PACIENTE, MÉTODO IN VITRO DE DIFERENCIAÇÃO ENTRE CÂNCER DE

TIREÓIDE E TECIDO DE TIREÓIDE NORMAL OU DE LESÕES

BENIGNAS DE TIREÓIDE, USO DE UM CONJUNTO DE GENES, MÉTODO

DE OBTENÇÃO DE DADOS PARA DIRECION AMENTO DO TRATAMENTO

DO CÂNCER DE TIREÓIDE, KIT LABORATORIAL E DISPOSITIVO PARA

CLASSIFICAR UMA AMOSTRA BIOLÓGICA DE GLÂNDULA TIREÓIDE COMO MALIGNA OU BENIGNA

[ 001 ] A presente invenção refere-se, na sua generalidade, a um método in vitro de detecção de câncer de tireóide em um paciente, assim como a um método in vitro de diferenciação de câncer de tireóide de lesões benignas ou de tecido normal de tireóide, além de alguns outros aspectos relacionados a tais métodos.

[ 002 ] De forma particular, a invenção refere-se a métodos in vitro que se baseiam na avaliação da expressão do conjunto de genes CLDN 10, HMGA2 e LAMB3 contidos em amostras de tecido de um paciente, com técnica de detecção molecular quantitativa, particularmente a partir de dados de análise RT-qPCR (transcrição reversa quantitativa de reação da polimerase em cadeia).

[ 003 ] A expressão conjunta dos 3 transcritos específicos mostrou-se capaz de detectar in vitro de câncer de tireóide e de discriminar tumores malignos, particularmente carcinomas papilíferos da tireóide, de lesões benignas ou de tecido normal de tireóide, e tumores com maior ou menos risco de metástases linfonodais, com alta sensibilidade e alta especificidade.

[ 004 ] Entenda-se que, conforme o contexto, a menção a "genes" pode denotar "transcritos", como bem sabe diferenciar o técnico no assunto.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[ 005 ] Convencionalmente a discriminação entre nódulos malignos e benignos da tireóide é feita por cintilografia, ultrassonografia e biópsia aspirativa por agu lha fina, seguida de anál ise h istológica . Apesar de muitos avanços no diagnóstico e terapia de nódulos da tireóide e câncer da tireóide, sabe-se que tais métodos não apresentam especificidade, particu larmente para discrim inar entre o adenoma folicu lar de tireóide (FTA) e o carcinoma folicular de tireóide (FTC) . Como resultado, ocorre uma grande quantidade de pacientes que não apresentam doença maligna mas que são desnecessariamente tratados.

[ 0 0 6 ] Em relação a outros tipos de câncer, que não o de tireóide, a literatura mostra que o perfil da expressão gênica pode perm itir a discrim inação de diferentes entidades tumorais. No entanto, há poucos ou nenhum transcrito em comum dentre vários estudos que tentam classificar as diferentes entidades do carcinoma de tireóide com base no perfi l de expressão gênica . A aplicação de um classificador de um estudo a dados de outro geralmente não apresenta resultados eficazes de classificação.

[ 0 07 ] Carcinomas bem diferenciados de tireóide são geralmente associados a uma evolução lenta da doença e, em 80-85% dos casos, são classificados como carcinomas papi iíferos da tireóide (PTC, do inglês papillary thyroid câncer). Além de exposição a radiação, baixo ou alto consumo de iodo e antecedentes fami liares de câncer de tireóide, são pouco conhecidos os fatores de risco que contribuem para o desenvolvimento de tais tumores.

[ 0 0 8 ] A expressão aumentada de vários fatores de crescimento e seus receptores, alteração de reguladores do ciclo celu lar e moléculas de adesão são eventos conhecidos no processo tumoral da tireóide e sua progressão. No entanto, até o presente, poucos estudos investigaram em profundidade as funções biológicas relacionadas aos genes expressos de forma diferencial em PTC, os quais podem infl uenciar a tumorigênese .

[ 0 0 9 ] Atualmente tem sido verificado um grande aumento na incidência de PTC comparado à incidência geral de cânceres. Há sugestões de que isso seja consequência do aperfeiçoamento da detecção de tumores menores, em particu lar, pelo extenso uso de biópsia aspirativa com agulha fina guiada por ultrassom (ou "FNAB", do inglês fine needle aspiration biopsy) .

[0010] Mesmo assim, as estratégias atuais para diagnóstico de nódulos da tireóide frequentemente levam a ciru rgias desnecessárias, pois, dentre altas porcentagens de FNAB encontradas em literatura, entre 10% a 26% reportadas como de natureza indeterm inada, apenas cerca de um terço se constata posteriormente ser de natureza maligna, a maioria da variante folicular do PTC.

[0011] Decorre assim que há pacientes submetidos de forma desnecessária à cirurgia de excisão da tireóide, e por esse motivo tratados com reposição de hormônio da tireóide pelo resto da vida . Essas cirurgias representam despesas crescentes para os sistemas de saúde. A terapia de reposição hormonal modifica a qual idade de vida e cria despesas ao paciente. Am bas as situações poderiam, de outra forma, ser evitadas com diagnósticos mais práticos e precisos, os quais têm sido buscados.

[0012] Nesse sentido, já foi proposta a detecção via FNAB das con hecidas ocorrências elevadas de mutações genéticas de carcinomas de tireóide bem diferenciados, principalmente BRAFV600E . Entretanto, há baixa sensibil idade desse teste. Tam bém foram investigados perfis diagnósticos de câncer de tireóide util izando ensaios de m RNA, mi RNA e meti lação em amostras de tumor obtidos de cirurgias e FNAB - apesar de alta acurácia demonstrada, a maioria falhou em demonstrar sensibilidade e especificidade otim izadas nas análises de validação, ao util izar grupos de amostras independentes.

[0013] Finalmente, há divulgações no estado da técnica de análises de perfis moleculares com um grande número de biomarcadores potenciais. Tais análises, no entanto, têm custo elevado, por esse motivo são menos acessíveis à população em geral . Na prática clínica pequenos grupos de marcadores seriam mais desejáveis, podendo ser avaliados pela técnica RT- qPCR ou imuno-histoquímica .

[ 0014 ] Em vista dessas várias circunstâncias, existe uma necessidade crítica de identificação de marcadores moleculares que possam ser aplicados ao diagnóstico de lesões de tireóide, com precisão, de forma prática e com valores mais acessíveis.

[ 0015 ] Conforme conhecido do homem da técnica, as seguintes definições se aplicam à presente invenção :

- expressão gênica : processo pelo qual a informação contida em um gene ou sequência de DNA é processada em um produto gênico funcional, como RNA, que poderá ser traduzido em proteínas;

- gene de referência : gene cuja expressão é mantida em nível constante tanto em células normais quanto em células tumorais e em diferentes condições experimentais;

- transcritos : moléculas de RNA mensageiro formadas a partir da fita molde de DNA de um determinado gene;

- Cq {cycle quantification) = número representativo do ciclo da PCR que a amplificação ultrapassa um limiar estabelecido de fluorescência, permitindo uma quantificação do número inicial de cópias de DNA/cDNA alvo iniciais

- ACq : diferença entre os Cq {cycle quantification) obtidos para a amostra referência e a amostra em análise;

- iniciadores : segmentos de ácidos nucleicos, tipicamente com 15 a 30 nucleotídeos, com sequência complementar ao DNA ou ao RNA alvo a ser amplificado pela PCR (reação em cadeia da polimerase) .

- técnica de detecção molecular quantitativa - entende-se como a utilização de RT-PCR, RT-qPCR, imuno-histoquímica ou qualquer técnica equivalente voltada à mesma finalidade tal como conhecida por um técnico no assunto.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [ 001 6 ] A presente invenção propicia a redução do número de cirurgias desnecessárias que ocorrem como resultado de diagnósticos imprecisos, consequentemente reduzindo custos dos cuidados de saúde e morbidade para os pacientes.

[ 0017 ] A invenção utiliza, diferentemente da arte anterior, um conjunto de apenas 3 marcadores moleculares, suficientes não só para permitir adequadamente detectar, mas também para distinguir entre o câncer de tireóide e tecido de tireóide normal ou de lesões benignas, bem como carcinomas com maior risco de metástases linfonodais.

[ 0018 ] Assim, dentro de um primeiro aspecto, a invenção refere-se a métodos in vitro, quais seja, de detecção de câncer de tireóide em um paciente e de diferenciação entre câncer de tireóide e lesões benignas ou tecido de tireóide normal . Esses métodos compreendem submeter a amostra de tecido suspeito do paciente à técnica de detecção molecular quantitativa empregando, por meio da análise da expressão gênica, os genes LAMB3, CLDN 10 e HMGA2, em comparação com pelo menos um gene de referência .

[ 001 9 ] Sem exclusão de quaisquer outros, são adequados como genes de referência os escolhidos, por exemplo, dentre EIF2B1, PUM 1, GAPDH, HPRT1, GUSB, ACTB, B2M, H M BS, IP08, PGK1, RPLPO, TBP, TFRC, UBC, YWHAZ, PPIA, POLR2A, CASC3, CDKN IA, CDKN 1 B, GADD45A, PSMC4, PES l, ABL1, ELF1, ATP6, M RPL19, POP4, RPL37A, RPL30, RPS17. De forma particular utilizam-se como referência os genes EIF2B1 e PUM 1.

[ 0020 ] Os métodos da invenção acima mencionados são particularmente voltados a carcinomas de tireóide derivados do epitélio folicular, em especial aos carcinomas papilíferos de tireóide (PTC) .

[ 0021 ] A amostra de tecido de paciente a ser avaliada pode ser fresca, fixadas em blocos de parafina ou congelada. De forma particular a amostra de tecido é obtida via biópsia aspirativa de agulha fina (FNAB) . [0022] A base desta invenção foi a elaboração do perfil de expressão genética utilizando microarranjos em 61 tecidos com PTC e 13 tecidos normais adjacentes (NT). Uma lista confiável de transcritos foi utilizado uma validação inter-estudos (138 casos PTC/NT em bases públicas externas). Os resultados foram então coletivamente interpretados por análise in silico. Um painel de 28 transcritos foram selecionados e avaliados usando a técnica de RT-qPCR (reação da polimerase em cadeia por transcrição reversa quantitativa), incluindo lesões benignas de tireóide (BTL) e outros carcinomas de tireóide derivados de células foliculares (OFDTC). O algoritmo diagnóstico da invenção foi desenvolvido (conjunto de treinamento: 23 NT, 8 BTL e 86 PTC), validado (conjunto independente: 10 NT, 140 BTL, 120 PTC e 12 OFDTC) e associado com aspectos clínicos.

[0023] A técnica de detecção molecular quantitativa empregada utilizou, em particular, a análise de RT-qPCR para avaliar os marcadores alvo detectados na análise de dados de expressão gênica em larga escala.

[0024] Embora em literatura técnica os transcritos CLDN10, HMGA2 e LAMB3 já tenham sido associados a PTC, eles sempre são mencionados dentro de extensas listas de genes como apresentando expressão aumentada ou diminuída em PTC. Não se conhece, por essa técnica, a indicação ou sugestão limitada apenas aos 3 genes de forma específica, ou que sua associação permitisse adequada detecção de PTC ou discriminação entre PCT e lesões benignas ou tecido normal de tireóide.

[0025] Adicionalmente, o uso de tais marcadores também é útil para melhor estratificar o risco de metástases nos nódulos linfáticos dos pacientes com diagnóstico de tumor maligno. É possível associar os resultados obtidos pela RT-qPCR (ou técnica de detecção molecular quantitativa equivalente) com uma escala de risco que é calculada, por exemplo, de acordo com o método de PFAFFL (Pfaffl MW. A new math em atiçai model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001 May l;29(9):e45). Este método é baseado na divisão do ACq do transcrito de interesse pela média geométrica dos ACq dos transcritos referência selecionados.

[0026] Essa metodologia não exclui outros métodos conhecidos para a mesma finalidade, por exemplo aquela proposta por LIVAK & SCHMITTGEN (Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(- Delta Delta C(T)). Methods. 2001 Dec;25(4):402-8).

[0027] Ao término da normalização dos dados (método de Pfaffl ou de Livak & Schmittgen) aplica-se o algoritmo abaixo que determina o risco de malignidade na amostra estudada, conforme o status da doença:

Escore = CDLNIO x 0,196 + HMGA2 x 0,343 + LAMB3 x 0,335 - 4,217

[0028] O valor numérico (escore) obtido com esse algoritmo relaciona- se com a probabilidade de malignidade conforme indicado abaixo, e ilustrados na fig. 1;

- Entre -50 e -1,6: intervalo benigno. Quanto mais baixo o valor, menor a probabilidade de malignidade - dentro desta faixa estão as lesões não- malignas e tecido normal, indistintamente;

- Entre -1,6 e 50: intervalo maligno. Quanto mais alto o valor, maior a probabilidade de malignidade.

[0029] Dentro do intervalo maligno, há a modulação das probabilidades de acometimento de linfonodos cervicais, quais sejam:

- probabilidade baixa: escore entre -1,6 a 1,1;

- probabilidade intermediária: escore entre 1,1 a 2,2;

- probabilidade alta (superior a 50%): escore entre 2,2 e 50.

[0030] Sem que se esteja limitando a invenção à qualquer aspecto específico, a invenção levou em conta certas constatações.

[0031] CLDN10, que codifica uma proteína integral de membrana, apresenta expressão aumentada em PTC quando comparada com tecido normal (NT), mas baixa expressão em tecido de lesões benignas da tireóide (BTL), ou em outros carcinomas da tireóide derivados de células foliculares (OFDTC) como aqueles pobremente diferenciados, anaplásicos, foliculares e carcinoma de células de Hurthle. Assim, foi um membro classificador importante na discriminação entre BTL e PTC, apesar de menor probabilidade de identificação de FTC. Entretanto, a expressão aumentada de HMGA2 e de LAMB3 e a expressão diminuída de CLDN 10 podem ser indicativas de FTC.

[ 0032 ] O produto de HMGA2, o qual apresentou expressão aumentada em PTC, altera a estrutura reguladora da cromatina afetando a transcrição de vários genes. Apesar de alta sensibilidade e especificidade, como único marcador avaliado por RT-qPCR, a expressão do HMGA2 não foi suficiente para discriminar entre lesões benignas e malignas, mesmo apresentando expressão muito alta em PTC.

[ 0033 ] O produto do gene LAMB3 pertence a uma família de proteínas da membrana basal (lamininas), havendo importante associação entre sua expressão aumentada e metástase em nódulos linfáticos. Este fato é confirmado no maior risco de metástase linfonodal em pacientes com PTC que apresentaram escores mais elevados.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[ 0034 ] Os marcadores diagnósticos da invenção, necessários e suficientes, são os transcritos CLDN 10, HMGA2 e LAMB3, utilizados no método de detecção de câncer de tireóide e no método in vitro de diferenciação entre câncer de tireóide e tecido de tireóide normal ou de lesões benignas. Para esta finalidade é utilizada a técnica de detecção molecular quantitativa, particularmente RT-qPCR, onde são utilizadas amostras de tecido suspeitos de tumor do paciente.

[ 0035 ] O método da invenção é realizado, em uma concretização particular, associando-se os resultados obtidos na detecção molecular quantitativa com uma escala de risco, por exemplo com os métodos de Pfaffl (2001) ou Livak & Schmittgen (2001), mencionados acima.

[0036] A amostra do paciente a ser avaliada, conforme os métodos da invenção, pode ser tecido a fresco, em blocos de parafina ou congelado. De forma particular, a amostra de tecido é obtida via biópsia aspirativa de agulha fina (FNAB).

[0037] A expressão relativa dos marcadores HMGA2, LAMB3 e CLDN10 foi analisada por RT-qPCR usando a comparação com a expressão dos genes de referência EIF2B1 (sinónimos: EIF2B, EIF2BA) e PUM1 (sinónimos: HSPUM, PUMH, PUMH1, PUML1).

[0038] O desempenho desse classificador (composto pelos três transcritos marcadores) foi testado em ensaio de validação, apresentando 98,1% de acurácia em relação ao carcinoma papilífero de tireóide e 80,5% de acurácia para outros tipos de carcinomas de tireóide derivados do epitélio folicular (OFDTC).

[0039] Em outro aspecto, a invenção é utilizada em biópsias de nódulos da tireóide para orientar cirurgias e acompanhamento clínico, ao mesmo tempo alerta sobre quais casos malignos possuem maior risco de apresentar envolvimento de linfonodos, particularmente quando há expressão aumentada de LAMB3.

[0040] Dentro de outro aspecto, a invenção refere-se também ao uso de um conjunto de transcritos caracterizado pelo fato de ser em um método diagnóstico in vitro de câncer de tireóide, dito conjunto compreendendo os transcritos LAMB3, CLDN10 e HMGA2 em comparação com ao menos um transcrito de referência.

[0041] Dentro de outro aspecto, a invenção refere-se ainda ao uso de um conjunto de transcritos caracterizado pelo fato de ser em um método de análise para diferenciar entre o câncer de tireóide e tecido de tireóide normal ou de lesões benignas, dito conjunto compreendendo os transcritos LAMB3, CLDNIO e HMGA2 em comparação com ao menos um transcrito de referência [0042] Dentro de mais um aspecto, a invenção refere-se a um método de obtenção de dados para direcionamento do tratamento de câncer de tireóide caracterizado pelo fato de que compreende submeter uma amostra de tecido suspeito do paciente à técnica de detecção molecular quantitativa que utiliza, para análise de expressão gênica, o conjunto de transcritos LAMB3, CLDNIO e HMGA2, em comparação com a expressão de pelo menos um gene de referência, opcionalmente associada a uma escala de risco.

[0043] Dentro de mais um aspecto, a invenção refere-se a um kit laboratorial caracterizado pelo fato de que compreende reagentes para detectar a expressão dos genes LAMB3, CLDNIO E HMGA2 relacionados ao diagnóstico de PTC, assim como para avaliar ou auxiliar na avaliação de sua expressão em relação a, no mínimo, um gene de referência, opcionalmente contendo um manual de instruções para uso.

[0044] Dentro de uma realização particular o kit laboratorial da invenção compreende os componentes:

a- componente adequado à extração de RNA da amostra de tecido de um paciente;

b- componente adequado à conversão do RNA em DNA complementar;

c- desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs)

d- iniciadores para os transcritos alvo CLDNIO, HMGA2,

LAMB3 e para um ou mais transcritos de referência;

e- tampão para a reação de transcriptase reversa;

f- solução 5 mM de dietiltreitol (DTT);

g- enzima transcriptase reversa;

h- solução contendo tampão para PCR, 1,5 mM de MgCI2, 0,2 mM de dNTPs, 0,25% de DMSO, 1 unidade de DNA Taq polimerase, e 0,01X de molécula repórter Sybr Green I; i- meios para calcular os escores de acordo com uma tabela de risco que indica os resultados por meio da aplicação do algoritmo diagnóstico :

Score=CDLN 10 x 0,196 + H MGA2 x 0,343 + LAM B3 x 0,335 - 4,217.

[ 0045 ] Dentro de mais um aspecto, a invenção refere-se a um dispositivo para classificar uma amostra biológica da glândula tireóide como maligna ou benigna, caracterizado por compreender:

- meios para medir o nível de expressão dos genes LAM B3, CLDN 10 e H MGA2;

- meios para correlacionar o nível de expressão com uma classificação de status da doença da tireóide;

- meios para expressar tal status.

[ 004 6 ] Os mencionados meios são conhecidos do técnico no assunto :

- meios para medir o nível de expressão são, por exemplo, RT-PCR, RT-qPCR ou qualquer outro equivalente;

- Meios para correlacionar o nível de expressão com o status da doença de tireóide são, por exemplo, as metodologias de Pfaffl (2001) ou Livak & Schmittgen (2001), já mencionadas anteriormente;

- Os "meios para expressar" o status da doença são quaisquer, por exemplo um mostrador onde aparecem dígitos, códigos, palavras, cores ou imagens, sem excluir quaisquer outros meios ou dispositivos adequados.

[ 0047 ] Para a realização da detecção molecular quantitativa do conjunto de transcritos da invenção, incluindo um ou mais transcrito de referência, podem ser utilizados iniciadores (ou "primers") comerciais ou iniciadores específicos, como descrito mais adiante.

EXEMPLOS

[ 0048 ] Para um melhor entendimento da invenção e esclarecer sua aplicabilidade, são apresentados abaixo exemplos que apresentam realizações particulares da invenção, que não impõem, de qualquer forma que seja, limites à extensão da invenção. Exemplo 1 - Métodos da invenção com uso de iniciadores comerciais na técnica de detecção molecular quantitativa.

[ 0049 ] Após a extração de RNA, realizados por kits RNeasy mini kit (da empresa norte americana Qiagen), o RNA é convertido em DNA complementar ou cDNA (dia 1). O protocolo para a conversão de RNA em cDNA iniciou-se com a adição de iniciadores oligo dT ^{12 18} (da empresa norte- americana GE Healthcare Life Sciences) e/ou random primers (da empresa norte-americana Invitrogen), desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs) (da empresa norte-americana Invitrogen), tampão Super Script III First Strand Buffer (da empresa norte-americana Invitrogen), 5 mM de dietiltreitol (DTT) (da empresa norte-americana Invitrogen) e 200 unidades da enzima Super Script III Reverse Transcriptase (da empresa norte-americana Invitrogen), seguindo uma série de incubações em variadas temperaturas. É importante frisar que quaisquer métodos alternativos de conversão de RNA em cDNA podem ser utilizados. A amplificação pela PCR foi realizada usando- se 20 ng de cDNA, IX de ensaios TaqMan® Gene Expression (sondas e iniciadores, da empresa norte americana Applied Biosystems), IX de TaqMan ^® Universal Master Mix II (da empresa norte americana Applied Biosystems) completando com água ultrapura (Ambion®, da empresa norte- americana Life Technologies) para 15 de volume final (dia 2). Foram utilizados três iniciadores comerciais, da empresa norte americana Applied Biosystems, para amplificação dos transcritos alvos CLDN10 (ensaio TaqMan ^® Hs00734479_m l), HMGA2 (ensaio TaqMan ^® Hs00971724_m l) e LAMB3 (ensaio TaqMan ^® Hs00165078_m l) e para dois transcritos referência, EIF2B1 (ensaio TaqMan ^® Hs00426752_m l) e PUM1 (ensaio TaqMan ^® Hs00472881_m l). As reações foram montadas em duplicatas na presença de controles negativos (No Template Control) em sistema de PCR. Para o cálculo de quantificação dos transcritos de interesse foi utilizado o método proposto por PFAFFL (2001), que se baseia na divisão do ACq do transcrito de interesse pela média geométrica dos ACq dos transcritos referência selecionados. Exemplo 2 - Métodos da invenção com uso de iniciadores específicos desenvolvidos para uso na técnica de detecção molecular quantitativa.

[0050] Após a extração de RNA e posterior conversão para cDNA

(dia 1), é realizada a PCR, utilizando as seguintes sequências para os iniciadores dos transcritos alvo (dia 2):

- CLDN10 - Seq. ID 1 e Seq. ID 2

- HMGA2 - Seq. ID 3 e Seq. ID 4

- LAMB3 - Seq. ID 5 e Seq. ID 6

- EIF2B1 - Seq. ID 7 e Seq. ID 8

- PU Ml - Seq. ID 9 e Seq. ID 10

[0051] A PCR foi realizada contendo 20 ng de cDNA, lx de Sybr

Green I Master Mix (da empresa norte-americana Applied Biosystems), 200 μΜ de cada iniciador para um volume de 12,5 μΙ_. As reações foram montadas em duplicatas na presença de controles negativos ("/Vo Template Control") em sistema de PCR em 40 ciclos de amplificação. Para o cálculo de quantificação dos transcritos de interesse é utilizado o método proposto por PFAFFL (2001), que se baseia na divisão do ACq do transcrito de interesse pela média geométrica dos ACq dos transcritos referência selecionados. Ao término da normalização, foi aplicado o algoritmo da invenção

Score = CDLN10 x 0,196 + HMGA2 x 0,343 + LAMB3 x 0,335 - 4,217

Exemplo 3 - métodos da invenção aplicados a caso real.

[0052] O paciente MCS apresentou nódulo suspeito de tireóide e segundo exames clínicos, laboratoriais e de imagem foi indicada a biópsia aspirativa por agulha fina;

[0053] O material remanescente da biópsia foi submetido à extração de RNA seguida de conversão para cDNA (tempo estimado de 5 horas); [0054] Foi realizada a PCRcom os iniciadores conforme o exemplo 1(40 ciclos de amplificação: 1 minuto em 95°C, 30 segundos em 60°C) (tempo estimado de 2 horas);

[0055] Aplicado o algoritmo diagnóstico obteve-se o escore de 3,72, indicando alto risco de malignidade;

[0056] O caso foi submetido à tireoidectomia total, sendo confirmado por análise histopatológica se tratar de carcinoma papilífero de tireóide de variante clássica;

[0057] Como o valor do escore foi superior à 2,2, o caso foi também classificado como de alto risco de acometimento de linfonodos, sendo também indicado o esvaziamento cervical, onde foi comprovada por análise histopatológica a presença de lesão linfonodal.

Exemplo 4 - método da invenção aplicados a caso real.

[0058] O paciente TBB apresentou nódulo suspeito de tireóide e segundo exames clínicos, laboratoriais e de imagem foi indicada a biópsia aspirativa por agulha fina;

[0059] O material remanescente da biópsia foi submetido à extração de RNA seguido de conversão para cDNA (tempo estimado de 5 horas).

[0060] Foi realizada a PCR conforme o exemplo 2 (40 ciclos de amplificação: 1 minuto em 95°C, 30 segundos em 60°C) (tempo estimado de 2 horas);

[0061] Quando aplicado o algoritmo diagnóstico obteve-se o escore de -1,5, apresentando alto risco de malignidade.

[0062] O caso foi submetido à tireoidectomia total, sendo diagnosticado como carcinoma folicular minimamente invasivo.

[0063] Como o valor foi inferior à 2.2, o caso foi também classificado como de baixo risco de acometimento de linfonodos, não sendo indicado o esvaziamento cervical.

Exemplo 5 - método da invenção aplicados a caso real. [0064] Paciente WS apresentou nódulo suspeito de tireóide e segundo exames de imagem foi indicada a biópsia aspirativa por agulha fina;

[0065] O material remanescente da biópsia foi submetido à extração de RNA seguido de conversão para cDNA conforme o exemplo 2 (tempo estimado de 5 horas);

[0066] Foi realizada a PCR conforme o exemplo 2 (40 ciclos de amplificação: 1 minuto em 95°C, 30 segundos em 60°C) (tempo estimado de 2 horas);

[0067] Aplicado o algoritmo diagnóstico obteve-se o escore de -7,1, indicando baixo risco de malignidade;

[0068] Apesar de recomendado apenas o seguimento, o paciente optou pela tireoidectomia total, sendo diagnosticado pela análise histológica da peça cirúrgica apenas adenoma folicular.

[0069] Sabe-se que a partir das informações fornecidas, com o auxílio dos exemplos acima descritos, um técnico no assunto pode fazer uso da invenção usando diferentes formas das aqui reivindicadas, mas realizando funções e obtendo resultados iguais ou similares aos apresentados, o que indica que não se afasta da invenção protegida.