PERIFÉRICA

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, y más concretamente se refiere a un método de identificación de células epiteliales circulantes en sangre periférica que permite discriminar entre individuos que padecen una enfermedad que cursa con destrucción de células epiteliales o no, así como el kit o dispositivo para llevar a cabo los métodos de la invención.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El epitelio es un tejido compuesto por células estrechamente unidas, con escasa sustancia intercelular. Las células epiteliales derivan de dos de las capas germinativas embrionarias, el ectodermo y el endodermo, y estructuralmente componen la mayoría de los órganos.

Del ectodermo deriva el epitelio de la epidermis y de la córnea. Anejos glandulares como las glándulas sudoríparas, sebáceas y mamarias.

Del endodermo deriva el tejido de recubrimiento del tubo digestivo del tubo digestivo también de origen endodérmico. También son de origen endodérmico todas las glándulas que integran el aparato digestivo, como el hígado, páncreas y glándulas gástricas e intestinales.

El mesodermo da origen a riñon, y aparatos genitales masculino y femenino

Una propiedad fundamental de las células epiteliales es su tendencia inherente a mantener un contacto muy extenso entre sí, formando capas coherentes que recubren superficies y tapizan cavidades.

El epitelio respiratorio tienen un doble origen: el epitelio de la laringe, tráquea, bronquios y alveolos pulmonares tiene un origen endodérmico, mientras que las estructuras cartilaginosas, musculares y el sistema vascular tienen origen mesodérmico. Las células epiteliales, especialmente las que recubren la superficie externa del cuerpo y del intestino, se hallan sometidas a traumatismos mecánicos y de otros tipos de manera constante. En condiciones fisiológicas, en estos epitelios mueren células constantemente que luego son desprendidas. En el conducto gastrointestinal las células sufren una exfoliación continua, en las puntas de las vellosidades.

Por el contrario, en las vías respiratorias y especialmente en la mayoría de las glándulas, la degeneración del epitelio es rara y, por tanto, el plazo vital de las células es bastante largo.

La pérdida fisiológica de las células en el epitelio se ve compensada con la correspondiente regeneración, que en los vertebrados se produce mediante la proliferación mitótica de elementos celulares relativamente indiferenciados.

En el tejido pulmonar, los macrófagos alveolares son los encargados de fagocitar y eliminar material pulmonar degradado, incluyendo neumocitos Tipo I, neumocitos Tipo II y surfactante.

Cuando, por naturaleza, las partículas no pueden ser digeridas por el macrófago, éste migra con ellas en su fagosoma hasta el inicio del transporte mucociliar, desde donde se movilizan hasta la orofaringe y son deglutidos o eliminados con el esputo. La EPOC (Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica) es una de las enfermedades respiratorias con mayor prevalencia y con mayor morbimortalidad a nivel mundial. Supone la tercera causa de muerte tan sólo por detrás de las enfermedades cardiovasculares y el cáncer, y afecta a cerca del 10% de la población adulta de los países desarrollados. Además, una proporción elevada de los pacientes no están diagnosticados o no reciben un tratamiento adecuado para su enfermedad. Más del 70% de los pacientes desconocen padecerla, permaneciendo muchos de ellos sin diagnosticar incluso hasta fases muy avanzadas de la enfermedad.

La EPOC se caracteriza por una pérdida progresiva de función pulmonar como consecuencia fundamentalmente de la exposición al humo del tabaco, que es la traducción fisiológica de los procesos inflamatorios e inmunitarios que llevan a la destrucción de unidades alveolares, pérdida de las vías aéreas de pequeño calibre y la fibrosis peribronquial características de esta enfermedad. Como consecuencia de estos procesos, son liberados a la circulación general restos de la degradación del parénquima pulmonar como elementos de la matriz extracelular.

La pérdida de función pulmonar que se produce en la EPOC puede ser muy diferente entre pacientes, y es posible que los procesos que alteran la maduración pulmonar en la infancia predispongan de forma significativa al desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, detectar los pacientes que pierden aceleradamente función pulmonar no es factible al no disponer de biomarcadores específicos de los procesos patológicos pulmonares.

En los últimos años hemos asistido al desarrollo de técnicas que permiten la identificación en sangre periférica de células provenientes de tejidos humanos, agrupadas bajo el término biopsia líquida, y que han demostrado una utilidad diagnóstica y pronostica en el campo de la oncología. Especialmente interesantes han sido los avances que han aportado las biopsias líquidas en el seguimiento de pacientes con cáncer de pulmón, añadiendo información pronostica y permitiendo una personalización del tratamiento para estos pacientes. Conociendo los mecanismos implicados en la patogenia de la EPOC, es posible que puedan verterse al torrente sanguíneo células alveolares o restos de las mismas, y que estas puedan identificarse en sangre periférica de pacientes con EPOC mediante biopsia líquida, al igual que sucede con las células tumorales circulantes. El diagnóstico actual de la EPOC se basa, fundamentalmente, en manifestaciones clínicas -tos, expectoración, disnea- , y pruebas de función pulmonar, principalmente la espirometría -FEV1 <0,7 después de broncodilatadores-. En ambos casos se trata de epifenómenos, síntomas clínicos y obstrucción bronquial, que acontecen cuando las alteraciones fisiopatológicas de la enfermedad ya está asentadas, no existiendo marcadores que permitan un diagnóstico temprano de la misma, antes de que llegue a ser irreversible, como ocurre en la mayoría de los casos diagnosticados de EPOC. . El coste directo medio anual de un paciente con EPOC en España se ha cuantificado entre 910 y 2.061 €. El disponer de un método de diagnóstico que permita identificar precozmente a los individuos que padecen la enfermedad, o que tienen un alto riesgo de desarrollarla, mejorando la sensibilidad y especificidad de los procedimientos actuales, disminuiría los costes económicos y mejoraría el pronóstico de dichos pacientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han determinado la sensibilidad y especificidad in vitro de la primera técnica de detección de células pulmonares circulantes (CPCs) y posteriormente han demostrado que es posible aislar CPCs en sangre periférica de pacientes con EPOC. Aunque hasta la fecha no se han encontrado referencias que demuestren la presencia de células epiteliales bien diferenciadas en el torrente sanguíneo, su presencia sería indicativa de la existencia de intensos procesos de agresión tisular, que superan la capacidad de los macrófagos para eliminar el material "de desecho", así como otros mecanismos fisiológicos, y esto es un hecho especialmente significativo en tejidos epiteliales tales como el pulmón y las estructuras glandulares.

Por tanto, la técnica descrita en la presente invención, que por primera vez consigue detectar la presencia de células epiteliales bien diferenciada en sangre periférica, serviría para el diagnóstico de individuos que padecen EPOC, así como para cualquier enfermedad que curse con destrucción tisular y liberación de células epiteliales

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1.- Caracterización inmunofluorescente y citomorfológica de células H820 'spiked' en sangre y CPC de pacientes con EPOC. Las columnas muestran señal para (azul) 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) para la tinción del ácido nucleico (nuclear), expresión de citoqueratina-FITC (verde), púrpura (púrpura rojizo) expresión de CD44v6-Alexa Fluor® 633, (gris) visualización de campo brillante y canales fusionados. La primera fila representa células aisladas de cáncer de pulmón H820 de experimentos de enriquecimiento, con expresión positiva de citoqueratina y CD44v6. Las filas segunda y tercera representan CPC aisladas de pacientes con EPOC con señal positiva para citoqueratina y CD44v6.

Figura 2.- Características de la EPOC de los participantes en el estudio basadas en la presencia de CPC aisladas de muestras de sangre, a) Valores de la función pulmonar (expresados como% de lo predicho). b) Tasa anualizada de exacerbaciones moderadas y graves en el año anterior, c) puntajes CAT (prueba de evaluación de la EPOC), d) Disminución de la función pulmonar (expresada como disminución anualizada del FEV1 en mi / año). Las barras representan los valores medios y SEM. CPC +: CPC aisladas; CPC -: las CPC no están aisladas

Figura 3.- Diferencias en el índice BODEx dependiendo de la presencia de CPC aisladas en muestras de sangre. Las barras representan Mean y SEM. * = p <0.05. CPC +: CPC aisladas; CPC-: las CPC no están aisladas

Figura 4.- Caracterización inmunofluorescente e histomorfológica de neumocitos de tejidos pulmonares no tumorales. Las columnas muestran señal para (azul) 4 ', 6- Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) para tinción de ácido nucleico (nuclear), expresión (verde) CD44v6-FITC, visualización de campo brillante (gris) y canales fusionados. Las filas representan tejidos pulmonares de pacientes con neumotorax.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las células epiteliales degradadas posen mecanismos fisiológicos de eliminación, principalmente mediante la fagocitación por parte de macrofagos. Así, en el caso del tejido pulmonar, los macrofagos alveolares son los encargados de fagocitar y eliminar material pulmonar degradado, incluyendo neumocitos Tipo I, neumocitos Tipo II y surfactante. Cuando, por su naturaleza, las partículas no pueden ser digeridas por el macrófago, éste migra con ellas en su fagosoma hasta el inicio del transporte mucociliar, desde donde se movilizan hasta la orofaringe y son deglutidos o eliminados con el esputo.

Así, las enfermedades que pueden dar lugar a la presencia de células epiteliales circulantes serían aquellas que inciden en hígado, páncreas, intestino, glándulas gástricas e intestinales y órganos genitales.

La presente invención describe un procedimiento para detectar células epiteliales que, sorprendentemente, sí se pueden detectar en el torrente sanguíneo.

Concretamente, el método de la presente invención describe un procedimiento automatizado de aislamiento, detección y caracterización fenotípica y genética de células procedentes de tejidos epiteliales y que pueden ser detectadas en sangre. La detección de dichas células en sangre periférica viene determinada por la existencia de un proceso fisiopatológico que dé lugar a fenómenos de desestructuración y destrucción tisular, como puede ser, por ejemplo pero sin limitarnos, el caso de la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica -EPOC -, o la existencia de enfermedad tumoral. Así, en el primer caso podríamos hablar de Células Pulmonares Epiteliales Circulantes (CPCs) y en el segundo caso de Células Tumorales Circulantes (CTCs).

La capacidad de las células tumorales para producir metástasis a distancia es ampliamente conocida, y en su detección y caracterización se centran numerosos estudios clínicos y de investigación básica. Sin embargo, hasta el momento no se han detectado células epiteliales circulantes en el torrente sanguíneo. El método de la presente invención centra su aplicación clínica en la posibilidad de detectar células epiteliales circulantes no tumorales, como biomarcador específico de daño tisular. Esta técnica podría aplicarse a la detección de cualquier célula epitelial, usando los marcadores específicos que la identifiquen. Además, también permite el uso de marcadores intracitoplasmáticos y nucleares para el aislamiento celular automatizado.

MÉTODOS DE LA INVENCIÓN Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de identificación de células epiteliales circulantes en sangre periférica, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende los pasos de incubar la muestra de sangre periférica con los marcadores intracitoplasmáticos, nucleares y/o de superficie en función de la célula epitelial circulante, y de su origen tisular a detectar, e identificar las células mediante técnicas inmunocitoquímicas, moleculares y/o citogenéticas.

Preferiblemente, el primer método de la invención comprende un paso previo de someter la muestra de sangre periférica de un individuo a una separación por gradiente de densidad.

En otra realización preferida después de la separación por gradiente de densidad se realiza un paso que consiste en recoger la inferíase y lavarla con buffer salino antes de incubar la muestra con los marcadores.

Las células que identifica el primer método de la invención, en principio, son preferiblemente células no tumorales. Aún más preferiblemente son células no tumorales provenientes de tejidos corporales afectos de cualquier proceso de agresión tisular. En otra realización más preferida, son células epiteliales procedentes de los pulmones, el hígado, el páncreas y células provenientes de las glándulas gástricas e intestinales, el riñon, órganos genitales, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, los marcadores intracitoplasmáticos se seleccionan de la lista que consiste en: Citoqueratinas, Vimentina, SP1 (Antígeno surfactante A y B), o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, los marcadores nucleares son factores de transcripción, y preferentemente se seleccionan de entre Snail, Slug, SOX2, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, los marcadores de superficie se seleccionan de la lista que consiste en N-cadherina, EpCam, CD44v6, AXL, EGFR, EMA, MUCINA, CD133, Sca1 , In asialoglicoproteína (ASGPR) o cualquiera de sus combinaciones.

Más preferiblemente, los marcadores son propios de las CPCs, y se seleccionan de la lista que consiste en: Citoqueratinas, CD44V6, SP1 , Sca1 y SOX2. En una realización aún más preferida, la célula epitelial circulante que se detecta con el primer método de la invención es una célula pulmonar circulante (CPC).

En otra realización más preferida, los marcadores son propios de células hepáticas, y se seleccionan de la lista que consiste en: sialoglicoproteína, mir122, CXCR4 (CD184), CD90, ALDH1

En otra realización más preferida, los marcadores son propios de células de páncreas, y se seleccionan de la lista que consiste en: KRAS, TP53 ,CDKN2A/p16, MAD4/DPC4, miR-7, miR-375, miR-16, miR-196a miR-16, miR-196, miR-27a-3p miR-145, miR-150, miR-223, miR-636, miR-21 , miR-196a, miR-196b, miR-18a, miR-223 y miR-221. En otra realización más preferida, los marcadores son propios de células provenientes de glándulas gástricas e intestinales (separar si es necesario), y se seleccionan de la lista que consiste en: miR-557; SPM , NFIC, SPIB, THAP1 , urokinase- type tissue plasminogen activator (upaR)

En otra realización más preferida, los marcadores son propios de células renales, y se seleccionan de la lista que consiste en: CK7, AMACR, CA IX, TFE3, upaR

En otra realización más preferida, los marcadores son propios de células provenientes de los órganos genitales, y se seleccionan de la lista que consiste en: BRAC1/2, IPK3, iR-132, miR-26a, miR-145, EMG1 y SEMG2, FOLH1 , TGM4, TKTL1 , LDHC and PGK2

En otra realización más preferida, los marcadores son propios de células provenientes del sistema nervioso central, y se seleccionan de la lista que consiste en: Nestin, SOX10, Notchl , HES1 , HES2, Occludin, PAX6, HES5, GABA _B receptor 1 y 2, GAD65, GAD67, GFAP, GLAST, BLBP, TN-C, N-cadherin, Nestin y SOX2.

La separación de las poblaciones que presentan el fenotipo de interés se puede llevar a cabo mediante técnicas de separación por afinidad, entre las que se incluyen, pero sin limitarnos: separación magnética (utilizando partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos), cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a anticuerpos monoclonales o usados junto a anticuerpos monoclonales, y "panning" con el anticuerpo asociado a un soporte sólido, así como mediante otras técnicas que resulten adecuadas. Se puede obtener una separación más precisa mediante citometría de flujo, técnica que permite separar poblaciones celulares en función de la intensidad de la tinción, junto con otros parámetros como el tamaño celular y la complejidad celular.

Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de aislamiento de células epiteliales circulantes en sangre periférica, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos del primer método de la invención, y además comprende el paso de aislar las células identificadas mediante una técnica de separación por afinidad.

En una realización más preferida de este aspecto de la invención, la técnica de separación por afinidad se selecciona de entre técnicas que empleen propiedades físicas, como tamaño y peso, y técnicas que empleen propiedades biológicas (como marcadores), o su combinación.

En una realización más preferida de este aspecto de la invención, la técnica de separación por afinidad se selecciona de la lista que consiste en: separación magnética, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a anticuerpos monoclonales o usados junto a anticuerpos monoclonales, "panning" con el anticuerpo asociado a un soporte sólido, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la técnica de separación por afinidad se realiza mediante partículas (o microesferas) magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos. Es decir, la separación se realiza mediante selección positiva inmunomagnética. Más preferiblemente se emplea una pluralidad de partículas magnéticas o microesferas magnéticas que tienen: a) un diámetro entre 20 nm y 500 nm, o que permite identificar marcadores nucleares e intracitoplasmáticos, más preferiblemente de aproximadamente 50 nm, b) un diámetro entre 4000 nm y 6000 nm, preferiblemente de aproximadamente 5000 nm, que permite identificar marcadores nucleares, o c) una combinación de ambas.

Aún más preferiblemente se emplea una combinación de partículas magnéticas o microesferas magnéticas del tipo (a) y (b).

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que padecen una enfermedad que cursa con destrucción tisular y liberación de células epiteliales, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos del primer método de la invención, y además comprende cuantificar el número de células aisladas del segundo método de la invención.

Adicionalmente, el tercer método de la invención además comprende comparar el número de células identificadas con una muestra de referencia. El término "muestra de referencia" o "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a la cantidad absoluta o relativa de células epiteliales que permite discriminar entre individuos que padecen la enfermedad que cursa con destrucción tisular y liberación de células epiteliales de los que no. Preferiblemente permite discriminar entre los que padecen la enfermedad y los individuos sanos.

Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras de individuos que no padecen ninguna de estas enfermedades. En una realización particular, en ausencia de muestras de referencia, la cantidad de referencia es 0.

En el caso de la EPOC, la cantidad de referencia se refiere a la cantidad absoluta o relativa de CPCs que permite discriminar entre individuos que padecen EPOC de los que no. Aún más preferiblemente permite discriminar entre a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC, c) individuos con adenocarcinoma, d) individuos con carcinoma escamoso, e) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o f) individuos con EPOC y carcinoma escamoso. g) Individuos con enfisema

En una realización preferida, la enfermedad que cursa con destrucción de células epiteliales se selecciona de entre EPOC y/o enfisema o cualquiera de sus combinaciones. De forma aún más preferida, la enfermedad se selecciona de entre enfisema panacinar por déficit de Alfa-1 -Antitripsina; enfisema centroacinar o centrolobulillar, que es el que se asocia al consumo de tabaco; enfisema bulloso congénito o asociado a procesos de fibrosis pulmonar, y enfisema paraseptal o acinar distal, relacionado con procesos cicatriciales. Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que padecen una enfermedad que cursa con destrucción de células epiteliales, de ahora en adelante cuarto método de la invención, que comprende los pasos del primer y tercer método de la invención, y además comprende clasificar al individuo en el grupo de individuos que tienen mayor riesgo de padecer una enfermedad que cursa con destrucción tisular y liberación de células epiteliales, cuando se detecta la presencia de células epiteliales circulantes, preferentemente cuando la concentración de estas células epiteliales circulantes es superior a una cantidad de referencia. En una realización particular, en ausencia de muestras de referencia, la cantidad de referencia es 0.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con destrucción del parénquima pulmonar y liberación de células epiteliales se selecciona de entre EPOC y/o Enfisema, así como otros procesos pulmonares que cursen con destrucción tisular, como enfermedades neoplásicas, inflamatorias o autoinmunues, o cualquiera de sus combinaciones. De forma aún más preferida, la enfermedad se selecciona de entre enfisema panacinar por déficit de Alfa-1 -Antitripsina; enfisema centroacinar o centrolobulillar, que es el que se asocia al consumo de tabaco; enfisema bulloso congénito o asociado a procesos de fibrosis pulmonar, y enfisema paraseptal o acinar distal, relacionado con procesos cicatriciales.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a un método de seguimiento de la respuesta al tratamiento de individuos que padecen una enfermedad que cursa con destrucción tisular y liberación de células epiteliales, de ahora en adelante cuarto método de la invención, que comprende llevar a cabo los pasos de cualquiera de los métodos primero a tercero de la invención, de manera no simultánea.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con destrucción tisular y liberación de células epiteliales se selecciona de entre EPOC y/o enfisema, así como otros procesos pulmonares que cursen con destrucción tisular, como enfermedades neoplásicas, inflamatorias o autoinmunues, o cualquiera de sus combinaciones. De forma aún más preferida, la enfermedad se selecciona de entre enfisema panacinar por déficit de Alfa-1 -Antitripsina; enfisema centroacinar o centrolobulillar, que es el que se asocia al consumo de tabaco; enfisema bulloso congénito o asociado a procesos de fibrosis pulmonar, y enfisema paraseptal o acinar distal, relacionado con procesos cicarticiales.

El término "seguimiento de la respuesta al tratamiento", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, a la supervisión del desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo, pero sin limitarse, la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento de la enfermedad que cursa con destrucción de células epiteliales, o a una intervención quirúrgica. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el seguimiento se realiza post-tratamiento.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método de seguimiento de la posibilidad de establecer un pronóstico de la enfermedad, en función de la cantidad absoluta o relativa de células epiteliales circulantes que se detecten, como indicador de la amplitud del daño tisular directo que tiene lugar en cada tejido, detectado mediante el cuarto método de la invención. Por tanto en una realización preferida de este aspecto de la invención, el establecimiento de un pronóstico de la enfermedad.

USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN

Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprende un principio activo que se selecciona de entre un agonista β2, un anticolinérgico, un compuesto del grupo de los corticoesteroides, un inhibidor de la fosfodiesterasa y un supresor del sistema inmune, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con EPOC y/o enfisema identificable por el tercer o cuarto método de la invención.

Un octavo aspecto de la invención se refiere uso de una composición farmacéutica que comprende un principio activo que se selecciona de entre complejos de coordinación de platino (cisplatino o carboplatino), gemcitabina, paclitaxel, docetaxel, etopósido, vinorelbina, pemetrexed, gefitinib, erlotinib, bevacizumab, o cualquiera de sus combinaciones, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo con adenocarcinoma y carcinoma escamoso, asociado o no a EPOC y/o enfisema, identificables por el tercer o cuarto método de la invención.

KIT O DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO

Un noveno aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo de diagnóstico, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para analizar la cantidad de células epiteliales circulantes en sangre periférica, y que comprende una pluralidad de partículas magnéticas o microesferas magnéticas recubiertas de antígenos específicos se seleccionan de: a) un grupo de partículas con un diámetro de entre 20 nm y 500 nm, b) un grupo de partículas con un diámetro de entre 4000 nm y 6000 nm, preferiblemente 5000 nm, o c) un grupo formado por partículas de los dos grupos anteriores.

Más preferiblemente comprende los medios necesarios para comparar la cantidad de células epiteliales circulantes detectada con una cantidad de referencia.

Aún más preferiblemente, el kit de la presente invención comprende los elementos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la presente invención.

El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.

El kit además puede estar automatizado, o puede incorporarse en un dispositivos capaz de llevar a cabo aislamiento de diferentes tipos celulares que son reconocidos por anticuerpos que van conjugados a partículas magnéticas, y usando un flujo líquido, preferentemente empleando técnicas de microfluídica. Un ejemplo de este tipo de dispositivos son los sistemas IsoFlux, desarrollados por Fluxión Biosciences.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

Determinación de la especificidad y sensibilidad de la metodología a partir de cultivos de Células Pulmonares H820, como modelo para el estudio de CPCs 1. Cultivo celular: Las líneas celulares de cáncer de pulmón se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) (15). Las células H820 se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal y 100 U / mi de penicilina y 100 ng / mi de estreptomicina a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de C02.

2. Anticuerpos utilizados para la detección de CPCs:

- Citoqueratina: pan-cytoqueratina (clon AE1/AE3) (Sigma Aldrich). Las citoqueratinas son proteínas del citoesqueleto presentes en las células epiteliales tanto normales como tumorales.

- Anti-CD44v6: Anticuerpo policlonal Anti-CD44v6 producido en conejo (AB2080) (Merckmillipore). En el aparato respiratorio se puede constatar expresión del CD44v6 en el epitelio pulmonar normal (neumocitos tipo II preferentemente) y aquella parece jugar un papel importante en el mantenimiento de la arquitectura tisular.

3. Experimentos con sangre total: se aislaron células de neumocitos de tipo II a partir de sangre mediante centrifugación de doble gradiente con FicolH , 1 19 g / mi (Histopaque 1 119) y 1 ,058 g / mi basado en Ficoll PM400 a 16% P/V. Debido a la densidad similar del Ficoll 1 ,058 g / mi y sangre, aproximadamente 1 ,060 g / mi, y para evitar el mezclado, la sangre debe ser diluida previamente en PBS1X al 19% (4 mi de sangre / 17,3 mi de PBS1X).

Se colocaron 10 mi de Ficoll 1 1 19 en la parte inferior de un tubo de fondo cónico de 50 mi, luego 5 mi de Ficoll 1058 se añadió con cuidado la sangre diluida sobre el doble gradiente de Ficoll.

Los tubos se centrifugaron a 700G durante 45 minutos sin interrupción (Centrífuga Allegra X-12R (Beckman Coulter), después se recuperó la fase celular mononuclear entre las dos capas de ficoll y se permeabilizaron y fijaron de acuerdo con el kit de enriquecimiento y detección de carcinoma celular con tecnología MACS (MiltenyiBiotec, BergischGladbach, Alemania). Posteriormente, estas células se incubaron con un anticuerpo específico de múltiples citoqueratinas (CK3-1 1 D5) (MiltenyiBiotec, BergischGladbach, Alemania) que reconocía citoqueratinas citoplasmáticas 7, 8, 18 y 19 y posteriormente con un anticuerpo FITC-anti-citoqueratina (clon: CK3-6H5; MiltenyiBiotec). Finalmente, las células positivas de citoqueratina se obtuvieron a través de columnas magnéticas de separación de células MACS (MiltenyiBiotec) y se centrifugaron sobre láminas de vidrio recubiertas con poly-L-lisina.

Las células positivas para la citoqueratina se visualizaron y se localizaron bajo microscopía epifluorescente, observando su señal verde citoplásmica específica. A continuación, las muestras se incubaron con un anticuerpo policlonal anti-CD44v6, exón v6rabbit (AB2080 Merckmillipore), combinado con un anticuerpo secundario Alexa Fluor 633 de IgG de cabra anti-conejo (H + L) (A-21070 ThermoFisher) y montado usando medio de montaje VECTASHIELD ConDAPI (Vector Labs). Por último, las diapositivas se visualizaron bajo Zeiss LSM 710 confocal / multiphoton láser microscopio de barrido. [Ortega, F.G. et al. miRNA in situ hybridization in circulating tumor cells - MishCTC. Sci. Rep. 5, 9207; DOI:10.1038/srep09207 (2015)].

4. Determinación de CPCs en sujetos sanos no fumadores: previa a la determinación de CPCs en pacientes con EPOC, se realizó una determinación de CPCs con esta metodología en 10 sujetos sanos sin enfermedad respiratoria previa ni historial de exposición a tabaco previo.

5. Determinación de sensibilidad y especificidad de la prueba: Determinación de CPCs en pacientes con EPOC

Diseño del estudio

Estudio observacional transversal realizado de forma ambulatoria de dos servicios de neumología, durante los periodos de Octubre de 2016 a Enero de 2017.

Población de estudio

Participaron en el estudio pacientes adultos mayores de 40 años con un diagnóstico previo de EPOC de acuerdo con las normativas internacionales (4), definido en base a un consumo acumulado de al menos 10 paq- año y un cociente postbroncodilatación FEV 1 /FVC< 0.70 y al menos un seguimiento previo de 3 años en consulta. Como criterios de exclusión se encontraban la presencia de una exacerbación de la EPOC en las 4 semanas previas a la visita, el antecedente de intervención quirúrgica o toma de biopsia por cualquier motivo en el mes previo, la presencia de un déficit de alfa-1 antitripsina u otras enfermedades respiratorias crónicas aparte de la EPOC y la existencia de una neoplasia previa, así como la negativa a participar en el estudio o la incapacidad para realizar las exploraciones complementarias o responder a los cuestionarios. Variables de estudio

Para cada paciente se recogió información acerca de sus datos sociodemográficos, hábitos tóxicos y enfermedades concomitantes. Todos los pacientes realizaron una espirometría postbroncodilatador de acuerdo con las normativas actuales, así como cuestionarios validados acerca de su enfermedad respiratoria (disnea medida mediante la escala mMRC, puntuación del cuestionario de valoración de la EPOC- CAT®, COPD Assesment test), y una valoración multidimensional de la gravedad de la enfermedad mediante el índice BODEx. Además, para cada paciente se recogió la caída de la función pulmonar anualizada. Para la determinación de CPCs se realizó una extracción de 10 ml_ de sangre periférica de vena cefálica (tras desechar los primeros 10 mL para evitar contaminación por células epiteliales de la epidermis) en tubos de EDTA (Tubos EDTA Vacutainer® (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) y posteriormente se procesaron dichas muestras a temperatura ambiente en un plazo menor a 2 horas evitando la exposición de las muestras a la luz natural. Análisis estadístico

Las variables cualitativas se expresan como frecuencias absolutas y relativas, las variables cuantitativas según sigan o no una distribución normal (tras la aplicación del test de Kolmogorov-Smirnov o Shapiro-Wilk) se expresan Md±SD (media, desviación estándar) y rango (mínimo y máximo) o P50 [P25 - P75] (mediana, rango intercuartílico) respectivamente. La comparación de las variables cuantitativas según los grupos de estudio, se efectuó mediante ANOVA para muestras independientes o H de Kruskal Wallis (según sigan o no distribución normal). El nivel de significación estadística, se estableció en p < 0,05. El análisis estadístico se realizó con el paquete Statistical Package for Social Sciences (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) versión 20.0.

Aspectos éticos

El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica de la Universidad de Granada. Se observaron los principios de la Declaración de Helsinki para proyectos de investigación con seres humanos. Todos los participantes fueron informados de la naturaleza del estudio y sus objetivos y otorgaron su participación en el mismo mediante firma del consentimiento informado. Resultados del ensayo

Diecisiete pacientes con EPOC se incluyeron en el estudio de determinación de CPC. Las características básales de los pacientes con EPOC que participaron en el estudio se muestran en la Tabla 1. En resumen, fueron pacientes de sesenta años, en su mayoría hombres, con un alto consumo acumulativo de tabaco y más del 25% eran fumadores actuales. Tenían obstrucciones bronquiales de gravedad moderada y la gran mayoría de ellos se incluyeron en el grupo B de la clasificación Global Obstructive Lung Disease (GOLD) (58.8% de la muestra t°otal).

Tabla 1. Características clínicas de los pacientes con EPOC incluidos en el estudio de aislamiento de CPC. Los datos continuos se muestran como la media ± desviación estándar o mediana (rango intercuartílico) y las variables categóricas como n (%). IMC = índice de masa corporal. Post-BD: prueba post broncodilatadora. CAT = prueba de evaluación de EPOC. mMRC: escala modificada del Medical Research Council. índice BODEx = IMC, obstrucción del flujo aéreo, disnea y exacerbaciones graves.

En 6 de los pacientes (35,29% del total), se demostró la presencia de CPC en sangre periférica, con una tasa de detección de 1 CPC / 106 células hematopoyéticas. La figura 1 muestra una CPC de un paciente con EPOC. La Tabla 2 muestra las características de los pacientes en los que se aislaron las CPC, así como aquellos en los que las CPC no se aislaron.

Tabla 2. Características de la EPOC de los pacientes clasificados según el aislamiento de las CPC. Los datos continuos se muestran como la media ± desviación estándar o mediana (rango intercuartílico) y las variables categóricas como n (%).

Los pacientes con CPC mostraron una tendencia hacia peor función pulmonar, más exacerbaciones moderadas y severas en el año anterior, más intensidad de síntomas medidos por el cuestionario CAT y una mayor disminución anualizada de la función pulmonar, aunque ninguno de estos resultados fue estadísticamente significativo (Fig. 2). Los pacientes con CPC en sangre periférica mostraron una mayor gravedad de la enfermedad evaluada mediante el índice multidimensional BODEx (Fig. 3).

Tinción inmunofluorescente de tejidos pulmonares no tumorales:

Se obtuvieron secciones congeladas de tejidos pulmonares no tumorales de pacientes con neumotorax y se usaron como control específico para la expresión de CD44v6 de los neumocitos. Brevemente, las secciones se descongelaron y luego se fijaron con acetona fría (-20 ° C) al 100% durante 10 minutos. Se lavaron dos veces con PBS1X 0,5% Tween, se bloquearon con albúmina de suero bovino al 3% durante 1 hora y se incubaron con CD44v6-FITC (MCA1730 BioRad) a 4°C durante la noche. Las secciones se lavaron nuevamente tres veces, se incubaron con DAPI durante 5 minutos, se lavaron con PBS1X y se montaron con el kit Slowfade Antifade (S2828 ThermoFisher) para visualización inmunofluorescente.

Los controles negativos de otros tejidos epiteliales, como los tejidos de próstata e hígado, también se analizaron con la misma metodología. En estos casos no se observó la tinción de CD44v6.