〔マウス腹腔浸出マクロファージを用いた各 種乳酸菌のインターフェロンβ産生促進試験� ��
 表1に示す乳酸菌を使用し、インターフェロ ンβ産生促進試験を実施した。

1.乳酸菌懸濁液の調製
 MRS培地に各種乳酸菌を1×10 ⁷ 個/mlとなるように接種した。テトラジェノコ ッカス属は、食塩10%を含有するMRS培地に1×10 ⁷ 個/mlとなるように接種した。30℃で48~72時間� �置培養した後、95℃で10分間の煮沸殺菌を行� ��た。その後、遠心濃縮機によって培地を除� ��して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄� ��、細胞培養用のRPMI培地に波長600nmで吸光度� ��0.125となるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を� �製した。

2.インターフェロンβ産生促進試験
 調製した乳酸菌懸濁液のインターフェロン� �産生促進活性を、マウス(8~12週齢BALB/c、雄、 チャールズリバー社)より採取、調製した腹� �滲出マクロファージ細胞を用いて評価した� �
(1)腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製
 チオグリコレート2mlを腹腔内に投与し、刺� ��したマウスから、投与3日後に無菌的に腹腔 滲出マクロファージを採取した。採取したマ クロファージを独自に調整したFBS溶液にて洗 浄後、細胞数を測定し、2×10 ⁶ 個/mlの濃度になるようにRPMI 1640培地で調製� �た。調整したマクロファージ細胞溶液を96穴 組織培養プレートに1穴当たり100μlを播種し� �。これにRPMI 1640培地、あるいは上記の濃度� ��調整した乳酸菌菌体懸濁液をそれぞれ1穴当 たり100μl加え、37℃の5%炭酸ガス培養器内で� �養し、共培養開始後3時間、6時間の培養上清 を回収した。
(2)インターフェロンβ産生促進活性の測定
 上記のように経時的に回収した培養上清を� ��上清を経時的に回収し、インターフェロン� �測定キット(PBL社製)を用い、エンザイムイム ノアッセイにより測定した。

 結果を図1に示す。共培養の開始後6時間� �において、テトラジェノコッカス属、ラク� �バチルス属、ペディオコッカス属、ロイコ� �ストック属及びストレプトコッカス属の乳� �菌が、腹腔滲出マクロファージ細胞のイン� �ーフェロンβ産生を促進することが確認され た。以上により、乳酸菌の菌体が、インター フェロンβ産生促進剤として有用であること� ��示された。

 〔骨髄由来樹状細胞を用いた各種乳酸菌の� ��ンターフェロンβ産生促進試験〕
 表2に示す乳酸菌を使用し、インターフェロ ンβ産生促進試験を実施した。

1.乳酸菌懸濁液の調製
 MRS培地に各種乳酸菌を1×10 ⁷ 個/mlとなるように接種した。テトラジェノコ ッカス属は、食塩10%を含有するMRS培地に1×10 ⁷ 個/mlとなるように接種した。30℃で48~72時間� �置培養した後、95℃で10分間の煮沸殺菌を行� ��た。その後、遠心濃縮機によって培地を除� ��して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄� ��、細胞培養用のRPMI培地に乳酸菌懸濁液を調 製した。

2.インターフェロンβ産生促進試験
(1)骨髄由来樹状細胞懸濁液の調製
 骨髄由来樹状細胞は、BALB/cマウスもしくはC 57BL/6マウスをイソフルラン吸入麻酔下に頸椎 脱臼して安楽死させた後、下肢から大腿骨、 頸骨を取り出し、氷冷した1%ウシ胎児血清(FCS ,非動化したもの)加RPMI1640培地(Sigma社製)の入� ��た細胞培養用6cm ディッシュ(BD FALCON社製)� �入れた。1%FCS加RPMI1640を注入して骨髄を押し� ��した後、懸濁した。得られた細胞懸濁液を� ��ルストレイナー(40μm, BD FALCON)で濾過した� �、440×gで5分間遠心分離した。

 溶血バッファー(5mL,0.155M NH ₄ Cl,0.01M Tris, pH7.5)を加え5分間氷上に置いた後 、1%FCS加RPMI11640(5mL)を加えて遠心分離し、1%FCS 加RPMI1640でさらに2回洗浄した。phycoerythrin(PE)� ��識抗I-A抗体(Clone M5/114.14.2, BD Pharmingen社製,  0.2mg/mL)、PE標識抗CD4抗体(Clone GK1.5, BD Pharmi ngen社製,0.2mg/mL)及びPE標識抗CD8抗体(Clone 53-6.7 ,BD Pharmingen社製,0.2mg/mL)をMACS running bufferで� �れぞれ1000倍希釈した抗体カクテル(100μL/10 ⁷  cells)及びウサギIgG(50μg/mL, Zymed社製)を加え� ��氷上で30分間静置した。

 MACS running bufferで1回洗浄した後、抗PE magne tic beads(20μL/10 ⁷  cells,Miltenyi社製)とMACS running buffer(80μL/10 ⁷  cells)を加え、4~8℃で15分間静置した。反応� �の20倍量のMACS running bufferで1回洗浄した後� �MACS running buffer(0.5mL/10 ⁸  cells)に懸濁し、自動磁気分離システム(Auto  MACS, Miltenyi社製)を用いてネガティブフラク� �ョンを分離した。分離した細胞を1%FCS加RPMI16 40培地で1回洗浄した後、顆粒球単球コロニー 刺激因子(GM-CSF)加基本培地に懸濁した。基本� ��地は、ペニシリン(100,000 U/L,明治製菓社製)� ��ストレプトマイシン(100mg/L,明治製菓社製)、 2-メルカプトエタノール(50μM,Gibco社製)、L-グ� ��タミン酸(2mM,ナカライテスク社製)、HEPES(20mM ,同仁化学研究所製)加RPMI1640培地(Gibco社製)に� ��働化したFCS(Hyclone社製)を10%添加したものを� ��いた。

 GM-CSFはマウスGM-CSF遺伝子を導入したplasmacyto ma X63-Ag8(J558L-GM-CSF)の培養上清を基本培地に10 %添加した。細胞液をトリパンブルー(Gibco社� �)で懸濁し、血球計算板を用いて細胞数を計� ��した後、細胞培養用6ウェルプレート(BD FALC ON社製)に1.2×10 ⁶ /4mL/ウェルとなるように分注し、培養した。� ��養開始後3日目及び6日目に培地を2mL吸引除� �して新しいGM-CSF加基本培地を2mL加え、培養� �始後8日目に浮遊細胞を未成熟樹状細胞とし� ��回収した(CD11c陽性細胞>85%)。細胞を1%FCS加 RPMI1640培地で3回洗浄した後、基本培地に懸濁 し、骨髄由来樹状細胞懸濁液とした。

 (2)インターフェロンβ産生促進活性の測定
 上記のようにして得た2種類の細胞懸濁液と 、乳酸菌懸濁液とを一定の割合(骨髄由来樹� �細胞数:乳酸菌数=1:50)で混合し、共培養を行� ��た。培養6時間後に上清を回収し、実施例1� �同様にエンザイムイムノアッセイにより、� �清中インターフェロンβ濃度を測定した。
 結果を図2に示す。図に示すように各種乳酸 菌、ビフィドバクテリウム属よりインターフ ェロンβの産生が確認された。

〔テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌の インターフェロンβ産生促進試験〕
1.乳酸菌懸濁液の調製
 乳酸菌としてテトラジェノコッカス・ハロ� ��ィラスTh221(Tetragenococcus halophilus Th221)を使� �した。当該菌株は、独立行政法人 産業技術 総合研究所 特許生物寄託センターに寄託さ� ��ており、その受託番号は、FERM AP-21310であ� �。
 まず、食塩10%を含有したMRS培地にテトラジ� ��ノコッカス・ハロフィラスTh221を1×10 ⁷ 個/mlとなるように接種した。30℃で48~72時間� �置培養した後、95℃で10分間の煮沸殺菌を行� ��た。生理食塩水にて菌体を洗浄後、生理食� ��水に1×10 ⁹ 個/mlとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調 製した。

2.RNaseA処理
 上記乳酸菌懸濁液に10μg/mlとなるようにRNase A(Sigma社製 Ribonuclease A from bovine pancreas)を� �加し、1時間、37℃でインキュベートを行っ� �。その後、生理食塩水にて菌体を洗浄し、� �び生理食塩水に1×10 ⁹ 個/mlとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調 製した。
3.インターフェロンβ産生促進試験
 上記にて調製した乳酸菌懸濁液のインター� ��ェロンβ産生促進活性及びインターロイキ� �12産生促進活性を、6週齢BALB/cマウス(日本エ� ��エルシー社製)より採取、調製した骨髄由来 樹状細胞を用いて評価した。

(1)骨髄由来樹状細胞懸濁液の調製
 骨髄由来樹状細胞は、BALB/cマウスをイソフ� ��ラン吸入麻酔下に頸椎脱臼して安楽死させ� ��後、下肢から大腿骨、頸骨を取り出し、実� ��例2と同様に調整した。

(2)インターフェロンβ産生促進活性の測定
 上記のようにして得た2種類の細胞懸濁液と 、乳酸菌懸濁液とを一定の割合(骨髄由来樹� �細胞数:乳酸菌数=1:50)で混合し、共培養を行� ��た。上清を経時的に回収し、実施例1と同様 にエンザイムイムノアッセイにより、上清中 インターフェロンβ濃度を測定した。
 結果を図3に示す。乳酸菌懸濁液が骨髄由来 樹状細胞のインターフェロンβ産生を促進し� ��乳酸菌懸濁液のRNaseA処理によりインターフ� ��ロンβ産生促進活性が低下した。
 以上から、インターフェロンβ産生促進活� �の有効成分がRNAであることが示された。

4.インターロイキン12産生促進活性の測定
 上記で回収した上清のインターロイキン12� �度をエンザイムイムノアッセイにより測定� �た。エンザイムイムノアッセイは、ラット� �マウスインターロイキン12抗体(Pharmingen 社� �)を0.2M、pH6.0のリン酸緩衝液で2μg/mlに調製し た溶液を、96穴組織培養プレート1穴当たり100 μl加え、室温で一晩放置しラット抗マウスイ ンターロイキン12抗体を各穴に付着させたプ� ��ートを用いて行った。培養上清を1穴当たり 100μl加え室温で90分間放置し、培養上清のマ� ��スインターロイキン12をプレートに付着し� �ラット抗マウスインターロイキン12抗体と結 合させた。
 洗浄後ラットビオチン化抗マウスインター� ��イキン12抗体(Pharmingen 社製)を加え、プレー トに結合させたマウスインターロイキン12に� ��合させた。洗浄後ストレプトアビジンで標� ��したペルオキシダーゼ酵素(Vector 社製)を加 え、ビオチンと結合させた。TMB基質溶液(Moss/ コスモバイオ 社製)を1穴当たり100μl加え、� �温で20分間反応させ、反応を0.5N塩酸で停止� �、マイクロプレートリーダーで吸光度450nmを 測定し、リコンビナントマウスインターロイ キン12(Pharmingen 社製)で作成した標識曲線か� �、培養上清中のインターロイキン12の濃度を 求めた。
 結果を図4に示す。インターフェロンβとイ� ��ターロイキン12の産生促進活性の間に高い� �関が見られ、インターフェロンβの産生と共 にTh1型免疫誘導に関わるインターロイキン12� ��産生が誘導された。以上より、乳酸菌の刺� ��によりインターフェロンβ産生が促進され� �それにより免疫調節作用が誘導されること� �確認された。

〔TLR3ノックアウトマウスを使用したインタ� �フェロンβ産生促進試験〕
 乳酸菌の構成成分を認識するToll様受容体(TL R)に着目し、2本鎖RNAを認識するTLR3をノック� �ウトしたマウス(6~12週齢C57BL/6、雌、兵庫医� �大学より分与)を用いて、インターフェロン� �産生促進活性を評価した。骨髄由来樹状細� �の調製、乳酸菌の調製、インターフェロンβ 産生促進活性の測定は実施例2と同様の方法� �行った。共培養開始後12、24時間目の上清中� ��インターフェロンβ濃度を測定した。

 結果を図5に示す。TLR3をノックアウトし� �細胞においてインターフェロンβ産生促進活 性が低下した。以上により、インターフェロ ンβ産生促進活性にTLR3が関わっていること、 即ち、インターフェロンβ産生促進活性の有� ��成分に乳酸菌の2本鎖RNAが関わっていること が示された。

〔TRIFノックアウトマウスを使用したインタ� �フェロンβ産生促進試験〕
 TRIFというアダプター分子はTLR3からのシグ� �ルを伝達する。このアダプター分子をノッ� �アウトしたマウス(6~12週齢C57BL/6、雌、兵庫� �科大学より分与)を用いて、実施例3と同様に インターフェロンβ産生亢進活性を評価した� ��骨髄由来樹状細胞の調製、乳酸菌の調製、� ��ンターフェロンβ産生促進活性の測定は実� �例2と同様の方法で行った。共培養開始後12� �24時間目の上清のインターフェロンβ濃度を� ��定した。

 結果を図6に示す。TRIFをノックアウトし� �細胞においてインターフェロンβ産生促進活 性が低下した。以上により、乳酸菌によるイ ンターフェロンβ産生促進活性がTRIFを経由す るシグナルであることが確認された。

〔食品の製造例〕
 ペディオコッカス・ペントサセウスNRIC1915� �を、100mlのMRS培地で30℃、24時間培養した後� �生理食塩水中に分散、遠心分離することに� �り、菌体ペーストを得た。

 これを無調整豆乳(紀文フードケミファ製 )に添加し、30℃で24時間培養することにより� ��ヨーグルト様食品を得た。

〔インターフェロンβ中和試験〕
 インターフェロンβとインターロイキン12の 間に高い相関が確認されたことから、ラット 由来抗マウスインターフェロンβ抗体(Yamasa社 製)を80μg/mlとなるように培養液に添加し、骨 髄由来樹状細胞より培養上清中へ分泌された インターフェロンβを中和したときのインタ� ��ロイキン12産生量を測定した。
 骨髄由来樹状細胞の調製、乳酸菌の調製、� ��ンターロイキン12産生促進活性の測定は、� �施例3と同様の方法で行った。
 インターロイキン12p35、インターロイキン12 p40、インターフェロン・レギュラトリー・フ ァクター7のmRNA発現量は、定量的リアルタイ� ��PCR法により測定を行った。
 mRNAの抽出は、共培養開始6時間目にRNeasy Min i Kit(Qiagen社製)を用いて行った。その後、総R NA量が300ngとなるように抽出液を分取後、ExScr ipt RNA PCR Kit(Takara社製)を用いて逆転写反応� ��行い、cDNAを得た。

 これを用い、Sybr Premix Ex Taq(Takara社製)に� �り定量的リアルタイムPCRを行った。各mRNAに� ��する特異的なプライマーとして、インター� ��イキン12p35は、センス 5’-CTTAGCCAGTCCCGAAACCT-3 ’(配列番号1)、アンチセンス 5’-TTGGTCCCGTGTGA TGTCT-3’(配列番号2)、インターロイキン12p40は 、センス 5’-GTTCAACATCAAGAGCAGTAGCA-3’(配列番号 3)、アンチセンス 5’-CTGCAGACAGAGACGCCATT-3’(配� ��番号4)、インターフェロン・レギュラトリ� �・ファクター7は、センス 5’-ACAGGGCGTTTTATCTTG CG-3’(配列番号5)、アンチセンス 5’-TCCAAGCTCC CGGCTAAG-3’(配列番号6)、βアクチンは、センス  5’-GCTACAGCTTCACCACCACAG-3’(配列番号7)、アンチ センス 5’-GGTCTTTACGGATGTCAACGTC-3’(配列番号8)� �用い、Mx3000P(Stratagene社製)により測定した。� ��発現量は、βアクチンの発現量にて標準化� �行い、刺激前に対する相対発現量を求めた� �
 インターフェロンβを中和することにより� �ンターロイキン12産生量が減少した。結果を 図7に示す。

 mRNA発現量は、インターロイキン12p35が減少� ��ており、インターフェロンβがインターロ� �キン12p35に影響を与えていることが示された 。結果を図8に示す。
 一方、インターロイキン12p40の発現量に影� �はなかった。結果を図9に示す。
 また、インターフェロンβにより誘導され� �インターフェロン・レギュラトリー・ファ� �ター7の発現量も減少していた。結果を図10� �示す。
 以上から、テトラジェノコッカス・ハロフ� ��ラスTh221の刺激により骨髄由来樹状細胞か� �産生されたインターフェロンβが、インター ロイキン12p35産生を誘導することによりイン� ��ーロイキン12の産生促進に関わっているこ� �が示された。

〔乳酸菌によるインターフェロンβを介した� ��ンターフェロンγ産生細胞の誘導〕
 骨髄由来樹状細胞とCD4 ⁺  T細胞の共培養を行なうとき、乳酸菌のイン ターフェロンβ産生促進作用によりインター� ��ェロンγ産生細胞が誘導されるかを確認し� �。
 骨髄由来樹状細胞の調製、乳酸菌の調整は� ��施例3と同様に行なった。また、CD4 ⁺  T細胞はDO11.10マウスの脾臓から調製した。DO 11.10マウスの脾臓を採取後、メッシュにより� ��り潰し、脾臓細胞を得た。その後、抗マウ� ��CD4ビーズ(Miltenyi)と30分間インキュベートし� ��Auto MACS(Miltenyi)により、CD4 ⁺  T細胞を得た。
 96ウェルプレートにおいて1ウェル当たり1×1 0 ⁵ 個の骨髄由来樹状細胞と5×10 ⁵ 個のCD4 ⁺  T細胞及び5×10 ⁶ 個のテトラジェノコッカス・ハロフィラスTh2 21を培養した。ラット由来抗マウスインター� ��ェロンβ抗体(Yamasa社製)を80μg/mlとなるよう� ��培養液に添加し、骨髄由来樹状細胞より培� ��上清中へ分泌されたインターフェロンβを� �和した。コントロール抗体として、抗ラッ� �IgG1抗体を用いた。
 培養開始3日目に培地交換を行い、7日目に� �ローサイトメトリー FACS Aria(BD社製)を用い� ��、インターフェロンγ産生細胞、インター� �イキン4産生細胞の割合を調べた。測定には� ��マウスインターフェロンγ抗体(BD Pharmingen)� ��抗マウスインターロイキン4抗体(BD Pharmingen )を用いた。
 結果を図11に示す。テトラジェノコッカス� �ハロフィラスTh221の刺激によりインターフェ ロンγ産生細胞の割合が増加した。また、抗� ��ンターフェロンβ抗体により、インターフ� �ロンγ産生細胞の誘導が抑制された。このこ とから、乳酸菌の刺激により、インターフェ ロンβを介してインターフェロンγ産生細胞� �誘導されることが確認された。