズによる細胞精製)
 CD8陽性細胞は、磁性マイクロビーズに結合� ��せた抗CD8抗体及びカラム(ミルテニイバイオ テック)を用いてそのプロトコールに従い分� �した。
(細胞培養)
 マウス及びヒト由来のそれぞれの細胞につ� ��、2×10 ⁵ 個の細胞を96ウェルプレート上の平坦な底部� ��有する1ウェル内で、10ng/.mlのIL2を含有する2 00μlの完全培地(RPMI1640+10%FCS及び50μM 2-ME)中で 培養した。
(ELISA)
 マウス細胞の培養上清中のIL10濃度について は、マウスIL10用のELISAキット(R&Dシステム� ��)を用いた。ヒト細胞の培養上清中のIL10濃� �については、SRLに依頼した。
(DNAマイクロアレイ)
 それぞれ1×10 ⁶ 個のCD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T 細胞は、C57BL/6マウスの脾臓細胞からEFACSヴァ ンテージセルソーターを用いて回収した。mRN Aを回収した細胞から抽出し、DNAマイクロア� �イ解析は北海道システムサイエンスに依頼� �た。

(マウスにおけるCD8陽性CXCR3陽性細胞とCD8陽性 CD122陽性細胞の発現の比較解析)
 マウスにおけるCD8陽性CXCR3陽性T細胞とCD8陽� ��CD122陽性T細胞との発現プロファイルを比較� ��るために、まず、DNAマイクロアレイを実施� ��た。セルソーティングによりC57BL/6マウスの 脾臓からCD8陽性CD122陽性T細胞及びCD8陽性CD122� ��性T細胞のそれぞれをおおよそ100万個程度採 取し、これらの細胞集団から抽出したmRNAに� �きDNAマイクロアレイ解析を行った。

 マイクロアレイの結果、10個以上の遺伝� �がCD8陽性CD122陰性T細胞におけるよりもCD8陽� �CD122陽性T細胞において2倍以上の発現レベル� ��示した。なかでも、CXCR3遺伝子がCD8陽性CD122 陰性T細胞よりもCD8陽性CD122陽性T細胞におい� �10倍以上発現していることがわかった。

 次いで、マウス抗CXCR3抗体を用いてマウ� �の脾臓におけるCXCR3(CD183)遺伝子の発現レベ� �をフローサイトメトリーで分析した。具体� �には、脾臓細胞を異なる週令のC57BL/6マウス� ��ら採取し、抗CD8抗体及び抗CXCR3抗体で染色� �、その後、フローサイトメトリーにより分� �した。結果を図1A及び図1Bに示す。

 図1A及び図1Bに示すように、CD8陽性T細胞� �うちの一部がCXCR3を発現していることがわか った。また、CXCR3陽性T細胞の割合は、マウス の個体年齢に依存する傾向があることがわか った。すなわち、新生仔マウスはほとんどCD8 陽性細胞を有していなかったが、1週令マウ� �あたりからCD8陽性細胞が現れはじめた。幼� �マウスでは、高い割合でCXCR3陽性細胞を含ん でいたが、同様の現象は、CD122陽性細胞にも� ��察されていた。また、マウスの週令によるC XCR3陽性細胞の割合の変動を解析してみると� �CD122陽性細胞におけるのと類似のパターン示 すこともわかった。

 同時に、CD8陽性細胞群におけるCXCR3及びCD 122の発現を解析した。具体的には、4週令マ� �スについて、CD8陽性細胞にゲートされた細� �についてCD122及びCXCR3の発現プロファイル及� ��CD4陽性細胞にゲートされた細胞についてCD25 及びCXCR3の発現プロファイルをフローサイト� ��トリーにより分析した。結果を図1Cに示す� �

 図1Cに示すように、CD122及びCXCR3の双方を� ��現する明瞭な細胞集団があることがわかっ� ��。また、図1Cに示すように、CD25及びCXCR3の� �方を発現する細胞集団を見出すことはでき� �かった。以上の結果から、マウスのCD8陽性� �胞集団において、CD122及びCXCR3の発現には強� ��相関関係があることがわかった。一方、マ� ��スのCD4陽性細胞において、CD25及びCXCR3の発� ��にはなんら相関関係がないことがわかった� ��

 また、CD8陽性細胞をCD44及びCD62L(CD44弱陰� �CD62L強陽性、CD44強陽性CD62L弱陽性、CD44強陽� �CD62L強陽性)の発現状態に基づき3つの細胞集� ��に分けて、これらの各集団のCD122及びCXCR3の 発現プロファイルを確認した。具体的には、 抗CD8抗体でコートしたマグネティックビーズ を用いて6週令マウスから回収したCD8陽性細� �を抗CD44抗体、抗CD62L抗体及び抗CD122抗体並び に抗CXCR3抗体で染色した。これらの細胞をフ� ��ーサイトメトリーで分析して、CD44及びCD62L� ��発現パターンで決定される3つの細胞集団(#1 :CD44弱陽性CD62L強陽性、#2:CD44強陽性CD62L強陽� �、#3:CD44強陽性CD62L弱陽性)におけるCD122及びCX CR3の発現プロファイルを確認した。結果を図 1Dに示す。

 図1Dに示すように、CD8陽性CD122陽性T細胞� �団(CD44強陽性CD62L強陽性T細胞集団)は、CD122及 びCXCR3の双方を発現する細胞を高率で含み、� ��イーブT細胞集団(CD44陰性CD62L強陽性T細胞集� ��)がCD8陽性CXCR3陰性T細胞であることがわかっ た。さらに、エフェクターメモリー細胞集団 (CD44強陽性CD62L弱陽性T細胞集団)は、CXCR3又はC D122を発現する細胞を含むものの、CD44強陽性C D62L強陽性T細胞集団と比べて明確なCD8陽性CXCR 3陽性T細胞集団を示すものではなかった。

(マウスCD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御性T細胞と� ��てin vivoにおける機能解析)
 本実施例では、リンパ球欠損重症複合型免� ��不全(SCID)マウスにCD8陽性CXCR3陽性T細胞を伴� ��て又は伴わずにCD8陽性CXCR3陰性T細胞の移植� ��験を行った。最初に、CD8陽性CXCR3陽性T細胞� ��びCD8陽性CXCR3陰性T細胞をBALB/cマウスから抗C D8抗体マグネティックビーズ及びセルソータ� ��を用いて回収した。ビーズ処理後であって� ��ルソーティング前のフローサイトメトリー� ��びセルソーティング後のフローサイトメト� ��ーによる分析結果を図2Aに示す。

 図2Aに示すように、実験に用いた細胞は� �BALB/cマウスからセルソーティングにより採� �し、純度が確認された。こうして調製され� �CD8陽性CXCR3陰性T細胞をCD8陽性CD122陽性T細胞� �混合した状態又は混合しない状態で、CB-17 S CIDマウスに移植した。

 なお、リンパ球欠損SCIDマウス又はRAG ^-/- マウス(データ示さず)にCD8陽性CXCR3陰性T細胞� ��移植する場合には、このT細胞を受容したマ ウスは、CD69陽性活性化CD8陽性T細胞及び脾臓� ��おける顆粒球の増加を伴って不健康になり� ��最終的には赤血球生成が抑制される顆粒球� ��位の造血傾向を示すようになる。このよう� ��造血傾向は、CD8陽性CD122陽性制御性T細胞の� ��足の良好なマーカーになりうる。以上のこ� ��から、本実施例では、CD8陽性CXCR3陰性T細胞� ��CD69発現と脾臓における顆粒球の増大を指標 としてT細胞の活性化を測定することとした� �

 具体的には、3×10 ⁵ 個のCD8陽性CXCR3陰性T細胞のみ、又は10 ⁵ 個のCD8陽性CXCR3陽性T細胞及び3×10 ⁵ 個のCD8陽性CXCR3陰性T細胞との混合物を静脈経 由でCB-17 SCIDマウスに移植した。10週間経過� �、脾臓細胞をフローサイトメーターにより� �析した。結果を図2B~図2Dに示す。

 図2Bに示すように、CD8陽性CXCR3陰性T細胞� �みを受容したSCIDマウスは、CD69陽性活性化CD8 陽性T細胞の増加が認められたが、CD8陽性CD122 陰性T細胞とCD8陽性CD122陽性T細胞とを受容し� �マウスでは、このような活性化されたT細胞� ��増加は認められなかった。図2Cに示すよう� �、CD8陽性CXCR3陰性T細胞のみを受容したマウ� �の脾臓におけるGr-I陽性顆粒球の増加は、双� ��のT細胞を受容したマウスにおいては観察さ れなかった。さらに、図2Dに示すように、CD8� ��性CXCR3陰性T細胞のみを受容したマウスの骨� ��においては顆粒球優位でありかつ赤血球生� ��が抑制された造血状態が認められたが、双� ��のT細胞を受容したマウスの骨髄においては こうした状態は改善されていた。

 以上の結果から、マウスにおいてはCD122� �加えてCXCR3もCD8陽性制御性T細胞のマーカー� �して利用できることがわかった。

(マウスCD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御性T細胞と� ��てのin vitroでの機能解析)
 本実施例では、試験管内におけるマウスのC D8陽性CXCR3陽性T細胞の制御性T細胞の作用を調 べた。マウスの脾臓細胞をセルソーティング にかけて、CD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXC R3陰性T細胞をそれぞれ回収した。

 それぞれの細胞を、抗マウスCD3抗体+抗マ ウスCD28抗体コーティングビーズ(Dynabeads Mouse CD3/CD28 T Cell Expander)で刺激して培養した。� �体的には、CD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CX CR3陰性T細胞をC57BL/6マウスからセルソーティ� ��グにより回収し、それぞれ抗マウスCD3抗体� ��び抗マウスCD28抗体でコーティングしたマイ クロビーズによる刺激下で培養した。48時間� ��過後、まずCD8抗体で染色し、その後、Cytofix /Cytopem(BDバイオサイエンス)を用いて細胞内IL1 0を検出した。また、同様にして培養して得� �れた各培養上清のIL10濃度をELISAにより測定� �た。これらの細胞についてのフローサイト� �トリーの結果を図3A及び図3Bに示す。また、E LISAによるIL10の測定結果を図3Cに示す。

 図3A及び図3Bに示すように、CD8陽性CXCR3陰� ��T細胞に比べてより多くのCD8陽性CXCR3陽性T細 胞がIL10を産生するようになった。IL10は、CD8� ��性CD122陽性制御性T細胞によって産生される� ��も重要な作用伝達因子である。図3Cに示す� �うに、培養上清についてのELISAにおいても、 同様の現象が確認された。

 また、先と同様の抗体コーティングビー� ��を用いて刺激したCD8陽性CXCR3陰性T細胞培養� ��おけるIFN-γ量を測定した。具体的には、セ� ��ソーティングによりC57BL/6マウスから採取し たCD8陽性CXCR3陰性T細胞をまずCFSEによりラベ� �し、その後、単独又はCD8陽性CXCR3陽性T細胞� �共に培養した。抗CD3抗体及び抗CD28抗体をコ� ��トしたマイクロビーズによる刺激下で48時� �培養した後、CFSE細胞(CD8陽性CXCR3陰性T細胞)� �IFN-γの産生活性をフローサイトメトリーに� �り調べた。結果を図3D及び図3Eに示す。また� ��上記と同様にして細胞培養を行い、CFSE蛍光 の減少によって細胞増殖を評価した。結果を 図3Fに示す。

 図3Dに示すように、CD8陽性CXCR3陽性T細胞� �伴わないCD8陽性CXCR3陰性T細胞は、IFN-γを産� �した。一方、図3Eに示すように、このような IFN-γ産生は、CD8陽性CXCR3陰性T細胞がCD8陽性CXC R3陽性T細胞とともに培養されたときには明ら かに抑制され、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御活 性を呈していた。また、図3Fに示すように、C FSE蛍光の減少によって計測されたCD8陽性CXCR3� ��性T細胞の増殖状態からは、単独培養時に比 較して、CD8陽性CXCR3陽性T細胞と共培養したと き、CD8陽性CXCR3陰性T細胞の増殖が抑制されて いることがわかった。すなわち、CD8陽性CXCR3� ��性T細胞がCD8陽性CXCR3陰性T細胞に対して増殖 抑制能を有していることがわかった。

 以上の結果から、CD8陽性CXCR3陽性T細胞及� ��CD8陽性CXCR3陰性T細胞の関係は、CD8陽性CD122� �性T細胞及びCD8陽性CD122陰性T細胞の関係に極� ��て類似していることがわかった。

(ヒトCD8陽性CXCR3陽性T細胞の発現解析)
 Ficoll重層遠心分離によってヒト末梢血から� ��核球を分離し、抗ヒトCD8抗体、抗ヒトCXCR3� �体及び抗ヒトCD122抗体で染色し、フローサイ トメトリーにより分析した。結果を図4A及び� ��4Bに示す。

 図4Aに示すように、ヒト末梢血から採取し� �リンパ球には、明確にCD8陽性CD122陽性T細胞� �確認できなかったが、Low-intermediate レベル� �CD8陽性T細胞(CD8 ^dim )中にCD122陽性細胞を見出した。しかしながら 、これらのCD8 ^dim CD122陽性細胞のほとんどがCD3陰性NK様細胞で� �った(データ示さず)。これに対して、図4A及� ��図4Bに示すように、CD8強陽性細胞集団中に� �らかにCXCR3陽性細胞が観察された。すなわち 、CXCR3の発現プロファイルは、ヒト末梢血リ� ��パ球におけるCD122発現プロファイルとは異� �っていた。また、マウスCD8陽性細胞集団に� �けるCD122及びCXCR3の発現に関しては正の相関� ��係が認められた(実施例1、図1C)のに対し、� �トCD8強陽性細胞集団におけるCD122及びCXCR3の� ��現には何ら相関関係は見出されなかった(図 4B)。

 さらに、CD8陽性CXCR3陽性T細胞がセントラ� ��メモリー細胞やエフェクターメモリ細胞と� ��連があるかとうかを調べるために、ヒト細� ��を抗CD45RA抗体及び抗CCR7抗体で染色し、フロ ーサイトメトリーを行った。結果を図4Cに示� ��。

 図4Cに示すように、CD8陽性CXCR3陽性T細胞� �CD8陽性CXCR3陰性T細胞よりは多くのCD45RA陰性� �モリー細胞を含んでいるものの、CD8陽性CXCR3 陽性T細胞とセントラルメモリー細胞(CD45RA陰� ��CCR7陽性)やエフェクターメモリー細胞(CD45RA� ��性CCR7陰性)とは明らかな相関関係は認めら� �かった。

 全てのCD8陽性細胞集団におけるCXCR3陽性� �胞の比率を、異なる年齢の健常人ボランテ� �アから採取した末梢血リンパ球(単核球)につ いて、CD8及びCXCR3の発現プロファイルをフロ� ��サイトメトリーにより分析した。結果を図4 Dに示す。また、ヒト末梢血リンパ球につい� �の、CD4及びCD25の発現プロファイルをフロー� ��イトメトリーにより分析するとともに、CD4� ��性にゲートされた細胞集団についてのCD25及 びCXCR3の発現プロファイルをフローサイトメ� ��リーで分析した。結果を図4Eに示す。

 図4Dに示すように、相対的に多くのCD8陽� �CXCR3陽性T細胞が若年層と老年層に存在する� �向がある程度示唆された。しかしながら、� �CD8陽性細胞におけるCD8陽性CXCR3陽性T細胞の� �率の変化は、マウス(実施例1、図1A及び図1B)� ��おけるほど明確に観察されなかった。また� ��図4Eに示すように、ヒトにおいては、マウ� �と同様、CD4陽性細胞集団においてCD25及びCXCR 3の相関関係は認められなかった。

(ヒトCD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御性T細胞とし� ��のin vitroでの機能解析)
 実施例3においては、CD8陽性CXCR3陽性T細胞は 、マウスにおいて制御性T細胞として機能し� �。本実施例では、CD8陽性CXCR3陽性T細胞がヒ� �においても制御性T細胞として機能するかど� ��かを確認した。

 まず、ヒト末梢血単核球画分を分離し、� ��ルソーティングにかけて、CD8陽性CXCR3陽性T� ��胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞をそれぞれ回収� ��た。結果を図5Aに示す。次に、抗ヒトCD3+抗� ��トCD28抗体コーティングビーズ(Dynabeads MouseC D3/CD28 T Cell Expander)の刺激下で、CD8陽性CXCR3� ��性T細胞とCD8陽性CXCR3陰性T細胞とをそれぞれ 別々に培養し、培養上清のIL10濃度をELISAで測 定した。また、培養細胞をまず抗CD8抗体で染 色し、その後、細胞内IL10をCytofix/Cytopemを用� �て染色し、これらの細胞をフローサイトメ� �リーで分析した。これらの結果を図5B並びに 図5C及び図5Dに示す。図5B~図5Dに示すように、 CD8陽性CXCR3陽性T細胞はCD8陽性CXCR3陽性T細胞に 比較してより多くのIL10を産生していること� �わかった。

 また、CD8陽性CXCR3陰性T細胞の単独培養及� ��CD8陽性CXCR3陽性T細胞との共培養につき、CFSE 標識細胞(CD8陽性CXCR3陰性T細胞)のIFN-γ産生活� ��を調べた。具体的には、セルソーティング� ��よりヒト末梢血から採取したCD8陽性CXCR3陰� �T細胞をまずCFSEによりラベルし、その後、単 独又はCD8陽性CXCR3陽性T細胞と共に培養した。 抗CD3抗体及び抗CD28抗体をコートしたマイク� �ビーズによる刺激下で96時間培養した後、抗 CD8抗体による染色及び抗ヒトIFN-γ抗体による 細胞内染色を行い、IFN-γ産生活性をフローサ イトメトリーにより評価した。結果を図5E及� ��図5Fに示す。

 図5E及び図5Fに示すように、CD8陽性CXCR3陰� ��T細胞のみを培養したときにはIFN-γを産生し たが、CD8陽性CXCR3陽性T細胞と共培養したとき には、明らかにより少量のIFN-γしか産生しな かった。

 さらに、CFSE蛍光の減少に基づく細胞増殖 についても調べた。結果は、図5Gに示すよう� ��、単独培養時に比較して、CD8陽性CXCR3陽性T� ��胞と共培養したとき、CD8陽性CXCR3陰性T細胞� ��増殖が抑制されていた。すなわち、CD8陽性C XCR3陽性T細胞は、CD8陽性CXCR3陰性T細胞の増殖� ��抑制する能力があることがわかった。

 以上の結果から、ヒトのin vitro実験系に� ��いて、CD8陽性CXCR3陽性T細胞は制御性T細胞と して機能することがわかった。また、ヒトCD8 陽性T細胞では発現されないCD122に代わり、CXC R3は、ヒト制御性T細胞のマーカーとして利用 できることがわかった。既に、実施例2及び3� ��おいて示したように、マウス実験系におい� ��、CD8陽性CXCR3陽性T細胞がCD8陽性CD122陽性制� �性T細胞として実質的に等しいことを示した� ��、ヒトCD8陽性CXCR3陽性T細胞がマウスCD8陽性C D122陽性制御性T細胞のヒトにおける対応細胞� ��あることがわかった。

(ヒト多発性硬化症(MS)モデルマウス(EAEマウス )に対するCD8陽性CD122陽性細胞投与の効果)
 ヒトMSの動物モデルとしてマウスEAE(実験的� ��己免疫性脳脊髄炎)がある。本実施例では、 以下のプロトコールに従い、EAEマウスに対し てCD8陽性CD122陽性T細胞を投与してその症状の 改善について評価した。

(プロトコール)
(1)抗マウスCD122抗体(クローンTM-b1)は、ハイブ リドーマ細胞をヌードマウスの腹腔に植え付 けて増殖させた後に、腹水を回収し、硫安沈 殿をして精製したものを使用した。マウス1� �あたり25mgの抗体を尾静脈より注射した。
(2)EAEの誘導には、メスのB6マウスを使用し、2 00mgのMOG _35-55 ペプチドを4mg/mlの結核菌死菌を含んだ完全フ ロイントアジュバントとよく混合し、エマル ジョン化したものを尾の付け根の皮内に注射 (この時をday0とする)し、同日と2日後の2回に� ��たりPertussis Toxin 200ngを腹腔内に注射する� �とで行った。
(3)EAE症状の評価は、スコア0:症状なし、スコ� ��1:尾または片側の後肢の脱力、スコア2:尾と 後肢の脱力、スコア3:後肢の不完全麻痺、ス� ��ア4:後肢の完全麻痺、スコア5:マウス死亡、 として行った。
(4)CD8 ⁺ CD122 ⁺ 細胞もしくはCD8 ⁺ CD122 ^- 細胞の移入には、マウス脾細胞からCD8 ⁺ 細胞を抗CD8抗体の結合した磁気ビーズ(ミル� �ニー社製)を用いて分離回収し、さらにそれ� ��蛍光標識抗CD8抗体と蛍光標識抗CD122抗体で� �色したものをセルソーター(BD社製FACSVantage S E)を用いて99%以上の純度で回収し、その細胞� ��マウスの尾静脈から注射した。プロトコー� ��の概要とB6マウスにMOGペプチドを免疫してEA Eを誘導し、症状をスコア化して追跡した結� �を図6に示す。

 図6に示すように、抗CD122抗体を注射してCD8 ⁺ CD122 ⁺ 細胞を除去したマウスにEAEを導入すると、ピ ークに達した症状が回復せずに重症のまま経 過した。これに対して、こうしたマウスに、 他の同系マウスから採取したCD8 ⁺ CD122 ⁺ 制御性T細胞を移入すると速やかな症状の快� �が認められた。CD8 ⁺ CD122 ^- 制御性T細胞を移入しても症状は回復しなか� �た。以上のことから、CD8 ⁺ CD122 ⁺ 制御性T細胞がEAEの症状快復に必須の役割を� �ていることがわかった。CD8 ⁺ CD122 ⁺ 制御性T細胞は、ヒトのCD8 ⁺ CXCR3 ⁺ 制御性T細胞に相当することから、CD8 ⁺ CXCR3 ⁺ 制御性T細胞は、ヒトのMSの予防又は治療に用 いることができることがわかった。

(炎症性腸疾患モデルマウスへに対するCD8陽� �CD122陽性T細胞投与の効果)
 潰瘍性大腸炎とクローン病を総称して炎症� ��腸疾患(IBD)というが、これらも免疫応答が� �わった自己免疫性疾患の一つである。IBDモ� �ルマウスにもいくつかの種類があるが、よ� �使われるものとしてリンパ球を欠損するRAG� �ックアウトマウスにCD4 ⁺ CD45RB ⁺ 細胞を養子移入するという系がある。本実施 例では、RAGノックアウトマウスに対してCD8 ⁺ CD122 ⁺ 制御性T細胞を投与したときのIBDの症状の変� �を観察した。なお、IBDの症状が体重変化に� �実に反映されることは、これまでの多くの� �文によって証明されている。

(プロトコール)
(1)リンパ球を持たないRAGノックアウトマウス (遺伝的背景はB6)に各種の細胞を移入した後� �マウスの体重を暫時計測し、細胞移入前の� �重に対する増減を百分率で記録した。
(2)CD4 ⁺ CD45RB ⁺ 細胞、CD4 ⁺ CD45RB ^- 細胞、CD8 ⁺ CD122 ⁺ 細胞、CD8 ⁺ CD122 ^- 細胞はすべてB6マウスの脾細胞から調製した� ��
(3)第一段階として、抗CD4もしくは抗CD8抗体を 結合させた磁気ビーズ(ミルテニー社製)によ� ��てCD4 ⁺ 細胞もしくはCD8 ⁺ 細胞を分離回収し、その後蛍光標識した抗CD4 、抗CD45RB、抗CD8、抗CD122抗体で染色して、目� ��の細胞をセルソーター(BD社製FACSVantage SE)を 用いて高純度で分離回収した。
(4)CD4 ⁺ CD45RB ⁺ 細胞はいずれの組み合わせの細胞移入におい ても4x10 ⁵ 個を用い、そこにCD8 ⁺ CD122 ⁺ 細胞、CD8 ⁺ CD122 ^- 細胞、CD4 ⁺ CD45RB ^- 細胞はそれぞれ2x10 ⁵ 個を加える形で混ぜ合わせて経静脈的に移入 した。
結果を図7に示す。

 RAGノックアウトマウスに見られるIBDは、移� ��したCD4 ⁺ CD45RB ⁺ 細胞がCD4 ⁺ の制御性T細胞(CD4 ⁺ CD25 ⁺ 細胞)を含まないために起こってくるもので� �る。CD4 ⁺ CD45RB ^- 細胞(CD4 ⁺ CD25 ⁺ 制御性T細胞を含む)を同時に移入すれば症状( 下痢、血便、体重減少)は起こってこない。� �た、CD4 ⁺ CD45RB ^- 細胞の代わりに正常マウスから採取したCD8 ⁺ CD122 ⁺ 制御性T細胞をCD4 ⁺ CD45RB ⁺ 細胞と同時に移入してもIBD症状は起こってこ なかった。この実験結果は、CD8 ⁺ CD122 ⁺ 制御性T細胞がIBDの発症抑制に効果的に働く� �とを示しており、CD8 ⁺ CD122 ⁺ 制御性T細胞(ヒトではCD8 ⁺ CXCR3 ⁺ 制御性T細胞)がIBDの予防/治療に使えることが わかった。

(CD8 ⁺ CD122 ⁺ 制御性T細胞(ヒトCD8 ⁺ CXCR3 ⁺ 制御性T細胞)のin vitroでの培養)
 ヒト疾患に対する制御性T細胞の有用性を示 すには、その制御性T細胞をin vitroで培養増� �させることが必要である。具体的方法とし� �は、末梢血から採取した制御性T細胞を抗CD3� ��体などで刺激して活性化状態にし、IL-2添加 培地中で培養して増殖させる技術を確立する 必要がある。本実施例では、培養増殖させる ことが簡単なマウスT細胞を用いて実験を行� �た。

 CD8 ⁺ CD122 ⁺ 細胞を、セルソーターを用いて純粋に採取し 、抗CD3抗体(BDBiocoat、BD社製)で24時間刺激し活 性化状態にした。以後は、細胞の維持・増殖 にはヒトレコンビナントIL-2(50ng/ml)のみを加� �た培地で行い、細胞を100倍以上まで増殖さ� �得ることがわかった。この増殖させた細胞� �は、CD8 ⁺ 制御性T細胞が抑制作用を発揮するための必� �分子であるIL-10を発現することが、培養上清 中のIL-10をELISA法(QuantikineマウスIL-10測定キッ� ��、R&D社製を使用)で測定した結果確かめ� �れており、制御性細胞としての機能を保っ� �ままマウスCD8 ⁺ 制御性T細胞を培養増殖させることが可能で� �ることがわかった。同様の方法により、ヒ� �CD8 ⁺ CXCR3 ⁺ 制御性T細胞を培養できると考えられる。