Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur submersen Züchtung von Pseudomonas aerugi nosa-Bakter enstämmen aus der taxonomi sehen Familie der Pseudomonadaceae.

Bakteri um-Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer, pathogener Keim, der häufig bei Krankenhausinfektionen auftritt, hauptsächl ch bei Patienten mit geschwächter Immunabwehr, wie bei Verbrennungspatienten, bei Personen, die an cystischer Fibröse leiden oder organische Fehlfunktionen aufweisen, und bei Tumorpatienten. Antibiotika sind gegen Pseudomonasi nfekti onen infolge des Auftretens von Res stenzen nur beschränkt wirksam, weshalb man bemüht ist, immunologische Methoden zur Bekämpfung von Infektionen durch Pseudomonas aeruginosa anzuwenden.

Infektionen können durch eine Vielzahl von Stämmen ausgelöst werden, die O-Gruppenanti gene und H-Antigene produzieren. Gemäß dem H-Aπt ^• > ^■ genschema nach Ansor3 (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 242, 228 - 238 (1978)) wird unter Verwendung der indirekten Immunfluoreszenztechnik bei Pseudomonas aeruginosa ein komplexes F Lage l la-Anti gen a mit den Partialantigenen ag, a-], a2 _. 83, 84 und ein uniformes FLage l la-Anti gen b differenziert. Die Partialfaktoren ag - a ^ sind unabhängige Determinanten, so daß ein flagellares Anti genschema mit mehreren H-Typen resultiert. O-Gruppen und H-Typ zeigen freie Kombinati onen.

Es ist bereits bekannt, zur Prophylaxe gegen Pseudomonasi nfekti onen Pseudomonasva kzi ne herzustellen, wobei als Ausgangsmaterialien entweder Pseudomonas aeruginosa-Bakteri en asse selbst und/oder KuIturfi It rate

verwendet werden, die unter Züchtung der Mikroorganismen auf Oberflächenkulturen oder sub ers in komplexen Nährmedien gewonnen wurden. Bei diesen komplexen Nährmedien wurden neben einer Kohlenstoff- und Energiequelle (meist Kohlenhydrate ⁾ und essentiellen Nährsalzen verschiedenste Extrakte und/oder Hydrolysate tierischer, mikrob eller oder pflanzlicher Prote ne (sogenannte Peptone) verwendet. Derartige Nährlösungssupplemente sind in ihrer genauen Zusammensetzung nicht definiert und zudem von Charge zu Charge variabel. Sie enthalten neben Aminosäuren auch unvollständig abgebaute Proteinbruchstücke und Undefinierte Komplexe derselben und dienen im wesentlichen zur Deckung des Aminosäure- und Wuchsstoffbeda rfes . Kulturüberstände sind deshalb immer reich an Substanzen nicht-bakteriellen Ursprunges, was den Nachteil hat, daß für die Bereitung eines F Lage l la-Anti gens von Pseudomonas aeruginosa immer mehrere der Kultivierungsstufe nachzustellende Trennstufen notwendig sind, um ein immunogen wirksames F Lage l la-Ant gen soweit wie möglich von aus dem Nähr ^dium stammenden Verunreinigungen zu befrei en.

Ein weiterer Nachteil der bisherigen Chargen- bzw. "batch"-wei se durchgeführten Züchtungsverfahren besteht darin, daß die Bakterien vom Zeitpunkt ihrer Inokulation bis zum Zeitpunkt ihrer Abtrennung aus der Kultur einem Zustand der kontinuierlichen physiologischen Änderung unterworfen sind. Das auslösende Moment für diese physiologische und daher funktionelle Differenzierung der bakteriellen Biomasse ist durch das Zellwachstum selbst und der damit ursächlich bedingten zeitlichen Veränderung der Zusammensetzung des Nährmediums bedingt. Die sichtbare Folge dieser spontanen physiologischen Differenzierung ist allein schon an den verschiedenen Phasen der Wachstumskurve einer "bat ch"-Ku Itur zu ermessen. Als

Konsequenz der beschriebenen direkten Beziehung zwischen der physiolog schen Aktivität der Zellmasse einerseits und ihrem Umgebungsmilieu anderseits ist damit auch eine bevorzugte Anreicherung verschiedener intra- und extrazellulärer Stoffwechse Lprodukte je nach Wachtsumsphase und Differenzierungsphase verbunden. Kulturüberstände einer "batch"-Kultur enthalten deshalb eine integrierte Mischung aller zeitlich über einzelne Differenzierungsphasen gebi ldeten Stoffwechse lprodukte .

Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Schwierigkeiten und Nachtei le und stellt sich die Aufgabe, ein submerses Züchtungsverfahren von Pseudomonas aerug nosa-Bakteri enstämmen zu schaffen, welches mit wesentlich besserer Ausbeute als bisher eine bakterielle Biomasse zur Gewinnung von Antigenen liefert, deren physiologischer Zustand während der Gesamtdauer der Kultivierung konstant bleibt; bei welchem ein synthetisches Nährmedium verwendet w rd, aus dem keine zusätzlichen Verunreinigungen durch Autoklavieren entstehen; und welches eine erleichterte chemische Aufarbeitung der bakteriellen Biomasse zu Flagel la-Anti gen er ögli cht .

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die folgenden H-Typ-Anti gene produzierenden Stämme

Stamm H-Typ

1 170001 b

M-2 b

2 5940 ag, ^a 2

3 5939 ag. •* $

1210 ag, a ^< |, a2

16990 ag, a-j, a2

5 170018 ag, a $ , a ^

in einem wässerigen, antigenfreien und proteinfreien Nährmedium, welches eine Sti ckstoffque l le und Mineralsalze sowie Succinat oder Harnstoff als Koh lenstoffque l le enthält, gezüchtet werden.

Die genannte Koh lenstoffque l le hat sich in besonderem Maß als wachstumsfördernd erwiesen.

Für die Stämme 170001, 5940, 5939, 5933 und 170018 ist die Bezeichnung nach Ansorg verwendet. Die Zuordnung der untypi s erten Stämme M-2, 1210 und 16990 zum entsprechenden H-Serotyp erfolgte aufgrund von Vergleichsuntersuchungen der Molekulargewichte und serologischen Kreuzreaktionen durch Montie et al.

Vorzugsweise wird die Züchtung der Stämme in kontinuierlicher Weise durchgefü rt.

Nach einer weiteren bevorzugten Arbeitsweise kann die Züchtung auf turbi dostati schem Weg erfolgen, wobei der Sauerstoffgehalt im Nährmedium 5 b s 20 %, vorzugsweise etwa 10 %, beträgt, die Zelldichte auf 2 - 3 x 10 ⁹ Zellen/ml gehalten und eine Verdünnungsrate des Substrates durch Zuführung von fr schem Nährmedium auf 0,1 My bis 0,3 My eingehalten wird.

Die erfindungsgemäße Züchtung der Pseudomonas aerugi nosa- Bakteri enstämme erfolgt unter Agitation und Belüftung einer "offenen Kultur" in solcher Weise, daß sie zum ma malen Wachstum und Ausb ldung der Flagellen veranlaßt werden. D e Zufuhr des Nährsubstrates ird in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der Kultur bzw. vom Gleichgewichtszustand, den die Kultur erreicht hat, vorgenommen. Die Regelung bzw. Steuerung der Zu ^f uhr von frischem Nährmedium erfolgt in Abhäng gkeit von einem dem

*/

Wachstum der Kultur proportionalen Parameter, vorzugsweise

der zeitlichen Veränderung der Zelldichte. Es können jedoch auch andere Parameter, die der Entwicklung der Kultur proportional sind, wie Atmungsaktivität, Cθ2~ Produktion, Änderung der Wasserstoff onenkonzent rat on, Änderung der Kohlenstoffquellenkonzentration, Respirationsquotient, Stickstoffverbrauch, Sauerstoffverbrauch und Wärmetönung, herangezogen werden. Weiters kann die Regelung der Zufuhr von frischem Nährmedium in Abhängigkeit von der Menge des gebi ldeten Antigens erfolgen.

Bei der erfindungsgemäßen kontinuierlichen Züchtungsmethode wird gleichzeitig mit der Zufuhr von frischem Nährmedium Kulturflüssigkeit aus dem Züchtungsgefäß abgezogen, so daß sich z ischen dem Wachstum und der physiolog schen Aktivität, insbesondere der Bildung von Zellen einerseits und dem Umgebungsmilieu der Zellen anderseits, ein genau definierbarer urd ^• jederzeit reproduz erbarer Fließgleichgewichtszustand einstellt, welcher auf praktisch zeitlich unbegrenzte Dauer erhalten werden kann.

Als Nährmedium w rd ein syn hetisches proteinfreies Medium verwendet, welches ausschließlich chemisch sowie physi kochemi seh qualitativ, und quantitativ erfaßbare Bestandtei le enthält. Geeignet ist eine anorganische Nährlösung, die alle essentiellen Elemente enthält.

Beim bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren sind für d e fermentative Produkt on der Keime sowohl das che ostatische Prinz der kontinuierlichen Kultur, bei welchem die physiologische Aktivität der Kultur durch e n limitierendes Substrat, vorzugsweise der KohLenstoff- und Energiequelle, reguliert wird, wie auch das turbidostatische Prinzip der kontinuierlichen Kultur, bei welchem die Verdünnungsgeschwindigkeit (My) und damit die

physiologische Aktivität der Kultur extern über einen Wachstumsparameter, vorzugsweise über die augenblickliche ZelLdichte der Kultur, regul ert wird, anwendbar.

Vorzugsweise wird die turbidostatische kontinuierliche Kultivierung angewendet.

Um ein maximales Bakterienwachstum zu fördern, sind auch die Temperaturen bzw. der pH-Wert von Bedeutung; so soll zweckmäßig während der Züchtung eine Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise 30°C, und ein pH-Wert von 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 7,0, eingehalten werden.

Im einzelnen wird das erfindungsgemäße Verfahren bei turbidostati scher Arbeitsweise in einem Fermentor durchgeführt, indem zunächst das Nährmed um mit einem Bakterienstamm beimpft und unter Einhaltung der angegebenen Bedingungen gearbeitet wird, bis die angegebene Zelldichte von 2 - 3 x 10" Zellen/ml in der logarithmischen Endphase erreicht wird. Sobald dies der Fall ist, wird aus dem Fermentor Bakteriensuspension kont nuierlich abgezogen und durch frische Nährlösung kontinuierlich ersetzt. Die Verdünnungsrate soll zweckmäßig nicht mehr als 0,3 My, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 My, betragen.

Unter den angegebenen Bedingungen werden nach Erreichen des Fließgleichgewichtszustandes 1,5 b s 2,0 g/l nasse Zellen erhalten, was einem Trübungswert der Suspension vor der Zent ri fugi erung bei 590 nm nach der Methode von Tyndall von 0,5 bis 0,7 entspricht.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:

Bei spi el :

Es wurde eine Nährlösung folgender Zusammensetzung ve rwendet :

Dinatriumsuccinat 4,05 g/L,

Dikaliummonohydrogeπphosphat 7 g/L,

Kaliumdihydrogenphosphat 3 g/L,

Ammoniumhydrogenphosphat 1 g/L,

Magnesiumsulfat . 7 H2O 0,05 g/L,

EisendlDchlorid 0,0025 g/L, der pH-Wert auf 7,0 eingestellt und die Temperatur auf 30°C gebracht. Die Nährlösung wurde mit dem Stamm Pseudomonas aeruginosa M-2 beimpft und in einen 15 l Fermentor eingebracht. Während einer Fermentationsdauer von 96 Stunden wurden 140 l des Nährmediums durchgesetzt, wobei der Luftdurchsatz 10 % pθ2 (Sauerstoffpartialdruck) betrug. Die Verdünnungsrate betrug 0,1 My. Die Zelldichte nach Erreichen des Fließgleichgewichtszustandes betrug 2 - 3 x 10 ⁹ Zellen/ml.

Unter den gleichen Bedingungen wurden die Stämme 170001 und 1210 kultiviert, wobei in der folgenden Tabelle die Kulturbedingungen, Ve rdünnungs rate, Sauerstoffpartialdruck in % und Zellenausbeute in g/l Naßgewicht nach zweimaliger Zentrifugation bei 15000 x g ersichtlich ist. Weiters sind die Trübungswerte der Suspension vor der Zentrifugierung angegeben.