I.低温耐性低増殖性細胞(LTT細胞)株の樹立方� �
 はじめに、本発明による低温耐性低増殖性� ��胞(LTT細胞)株の樹立方法について説明する� �

 本発明による低温耐性低増殖性細胞(LTT細 胞)株の樹立方法は、SCID(重症複合型免疫不全 症)マウス皮下可植性ヒト血管肉腫WB-SCIDより� ��た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ISOS-1培� ��上清含有培地で培養し、トリプシン-EDTA処� �によって剥離しない細胞を選択し、得られ� �(超)低増殖性細胞株を前記ISOS-1培養上清の培 地中添加量(培養上清含有濃度)を低減しなが� ��剥離継代培養することを特徴とする。ここ� ��、(超)低増殖性細胞株は特開2006-345811で開示 した方法により得られる。この方法を以下の (A)~(B)で説明し、本発明のLTT細胞の樹立方法� �ついて(C)で説明する。

 (A)低増殖性細胞の分離培養方法
 SCID(severe combined immunodeficiency disease;重症複 合型免疫不全症)マウスは、遺伝子再構成能� �異常があるために成熟したBおよびT細胞が先 天的に欠損したマウスであり、ヒト新生児で みられる遺伝性の重症複合型免疫不全症のモ デル動物である。レシピエントとしてのSCID� �ウスは、種々の系統が知られているが、本� �明ではいずれも用いることができる。一方� �ヒト血管肉腫は稀ではあるが致死性の高い� �瘍である。

 SCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫WB-SCID� �、本発明者らがヒト血管肉腫をSCIDマウスに� ��値して可植性腫瘍として樹立したものであ� ��(Masuzawa M.et al.,“Evaluation of recombinant inter leukin-2 immunotherapy for human hemangiosarcoma in a� �SCID mice model(WB-SCID)”,J.Dermatol. Sci.27(2):88-94,  2001)。本発明においては、この腫瘍(WB-SCID)� �たはこれに準じて作製したSCIDマウス皮下可� ��性ヒト血管肉腫を用いることができる。以� ��の説明では、便宜上、このようにして得ら� ��るSCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫細胞を WB-SCID腫瘍細胞と呼ぶ。

 低増殖性細胞を得るには、まず、WB-SCID腫 瘍細胞を腫瘍から得た後、マウス血管肉腫細 胞株ISOS-1培養上清含有培地で培養する。マウ ス血管肉腫細胞株ISOS-1培養上清を含まない培 地ではWB-SCID腫瘍細胞は数日間で死滅するた� �、マウス血管肉腫細胞株ISOS-1培養上清は培� �に必須である。マウス血管肉腫細胞株ISOS-1� �本発明者らにより樹立され(Masuzawa M. et al., “Establishment of a new murine-phenotypic angiosarcom a cell line(ISOS-1)“,J. Dermatol. Sci.,16(2):91-98,199 8)、東北大学加齢医学研究所医用細胞資源セ� ��ターに保存されている(保存番号:TKG 0590)。

 マウス血管肉腫細胞株ISOS-1培養上清は、上� ��ISOS-1を培養することにより得られるが、典� ��的には、FBS(ウシ胎児血清)を添加したDMEM-hig h glucose(ダルベッコ改変イーグル培地)を用い ることができる。具体的には(a)培地としてDME M-high glucose+10%FBS+2mM L-グルタミン+10mM Hepes+50 μg/mlゲンタマイシンを用い、ISOS-1細胞を1×10 ⁶ 程度フラスコで培養し、コンフルエントにな り細胞数約1×10 ⁸ となった状態で培地を回収し、遠心(3000rpm)後 、上清を凍結保存し、使用時に37℃で解凍後� ��濾過して使用する。ISOS-1培養上清の添加濃� ��は好ましくは50%以下である。

 WB-SCID腫瘍細胞を培養するための培地は、 上記ISOS-1培養上清の添加を除けば通常と同様 でよく、例えば、FBS(ウシ胎児血清)を添加し� ��DMEM-high glucose(ダルべッコ改変イーグル培地 )を用いることができる(Masuzawa M.et al.,“Estab lishment of a human hemangiosasarcoma cell line (ISO- HAS)”Int. J. Cancer, 81(2):305-308,1999参照)。培養 条件は後述の超低増殖性培養株を得る場合以 外は通常の温度条件及び湿度条件を採用し得 る。培養は接着培養にて行なう。

 次いで、トリプシン-EDTA処理を行ない、� �離した細胞を除く処理を行なう。処理時間� �5~30分間程度、好ましくは10~20分間程度、よ� �好ましくは15分間程度である。これにより、 酵素抵抗性細胞以外の細胞が除去できる。継 続培養しながらトリプシン-EDTA処理は通常5回 以上、好ましくは10回以上行ない、酵素抵抗� ��細胞のみを純化する。

 このように純化して得られたWB-SCID腫瘍細 胞は、それ自体低増殖性であるが、このWB-SCI D腫瘍細胞を剥離継代培養することにより、� �り低増殖性の細胞株を得ることができる。� �こで剥離継代培養とは、細胞に対してトリ� �シン-EDTA処理を行なった後、これを機械的に 剥離して培養する手法を繰り返して継代培養 を行なうことである。剥離継代培養における 機械的剥離操作としては接着細胞を穏やかか つ効果的に剥離するために慣用される剥離方 法が利用できるが、典型的にはピペッティン グ操作が用いられる。剥離継代培養は通常10� ��以上、好ましくは100代以上行なう。

 得られた細胞は密度依存性であり、密度が� ��いほど増殖が活発化する。
 (B)超低増殖性細胞株の樹立方法
 超低増殖性細胞株の樹立方法は、基本的に� ��上記の低増殖性細胞の分離培養方法と同様� ��あるが、初代培養時のマウス血管肉腫細胞� ��ISOS-1培養上清の添加濃度は好ましくは5~20%� �度、特に好ましくは20%程度とする。

 このようにして得られる(超)低増殖性細� �株は、マウスCD31、GSA-1陽性であり、マウス� �皮系細胞である。また、染色体はすべてマ� �ス型で、最頻数は77である。しかし、ヒト/� �ウス両クラスI抗原を同時発現している。ま� ��、ここで得られる(超)低増殖性細胞株のう� �ほとんどはマウス血管肉腫細胞株ISOS-1培養� �清の添加濃度5%以下では成育せず死滅する。

 得られた細胞株の1つがSLG/WB-SCIDであり、� ��成17年6月8日付で、独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センターに受託番号FER M-BP-10349号として寄託されている。

 (C)低温耐性低増殖性細胞(LTT細胞)株
 上述のように、前記SLG細胞はマウス血管肉� ��細胞株ISOS-1培養上清の添加濃度5%以下では� �育せず死滅する。しかし、継代培養しなが� �徐々に添加濃度を下げることにより添加濃� �0%の培地(例えば、10%FBS含有DMEM-high glucose培� �)で培養が可能な細胞が得られることが明ら� ��になった。

 本発明の低温耐性低増殖性細胞(LTT細胞)� �の樹立方法では、上記(B)の手順により新た� �(超)低増殖性細胞株を得、これを以下の操作 に供してもよいが、平成17年6月8日付で、独� �行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託� �ンターに受託番号FERM-BP-10349号として寄託し� ��SLG/WB-SCIDを用いてもよい。

 前記培養上清の添加濃度の低減は、任意の� ��法で行い得る。例えば、一定の割合(例えば 、継代するごとに30%~99%)で添加濃度を逓減し� ��もよいし、一定の値(例えば、継代するごと に1%~10%)添加濃度を低減してもよい。また、� �加濃度の低減に際して、低温処理を行って� �よい。例えば、添加濃度を20%以下とし
た時点で培養温度を低下させる。但し、28℃� ��下では成育しないので低温処理は28℃以上� �行うことが好ましい。好ましくは、添加濃� �を20%にした時点で28℃までの低温処理を行う 。

 このようにして得られた低温耐性低増殖� ��細胞株としては、例えば、LTT/WB-SCID(平成19� �7月10日付で、独立行政法人産業技術総合研� �所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-10 864号として寄託)がある。

 得られる細胞は28℃までの低温耐性となり� �また、温度を下げることで小型化するなど� �態上の変化も見られる(図1~4)。
 II.ライ菌の培養
 本発明による、低温耐性低増殖性細胞(LTT細 胞)株は倍加時間が1日以上28日以下であり、� �かも、適応温度が28℃までである。また、低 温により細胞増殖が制御可能であり、ライ菌 の培養に適している。

 後述の実施例に示すように、本発明によ� ��低温耐性低増殖性細胞(LTT細胞)株はライ菌� �容易に感染させることができる。例えば、� �温耐性低増殖性細胞(LTT細胞)を、例えば、マ ウス足蹠のライ腫より分離した粗なライ菌浮 遊液と混合培養するだけでよい。ライ菌の培 養は好ましくは28~32℃、より好ましくは30℃� �後にて行う。

 また、本発明の低温耐性低増殖性細胞(LTT 細胞)株によれば、ライ菌の継代培養を容易� �行うことができる。具体的には、ライ菌感� �LTT細胞を2度蒸留水(DDW)で処理することでLTT� �胞を破壊して、細胞内のライ菌を遊出させ� �新たにLTT細胞に感染させる。

 また、LTT細胞内感染ライ菌の長期培養に� ��いて、ライ菌障害や処理過程におけるライ� ��の損失などを避けるために、例えば、牛胎� ��血清(FBS)の添加濃度を2.5%まで低下させ、1%� �度の脂肪カクテルを混合した培地を用いる� �とができる。これにより、ライ菌増殖を保� �しつつLTT細胞増殖をさらに抑えることがで� �、従って、LTT細胞を破壊処理することなく� �ライ菌を感染したままでLTT細胞を適時分割� �ながら長期培養することが可能である。

 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的� ��説明するが、これらは本発明を制限するも� ��ではない。なお、下記の手技はすべて無菌� ��作で行なった。また、ライ菌はThai53株ライ� ��(国立感染症研究所ハンセン病研究センター より入手)を用いたが、この株がライ菌であ� �ことは、ライ菌の特異的プライマーを用い� �PCR(Cox RA, Kempsell K, Fairclough L, Colston MJ. T he 16s ribosomal RNA of  Mycobacterium leprae  contains a unique sequence which can be used for  identification by the polymerase chain reaction. J. M ed. Microbiol.,35:284-290,1991.参照)を用いて事前に 確認した。
参考例1:低増殖性細胞株の樹立
 (1)マウス血管肉腫細胞株ISOS-1培養上清の作� ��
 培地としてDMEM-high glucose+10%FBS+2mM L-グルタ� ��ン+10mM Hepes+50μg/mlゲンタマイシンを用い、I SOS-1(Masuzawa M. et al.,”Establishment of a new mu rine-phenotypic angiosarcoma cell line (ISOS-1)”,J.Der matol. Sci.,16(2):91-98,1998)を1×10 ⁶ を175cm ² フラスコで上記培地50ml中1週間培養した。フ� ��スコがコンフルエントになり細胞数約1×10 ⁸ となった状態で培地を回収し、遠心(3000rpmで1 0分間)後、上清を-20℃凍結保存した。これを� ��用時37℃で解凍後、0.45μmフィルターで濾過� ��て用いる。

 (2)WB-SCID細胞
 SCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫WB-SCID(Masu zawa M. et al.,“Evaluation of recombinant interleuki n-2 immunotherapy for human hemangiosarcoma in a SCID  mice model (WB-SCID)”, J. Dermatol. Sci.27(2):88-94 ,2001
)の腫瘍を摘出した。

 摘出腫瘍をシャーレに移し、生理食塩水� ��にて半割し、腫瘍中心半壊死組織より円刃� ��用いて擦過するようにして非酵素処理にて� ��胞遊出させた。遊出した細胞を遠心チュー� ��に移し、遠心器にて4℃、1000rpmで遠心し、� �胞を沈下させ上清を除去し、沈下した細胞� �を分離した。

 細胞層を上記(1)のマウス血管肉腫細胞株ISOS -1培養上清50%添加し、ヒト血管肉腫細胞用培� ��(DMEM-high glucose+10%FBS+マウス血管肉腫細胞株I SOS-1培養上清50%添加)(以後培地と略す)にて再� ��遊させて通常の培養皿に移し、CO ₂ インキュベータ内にて37℃、5%CO ₂ の通常の培養環境で培養を開始した(初代培� �)。

 以後週に2回培地を交換し、培養開始1週� �後、培地を除去し、生理食塩水で1回培養皿� ��を洗い、0.25%トリプシン-EDTA(GIBCO製)(以後、� ��リプシン-EDTAと略す)を適量加え10分間放置� �た。放置後、剥離した細胞を除去し、培養� �底に残存した細胞のみを生理食塩水で1回洗� ��、新たに新鮮な培地を加え継続培養した。� ��記の操作を週2回、計10回繰り返し、トリプ� ��ン-EDTA処理にて剥離する細胞がないことを� �認し、トリプシン-EDTAで剥離しなかった細胞 のみ培養を続けた。

 (3)低増殖細胞株の選択
 1カ月後、培養皿底に観察される細胞コロニ ーをトリプシン-EDTAで1時間処理し、その後ト ランスファーピペットで約10分間ピペッティ� ��グして機械的に細胞を剥離した。剥離細胞� ��新たな培養皿に移し、培養を継続した。

 培養皿内で増殖した細胞について上記と同� ��にピペッティングして機械的に細胞を剥離� ��剥離継代培養を繰り返した。
 2ケ月後、紐状に長い細胞群が単層敷石状に 安定して培養された。この細胞は密度依存性 (細胞密度が高いほど増殖は活発化)に増殖し� ��。

 径35mm培養皿(9.6cm ² )で培地2ml、培地交換週2回の培養条件で、10 ⁵ 個の細胞を培養すると最も増殖する7日目か� �10日目でも、倍加時間は約70時間であり、低� ��殖性であった。

 上記の培養条件で10日目以降に細胞は培養� �をほぼ覆い、唐草模様状に単層に増殖した� �コンフルエントの状態に近づくと、細胞の� �離が起こった。
 細胞数を減らして培養を繰り返すことで細� ��は性状を変化せず、ゆっくり増殖を続けた� ��

 得られた細胞は紐状で長い形態(長さ:約10 0~250μm)である。また、得られた細胞を自動細 胞分析装置(FACScan:Becton Dickinson社製)を用いCEL LQuest解析ソフトでFACS解析したところ、マウ� �CD31、GSA-1陽性でマウス内皮系細胞であるこ� �が確認された。染色体はすべてマウス型で� �71~79に及び、最頻数は77であった。また、ヒ� ��/マウス両クラスI抗原を同時発現しており� �電顕的には高密度顆粒が多く、きわめて細� �小器官に富んでいた。この細胞はDMSO10%添加� ��地で凍結保存が可能であった。

  参考例2:超低増殖性細胞株の樹立
 参考例1と同様にしてWB-SCID細胞を得た。(1)� �地に添加するISOS-1培養上清の添加比率を50%� �ら20%に低下させ、(2)CO ₂ インキュベータの温度設定を37℃から34℃に� �下させた他は参考例1と同様の培養条件でこ� ��を培養した。

 この結果、変更前の条件でコンフルエント� ��達した細胞密度の約50%まで増殖した時点で� ��胞は超低増殖性となり、この時点での倍加� ��間は1500時間以上であった。
 細胞の形状等は参考例1と同様であった。単 一株をSLG/WB-SCIDとして、平成17年6月8日付で、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄 託センターに寄託した(受託番号FERM-BP-10349号) 。