Titre : Insertion multicopies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon

[0001] La présente invention concerne un procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon. La présente invention concerne aussi les souches de champignon ainsi obtenues, et les différentes utilisations d’une telle souche de champignon modifiée.

Contexte de l’invention

[0002] Les souches de champignon sont utilisées pour la production de protéines d’intérêt. Par exemple, les souches de champignon appartenant au genre Trichoderma, notamment Trichoderma reesei, sont aujourd’hui majoritairement utilisées pour la production d’enzymes. Ces enzymes, par exemple les cellulases, sont en effet utilisées pour hydrolyser la biomasse cellulosique ou lignocellulosique en sucres simples. Les enzymes produites par les champignons filamenteux sont donc utiles dans les filières de production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés issus de sucres provenant de biomasse (ligno)cellulosique.

[0003] Afin d’améliorer la production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés, il a ainsi été envisagé d’améliorer la production de cellulases.

[0004] Par exemple, le brevet EP 448 430 B1 décrit une production industrielle optimisée de cellulases par Trichoderma reesei. Cette production est réalisée en protocole fed-batch (alimentation sans soutirage) en utilisant une solution d'alimentation contenant du lactose comme sucre inducteur de la production de protéines. Ce procédé de fermentation comprend deux étapes : une première étape de croissance du champignon en présence d’un excès de source carbonée et une deuxième étape de production d’enzymes grâce à l’ajout d’un inducteur dans le milieu avec un débit optimisé (mode fed-batch). Ces étapes sont réalisées en milieu liquide dans des bioréacteurs sous une agitation et en présence d’oxygène car le champignon est aérobie stricte. Un autre exemple de procédé optimisé de production de cellulases est décrit dans le brevet EP 2 744899 B1 .

[0005] En plus de l’optimisation des procédés de production de cellulases, il a également été envisagé de modifier génétiquement les souches de champignons afin de modifier leur capacité de production. Ainsi le demande internationale PCT/FR2016/053601 décrit la surexpression du gène TrAZFI dans une souche afin d’améliorer sa capacité de production d’une protéine d’intérêt, en particulier une enzyme cellulolytique.

[0006] Des procédés de fermentation et souches utiles pour améliorer la production d’enzymes cellulolytiques par des champignons filamenteux, et ce faisant de produits biosourcés mais également des biocarburants de seconde génération, sont donc déjà décrits dans l’art antérieur.

[0007] Les champignons peuvent également être utilisés pour produire des protéines utiles dans d’autres types d’industries, tels que l’industrie alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique (voir par exemple Rantasalo, A., Vitikainen, M., Paasikallio, T. et al. Novel genetic tools that enable highly pure protein production in Trichoderma reesei. Soi Rep 9, 5032 (2019) ou encore le brevet EP3405580).

[0008] Le promoteur TEF1 est connu comme un promoteur fort chez les champignons (Gao S, Zhou H, Zhou J, Chen J. Promoter-Library-Based Pathway Optimization for Efficient (2S)- Naringenin Production from p-Coumaric Acid in Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem. 2020 Jun 24;68(25):6884-6891. doi: 10.1021 /acs.jafc.OcOI 130. Epub 2020 Jun 11).

[0009] L’utilisation de ce promoteur TEF1 a également été décrite ou suggéré pour favoriser l’expression de gènes d’intérêt (voir par exemple US20080044878, US9732338, US6011147, W02018067068, US8071298, ou encore Kitamoto, N., Matsui, J., Kawai, Y. et al. Utilization of the TEF1-a gene (TEF1) promoter for expression of polygalacturonase genes, pgaA and pgaB, in Aspergillus oryzae . Appl Microbiol Biotechnol 50, 85-92 (1998) ; Zhang J, Cai Y, Du G, Chen J, Wang M, Kang Z. Evaluation and application of constitutive promoters for cutinase production by Saccharomyces cerevisiae. J Microbiol. 2017 Jul;55(7):538-544. Epub 2017 Jun 30 ; Umemura M, Kuriiwa K, Dao LV, Okuda T, Terai G. Promoter tools for further development of Aspergillus oryzae as a platform for fungal secondary métabolite production. Fungal Biol Biotechnol. 2020 Mar 23;7:3 ; Fang F, Salmon K, Shen MW, Aeling KA, Ito E, Irwin B, Tran UP, Hatfield GW, Da Silva NA, Sandmeyer S. A vector set for systematic metabolic engineering in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2011 Feb;28(2):123-36. Epub 2010 Oct 8 ; Tiina Nakari, Edward Alatalo and Merja E. Penttila, Isolation of Trichoderma reesei genes highly expressed on glucose containing media: characterization of the TEF1 gene encoding translation élongation factor 1 a, Gene, 136(1993)313- 318, 1993 Elsevier Science Publishers B.V; Partow S, Siewers V, Bjorn S, Nielsen J, Maury J. Characterization of different promoters for designing a new expression vector in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2010 Nov;27(11):955-64).

[0010] Egalement, l’intégration multicopie de vecteurs d’expression dans le génome d’un champignon a déjà été décrite, voir par exemple EP0778348 ou W01991002803.

[0011] Des techniques de génie génétique, impliquant notamment le promoteur TEF1 et l’expression de gènes d’intérêt, ont donc déjà été décrites dans l’art antérieur.

[0012] Par ailleurs, pour cibler une insertion à un locus bien défini, il faut habituellement, que le transgène soit encadré de séquences en amont en aval du locus cible. La taille (nombre de paires de base) de ces régions flanquantes dépend des organismes. Pour ceux ayant une capacité à réaliser une recombinaison homologue, ces séquences flanquantes peuvent-être courtes, par exemple dans le cas de Saccharomyces cerevisiae, une vingtaine de paires de bases suffisent pour cibler un locus (Janke C, Magiera MM, Rathfelder N, Taxis C, Reber S, Maekawa H, Moreno- Borchart A, Doenges G, Schwob E, Schiebel E, Knop M. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 2004 Aug;21(11):947-62). A contrario, chez d’autres champignons tels que Trichoderma reesei ces séquences flanquantes doivent faire 1000 paires de base et même dans ces conditions, la probabilité que l’insertion se fasse au site voulu est faible.

[0013] Les techniques d’édition génétique permettent de réduire la taille des régions flanquantes à 200 paires de bases et augmenter la probabilité d’insertion au site.

[0014] Néanmoins, il existe toujours un besoin pour de nouveaux procédés permettant l’expression améliorée de gènes d’intérêt et/ou des procédés de production de protéines d’intérêt, qui soient le plus efficaces possibles, notamment chez Trichoderma reesei.

[0015] La présente invention repose ici sur les résultats des Inventeurs montrant que le promoteur TEF1 peut être utilisé pour l’insertion multicopie d’un gène d’intérêt. Chaque copie fonctionnelle insérée entraîne une augmentation de l’expression dudit gène d’intérêt, augmentant ainsi la capacité de production de la protéine d’intérêt. Les résultats de la présente invention montrent également qu’il est possible de réaliser avec succès, notamment chez Trichoderma reesei, l’insertion au locus cible (la région en 5’ du promoteur TEF1) en utilisant une seule région flanquante du site d’insertion dans la cassette d’expression selon l’invention (au lieu des deux habituelles).

Bref exposé de l’invention

[0016] La présente invention concerne ainsi un procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ledit procédé comprenant une étape de transformation dudit champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression, ladite cassette comprenant :

- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- un gène d’intérêt,

- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.

[0017] L’invention concerne également l’utilisation d’une cassette d’expression pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ladite cassette d’expression comprenant :

- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- un gène d’intérêt,

- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.

[0018] L’invention concerne également un procédé de production d’une protéine d’intérêt comprenant les étapes suivantes :

- (i) une étape de transformation d’un champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour ladite protéine d’intérêt et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- (ii) une étape de culture du champignon transformé à l’étape (i) dans des conditions permettant la production de la protéine d’intérêt. [0019] L’invention concerne également une souche de champignon comprenant dans son génome plusieurs copies d’un gène d’intérêt sous la dépendance d’un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon génétiquement modifiée.

Exposé de l’invention

[0020] Dans un premier aspect, l’invention concerne un procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ledit procédé comprenant une étape de transformation dudit champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression, ladite cassette comprenant :

- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- un gène d’intérêt,

- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.

[0021] Selon l’invention, le terme « TEF1 » fait référence au facteur d’élongation de la traduction 1 (Translation Elongation Factor 1). Il s’agit d’une protéine de type GTPase qui intervient dans la biosynthèse des protéines. Chez Trichoderma reesei, la protéine TEF1 , codée par le gène TEF1, est représentée par SEQ ID NO : 2. L’expression du gène TEF1 est essentiellement constitutive (Tiina Nakari, Edward Alatalo and Merja E. Penttila, Isolation of Trichoderma reesei genes highly expressed on glucose containing media: characterization of the TEF1 gene encoding translation élongation factor 1 a, Gene, 136(1993)313-318, 1993 Elsevier Science Publishers B.V). Plus particulièrement, selon l’invention, le terme « TEF1 » fait référence au « TEF1 alpha ».

[0022] Selon l’invention, le promoteur TEF1 s’entend du promoteur sous la dépendance de laquelle le gène TEF1 est naturellement dépendant, dans un organisme non génétiquement modifié. Typiquement, chez Trichoderma reesei, le gène TEF1 qui code pour la protéine TEF1 de SEQ ID NO : 2 est sous la dépendance du promoteur TEF1 représenté par la séquence SEQ ID NO : 1. Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l’invention, le promoteur TEF1 est représenté par SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO : 1 , préférentiellement au moins 80%. Selon l’invention, l’expression « au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO : 1 » signifie toutes les valeurs comprises entre 60% et 100%, notamment les valeurs de 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%, préférentiellement au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, encore plus particulièrement au moins 98%, au moins 99%. L’homme du métier sait calculer un pourcentage d’identité entre deux séquences. Par exemple, selon l’invention, le pourcentage d'identité d'une séquence donnée par rapport à SEQ ID NO : 1 s’entend du pourcentage d’identité sur la longueur totale des séquences. Le pourcentage correspond ainsi au nombre de nucléotides (résidus le cas échéant) identiques entre cette séquence donnée et SEQ ID NO : 1 divisé par le nombre de nucléotides (résidus le cas échéant) dans la plus longue des deux séquences. Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l’invention, le promoteur TEF1 peut également s’entendre d’une séquence ayant moins de 60% d’identité avec SEQ ID NO : 1 tout en conservant une fonction identique. Cela s’entend notamment des promoteurs orthologues du promoteur TEF1 chez des champignons différents de Trichoderma, notamment Trichoderma reesei, qui ont des séquences très éloignées de SEQ ID NO : 1 , bien qu’assurant la même fonction que le promoteur TEF1 chez Trichoderma reesei (à savoir le promoteur TEF1 du gène TEF1 codant pour un facteur d’élongation de la traduction 1 , plus particulièrement le facteur d’élongation de la traduction 1 alpha). Cela peut également être le cas si le promoteur est muté (sur des nucléotides non essentiels à sa fonction de promoteur). Selon un mode de réalisation, le promoteur TEF1 peut également s’entendre du promoteur sous la dépendance de laquelle est un gène codant pour une protéine orthologue ou variante de la protéine TEF1 représentée par SEQ ID NO : 2. Ainsi, le promoteur TEF1 peut également s’entendre du promoteur d’un gène codant pour une protéine de SEQ ID NO : 2 ou une protéine ayant au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98%, au moins 99%. L’expression « au moins 80% » représente toutes les valeurs comprises entre 80% et 100%, soit 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%.

[0023] Selon l’invention, un promoteur représenté par une séquence ayant au moins 60% d’identité avec SEQ ID NO : 1 , représente de préférence un promoteur variant ou un promoteur orthologue chez un champignon différent de Trichoderma reesei.

[0024] Dans la cassette d’expression selon l’invention, c’est un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon qui est utilisé. Le terme « promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon » fait également référence au « promoteur TEF1 natif » de l’espèce de champignon. Typiquement, le promoteur TEF1 chez Trichoderma reesei étant représenté par SEQ ID NO : 1 , alors c’est un promoteur de SEQ ID NO : 1 qui doit être utilisé dans la cassette d’expression destinée à être intégrée lorsque le champignon hôte est Trichoderma reesei. En d’autres termes, le promoteur TEF1 qui doit être utilisé, dans la cassette d’expression selon l’invention, doit être identique au promoteur TEF1 naturellement présent dans l’espèce de champignon qui va être transformée. A titre d’exemple, si le champignon hôte utilisé est Saccharomyces cerevisiae, alors le promoteur TEF1 à utiliser dans la cassette d’expression est le promoteur TEF1 endogène/natif de Saccharomyces cerevisiae. Le terme « promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène » signifie que la séquence du promoteur TEF1 utilisé est strictement identique à celle du promoteur endogène, mais également que la séquence du promoteur TEF1 utilisé peut varier au niveau de certains nucléotides (non essentiels à la fonction du promoteur).

[0025] Le promoteur TEF1 présent dans une espèce de champignon peut aisément être déterminé, par exemple à l’aise des bases de données telles que FungiDB, par séquençage du génome du champignon ou toute autre technique appropriée. Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut ainsi comprendre avant l’étape de transformation une étape optionnelle de détermination de la séquence du promoteur TEF1 naturellement présent dans le champignon destiné à être transformé.

[0026] Selon l’invention, le terme « plusieurs copies » s’entend d’au moins deux copies. Selon un mode de réalisation préféré, entre 2 et 15 copies du gène d’intérêt sont insérées dans le génome du champignon transformé, de préférence entre 2 et 11 copies. Entre 2 et 15 copies s’entend bien entendu de toutes les valeurs comprises entre 2 et 15, soit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15.

[0027] L’étape de transformation s’entend de toute technique permettant l’intégration de la cassette d’expression dans le génome du champignon. Une telle technique est bien connue de l’homme du métier et s’entend par exemple de la biolistique (Te'o VS, Bergquist PL, Nevalainen KM. ,(2002). Biolistic transformation of Trichoderma reesei using the Bio-Rad seven barrels Hepta Adaptor System. J Microbiol Methods. 51(3):393-9) ou la méthode des protoplastes (Penttilà M, Nevalainen H, Ràttô M, Salminen E, Knowles J., (1987). A versatile transformation System for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene. 61 (2):155-64).

[0028] Selon l’invention, un « vecteur » s’entend de toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans une cellule hôte (ici le champignon). Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l’invention est un vecteur intégratif (de préférence un plasmide intégratif), permettant l’intégration de la cassette d’expression dans le génome du champignon. Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur ne comprend pas d’origine de réplication fongique.

[0029] Selon l’invention, une « cassette d’expression » comprend un fragment d’ADN (le gène d’intérêt) placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Ledit fragment d’ADN est ainsi placé sous le contrôle du promoteur TEF1. Selon l’invention, la cassette d’expression comprend au moins (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt, et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.

[0030] Selon l’invention, le terminateur utilisé dans la cassette d’expression selon l’invention est un terminateur différent du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon (c’est-à-dire le terminateur TEF1 natif de l’espèce de champignon). Selon l’invention, un terminateur TEF1 d’un autre champignon peut donc être utilisé, à la condition que ce soit un terminateur TEF1 différent du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon transformée (c’est le cas si le terminateur TEF1 a un pourcentage d’identité inférieur ou égal à 75% par rapport à la séquence du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon transformé). Selon un autre mode de réalisation particulier, le terminateur est différent d’un terminateur TEF1 endogène d’une espèce de champignon différente de l’espèce de champignon transformée. Selon un mode de réalisation particulier, le terminateur est un terminateur différent d’un terminateur TEF1. En d’autres termes il ne s’agit pas d’un terminateur dit terminateur TEF1 chez une espèce. Par exemple un terminateur CBH1 peut être utilisé.

[0031] Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur intégratif selon l’invention (de préférence un plasmide) comprend une cassette d’expression telle que susmentionnée et un marqueur de sélection. Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur intégratif selon l’invention comprend une cassette d’expression telle que susmentionnée, une origine de réplication non fongique (par exemple bactérienne) et un marqueur de sélection. L’expression « marqueur de sélection » s’entend d’un gène dont l’expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Le marqueur de sélection est un marqueur compatible avec l’hôte. L’utilisation d’un marqueur de sélection permet en effet d’identifier les champignons ayant intégré une modification génétique par rapport à celles qui ne l’ont pas intégrée. Il s’agit par exemple d’un gène de résistance aux antibiotiques, notamment le gène de résistance à l’antibiotique hygromycine hph.

[0032] Les champignons possèdent naturellement une copie du gène TEF1, sous la dépendance du promoteur TEF1. Selon l’invention, l’insertion multicopie est ainsi réalisée de façon à ce que l’expression du gène TEF1 endogène de l’espèce de champignon transformée soit maintenue. En d’autres termes, la séquence codante TEF1 et le promoteur TEF1 endogènes sont fonctionnels et présentent une expression de type sauvage. Selon un mode de réalisation, dans le procédé pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, l’insertion est réalisée en amont du promoteur TEF1 endogène dans le génome dudit champignon. En effet, comme indiqué ci-dessous, les champignons possèdent naturellement une copie du gène TEF1, sous la dépendance du promoteur TEF1. Selon ce mode de réalisation, l’insertion multicopie est donc réalisée en amont du promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon transformée. L’insertion est ainsi réalisée en 5’ du promoteur TEF1 endogène. De préférence, dans le procédé selon l’invention, l’insertion est ainsi réalisée entre 750 et 1250 paires de bases, de préférence environ 1000 paires de bases, par rapport au site d’initiation de la traduction du gène codant pour TEF1. De préférence, dans le procédé selon l’invention, l’insertion est ainsi réalisée entre 750 et 1250 paires de bases, de préférence environ 1000 paires de bases, par rapport au site d’initiation de la traduction du gène codant pour la protéine TEF1 de SEQ ID NO : 2 ou une protéine ayant au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO : 2.

[0033] Le choix du promoteur TEF1 et de la localisation de l’insertion multicopie de la cassette telle que définie selon l’invention, présentent plusieurs avantages. (1) Le promoteur TEF1 présente l’avantage d’être un promoteur fort, permettant ainsi un nombre de transcrits important à partir d’une même source de carbone. (2) Tout comme le gène TEF1, les gènes d’intérêts sous la dépendance du promoteur TEF1 ont ainsi une expression continue, essentiellement constitutive, et peu soumise à des systèmes de répression. (3) La séquence du promoteur TEF1 correspond également à la seule région flanquante nécessaire pour cibler le locus TEF1. Selon un mode de réalisation selon l’invention, la cassette d’expression selon l’invention comprend ainsi une seule région flanquante pour cibler le locus cible de l’insertion (la région en 5’ du promoteur TEF1).

[0034] Selon un mode de réalisation de l’invention, le gène TEF1 endogène sous la dépendance du promoteur TEF1 endogène sont conservés dans le génome transformé dudit champignon.

[0035] Parmi les champignons utilisables selon l’invention, on peut citer certains champignons du phylum des Ascomycètes (Ascomycota), des Basidiomycètes ( Basidiomycota ) et des Zygomycètes (Zygomycota). Dans un aspect préféré, selon l’invention, le champignon est un champignon filamenteux. Selon un mode de réalisation, le champignon filamenteux est choisi parmi les classes des orbiliomycètes, des pézizomycètes, des dothideomycètes, des eurotiomycètes, des lecanoromycètes, des léotiomycètes, des sordariomycètes et des saccharomycètes, de préférence les sordariomycètes. De façon avantageuse, le champignon selon l’invention appartient au genre Trichoderma, et plus particulièrement à l’espèce Trichoderma reesei.

[0036] Selon l’invention, un « gène d’intérêt » s’entend de tout gène dont la production est souhaitée. De préférence, le gène d’intérêt code pour une protéine d’intérêt. Selon l’invention, les protéines d’intérêt sont toutes les protéines pouvant être produites par un champignon, de façon naturelle (telles que les enzymes) ou bien par modification génétique (par exemple après transformation à l’aide d’un vecteur approprié). La protéine d’intérêt peut être endogène ou exogène. La protéine d’intérêt peut être une protéine native (telle que retrouvée dans la nature), une protéine chimérique, une protéine synthétisée ou bien un variant d’une protéine native, présentant notamment des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Selon un mode de réalisation, la séquence du gène d’intérêt peut comprendre des éléments additionnels appropriés comme, par exemple, une séquence codant pour un signal de sécrétion. Les protéines d’intérêt peuvent être des protéines utiles à tout type d’industrie (la production de biocarburant, alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique, ...)

[0037] Selon un mode de réalisation, dans le procédé selon l’invention, le gène d’intérêt code pour une enzyme, notamment une enzyme cellulolytique telle qu’une cellulase ou une hémicellulase. De façon préférée, les enzymes sont des cellulases. Selon l’invention, le terme « cellulases » s’entend plus particulièrement des enzymes choisies parmi les endoglucanases, les exoglucanases et les glucosidases, et plus particulièrement la b-glucosidase. Le terme « cellulase » fait plus particulièrement référence à une enzyme adaptée à l'hydrolyse de la cellulose et permettant aux microorganismes (tels que Trichoderma reesei) qui les produisent d'utiliser la cellulose comme source de carbone, en hydrolysant ce polymère en sucres simples (glucose).

[0038] Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape de sélection de la souche transformée, après l’étape de transformation. [0039] Les définitions et modes de réalisation relatif au premier aspect de l’invention s’appliquent mutatis mutandis aux autres aspects. Par exemple, toutes les définitions et préférences indiquées dans le premier aspect de l’invention ci-dessus s’appliquent également au deuxième, troisième, quatrième, cinquième, sixième et septième aspect de l’invention décrits ci- après.

[0040] Dans un second aspect, l’invention concerne également l’utilisation d’une cassette d’expression pour insérer plusieurs copies d’un gène d’intérêt dans le génome d’un champignon, ladite cassette d’expression comprenant :

- un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- un gène d’intérêt,

- un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon.

[0041] Dans un troisième aspect, l’invention concerne aussi un procédé de production d’une biomasse comprenant les étapes suivantes :

- (i) une étape de transformation d’un champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- (ii) une étape de culture du champignon, dans un milieu de culture approprié.

[0042] Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de production d’une biomasse comprend une étape de sélection d’un champignon transformé entre l’étape de transformation et l’étape de culture.

[0043] Selon un mode de réalisation, le milieu de culture peut comprendre un ou plusieurs substrats nécessaires à la croissance du champignon.

[0044] Dans un quatrième aspect, l’invention concerne aussi un procédé de production d’une protéine d’intérêt comprenant les étapes suivantes :

- (i) une étape de transformation d’un champignon à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour ladite protéine d’intérêt et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- (ii) une étape de culture du champignon transformé à l’étape (i) dans des conditions permettant la production de la protéine d’intérêt.

[0045] Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de production d’une protéine d’intérêt comprend une étape de sélection d’un champignon transformé entre l’étape de transformation et l’étape de culture.

[0046] L’étape de culture s’entend d’une culture dans un milieu approprié. Il s’agit d’un milieu adapté à la survie du champignon transformé et/ou à la croissance du champignon et/ou à la production de la protéine d’intérêt, voire sa sécrétion. Il peut s’agit d’un milieu adapté à la culture du champignon, complété au besoin pour devenir un milieu adapté à la production et/ou sécrétion de la protéine d’intérêt.

[0047] De façon avantageuse, plus particulièrement lorsque le gène d’intérêt code pour une enzyme cellulolytique, ledit procédé de production d’une protéine d’intérêt comprend aussi une phase de croissance d’une souche de champignon transformée selon l’invention, puis une phase de croissance et de production de protéines d’intérêt. Encore plus préférentiellement, ladite phase de croissance est réalisée en présence d’un substrat de croissance et ladite phase de croissance et de production de protéines d’intérêt est réalisée en présence d’un substrat inducteur. Le substrat de croissance et le substrat inducteur sont de préférence des substrats carbonés.

[0048] Ainsi, le substrat carboné de croissance est choisi de préférence parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique.

[0049] Le substrat carboné inducteur est ainsi choisi de préférence parmi le lactose, le cellobiose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique.

[0050] Selon un mode de réalisation, le procédé de production d’une protéine d’intérêt peut comprendre une étape de sécrétion de ladite protéine d’intérêt. La sécrétion peut être consécutive ou concomittante à la production de la protéine d’intérêt.

[0051] Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne un procédé de production de sucre à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant les étapes suivantes :

- (i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,

- (ii) une étape d’utilisation d’un champignon transformé à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour une enzyme cellulolytique et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- (iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat.

[0052] Les sucres (ou jus sucré) sont ainsi obtenus à l’issue de l’étape d’hydrolyse. De préférence ce sont des sucres en Cs-Ce.

[0053] Selon un mode de réalisation, ledit procédé de production de sucres peut également comprendre un ou plusieurs étapes de séparation. Ceci permet ainsi de séparer, notamment par distillation, les différents produits d’intérêt dilués dans l’eau.

[0054] Dans un sixième aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'un alcool à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant les étapes suivantes : - (i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité,

- (ii) une étape d’utilisation d’un champignon transformé à l’aide d’un vecteur comprenant une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon, (2) un gène d’intérêt codant pour une enzyme cellulolytique et (3) un terminateur, à l’exception du terminateur TEF1 endogène de l’espèce de champignon,

- (iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat,

- (iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu,

- (v) une étape de séparation, notamment par distillation.

[0055] L’alcool ainsi obtenu est par exemple utilisé comme un biocarburant. L’alcool ainsi obtenu peut aussi être utilisé comme solvant ou comme produit intermédiaire dans l’industrie chimique.

[0056] Selon l’invention, le terme « biocarburant » s’entend plus particulièrement d’un biocarburant de seconde génération, c’est-à-dire issu de ressources non alimentaires. Selon l’invention, le terme « biocarburant » peut également être défini comme étant tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D’une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d’exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol selon le type d’organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d’acides gras), ainsi que l’hydrogène. Le biocarburant est ainsi un alcool ou un biogaz..

[0057] De manière préférée, l’alcool est par exemple l’éthanol, le butanol, l’isopropanol, le 1 ,2- propane diol, le 1 ,3-propane diol, le 1 ,4-butane diol, et/ou le 2,3-butane diol. Plus préférentiellement, il s’agit de l’éthanol.

[0058] Selon un mode de réalisation préférée, lesdites étapes iii) et iv) sont réalisées simultanément. Cela est typiquement le cas dans les procédés de production dits « SSF » (Simultaneous Saccharification and Fermentation).

[0059] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique est une étape de mise en suspension en phase aqueuse dudit substrat cellulosique ou lignocellulosique.

[0060] Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolysat obtenu à l’étape iii) est un hydrolysat contenant des sucres en Cs-Ce, notamment du glucose.

[0061] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu est une étape de fermentation, en présence d'un organisme fermentaire, du glucose issu de l'hydrolysat de manière à produire un moût de fermentation. Un organisme fermentaire est par exemple une levure.

[0062] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de séparation est une séparation du biocarburant et du moût de fermentation, notamment par distillation.

[0063] Selon un mode de réalisation encore plus préféré, le substrat cellulosique ou lignocellulosique à hydrolyser est mis en suspension en phase aqueuse à raison de 6 à 40% de matière sèche, de préférence 20 à 30%. Le pH est ajusté entre 4 et 5,5, de préférence entre 4,8 et 5,2 et la température entre 40°C et 60°C, de préférence entre 45°C et 50°C. La réaction d'hydrolyse est démarrée par l'ajout des enzymes agissant sur le substrat prétraité. La quantité d’enzymes habituellement utilisée est de 10 à 30 mg de protéines excrétées par gramme de substrat prétraité ou moins. La réaction dure généralement de 15 à 48 heures. La réaction est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose. La solution de sucres est séparée de la fraction solide non hydrolysée, essentiellement constituée de lignine, par filtration ou centrifugation et ensuite traitée dans une unité de fermentation.

[0064] Selon un autre mode de réalisation encore plus préféré, lorsque l’étape d’hydrolyse et de fermentation sont réalisées conjointement, les enzymes et l'organisme fermentaire sont ajoutés simultanément puis incubés à une température comprise entre 30°C et 35°C pour produire un moût de fermentation. Selon ce mode de réalisation, la cellulose présente dans le substrat pré-traité est convertie en glucose, et en même temps, dans le même réacteur, l'organisme fermentaire (par exemple une levure) convertit le glucose en produit final selon un procédé de SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) connu de l'homme du métier. Selon les capacités métaboliques et hydrolytiques de l'organisme fermentaire, le bon déroulement de l'opération peut nécessiter l'addition d'une quantité plus ou moins importante de mélange cellulolytique exogène.

[0065] Dans un septième aspect, l’invention concerne aussi une souche telle qu’obtenue par le procédé de l’invention. L’invention concerne également une souche de champignon comprenant dans son génome plusieurs copies d’un gène d’intérêt sous la dépendance d’un promoteur TEF1 identique au promoteur TEF1 endogène de l’espèce de champignon génétiquement modifiée.

[0066] Les séquences de la présente invention sont décrites dans le Tableau 1 .

[0067] [Tableau 1]

[0068] Séquences de l’invention

[0069] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées et des exemples qui visent uniquement à illustrer l’invention, sans la limiter.

Brève description des Figures Fig. 1

[0070] [Fig. 1] représente la construction du plasmide utilisé dans l’Exemple 1.

Fig. 2

[0071] [Fig. 2] représente l’intensité de la fluorescence par unité de taille de spores de Trichoderma reesei en train de germer. La Figure 2 représente les résultats de 8 transformants : E1 , E2, E3, E4, E5, E6, E8 et E9 et celles de 3 souches non transformées : CL847-1 , CL847-2 et CL847-3.

Fig. 3

[0072] [Fig. 3] représente le promoteur TEF (TEF1) en amont du gène TEF1 dans le génome d’un champignon. Fig. 4

[0073] [Fig. 4] représente une illustration de l’intégration dans le transformant E1. 7 copies du gène d’intérêt EGFPont été intégrées. La triple indication « (1) le promoteur TEF1 , (2) le gène d’intérêt EGFP et (3) le terminateur CBH1 » illustre que la cassette a été correctement intégrée et que le gène EGFP est fonctionnel.

Fig. 5 [0074] [Fig. 5] représente une illustration de l’intégration dans le transformant E3. 10copies du gène d’intérêt EGFP ont été intégrées. La triple indication « (1) le promoteur TEF1 , (2) le gène d’intérêt EGFP et (3) le terminateur CBFI1 » illustre que les cas où la cassette a été correctement intégrée et que le gène EGFP est fonctionnel.

[0075] Exemples

[0076] Exemple 1 : Construction d’un vecteur contenant une cassette d’expression selon l’invention

[0077] Le plasmide de construction suivante a été obtenu :

- une origine de réplication d ’Escherichia coli ,

- un marqueur de sélection comprenant un promoteur fongique « cpc » et bactérien « IM7 » suivi du gène de résistance à l’Flygromycine (hph) et du terminateur fongique « TrpC »,

- une cassette d’expression comprenant (1) un promoteur TEF1 , (2) suivi du gène EGFP exprimant une protéine fluorescente verte et (3) le terminateur CBFI1 .

[0078] Ce vecteur peut être obtenu par toute méthode classique, bien connue de l’homme du métier. La construction de ce plasmide est présentée en Figure 1 . L’homme du métier peut par ailleurs aisément obtenir un vecteur (de type plasmidique) comprenant une cassette d’expression selon l’invention et un marqueur de sélection permettant de sélectionner les champignons transformés.

[0079] Exemple 2 : Transformation d’un champignon avec le vecteur d’expression de l’Exemple 1

[0080] Le plasmide de l’Exemple 1 a été utilisé pour transformer la souche de Trichoderma reesei dite CL847 (Durand H, Clanet M, Tiraby G. Genetic improvement of Trichoderma reesei for large scale cellulase production. Enzyme Microb Technol 1988, 10:341-346; Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. FIESLOT Ed, pp 39- 50).

[0081] Les transformants ont été sélectionnés sur leur capacité à croître sur un milieu contenant de l’Flygromycine.

[0082] Les repiquages ont mis en évidence des macroscopies différentes sur boite entre les transformants. Seuls ceux présentant au bout de 3 repiquages, une croissance à confluence du périmètre des boites de pétri de 9 cm, et arborant un tapis de spore dense, vert et hydrophobe ont été conservés.

[0083] Au bout de ces 3 étapes de sélection, huit transformants ont été conservés et utilisés pour une caractérisation en cytométrie en flux. L’étude de la fluorescence a permis de mettre en évidence huit niveaux d’expression de la fluorescence (Erreur ! Source du renvoi introuvable.).

[0084] L’intensité de la fluorescence par unité de taille de spores de Trichoderma reesei en train de germer est présentée en Figure 2. Ces mesures ont été réalisées à l’aide d’un cytomètre. [0085] L’étude génomique de quatre des huit transformants étudiés en cytométrie a permis de mettre en évidence le site d’insertion, et le nombre de copie du plasmide. Dans les quatre cas étudiés, toutes les insertions se sont faites en amont du promoteur TEF1. Le promoteur natif et constitutif du gène TEF1 est conservé. [0086] La Figure 3 illustre le gène TEF1 sous la dépendance du promoteur natif et constitutif du gène TEF1 dans le génome du champignon.

[0087] La Figure 4 représente une illustration de l’intégration dans le transformant E1. 7 copies du gène d’intérêt EGFP ont été intégrées

[0088] La Figure 5 représente une illustration de l’intégration dans le transformant E3. 10 copies du gène d’intérêt EGFP ont été intégrées.