Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Ver¬ fahren zur Kultivierung und Behandlung von Biokatalysatoren, wie Zellen, Partikel oder lösliche, chemische und/oder bio¬ logische Reaktionen beeinflussende Substanzen, bei welchen ein Reaktionsgefäss um seine Längsachse drehbar angeordnet und mit wenigstens einem Reaktionsraum versehen ist.

Bei den bekannten Vorrichtungen dieser Art, den sogenannten Rollkulturen, sind im wesentlichen zylindrische Flaschen vorgesehen, die auf auf einem Gestell angeordneten Rollen aufliegen, welche für die Rotation der Flaschen antreibbar sind. Eine solche Lösung ist z.B. in der US-PS- 4,238,568 enthalten. Diese Flaschen sind teilweise mit beimpfter Reak- tionsflussigkeit gefüllt, das restliche Flaschenvolumen ist durch ein für die Reaktion benötigtes Gas, z.B. Luft, ausge¬ füllt. Die Rollkultur erlaubt dabei sowohl die Kultivie¬ rung von Suspensionszellen wie auch von Zellen, die an der zylindrischen Innenfläche der Rollflaschen verankert sind, jedoch ausschliesslich in chargenweiser Kultivierungsmetho- de. Sie kann als Standardtechnik der Kultur von empfindli¬ chen Zellen gewertet werden und wird für die Routinekulti¬ vierung von Zellen aller Art im Labor eingesetzt. Für die technologische Produktion bzw. Vermehrung von tierischen Zellen wird die Technik der Rollkultur durch Verwendung von bis zu tausenden Rollerflaschen eingesetzt, um auf diese Weise eine assstabsvergrδsserung, das sogenannte "Scale up" _; in multiplen Einheiten zu erzielen.

Die Vorteile der Rollkultur und ihr routinemässiger Einsatz für Kulturen aller Art sind eindeutig darauf zurückzuführen.

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dass die Rotation, also das Rollen, von zylindrischen Fla¬ schen in langsamer Bewegung die schonendste Methode dar¬ stellt, ein Zellsystem zu Belüften und/oder in Suspension zu halten.

Die bekannte Rollkultur ist jedoch insofern nachteilig, weil sie nur chargenweise betrieben werden kann, d.h., dass kon¬ tinuierliche Kultivierung oder Perfusionskultivierung nicht möglich sind. Dies zuletzt auch deshalb, weil eine gesteuer¬ te Durchlüftung des Flascheninnenraumes nicht möglich ist. Weiters ist die Vergrδsserung des Betriebsmassstabes, also das Scale up, auf die Verwendung vom Vielfachen der Zahl der Rollerflaschen begrenzt. Darüberhinaus ist eine Immobilisie¬ rung der Zellen, d.h. eine künstliche Anreicherung der Zel¬ len über das natürliche Gleichgewicht hinaus in kontinuier- licher Kultur nicht möglich. Schliesslich führt das Scale up einer einzelnen Rollerflasche in der konventionellen zylin¬ drischen Form zu einem ungünstigen Verhältnis von benetzba¬ rer Oberfläche zum effektiven Volumen der Flüssigkeit in der Rollerflasche, wodurch der interphasiale Stofftransport ver- mindert wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, welche bei kontinuierlicher Kul- tivierungs- und Behandlungsmethode eine höhere Dichte von Biokatalysatoren ermöglicht.

Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass in dem Reaktionsgefäss zu dessen Längsachse hin sich er¬ streckende flache Teile angeordnet sind, dass die Zufuhr der Reaktionsflüssigkeit an .einem Ende des Reaktionsgefässes und die Abfuhr des fertigen Reaktionsproduktes an demselben oder anderem Ende des Reaktionsgefässes ausgebildet sind und dass das Innere des Reaktionsgefässes mit Gas beschickbar ist. Dadurch wird ermöglicht, die schonenden physikalischen Prin¬ zipien der Rollkultivierung zu nutzen und darüberhinaus hin¬ sichtlich der Betriebsweise auf alle bekannten Methoden der

kontinuierlichen Kultivierungsweise von Zellen oder Biokata¬ lysatoren, der Immobilisierung von Zellen oder anderer Bio¬ katalysatoren mit praktisch unbegrenztem interphasialem Stofftransport anzuwenden. So wird also ein hoher interpha- sialer Stofftransport unter physikalisch schonenden Bedin¬ gungen zwischen fester Biophase, flüssiger Phase und Gaspha¬ se gewährleistet.

Zellen, wie tierische Zellen, pflanzliche Zellen, parasitäre Mikroorganismen, in vitro Systeme also, die unter physika- lisch milden, also unter weitestgehend stress-freien Bedin¬ gungen, einen hohen Stofftransport benötigen, zählen zu den hauptsächlichsten Zielgruppen, für deren Kultivierung bzw. Behandlung die gegenständliche Erfindung bestimmt ist. Sie ermöglicht auch biochemische Umsetzreaktionen, die hohe An- sprüche an die Kombination eines hohen interphasialen Stoff¬ transportes mit physikalisch schonenden Bedingungen verknüp¬ fen.

Zusätzlich zu den genannten Bedingungen eines maximalen in¬ terphasialen Stofftransportes unter schonenden physikali- sehen Bedingungen vereint die gegenständliche Erfindung noch die reaktionskinetischen Vorteile eines Rδhrenreaktors und der künstlichen Anreicherung des für die Reaktion notwendi¬ gen Biokatalysators, wodurch es möglich ist, natürlich be¬ stehende Gleichgewichte einer Reaktion zugunsten einer hδhe- ren Produktions- bzw. Umsatzrate in Richtung einer erhöhten Reaktorraum/Zeit-Ausbeute positiv zu beeinflussen. Schliess- lich ermöglicht die vorliegende Erfindung noch, zusätzlich zu den Vorteilen einfacher verfahrenstechnischer Vorgangs¬ weisen eine maximale Anpassung an den Typus der biokatalyti- sehen Reaktion mit Zellen oder Molekülen vorzunehmen.

Die allgemeine Problematik bei der Züchtung empfindlicher Zellen ist beispielsweise in Acta Biotechnologica 2 (1982) 1 , 3-41 , beschrieben.

Vorteilhafterweise bestehen die sich zu der Längsachse er¬ streckenden flachen Teile aus Ringscheiben, wodurch eine Oberflächenvergrδsserung erzielt wird, ohne dass die enthal¬ tenden Zellen oder dergleichen mechanisch beansprucht wer- den. Dabei können die flachen, radial nach innen gerichteten Teile durch ungelochte Ringscheiben gebildet sein, wodurch über den gesamten Umfang des Reaktionsgefässes gleichmässige Verhältnisse erzielt werden. Nach einer zweckmässigen Lösung bestehen die flachen, radial nach innen gerichteten Teile aus ringförmig angeordneten getrennten Segmenten. Ein Vor¬ teil dieser Lösung ist darin zu sehen, dass zwischen den Segmenten freie Durchgangsspalten entstanden sind, durch welche die Flüssigkeit strömen kann. Eine andere Art kon¬ struktiv einfach da ^* s Kommunizieren der Zwischenräume zu er- reichen besteht darin, dass wenigstens einige der flachen radial nach innen gerichteten Teile perforiert sind. Eine zweckmässige Variante besteht darin, dass die flachen, ra¬ dial nach innen gerichteten Teile als schneckenartige Fδr- derstreifen ausgebildet sind. Weil diese Förderschnecke im Inneren des Reaktionsgefässes angeordnet ist, transportiert sie die Flüssigkeit während der Rotation von einem Ende des Reaktionsgefässes zum anderen. Das Reaktionsgefäss kann im Bereich der darin befindlichen Reaktionsflüssigkeit durch ungelochte Ringscheiben unterteilt sein, wodurch eine Unter- teilung des Reaktorinnenraumes in einzelne Abschnitte er¬ reichbar ist. Für einen besonders guten interphasialen Stofftransport können die flachen, radial nach innen gerich¬ teten Teile für die oberflächliche Aufnahme der Biokatalysa¬ toren bzw. der Reaktionsflüssigkeit ausgebildet sein. Dazu können die flachen, radial nach innen gerichteten Teile oberflächenmodifiziert sein. Um die Biokatalysatoren in ei¬ nem besonders günstigen Produktionsverhältnis an den flachen radial nach innnen gerichteten Teilen festlegen zu können, können auf diesen Teilen die Biokatalysatoren immobilisie- rende Beläge aufgebracht sein.

Um ein leichtes Scale up zu erzielen kann die Reaktions-

flüssigkeit an mehreren Stellen der Längserstreckung des Re¬ aktionsgefässes zuführbar und/oder das fertige Reaktionspro¬ dukt an mehreren Stellen der Längserstreckung des Reaktions¬ gefässes abführbar sein, wodurch auch ein Betrieb des Reak- tors mit teilweiser Befüllung möglich ist. Eine weitere Form der Immobilisierung der Zellen oder Biokatalysatoren ist auch darin gelegen, dass zwischen den flachen, radial nach innen gerichteten Teilen in der Reaktionsflüssigkeit suspen¬ dierte Trägerpartikel für die Biokatalysatoren angeordnet sind.

Weitere Vorteile der er indungsgemässen Vorrichtung sind auch darin zu erblicken, dass eine künstliche Anreicherung von Zellen, eine Immobilisierung löslicher oder suspendier¬ ter Biokatalysatoren oder die Erzielung der Reaktionskinetik eines Rδhrenreaktors, eines sogenannten plug flow reactor, zur Erhöhung der Raum/Zeit-Ausbeuten und Menge an gebildetem Produkt pro Volumeneinheit ermöglicht ist, und dass die _# künstliche Anreicherung von Zellen bzw. Biokatalysatoren durch chemische Bindungen erzielt werden kann. Weiters ist eine künstliche Anreicherung von Einzelzellen in freier Sus¬ pension von Zellaggregaten oder Pellets, von Zellen auf Mi- crocarriern oder in Mikrokapseln hinaus über jenes Ausmass möglich, das durch die Prinzipien der kontinuierlichen Kul¬ tur (flow cultures) vorgegeben ist. Die genannten Biokataly- satoren, also die Biophasen, werden dabei durch physikali¬ sche Kräfte, wie Schwerkraft, Zentrifugalkraft oder derglei¬ chen, im Reaktor zurückgehalten, während die flüssigen Pha¬ sen im Reaktor erneuert werden. Ausserdem sind durch die Auslegung der geometrischen Konfiguration der Apparatur und deren Betriebsbedingungen alle wesentlichen Aspekte für ei¬ nen bestimmten Prozess optimal auslegbar und in beliebige Betriebsgrδssen umsetzbar (scale up) .

Die Kultivierung und Behandlung von Biokatalysatoren mit der erfindungsgemässen Vorrichtung wird so durchgeführt, dass in das Reaktionsgefäss die Reaktionsflüssigkeit und die Bioka-

talysatoren eingebracht, das Reaktionsgefäss in Drehung ge¬ setzt und der Innenraum des Reaktionsgefässes mit Reaktions¬ gas permanent beschickt wird. Zweckmässig wird nach Errei¬ chen der gewünschten Konzentration an Biokatalysatoren wei¬ tere Reaktionsflüssigkeit eingebracht und das fertige Reak- tionsprodukt abgeführt. Manchmal ist es vorteilhaft, wenn die Reaktionsflüssigkeit an mehreren Stellen in das Reak¬ tionsgefäss eingebracht und an mehreren Stellen aus dem Re¬ aktionsgefäss abgeführt, z.B. abgesaugt wird. Für das Absau¬ gen des Reaktionsproduktes werden ein oder mehrere Absaug- röhre in den bzw. die Reaktionszwischenräume zwischen den Ringscheiben abgesenkt. Zum Durchmischen der im Reaktionsge¬ fäss befindlichen Phasen wird zweckmässig die Umdrehungsge¬ schwindigkeit des Reaktionsgefässes erhöht. Bei diesem Ver¬ fahren nützt man die Zentrifugalkraft aus. Bei einer ausrei- chenden Zentrifugalkraft kann man auch das Abtrennen der dichteren, die Biokatalysatoren enthaltenden Phase, von der eine geringere Dichte aufweisenden Reaktionsflüssigkeit, er¬ reichen. Aus wirtschaftlichen Gründen kann man auch ^' mehrere Reaktionsgefässe in Serie schalten.

Die Erfindung wird näher anhand einiger Zeichnungen erläu¬ tert:

Es zeigen:

Fig. 1 einen schematischen Schnitt durch eine erfindungs- gemässe Gesamtanlage, wobei die Führung der Phasen durch das Reaktionsgefäss angedeutet sind,

Fig. 1a in vergrδssertem Massstab den linken Teil des Reak¬ tionsgefässes aus der Fig. 1,

Fig. 2 vier Ausführungsformen der flachen, radial nach in- nen gerichteten Teile,

Fig. 3 den Schnitt III-III aus Fig. 2a,

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Fig. 4 zwei Ringscheiben in perspektivischer Ansicht,

Fig. 5 eine Lösung mit einem konischen Reaktionsgefäss und mit gleichem Flüssigkeitsniveau,

Fig. 6 eine Variante mit einem konischen Reaktionsgefäss und mit stufenweise angeordneten Ringscheiben,

Fig. 7 schematisch die Kultur von suspendierten Zellen mit einem schneckenartigen Fδrderstreifen,

Fig. 8 die Verteilung der im Reaktionsgefäss befindlichen Flüssigkeiten bei im Reaktionsgefäss durch die Zen- trifugalkraft des schnell rotierenden Reaktionsge¬ fässes zurückgehaltenen Zellen,

Fig. 9 die Betriebsweise der erfindungsgemässen Vorrich¬ tung mit an der Innenseite des Reaktionsgefässes immobilisierten Zellen oder Biokatalysatoren,

Fig. 10 eine Kombination einzelner Reaktionsgefasse zu ei¬ nem Reaktorverband, wobei je nach Einsatz der Vor¬ richtung beliebige Kombinationen möglich sind,

Fig. 11 eine Ausführungsform, in der schematisch die sedi- mentierten Trägerpartikeln eingezeichnet sind,

Fig. 12 eine schematische Anordnung der Zufuhr- und Abfuhr¬ rohre und

Fig. 13 eine Ansicht von links auf die Lösung gemäss der Fig. 12.

Mit Fig. 1 ist das Reaktionsgefäss bezeichnet, das in seinem Inneren zu seiner horizontalen .Längsachse 1' hin gerichtete, mit der Gefässwandung im Kontakt stehende flache, radial nach innen gerichtete Teile 3 aufweist. Bei den Ausführungs-

beispielen mit Ausnahme der Fig. 2d und Fig. 7 sind die fla¬ chen, radial nach innen gerichteten Teile 3 durch Ringschei¬ ben 3a,b,c gebildet, die je nach dem Einsatzgebiet der er- findungsgemässen Vorrichtung entsprechend oberflächenmodini- ziert sind. So können sie für eine gute Benetzbarkeit aufge¬ rauht oder beschichtet sein oder spezielle Beläge aufweisen, an denen die Zellen bzw. Biokatalysatoren immobilisiert wer¬ den. Als derartige Beläge kommen Vliese, Flore, Schwämme oder dergleichen in Betracht, die an der Oberfläche der fla- σhen, radial nach innen gerichteten Teile 3 befestigt sind. Diese Teile 3 liegen dabei mit ihren Aussenkanten direkt an der Innenwandung dos Reaktorgefässes 1 an. Wie in Fig. 1 schematisch dargestellt, sind die flachen, radial nach innen gerichteten Teile 3 in diesem Fall als gelochte Ringscheiben 3c ausgebildet, wobei lediglich eine ungelochte Ringscheibe 3a (s. Fig. 2) zwischengeschaltet ist. Dadurch ist im Be¬ reich der Reaktionsflüssigkeit der Innenraum des Reaktions¬ gefässes unterteilt, da durch die ungelochte Ringscheibe 3a ein Durchtritt von Flüssigkeit verhindert ist, wogegen durch die gelochten Ringscheiben 3c ein Flüssigkeitsaustausch zwi¬ schen den einzelnen Reaktionszwischenräumen 2 erfolgen kann.

Das Reaktionsgefäss 1 liegt auf paarweise angeordneten Rol¬ len 4 auf, mittels welcher es um seine horizontale Längsach¬ se 1 ¹ drehbar ist. In Fig. 1 sind zwei Paare Rollen 4 als Abstützelemente auch im oberen Teil des Reaktionsgefässes 1 eingezeichnet. Diese Konstruktion mit vier Paaren von Rollen 4 ist für den Fall bestimmt, dass man für die Rotation des Reaktionsgefässes 1 grosse Geschwindigkeiten verwenden will, um die Zentrifugalkraft ausnützen zu können. An seinen Enden ist das Reaktionsgefäss offen, wodurch es den Charakter ei¬ nes sogenannten Rδhrenreaktors aufweist. Über die eine Öff¬ nung 5 ist Gas und Nährlösung einbringbar und über die ande¬ re Öffnung 6 ist das fertige Reaktionsprodukt abziehbar und das Reaktionsabgas abführbar. Die Gaszufuhr ist mit 7 und die Gasableitung mit 8 bezeichnet. Die Zufuhr der Reaktions¬ flüssigkeit erfolgt über eine durch die Öffnung 5 in das In-

nere des Reaktionsgefässes 1 reichende Leitung 9, wobei die¬ se sowohl direkt am vorderen Ende des Reaktionsgefässes 1 ausmünden oder aber weiter in das Reaktionsgef ss 1 hinein¬ reichen kann, um die Reaktionsflüssigkeit an verschiedenen Stellen in den Reaktor einbringen zu können, wie dies in der Fig. 1 durch die Pfeile 10 angedeutet ist. Die Abfuhr des fertigen Reaktionsproduktes ist mit 11 bezeichnet, wobei, wie durch die gestrichelte Linie 12 (Fig. 1) gezeigt, der Abzug des fertigen Reaktionsproduktes an den jeweils gün- stigsten Stellen des Reaktionsgef sses 1 erfolgen kann. Dazu kann in einer in dieser Fig. 1 nicht dargestellten Weise ein Absaugrohr vorgesehen sein, das unterschiedlich tief in das Reaktionsgefäss 1 eingeführt und auf die gewünschte Niveau¬ höhe der Flüssigkeit abgesenkt werden kann. Eine solche Aus- fertigung wird später anhand der Fig. 12 und 13 näher er¬ klärt.

Die im Reaktionsgefäss 1 befindliche Reaktionsflüssigkeit bildet im Betrieb eine dünne Schicht 13 an der Innenwandung des Reaktionsgefässes 1 und an den Oberflächen der flachen, radial nach innen gerichteten Teile 3 im Bereich des Kontak¬ tes mit der Flüssigkeit (s. Fig. 5, 6 und 7).

Bei der in Fig. 1 wiedergegebenen Gesamtanordnung ist an beiden Enden des Reaktionsgefässes 1 je ein Behälter 14 bzw. 15 vorgesehen, in welche das Reaktionsgefäss 1 über seine Öffnungen 5, 6 einmündet. Das rotierende Reaktionsge¬ fäss 1 ist dabei gegenüber den feststehenden Behältern 14, 15 über eine Labyrinthdichtung 16 abgedichtet, wobei aller¬ dings Reaktionsgas gegebenenfalls auch über diese Labyrinth¬ dichtung austreten kann, falls im Reaktionsgefäss Überdruck herrscht; dieser Austritt von Reaktionsgas ist durch die punktiert eingezeichneten Pfeile 17 angedeutet. Die gesamte erfindungsgemässe Vorrichtung ist in einem abgeschlossenen Raum 18 angeordnet, in welchem die für die Reaktion nötige Raumtemperatur konstant gehalten werden kann. In diesem Raum werden auch die dargestellten Teile mechanisch gelagert

inkl. eines nicht dargestellten Antriebsmotors.

In Fig. 10 ist eine Kombination zweier Reaktionsgefasse ge¬ mäss Fig. 1 zu einer Batterie dargestellt, wobei das aus dem ersten Reaktionsgefäss austretende Reaktionsprodukt in das darunterliegende Reaktionsgefäss eingebracht wird, wodurch es dort zu einer Fortsetzung des Reaktionsprozesses kommt, bzw. wobei dort die Reaktion unter anderen inneren Bedingun¬ gen fortgesetzt werden kann.

Die Rotation des Reaktionsgefässes 1 gewährleistet einen sehr guten Stofftransport zwischen festen, flüssigen und gasförmigen Phasen. Die Rotationsbewegung kann mit konstan¬ ter oder wechselnder Bewegungsrichtung stetig oder mit wech¬ selnder Geschwindigkeit durchgeführt werden. Die in Fig. 1 gezeigte Art der Beschickung des Reaktionsgefässes mit Flüs- sigkeit und des Abzuges der Produkte und der Flüssigkeiten- verleiht der erfindungsgemässen Vorrichtung den Charakter eines Rohrreaktors, durch dessen reaktionskinetische Vortei¬ le eine verbesserte ProduktUmsetzung erzielt wird. Es ist jedoch auch möglich, die Flüssigkeitszufuhr bzw. -abfuhr in- dividuell auf jeden einzelnen Zwischenraum 2 gezielt vorzu¬ nehmen, wobei die Zwischenräume 2 durch zwischengeschaltete ungelochte Ringscheiben 3a abgeteilt sind. Durch die geome¬ trische Konfiguration kann je nach Bedarf ein ideal an den Prozess angepasstes Verhältnis von benetzbaren Oberflächen in bezug auf ein bestimmtes Füllvolumen erzielt werden, wo¬ bei die Zahl und der Aufbau der flachen, radial nach innen gerichteten Teile 3 und auch die Mantelform des Reaktionsge¬ fässes 1 massgebend sind. Der interphasiale Stofftransport erfolgt an der gesamten benetzten Oberfläche des Reaktions- gefässes 1. Dabei kann letzteres in beliebiger Richtung von dem zur Reaktion benötigten Gas durchströmt werden. Die fla¬ chen, radial nach innen gerichteten Teile 3 können förder¬ schneckenartig ausgebildet sein (Fig. 7), was neben der Oberflächenvergrösserung auch eine Förderwirkung der Reak- tionsflussigkeit bewirkt, wobei z.B. bei sedimentierten Zel-

len oder auf Microcarriern immobilisierten Biokatalysatoren durch eine gegenläufige Schnecke die Zellen gegen die Durch- strδmung der Flüssigkeit durch das Reaktionsgef ss bewegt werden, was die Verweilzeit der Zellen in der Reaktionsflüs- sigkeit entsprechend verlängert.

Zur Kultivierung von Zellen wird das in Fig. 1 dargestellte Reaktionsgefäss 1 in eine langsam rotierende Bewegung um die eigene, horizontale Längsachse -1 ' , vergleichbar einer Roll¬ kultur, versetzt. Die Geschwindigkeit der Bewegung wird der- art gesteuert, dass das Flüssigkeitsniveau im Reaktionsge¬ fäss 1 durch das Niveau der AblaufÖffnung 6 und die horizon¬ tale Lage des Reaktionsgef sses 1 vorgegeben ist. Dabei liegt zufolge des in bezug auf die Eingangsδffnung 5 grδsse- ren Durchmessers der Öffnung 6 der Ablauf tiefer als die Un- terkante der Öffnung 5, wodurch ein Austreten der Flüssig¬ keit durch die Eingangsδffnung 5 verhindert ist. Sollte es _* durch eine unsachgemässe Handhabung oder durch eine etwaige Betriebsstörung zu einem Flüssigkeitsaustritt durch die Öff¬ nung 5 kommen, dann wird die Flüssigkeit im Behälter 14 auf- gefangen und über die Leitung 19 abgeführt. Das fertige Re¬ aktionsprodukt tritt gemäss der Pfeile 11 entlang des Flan¬ sches 6' in den Behälter 15 aus, aus welchem es über die Leitung 20 bzw. 21 entnommen wird. Ein Teil der Flüssigkeit, also des Nährmediums, bildet einen Flüssigkeitsfilm über die gesarate, oberhalb des Flussigkeitsbulkes liegenden Bereich der inneren Oberfläche des Reaktionsgefässes 1 und der fla¬ chen, radial nach innen gerichteten Teile 3. Durch die gros- se Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und Flüssigkeitsfilm ei¬ nerseits und dem eingebrachten Gas andererseits - in der Re- gel Luft und/oder CO2 - ist ein hoher interphasialer Stoff¬ transport gewährleistet, woduch sowohl die Versorgung der Zellen mit Sauerstoff und/oder anderen Gasen als auch die Einstellung eines gewünschten pH-Wertes vorgenommen wird.

Für den Fall, dass die Kontrolle des pH-Wertes über die Gas¬ phase nicht ausreicht, kann über die Zufuhrleitung 9 für das

Reaktionsmedium oder über eine nicht dargestellte zusätzli¬ che Leitung ein das pH regelndes Medium zugeführt werden, was, wie die Pfeile 10 andeuten, auch auf einzelne Reak¬ tionszwischenräume 2 gezielt erfolgen kann.

Bei flachen, radial nach innen gerichteten Teilen 3, die nicht mit einem die Zellen immobilisierenden Belag versehen sind, befindet sich die Hauptmenge der suspendierenden Zel¬ len bzw. der die Zellen immobilisierenden Träger im Flüssig- keitsbulk des Reaktionsgefässes 1. Je nach dem Sedimenta- tionsverhalten der Zellen ist fallweise auch ein geringer Anteil des Zellgehaltes im Flüssigkeitsfilm an der inneren Oberfläche des Reaktionsgefässes zu finden.

Die Zuführung des frischen Nährmediums erfolgt entweder bei drehendem Reaktionsgefäss 1 , bzw. nach einem kurzen Still- stand desselben, vorzugsweise in die an der Eingangsδffnung 5 des Reaktionsgefässes 1 angeordneten Reaktionszwischenräu¬ me 2, um die Reaktionscharakteristik eines Rδhrenreaktors zu erzielen.

Im Fall der Kultur von Zellpellets,, Zellaggregaten, Micro- carriern oder von Zellen bzw. Biokatalysatoren in Mikrokap- seln wird das frische Nährmedium direkt in das rotierende Reaktionsgefäss 1 eingeführt, da das Sedimentationsverhalten dieser Partikel in der Regel ausreicht, um im Reaktionsge¬ fäss eine Zelldichte zu erreichen, die höher liegt, als es dem Gleichgewicht aus Zellwachstum minus Auswaschrate in ei¬ nem homogen durchmischten Reaktionsgefäss entspricht. Dies wird als Immobilisierungseffekt bezeichnet, welcher bei der erfindungsgemässen Vorrichtung graduell steuerbar ist.

Wenn nichtaggregierende Einzelzellen mit langsamer Sedimen- tation in der erfindungsgemässen Vorrichtung kultiviert wer¬ den und das Ausschwemmen der Zellen aus dem Reaktionsgefäss bzw. aus den einzelnen Reaktionszwischenräumen niedriger ge¬ halten werden soll als der natürlichen Zellzuwachsrate ent-

spricht, dann ist eine kurze Unterbrechung der Rotationsbe¬ wegung des Reaktionsgefässes 1 vor der Zudosierung der Nähr¬ lösung einzulegen. Die Dauer des Stillstandes des Reaktions¬ gefässes richtet sich einerseits nach dem Sedimentationsver- halten der Zellen und andererseits nach dem gewünschten An¬ reicherungsgrad der Zellen. Der durch den Stillstand des Re¬ aktionsgefässes bewirkte Betriebszustand ist in Fig. 9 ver¬ anschaulicht.

Die über den natürlichen Zellzuwachs hinausgehende Anreiσhe- rung der Zelldichte bzw. der Menge des Biokatalysators pro Volumeneinheit des Reaktionsgefässes 1 bewirkt eine Be¬ schleunigung der biokatalytischen Umsetzungen und damit eine Erhöhung der Produktivität des Systems, also der Raum/Zeit- Produktivität, und führt zu höheren Mengen des zu erzeugen- den Produktes pro Volumeneinheit, also zu höheren Titern.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemässen Vorrichtung ist auch dadurch gegeben, dass die Trennung des Reaktionsgefäs¬ ses in Reaktionszwischenräume neben einer künstlichen Anrei¬ cherung des Biokatalysators die bereits beschriebene Reak- tionscharakteristik eines Rδhrenreaktors erzielt, wodurch die erfindungsgemässe Vorrichtung geeignet ist, alle Phasen der physiologischen Differenzierung wachsender Zellen auf kontinuierlicher Basis zu reproduzieren, wodurch unabhängig von einem Zeitfaktor die Produktion der Zellen, die in be- stimmten Phasen der Entwicklung von Kulturen bevorzugt stattfindet, optimal für die Produktion auf kontinuierlicher Basis ausgenutzt wird. Tierische Zellen, die ihre Produkte bevorzugt als stationäre, d.h. als nur langsam oder über¬ haupt nicht propagierende Zellen abgeben, sind besonders vorteilhaft in diesem Reaktor zu kultivieren.

Der interphasiale Stofftransport im Reaktionsgefäss 1 und damit die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen sowie mit Sauerstoff oder anderen Gasen, der Immobilisierungseffekt auf die Zellen sowie die Charakteristik des Röhrenreaktors

wird durch die Geometrie des Reaktionsgefässes 1 vorgegeben, und zwar im speziellen durch das Verhältnis von Durchmesser D zu Flüssigkeitshöhe H^ zur Länge L _R des Reaktionszwi¬ schenraumes 2 des einzelnen in Fig. 4 wiedergegebenen Reak- tionszwischenraumes 2, sowie durch die Anzahl der kombinier¬ ten Reaktionszwischenräume 2 auf die Gesamtlänge des Reak¬ tionsgefässes 1 und die Betriebsbedingungen. Für biologische Reaktionen mit hohen Ansprüchen an den interphasialen Stoff¬ transport ist eine Segmentierung des Reaktionsgefässes 1 zu- gunsten eines hohen H^/LR-Verhältnisses bevorzugt. Kon¬ struktive Ausgestaltungen des Reaktionsgefässes 1 , die dar¬ auf abzielen, die inneren, und damit die wirksamen Oberflä¬ chen zu vergrδssern, sind z.B. durch eine reichere Struktu¬ rierung wie Aufrauhung des Materials an den inneren Ober- flächen des Reaktionsgefässes 1 oder durch andere Massnahmen möglich. Diese Massnahmen sind dazu geeignet, den mit der erfingsgemässen Vorrichtung erzielten Effekt einer hohen benetzbaren oder beschάchtbaren Oberfläche im Verhältnis zum effektiven Reaktionsflüssigkeitsvolumen wesentlich zu ver- grδssern.

Die Verweilzeitcharakteristik der durchströmenden Flüssig¬ keit, das Sedimentationsverhalten der Zellen in den einzel¬ nen Reaktionszwischenräumen 2 des Reaktionsgefässes 1 und das effektive Verhältnis von benetzbarer innerer Oberfläche des Reaktionsgefässes 1 zum Flüssigkeitsvolumen, kann durch eine von der zylindrischen Form abweichende Konfiguration verändert werden und damit den physiologischen Erfordernis¬ sen der Zellen optimal angepasst werden. Die in Fig. 5 und 6 schematisch dargestellten kegelstumpffδrmigen Reaktionsge- fasse sind derartige Beispiele. Je nach dem Öffnungswinkel des Mantels, dem Abstand und der Höhe der einzelnen Ring¬ scheiben 3a zueinander kann das Verhältnis von benetzbarer Oberfläche zu Flüssigkeitsvolumen, das Sedimentationsver¬ hältnis der Zellen und damit die Verweilzeit der Zellen bzw. Biokatalysatoren beeinflusst werden.

In Fig. 8 ist ein Betriebszustand der erfindungsgemässen Vorrichtung wiedergegeben, in welchem die Zellen durch Zen¬ trifugalkraft, die grosser ist als die zweifache Erdbe¬ schleunigung, im schneller rotierenden Reaktionsgef ss 1 zu- rückgehalten werden, während die Reaktionsflüssigkeit im Re¬ aktionsgefäss kontinuierlich erneuert wird. Die im Reak¬ tionsgefäss durch die Zentrifugalkraft zurückgehaltenen Zel¬ len bilden an der Innenwandung des Reaktionsgefässes 1 ein Sediment, während die Flüssigkeit im Reaktionsgefäss durch Zufuhr frischer Lösung durch die Öffnung 5 ausgetauscht wird. Eine weitgehende Entfernung der Flüssigkeit aus dem Inneren des Reaktionsgefässes 1 ist durch zusätzliche in dieser Figur nicht dargestellte Ableitungsrohre zum Abzug der Flüssigkeit möglich. In dieser Variante des Betriebes wird eine Absaugleitung, deren Öffnung nahe dem zylindri¬ schen Mantel des Reaktionsgefässes 1 angeordnet und die im Normalbetriebszustand geschlossen ist, geöffnet, wodurch die durch die Zentrifugalkräfte an die Wand des Reaktionsgefäs¬ ses 1 gedrückte Flüssigkeit abgezogen wird. Die als Ring- Scheiben ausgebildeten flachen, radial nach innen gerichte¬ ten Teile 3 erlauben dabei ein Nachströmen der Flüssigkeit von Eingang 5 des Reaktionsgefässes 1 bis zur Absaugleitung und so eine weitgehende Erneuerung des Flüssigkeitsinhaltes des Reaktionsgefässes 1 sowie ein Freiwaschen von "alten" Flüssigkeitsbestandteilen mit einem reduzierten Flüssig¬ keitsvolumen, welches zur Erneuerung der flüssigen Phase ge¬ nerell notwendig ist.

In Fig. 9 ist eine schematisσhe Betriebsweise der erfin¬ dungsgemässen Vorrichtung gezeigt, bei welcher die an den inneren Oberflächen des Reaktionsgefässes 1 anhaftenden Bio¬ katalysatoren, nämlich Zellen, bzw. die funktioneilen Zell¬ bestandteile, wie z.B. Enzyme, für eine bestimmte Reaktion eingesetzt werden. Wie schon weiter oben im Zusammenhang mit suspendierten Partikeln erwähnt, ist in diesem Fall das Ver- hältnis von besiedelbarer und benetzbarer Oberfläche zu dem reaktiven Flüssigkeitsvolumen im Reaktionsgefäss für den Er-

folg der biologischen Umsetzung, im speziellen für die er¬ zielbare Reaktor-Raum/Zeit-Produktivität, ausschlaggebend.

Für den Einsatz der erfindungsgemässen Vorrichtung unter Verwendung von spezifisch an den effektiven Oberflächen ge- bundenen Biokatalysatoren, und zwar unabhängig davon, ob es Zellen oder deren funktioneile Bestandteile sind, gelten analoge Prinzipien wie vergleichsweise für in der Flüssig¬ keit suspendierte Partikel hinsichtlich des interphasialen Stofftransportes in Relation zum Oberflächen/Volumen-Ver- hältnis und des Verweilzeitverhaltens von Flüssigkeitsteil¬ chen und dem Biokatalysator. Die effektive Oberfläche, wel¬ che zur Bindung der Zellen und/oder anderen Biokatalysatoren durch elektrostatische Verhältnisse oder andere Bindungsme¬ chanismen zur Verfügung stehen, ist für das Ergebnis der im Reaktionsgefäss ausgeführten Reaktion wichtig. Fig. 9 zeigt in schematisσher Darstellung die an die inneren Oberflächen des Reaktionsgefässes zur Umsetzung der Reaktionsflüssigkeit in kontinuierlicher Verfahrensweise immobilisierten Biokata¬ lysatoren-Schichten 13.

Die Beladungsdichte der inneren Oberflächen des erfindungs¬ gemässen Reaktionsgefässes mit Biokatalysatoren ist von der Wahl des Werkstoffes für die Beschichtung und gegebenenfalls noch von zusätzlichen Massnahmen abhängig.

Als Werkstoff für die Ausführung der inneren Oberflächen der erfindungsgemässen Vorrichtung sind Glas, Metallegierungen, Porzellan oder Kunststoffe usw. verwendbar, welche aufgrund ihrer Ladung oder aufgrund ihrer chemisch reaktiven Gruppen die Bindung eines Biokatalysators ermöglichen. Auch inerte Materialien können vorzugsweise für die Behandlung suspen- dierter Biokatalysatoren eingesetzt werden.

Auch Polymerisationsreaktionen oder Reaktionen, die aufgrund einer Änderung der Temperatur die Bindung von Biokatalysato¬ ren ermöglichen, können für die Beladung der wirksamen Ober-

flächen des Reaktionsgefässes verwendet werden.

Die bisherige Beschreibung anhand einiger Zeichnungen hatte dazu gedient, den Erfindungsgegenstand einfach zu erklären. Es ist selbstverständlich, dass alle Zeichnungen den Erfin- dungsgegenstand bzw. seine Bestandteile und seine Funktions¬ weise darstellen. In allen Zeichnungen sind gleiche Teile mit denselben Bezugsziffern versehen. Nachfolgend werden al¬ le Zeichnungen übersichtlich beschrieben, wobei die Bezugs¬ ziffern numerisch hintereinander beschrieben werden.

Fig. 1 zeigt einen schematischen Schnitt durch eine Gesamt¬ einlage wobei die Führung der einzelnen Phasen durch das Re¬ aktionsgefäss 1 angedeutet ist. Das Rotationsgefäss 1 ist um eine horizontale Längsachse 1 ' drehbar gelagert und am lin¬ ken Ende mit einer Abschlussscheibe 1 " versehen. Im Inneren des Reaktionsgefässes sind Zwischenräume 2 ausgebildet, de¬ ren oberer Rand im unteren Teil das Flüssigkeitsniveau 2 ' bestimmt. Diese Reaktionszwischenräume 2 sind durch flache, radial nach innen gerichtete Teile 3 begrenzt. Die flachen, radial nach innen gerichteten Teile 3 sind verschiedenartig ausgebildet. Als 3a ist eine ungelochte Ringscheibe bezeich¬ net, die die Funktion einer Trennringscheibe übernehmen kann. Eine Ringscheibe 3b ist mit veränderter Oberflächen¬ strukturen versehen, z.B. mit Rillen, Erhöhungen oder ande¬ ren Flächendeformationen. Eine gelochte Ringscheibe 3c dient zur Durchstrδmung der Flüssigkeit. Die Ringscheibe 3d be¬ steht aus ringförmig angeordneten Segmenten. Alle Ringschei¬ ben 3a bis 3d sind mit zentralen Löchern 3' versehen. 3" sind ringförmige Halterungen, die erleichtern, die Ring¬ scheiben im Reaktionsgefäss 1 zu halten. Anstelle der ring- fδrmigen Halterungen kann man auch z.B. einfache Erweiterun¬ gen der Ringscheiben verwenden oder im Umfang der Ringschei¬ ben je einen O-Ring einsetzen. Die Ringscheiben sind zweck¬ mässig mit Belägen 3"' versehen, die aus Flor, Vlies oder Schwamm bestehen können, so dass die aktive Oberfläche ver- grδssert wird. Man kann selbstverständlich auch Mittel ver-

wenden, die die Benetzbarkeit der Oberfläche vergrδssern. Gemäss Fig. 1 ist das rotierende Reaktionsgefäss auf je zwei Paaren von Rollen 4 gelagert, wobei zwei weitere Paare von Rollen 4 die Oberfäche des Reaktionsgefässes vom oberen Teil halten, um die Lage des Reaktionsgefässes 1 auch während grόsser Geschwindigkeiten zu sichern, mit welchen man die Verteilung der Flüssigkeit infolge der Rotationskraft er¬ reichen kann.

Die Rotationskraft kann sowohl zum Mischen als auch zum Se- dimentieren verwendet werden. Die Wellen der Rollen 4 sind mit 4' bezeichnet. Die Halterungen der Wellen 4' sind nicht dargestellt, da es sich um selbstverständliche Konstruktio¬ nen handelt, die allgemein bekannt sind. Dies betrifft auch andere Bestandteile, z.B. der Motorantrieb des Reaktionsge- fässes und die Befestigungsmittel von anderen Behältern. Die Öffnung 5 dient für die Zufuhr von Gas und Nährlösung. Die Öffnung 6 auf der rechten Seite der Fig. 1 ist für den Abzug bzw. die Abfuhr des Gases und der Nährlösung bestimmt. Diese Öffnung 6 ist mit einem Flansch 6' versehen. Im linken Teil der Zeichnung ist mit einem dicken Pfeil die Gaszufuhr dar¬ gestellt, mit einem dicken Pfeil im rechten Teil die Gasab¬ leitung 8. Im linken Teil ist gestrichelt eine in das Innere reichende Leitung für die Nährlösung eingezeichnet, wobei die Pfeile 10 die Richtungen zeigen, in welchen die Nährlδ- sung strömen kann. Im rechten Teil sieht man die Abfuhr 11 des fertigen Reaktionsproduktes, die mit einem gestrichelten Pfeil dargestellt ist. Abnahmestellen des Reaktionsproduktes sind mit der Bezugsziffer 12 bezeichnet. Auf den für die Re¬ aktion wirksamen Teilen bildet sich eine dünne Schicht 13 aus Reaktionsflüssigkeit, was den Austausch zwischen der Re¬ aktionsflüssigkeit und dem Reaktionsgas fördert. Um die Ver¬ bindung zwischen zwei seitlichen Behältern 14 und 15 mit dem rotierenden Reaktionsgefäss 1 zu schaffen, sind beidseitig Labyrinthdichtungen 16 ausgeführt. Als ein Teil dieser Laby- rinthdichtungen dienen die Wände der Behälter 14, 15, gegen¬ über ihnen ringförmige Scheiben 16' der Labyrinthdichtung 16

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befestigt sind. Punktierte Pfeile 17 zeigen Austritte von Reaktionsgas. Die ganze Vorrichtung ist in einem angeschlos¬ senen Raum 18 gelagert und befestigt. Aus dem linken Behäl¬ ter 14 führt eine Abfuhrleitung 19, aus dem rechten Behälter 15 zwei Entnahmeleitungen 20, 21. Die Flüssigkeit befindet sich im Boden 22. Sedimentierte Biokatalysatoren sind mit 23 und sedimentierte Trägerpartikel mit 24 benannt. Eine Messonde 25 kann verschiedene gewünschte Werte messen.

Fig. 1a zeigt im Detail und vergrδssertem Massstab den lin- ken Teil des Reaktionsgefässes 1 aus der Fig. 1. In dieser Zeichnung ist gut sichtbar, dass die gelochten Ringscheiben 3c die Strömung der Flüssigkeit zwischen den Reaktionszwi¬ schenräumen 2 erlauben und dass demgegenüber die ungelochte Ringscheibe 3a da als Trennringscheibe dient, die die linken Reaktionszwischenräume 2 von den rechten trennt. Bei den

Rollen 4 sind auch zusätzlich die schon erwähnten Wellen 4' dargestellt.

In der Fig. 2 sind die schon vorher genannten vier Beispiele der Ringscheiben 3a bis 3d gezeigt. Die Ringscheibe 2a ist auch mit einem Belag 3"' versehen, was gut in der Fig. 3 sichtbar ist, die den Schnitt III-III aus der Fig. 2a zeigt. In der Fig. 2b ist eine konstruktive Ausbildung ge¬ zeigt, wo die Ringscheibe 3b geprägte Oberflächen aufweist; in Fig. 2c ist eine gelochte Ringscheibe 3c und in Fig. 2d ist die Ringscheibe in vier Segmente 3d geteilt, so dass zwischen ihnen freie Räume für den Durchfluss der Flüssig¬ keit vorhanden sind, die dieselbe Aufgabe haben, wie die Löcher 3c' in der gelochten Ringscheibe 3c gemäss Fig. 2c. In. der Fig. 4 sehen wir zwei Ringscheiben 3. Bei diesen zwei Ringscheiben 3 sind der äussere Durchmesser D, die Flüssig- keitshδhe HL und Reaktionszwischenraumlänge LR einge¬ zeichnet.

Die Ausführungsform gemäss Fig. 5 weist ein konisches Reak¬ tionsgefäss 1 auf, wobei die ungelochten Ringscheiben 3a bis

zu einem einheitlichen Flüssigkeitsniveau 2 ¹ reichen.

Die Lösung gemäss Fig. 6 verwendet wieder ein konisches Re¬ aktionsgef ss 1 , die Ringscheiben 3a sind jedoch stufenweise angeordnet, so dass auch eine stufenweise Abstufung des Flüssigkeitsniveaus 2' erreicht wird. Mit der Bezugsziffer 13 sind sich im Betrieb ausbildende dünne Schichten aus Re¬ aktionsflüssigkeit auf den Ringscheiben 3a und inneren Flä¬ chen des Reaktionsgefässes 1 versehen.

Die Lösung nach Fig. 7 zeigt eine Ausführungsform, in der in den Reaktionszwischenräumen 2 in der Nährlösung suspendierte Zellen schematisch eingezeichnet sind. Die in der Fig. 2d dargestellten getrennten Segmente 3d sind in diesem Beispiel schneckenartig im Inneren des Reaktionsgefässes 1 angeordnet und können auch so als wenigstens eine kontinuierliche Fδr- derschneσke ausgebildet sein. Diese Lösung hat den Vorteil, dass in bezug auf die Rotationsbewegung des Reaktionsgefäs¬ ses die Flüssigkeit in der entsprechenden Richtung transpor¬ tiert wird. Die Segmente 2d können auch einen schneckenarti¬ gen Förderstreifen bilden.

Fig. 8 zeigt eine Verwendung der erfindungsgemässen Vorrich¬ tung als eine Zentrifuge. Das Reaktionsgefäss 1 wird mit ho¬ her Drehzahl angetrieben, so dass .sich die Nährlösung über den ganzen inneren Umfang des Reaktionsgefässes verteilt und die Biokatalysatoren sedimentieren.

Die Fig. 9 zeigt einen Zustand der Vorrichtung, bei dem an der Innenseite des Reaktionsgefässes und der flachen, radial nach innen gerichteten Teile 3 Zellen oder Biokatalysatoren in Schichten 13 immobilisiert sind.

Fig. 10 zeigt eine Lösung, bei der beispielsweise zwei schon früher beschriebene Vorrichtungen in Serie angeschlossen sind. Selbstverständlich kann man eine grδssere Anzahl von diesen Vorrichtungen in Serie anschliessen.

Fig. 11 zeigt eine Ausführungsform, in der schematisch die sedimentierten Trägerpartikel 24 eingezeichnet sind. Die übrige Funktionsweise entspricht der schon beschriebenen.

Fig. 12 und 13 zeigen den linken Teil eines Reaktionsgefäs- ses, wobei dieser Teil sowohl zur Zufuhr als auch zur Abfuhr von Flüssigkeiten und Gasen verwendet wird. Das Reaktionsge¬ fäss 1 ist in diesem Beispiel mit einer ungelochten Ring¬ scheibe 3a unterteilt. Diese Ringscheibe 3a ist. auch mit der ringförmigen Halterung 3" versehen, so dass man ihre Lage in Längsrichtung in dem Reaktionsgefäss einstellen kann. Wie besonders gut in der Fig. 13 sichtbar ist, ist das Gaszu¬ fuhrrohr 7 in der Abschlussscheibe 1" gelagert, ebenfalls das Gasableitungsrohr 8. Aus der Fig. 12 ersieht man gut die Länge dieser Rohre. Im unteren Teil der Abschlussscheibe 1" ist ein kürzeres L-fδrmiges Rohr 26 für die Flüssigkeitszu¬ leitung gezeigt, das mit einem rechtwinklig gebogenen Teil 26' versehen ist. Ahnlich ist ein läng-eres L-fδrmiges Rohr 27 für die Flüssigkeitszuleitung angeordnet, das ebenfalls einen rechtwinklig gebogenen Teil 27' aufweist. In derselben Abschlussscheibe 1 " ist auch ein kürzeres L-fδrmiges Rohr 28 für die Flüssigkeitsentnahme mit einem rechtwinklig geboge¬ nen Teil 28' dargestellt. Daneben ist ein längeres L-fδrmi¬ ges Rohr 29 für die Flüssigkeitsentnahme abgebildet, das ebenfalls einen rechtwinklig gebogenen Teil 29* aufweist. Die letztgenannten zwei Rohre 28 und 29 sind in der An¬ schlussscheibe drehbar angeordnet so dass man ihre recht¬ winklig gebogene Teile 28 ¹ , 29' durch Drehen des horizonta¬ len Teiles der Rohre nach oben und wieder nach unten bewe¬ gen kann. In den Figuren 12 und 13 sind diese Rohre 28 und 29 in der Lage eingezeichnet, in welcher ihre Enden bis zum Boden des Reaktionsgefässes 1 reichen, so dass man voll die Flüssigkeit entleeren kann. In der Fig. 13 sieht man, dass man die Rohre 28 und 29 so in den Richtungen der Pfeile 30 drehen kann, dass die Enden der genannten Rohre bis oberhalb des Flüssigkeitsniveaus 2' kommen und somit kein Absaugen der Flüssigkeit stattfinden kann.

Die genaue Funktion der erfindungsgemässen Vorrichtung wird nachstehend anhand eines mit dieser Vorrichtung ausgeführten Verfahrensbeispiels beschrieben.

BEISPIEL ZUR VERANSCHAOLICHUNG DER FUNKTION DES REAKTORS

Verwendete Materialien und Methoden

Zellinie: Maus/Maus Hybridoma-Linie 3RFUD6C3 aus der Samm¬ lung des Instituts für angewandte Mikrobiologie (IAM) produ¬ ziert einen monoklonalen Antikörper der Klasse IgG mit nicht näher definierter Spezifität und wurde für alle Versuche verwendet.

Nährmedium: Dulbeccos DMEM H21 (Fa. Gibco) plus 5 % foetales Kälberserum (Fa. PAA-Labor, Gallneukirchen) wurde für alle Versuche ohne weitere Zusätze verwendet.

Bereitung des Inoculums:

Die Zellinie wurde zunächst in Rouxflaschen (Einwegware der Fa. Nunc AG, Dänemark) 4 Tage bei 37 ^β C vorgezogen und hier¬ auf der gesamte Inhalt der Rouxflasche in eine Rollerflasche aus Glas (Standardausführung) übergeführt und mit frischem Nährmedium weitere 3 Tage bei 37 ^β C und einer Rollerge- schwindigkeit von ca. 1 Umdrehung pro Minute inkubiert. Nach 3 Tagen wurde die Rollerflasche von Hand durchgeschüttelt, um an der Wand haftende Zellen in Suspension zu bringen und die Zellzahl und der IgG-Gehalt analysiert. 100 ml der so kontrollierten Kultur wurden für die Beimpfung der erfin- dungsgemässen Vorrichtung verwendet.

Versuchsanordnung mit der erfindungsgemässen Vorrichtung (kurz Reaktor)

Der Reaktor wurde für die Versuchsdurchführung mit 12 löch¬ rigen, lamellenartig angeordneten Ringscheiben im Abstand

von ca. 1 cm zueinander gepackt. Im Abstand von 13 cm zum Reaktoreingang wurde eine Ringscheibe 3a eingesetzt, welche nur mit einer zentralen Öffnung 3' versehen war, so dass der Reaktor im Abstand von 13 cm in der Längsrichtung unterteilt war. Weitere 30 Ringscheiben im Abstand von ca. 1 cm befan¬ den sich im zweiten Segment des Reaktors.

Die Gesamtlänge des Reaktors betrug 50 cm, der Durchmesser 10 cm und insgesamt enthielt der Reaktor 43 Ringscheiben 3.

Das Material des Reaktors bestand aus Glas. Für die Ring- Scheiben wurde Polyester verwendet, dessen Oberfläche faser¬ artig modifiziert war. Der äussere Durchmesser der Ring¬ scheiben betrug 10 cm, der innere Durchmesser ca. 5,5 cm.

Der so aufgebaute Reaktor wurde nacheinander mit 0,1 n HC1, mit Leitungswasser, mit 0,1 n NaOH und zuletzt mit destil- liertem Wasser gründlich gereinigt und dann im Autoklaven 1 Stunde bei 120 °C sterilisiert (n = normal).

Der sterile und leere Reaktor wurde im Brutraum bei 37 ^β C vortemperiert und auf dem Rollerapparat (New;. Brunswick) bei ca. 1 Upm gerollt. Gleichzeitig wurde der Reaktor mit einem sterilen feuchten Gasgemisch von 95 % Luft und 5 % CO2 durchgast. Hydrophobe Filter mit der Ausschlussgrenze von 0,2 Mikrometer (Fa. Pall) sorgten für die Sterilhaltung. Durch eine Zuleitung in den Eingang des Reaktors wurde der leere Reaktor mit 100 ml Inokulum aus der Rollerflasche mit- tels einer peristaltischen Pumpe inokuliert. Der Reaktor wurde während der gesamten Prozedur mit ca. 1 Upm gerollt. Das Inokulieren nahm ca. 10 Minuten in Anspruch, wobei das in das erste Segment zugeführte Zell-Inokulum weitgehend von den 13 Lamellen als Kapillarflüssigkeit aufgesaugt wurde.

Nachdem sich das Inokulum im Reaktor befand, wurde mit der gleichen peristaltischen Pumpe über ein T-Stück im Ansaug¬ schlauch ca. 150 ml frisches Nährmedium zudosiert. Das erste

Segment des Reaktors war danach bis zu einem Flüssigkeits¬ niveau von ca. 2,5 cm gefüllt.

Der Reaktor wurde danach weiter mit 1 Upm gerollt und ohne weitere Zudosierung von Nährmedium mit ca. 0,5 Liter Gasge- misch pro Stunde mit 95 % Luft, 5 % CO2 begast und bei 37 ^β C inkubiert.

Nach ca. 24 Stunden wurde der Cθ2~Anteil des Gasgemisches leicht auf ca. 3-4 % CO2. 96-97 % Luft reduziert, um den pH-Wert, visuell an der Indikatorfarbe des Nährmediums er- kennbar, auf ca. pH 7,0 zu halten. Durch eine visuelle Kon¬ trolle durch den Glasbehälter könnte keine sichtbare Trübung des Nährmediums festgestellt werden. Ca. 60 Stunden nach Be¬ ginn der Kultur wurde die Rollgeschwindigkeit der Kultivie¬ rung auf ca. 30 Upm erhöht. Schon wenige Minuten nach Erhδ- hung der Rollgeschwindigkeit zeigte eine deutliche Trübung des Nährmediums an, dass sich Hybridomazellen aus der Ober¬ fläche der lamellenartigen Ringscheiben im Nährmedium sus¬ pendierten.

Hierauf wurde frisches Nährmedium in den Eingang des Reak- tors solange zudosiert, bis der gesamte Reaktor im ersten und zweiten Segment mit einem Flüssigkeitsniveau von ca. 2,5 cm gefüllt war. Die Dosierpumpe für das Nährmedium wurde da¬ nach abgestellt. Während der Befüllung, die ca. 0,5 Stunde dauerte, wurde die Rollgeschwindigkeit des Reaktors in ein- zelnen Schritten wieder auf ca. 1 Upm zurückgestellt und weiter bei 37 °C inkubiert. Das gesamte Nährmediumvolumen im Reaktor betrug danach ca. 950 ml, und die Belüftungsrate mit Luft/Cθ2-Gemisch wurde willkürlich auf ca. 5 1 pro Stunde erhöht. Die Zumischung von CO2 wurde während der folgenden 3 Tage von ca. 4 % Cθ2~Anteil auf ca..1 % von Hand reduziert, um den pH-Wert konstant zu halten.

Ca. 72 Stunden nach der weiteren Auffüllung des Reaktors, also ca. 100 Stunden nach der ersten Inokulation, wurde be-

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gönnen, den Reaktor kontinuierlich mit frischem Nährmedium zu beschicken, um so eine kontinuierliche Perfusionskultur einzuleiten. 100 ml frisches Nährmedium pro Stunde, entspre¬ chend einer Verdünnungsrate (D) von 0,1 wurde zunächst über vier Tage zudosiert. Aus dem Ablauf des Reaktors wurden Pro¬ ben zwecks Bestimmung der Zelldichte und der IgG Konzentra¬ tion gezogen. Danach wurde die Verdünnungsrate willkürlich auf 0,5, entsprechend einer Fliessgeschwindigkeit von ca. 500 ml Nährmedium pro Stunde erhöht und weitere vier Tage betrieben.

Die Abläufe aus dem Reaktor wurden hinsichtlich Zellzahl und IgG-Konzentration analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Analytik

Zellzahl

Die Bestimmung der Zellzahl in den Proben erfolgte durch Auszählung in der Thoma Kammer (Vitalfärbung mit Trypan- blau) .

IgG-Konzentration

Die Bestimmung der Konzentration von IgG im Kulturüberstand bzw. Ablauf des Reaktors erfolgte mittels der ELISA-Tech- nik. In Mikrotiterplatten wurde nach Standardbedingungen mit anti-Maus IgG-Immunserum (Fa. PAA-Labor, Gallneukirchen) vorgekoatet. Die Kulturüberstände wurden hierauf auf den so vorbereiteten Platten inkubiert, gewaschen und mit anti-Maus IgG-Ziegenserum Konjugat (Fa. P-L Biochemicals, Inc., Mil- waukee, WI) der IgG-Gehalt bestimmt. Als IgG-Standard wurde Maus-IgG der Fa. Sigma (St. Louis, Missouri) verwendet.

Ergebnisse

Tabelle 1 : Ergebnisse der Kultur von 3RFUD6C3 während der Kultur im Filmreaktor mit DMEM + 5 %FCS

Kulturmethode Reaktortyp Zel .lzahl IgG

Zeit (10 ^β Z/ml) (ug/ml)

(Stunden)

Batch ca. 96 Roux-Flasche 1,2 260

Batch ca. 72 Rollerflasche 1,4 240

Batch ca. 72 Filmreaktor - -

Batch ca. 72 Filmreaktor - -

Perfusion 1/D cä. 1/0,1 Filmreaktor ca. 0,08* 190*

Perfusion 1/D ca. 1/0,5 Filmreaktor ca. 0,06* 85*

* im Ablauf

Die Ergebnisse aus Tabelle 1 , insbesondere der Vergleich der einzelnen Kultivierungszeiten mit den verschiedenen Kulti¬ vierungsmethoden, lassen folgende Schlüsse zu:

1) Unter der Annahme, dass die spezifische IgG-Produktions- rate (pro Zellmenge und Zeit) der verwendeten Hybridoma-Li¬ nie für das verwendete Nährmedium eine Konstante, also eine von der Kultivierungsmethode unabhängige Grδsse darstellen sollte, dann hätte der Anreicherungsfaktor für die Immobili- sierung der Zellen im Filmreaktor gegenüber anderen Methoden den ca. 6- bis 10-fachen Wert.

2) Falls der unter Punkt 1) konstatierte Immobilisierungs¬ faktor für die Zellen nicht zutreffen sollte, dann würde dies bedeuten, dass im Filmreaktor eine gesteigerte spe¬ zifische Produktionsrate der Bildung des IgG festzustel¬ len ist.

3) Wie auch immer die Ursachen liegen, ob Punkt 1) oder

Punkt 2) mehr gültig ist, die volumetrische Produktivi¬ tät der monoklonalen Antikδrperbildung (=IgG/Reaktorvo- lumen x Zeit) ist im erfindungsgemässen Filmreaktor und im konkreten Versuch um das 6- bis 10-fache gesteigert, gegenüber einer stationären Suspensionskultur.

Es ist selbstverständlich, dass der Erfindungsgegenstand auf das Dargestellte nicht beschränkt ist. So kann man die An¬ zahl der Ringscheiben 3 dem konkreten anpassen, was selbst¬ verständlich auch die Zufuhr- und Abfuhrleitungen betrifft. Auch der Antrieb der erfindungsgemässen Vorrichtung kann in einer an sich bekannten Weise auch anders ausgebildet sein als dargestellt ist.