Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein in vitro-Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer(z. B. auch teratogener) Effekte auf der Basis differenzierender pluripotenter embryona¬ ler Stamm(ES)-Zellen der Maus und Ratte sowie an aus primordia- len Keimzellen etablierten embryonalen Keim(EG)-Zellen.

Der Nachweis teratogener Eigenschaften von chemischen Wirk¬ stoffen erfolgt derzeit durch Bestimmungen der Reproduktions- toxizität von Prüfsubstanzen nach Einfach- und Mehrfachappli¬ kation an trächtigen Laborsäugern und durch Prüfungen der Embryotoxizitat in frühen Stadien der Schwangerschaft (Holz und Siegemund, Der Einsatz von Tieren in der Forschung und Entwick¬ lung im Verbraucher- und Umweltschutz, Abschlußbericht zur Basiserhebung des Batelle-Instituts 1988). Des Weiteren werden in vitro-Versuche mit Säuger-Embryonen (Neubert und Merker, Cell culture techniques - applicability for studies on prenatal differentiation and toxicity, de Gruyter, Berlin - New York (1981)) und embryonalen Organen für Teratogenitätsteste einge¬ setzt. Diese Testverfahren haben jedoch den großen Nachteil, daß sie nach wie vor den Einsatz einer großen Anzahl von lebenden Säugern, insbesondere Ratten und Mäusen voraussetzen. In vitro- Testverfahren, bei denen Primärzellkulturen aus Extremitäten¬ knospen (z.B. "limb buds", Kochhar, Teratology 11, 273-287 (1975)), oder Gehirnanlagen embryonaler Ratten (Flint and Orton, Toxicol. Appl. Pharmacol. 76, 383-395 (1984)) oder permanente Zellinien aus embryonalen oder adulten Säugetiergeweben oder aus menschlichen Geweben, wie Tumorzellen des Ovars oder embryonale Gaumenzellen eingesetzt wurden, erfüllen im engeren Sinn nicht die Anforderungen, die an Teratogenitätstests gestellt werden, nämlich Hinweise auf mögliche Entwicklungsstörungen während der Embryogenese zu geben.

Seit einigen Jahren gibt es Bemühungen, permanente Kulturen totipotenter/pluripotenter embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) auch zum Nachweis embryotoxischer und mutagener Stoffe zu ver¬ wenden (Laschinski et al, Reproductive Toxicol. 5, 57-65 (1991), Newall and Beedles, Toxicol. in Vitro 8, 697-701 (1994), Sehl- meyer and Wobus, Mutation Res. 324, 69-76 (1994)). Embryonale Stammzellen sind d i e totipotenten Zellen des frühen Embryos, aus denen sich der komplette Säugetierorganismus entwickelt. Störungen während der Keimblatt- und pränatalen Entwicklung kön¬ nen zum Absterben der Embryonen (präimplantativem Tod) , zu Entwicklungsstörungen, Fehlentwicklungen bzw. Mißbildungen führen. Als in vitro-Systeme totipotenter bzw. pluripotenter Zellen sind

1. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen), permanente Linien toti¬ potenter embryonaler Zellen (Evans and Kaufman, Nature 282, 507- 509 (1981)) und

2. Embryonale Keimzellen ("embryonic germ cells", EG-Zellen), die aus primordialen Keimzellen (PGC) ca. 9 Tage alter Embryonen gewonnen und als permanente Zellinien kultiviert werden (Stewart et al, Dev. Biol. 161,626-628 (1994)) bekannt.

Sowohl ES-Zellen als auch EG-Zellen sind totipotent und nehmen in vivo nach Retransfer in die Blastozyste an der normalen Embryogenese teil und sind in der Lage, die Keimbahn zu kolo¬ nisieren (Bradley et al, Nature Bd. 309, 255-256 (1984), Matsui et al, Cell 70, 841-847 (1992)).

In vitro können ES-Zellen nach Differenzierung in Embryo-ähnli¬ chen Aggregaten, sogenannten "embryoid bodies" Derivate aller drei Keimblätter bilden, d.h. in kardiogene (Doetschmann et al, J. Embryol. Exp. Morphol. 87, 27-45 (1985)), myogene (Rohwedel et al, Dev. Biol. 164, 87-101 (1994), neuronale und hämatopoie- tische Zellen (Wiles and Keller, Development 111, 259-267 (1991) ) differenzieren.

In bisherigen Experimenten wurde nachgewiesen, daß das Teratogen

Retinsäure (RA) zu gravierenden Veränderungen der Expression gewebespezifischer Gene führt, wenn es zu bestimmten Zeiten der "embryoid body"-Differenzierung einwirkte und zu Aktivierung, Hemmung oder Modulation der Expression von Herz- oder Skelett¬ muskel-spezifischen Genen führte (Wobus et al., Roux's Arch. Dev. Biol. 204, 1994, 36-45). Diese Aktivierung, Reprimierung oder Modulation der Genexpression kann auch über Reportergene, z. B. X-Gal oder Luziferase, sichtbar gemacht werden. Bisherige in vitro-Verfahren mit ES-Zellen betreffen in erster Linie Testverfahren zum Nachweis der zytotoxischen Wirksamkeit embryotoxischer Verbindungen mit Hilfe des MTT-Testes (Laschinski et al s.o.). Dabei wurde in ES-Zellen eine höhere zytotoxische Sensitivität beobachtet als in differenzierten Zellen.

Untersuchungen zur Zytotoxizität mit Hilfe des "stem cell tests" zum Nachweis teratogener Effektivität wurden von Newall and Beedles, Toxicol. in Vitro 8, 697-701 (1994) beschrieben. In allen diesen Untersuchungen dienten zytotoxische Effekte als Maß für embryoschädigende Eigenschaften teratogener/embryotoxi- scher Substanzen.

Es ist festzustellen, daß ES-Zellen das zur Zeit wichtigste Zellmodell in der Entwicklungsbiologie sind, vor allem zur Konstruktion transgener Organismen, ihr Einsatz in der Reproduk- tions- und Gentoxikologie bisher jedoch begrenzt ist.

Die Erfindung hat das Ziel, ein routinemäßig einsetzbares in vitro-Testverfahren zur Ermittlung Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte bereit zu stellen.

Die Aufgabe der Erfindung liegt darin, ein in vitro-Testverfah¬ ren zum Nachweis embryotoxischer/teratogener Eigenschaften von chemischen Wirkstoffen an embryonalen Stamm(ES)-Zellen oder an aus primordialen Keimzellen etablierten embryonalen Keim(EG)- Zellen zu entwickeln. Das Testverfahren soll insbesondere geeig¬ net sein, Hinweise auf mögliche Entwicklungs- und Differenzie¬ rungsstörungen während der Embryogenese zu geben.

Die Erfindung wird gemäß der Ansprüche realisiert. Es werden stabile transgene ES- oder EG-Stammzellklone konstru¬ iert, bei denen ein bakterielles Reportergen LacZ oder das Luziferasegen unter die Kontrolle von gewebespezifischen Promo¬ toren oder Entwicklungskontrollgenen gebracht wird. Nach Diffe¬ renzierung der ES-Zellen in Anwesenheit teratogener Substanzen in die verschiedenen Keimbahnderivate erfolgt eine differenzie¬ rungsanhängige Expression in den Zellen, die die gewebespezi¬ fischen Promotoren exprimieren. Die Aktivierung, Reprimierung oder Modulation dieser gewebespezifischen Gene wird mit einer einfachen Färbereaktion, dem X-Gal Assay, bestimmt. Mit der Erfindung wird eine Batterie von relevanten Test-ES-Zellklonen entwickelt, die neben dem Reportergen LacZ (und einer Neomycin- kassette zur Selektion stabiler Transfektanten) Promotor¬ sequenzen enthalten, die charakteristische und wesentliche Merkmale der ektodermalen und mesodermalen Linie regulieren. Das sollten insbesondere Gene sein, die die neuronale, kardiogene, die Muskel- und die Skelettentwicklung determinieren. Nach Transfektion dieser Vektoren in pluripotente ES-/EG-Zellen der Maus oder der Ratte werden stabile Stammzellklone selektiert und diese nach "embryoid body"-Entwicklung zu spezifischen Zeiten in Anwesenheit von Testsubstanzen differenziert (Abb.l). Danach kann die differenzierungsabhängige Expression der gewebespezi¬ fischen Gene mit Hilfe der X-Gal-Färbung in verschiedenen Ent¬ wicklungsstadien (unter Zeiteinhaltung und Einsatz dafür geeig¬ neter Vektoren) nachgewiesen werden. Diese Färbetechnik ist standardisierbar und über photometrische Verfahren automati¬ sierbar.

Mit diesem Testverfahren ist es möglich, in vitro Chemikalien¬ induzierte Veränderungen der zellulären Differenzierung, die während der Keimblattdifferenzierung und frühen embryonalen Entwicklung stattfinden und zu Entwicklungsstörungen führen, festzustellen. Bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren werden keine lebenden Tiere, sondern permanente Zellinien eingesetzt.

Der wesentliche Vorteil der Erfindung besteht darin, daß ein standardisierbares, im Routine-Screening einsetzbares in vitro

Modell etabliert wird, das zu einer Einsparung von Versuchstie¬ ren führt. So wurden im Bereich der Reproduktionstoxikologie in Deutschland pro Jahr (1987) ca. 20000 Säugetiere und Vögel ein¬ gesetzt. Darüber hinaus werden eine große Anzahl von Säugern zur Entnahme embryonaler Organe und Gewebe (embryonale Herzmuskel¬ zellen, "limb bud" Kulturen, "micromass"-Assay u.a.) benötigt, so daß die Gesamtzahl bei Tierzahlen von mindestens 50 000 liegen dürfte.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können im Vorscreening fol¬ gende Testverfahren teilweise ersetzt und ergänzt werden:

- in vivo-Segment II-Studien,

- Teste mit embryonalen Organen ("limb bud" Kulturen) und Pri¬ märkulturen

- Testverfahren mit artifiziellen Embryonen

Anschließend wird die Erfindung an einem Ausführungsbeispiel nä¬ her erläutert, das die Anmeldung jedoch nicht beschränken soll.

Beispiel 1

Das Testverfahren ist in Abb. 1 schematisch dargestellt. Es werden transgene ES-Zellklone, bei denen LacZ unter der Kontrolle des vetrikelspezifischen MCL-2V Promotors (Franz et al, Circ. Res. 72 (1993) 629-638) exprimiert wird, für die Un¬ tersuchung solcher kardiotoxisehen Substanzen eingesetzt, die zu Entwicklungsstörungen am Herzen führen.

Zum Einsatz kommen Klone, die mit dem Vektor pGNA-MLC 2.1-LacZ transfiziert wurden und MLC-2V stabil exprimieren. Während der mesodermalen Differenzierung in embryoid bodies wird die Testsubstanz Retinsäure (RA) zugegeben (z. B. von Tag 5 bis 15) und anschließend eine X-Gal-Färbung der differenzierten em¬ bryoid bodies durchgeführt.

Abb.2 zeigt die Aktivierung der MLC-2V-Expression im MLC-Klon 3 durch 10" ⁸ M (E,F)und 10 ^"9 M (C,D)RA nach Behandlung zwischen 5. und 15. Tag der embryoid body-Differenzierung. Die Kontrollzel-

len (A,B) zeigen X-Gal-Färbung ohne Induktion durch die terato- gene Substanz RA.

Die Vektoren werden auch zur Transfektion von EG-Zellen oder von Ratten-ES-Zellen benutzt.