【발명의 명칭】

세포독성이 저감화된 용암해수염 및 이의 제조방법

【기술분야】

본 발명은 대한민국 산업통상자원부 지원 하에 과제번호 R0004410에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 (재)제주지역사업평가단， 연구사업명은 "제주지역주력산업육성과제" ， 연구과제명은 "용암수활용 천연물 특화 스파테라피 웅용 제품 개발 및 제품화" ， 주관기관은 (주)두래， 연구기간은 2015.08.01 ~ 2018.07.31이다.

본 발명은 세포독성이 저감화된 용암해수염 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 용암해수염에 발벼의 누룩곰광이 발효물을 첨가하는 것을 포함하는 용암해수염의 세포독성 저감화 방법 및 이의 제조방법으로 제조된 세포독성이 저감화된 용암해수염을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

제주도는 화산활동으로 인한 현무암층이 넓게 분포되어 있으며， 경사가 완만한 동서 사면으로는 용암지대가 넓게 발달 되어 있다. 특히 동부지역은 투수성이 우수한 지층이 두¾고 넓게 분포되어 있어 해수가 유입될 수 있는 천연의 조건을 지니고 있다. 바다의 압력에 의해 현무암층으로 여과되면서 유입된 해수는 고지대에서 바다쪽으로 흘러 내려오는 지하 담수와 만나 담수, 염수 경계면을 형성하게 된다 (김창숙 2012) . 이 담수， 염수 흔합대 하부에 존재하는 해수가 용암해수이다. 제주용암해수란 제주도에서만 볼 수 있는 특별한 수자원으로 해수가 현무암층과 사니질층을 통해 자연 여과되어 오랜 기간 동안 저장된 물이다. 제주 용암 해수염이 란 용암해수로부터 얻어지는 미네랄 해수염으로서 멸균 필터링， 증발， 건조 등을 통해 얻을수 있다.

용암해수에는 일반 해수 및 심층수보다 필수 미네랄 (나트륨， 마그네슘， 칼슘， 칼륨 등)이 풍부하며 일반적인 미네랄 성분들 (철， 몰리브덴， 아연， 망간)은 심층부와 삼다수보다 더 많은 양을 함유하고 있다. 특히 제주 용암해수는 바나듐을 함유하고 있어 인체의 생리활성에 긍정적인 효과를 기대할 수 있다. 바나듐은부신의 catecholamine 대사에 관계하여 지방질 대사에 영향을 주고 콜레스테를의 합성을 막아동맥 경화를 예방하고 뼈와 연골， 치아의 형성에 필요하며 세포의 대사에 필수적인 원소이다. 특히 인슐린의 분비를 안정시키는 작용을 해 당뇨치료에 이용되고 있으며 고지혈증 개선 효과가 있어 성인병 예방효과가 높다. 또한 제주용암해수에는 해양심층수에는 없는 게르마늄과 셀레늄을 함유하고 있어 혈액순환 촉진， 면역력 증강， 항암작용， 지방의 산화작용 억제， 항산화능， 항암， 불임, 노화 및 콜레스테롤 수치 개선 효과를 기대할 수 있다. 용암해수염은 상기의 취득한 용암해수를 멸균필터를 이용하여 제균한 후, 가열 증발， 진공 증발， 천일 건조 또는 통풍 건조등의 방법을 이용하여 수득하였다 용암해수염에 함유된 미네랄 성분들을 대상으로 여러 종류의 화장원료로서의 가능성이 개시되었다. 관련 특허 문헌으로는 용암해수 미네랄을 이용한 피부 외용제 조성물 (한국등록특허 계 1463012호)， 용암해수를 함유한 화장품 조성물 (한국등록특허 계 1450051호)， 용암해수염을 함유하는 조성물 (한국등록특허 제 0947638호) , 탈염 용암해수를 이용한 피부 외용제 조성물 (한국등록특허 제 1402025호)， 탈염 용암해수의 발효물의 제조 방법과 그 방법에 의하여 얻어진 발효물 및 그 발효물을 이용한 화장료 조성물 (한국등록특허 제 1347694호)이 있다. 용암해수염은 용암해수에서 분리, 정제되면서 미네랄과 염이 동시에 농축이 되거나 공정에 따라 미네랄 혹은 염만이 선택적으로 농축이 된다. 본 발명을 위한 사전 연구 시 고농도로 농축된 용암해수염은 일정 농도 이상 사용하면 세포독성을 나타내어 이용에 제한이 있음을 확인하였다. 화장원료로서 용암해수염을 사용한 특허 문한으로 용암해수염을 함유하는 조성물 (한국등록특허 계 0947638호)이 있다. 상기 선행 문헌에서는 용암해수염 및 녹차， 홍차， 알로에， 포도， 바나나 및 사과추출물로부터 선택된 하나 이상을 함유하는 용암해수염으로 50//g/ ~ 200/ g/m의 낮은 농도 조건에서 세포독성을 평가하였다. 상기 문헌 어디에서도 90mg/ 이상의 농도로 사용시 화장료로서의 세포독성 문제점에 대해 언급된 바 없으며 또한 이를 해결하는 방안에 개시된 바 없다.

본 발명은 생물학적인 공정을 통해 제주 용암해수염의 세포독성을 낮추고 광노화 억제 및 피부 보습 효과가 있는 화장료 조성물을 제공한다. 여기서 생물학적인 공정이라 함은 고체발효한 제주밭벼를 이용한 제주 용암해수염의 순화 공정을 뜻한다. 고체발효 (Solid state ferment at ion)는 액상 발효 (Submerged ferment at ion)와는 달리 바이오매스 (Biomass)와 같은 고체 기질들을 대상으로 미생물을 배양하는 것을 의미한다. 고체발효는 예로부터 곰팡이류와 바실러스류， 그리고 유산균류를 이용하여 쌀 또는 콩을 발효시킴으로써 코지 (Koji)나 된장을 생산하기도 하고， 치즈를 생산하는 등 식품산업에 있어서 미생물의 효소 및 대사산물을 생산하는데 주로 사용되어 왔다. 고체발효기술의 장점으로는 액상발효 대비 상대적으로 값싼 원료와 저렴한 설비에 따른 낮은 생산 비용， 높은 효소 생산량 및 안정성 그리고 배출되는 폐기물이 최소화되어 친환경적인 요소 등이 많다. 하지만 대규모화 되는데 있어 표준 생산 공정을 설정하기 어려우며 다양한 미생물과 원료들에 따라 배양조건 (산소량， 온도 및 습도 조절 등)을 확립하는데 어려움이 있다. 최근 친환경적인 생산 산업을 추구하는 유럽에서는 고체발효 공정에 대한 연구가 심화되고 있는 실정이다.

피부노화는 내인성 노화 (intrinsic, chronological aging)와 광노화 (phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다 [Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol . ,21, 610-613(1989)]. 이 중， 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다. 또한, 피부노화는 자외선， 스트레스， 질병상태， 환경인자， 상처， 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며， 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고， 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사， 염증반웅에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고， 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식 시켜야 피부가 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

노화에는 활성산소종뿐만 아니라 MMP(Matr ix metal lopretease)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소 (MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 노출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로， 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

또한， 노화에는 색소 침착에 의한 피부 변화가 있을 수 있다. 피부는 태양광의 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 정상적으로 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 피부 세포의 일종인 멜라노사이트에서 생성되고， 피부 표면에 분포되어 인체에 유해한 자외선을 차단하는 자연적인 스크리닝 기능을 나타낸다. 멜라닌 색소는 여러 단계의 산화반웅을 거쳐 L-티로신 (L-tyros ine)으로부터 합성되어지며， 이것의 생합성 기작에는 티로시나아제 (tyros inase) DHICA ox i dase ( tyros i nase related protein— 1， TRP— 1) , DOPAchrome tautomerase( tyrosinase related protein— 2， TRP— 2)， Catechol— 0— methyl transferase(COMT)와 같은 여러 효소들이 관여하고 있다. 이 증 티로시나아제 (tyrosinase)는 L-티로신 (L—tyrosine)과 도파 (3 , 4- d ihydroxyphenyl al anine ,D0PA)를 산화시켜 도파 (D0PA)와 도파퀴논 (D0PA- quinone)을 생성한다. 각질형성세포에 있는 멜라닌의 양과 분포에 의해 피부색 및 피부 색소 침착의 대부분이 결정되므로， 미백소재의 미백효과를 검정하기 위해서는 멜라닌의 합성을 촉진 시키는 티로시나아제의 활성을 저해 하거나 멜라닌 형성을 억제하는지 여부가 중요하다.

이에， 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과， 용암해수염에 발벼의 누룩곰광이 발효물을 첨가하는 것을 포함하는 용암해수염의 세포독성 저감화 방법으로 용암해수염을 제조하였다. 이 경우 화장료 조성물로서 용암해수염을 높은 농도로 사용 가능하도록 세포독성이 저감되었으며， 멜라닌 생성， 티로시나아제 발현을 억제하여 피부 미백 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 자외선에 의해 증가된 MMP-1를 억제하고 자외선에 의해 감소된 type 1 procol l agen를 효과적으로 회복시킴으로써 광노화에 의하여 손상된 피부를 개선시킬 수 있음을 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

따라서, 본 발명의 주된 목적은 화장료 조성물로서 용암해수염을 높은 농도로 사용하여도 세포독성이 나타나지 않으며， 멜라닌 생성， 티로시나아제 발현을 억제하여 피부 미백 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 자외선에 의해 증가된 MMP-1를 억제하고 자외선에 의해 감소된 type 1 procol lagen를 효과적으로 회복시킴으로써 광노화에 의하여 손상된 피부를 개선시킬 수 있는 세포독성이 저감화된 용암해수염 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포독성이 저감화된 용암해수염 및 이의제조방법을 이용한 용암해수염을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

【기술적 해결방법】

본 발명의 한 양태에 따르면， 본 발명은 용암해수염에 발벼의 누룩곰광이 발효물을 첨가하는 것을 포함하는 용암해수염의 세포독성 저감화 방법을 제공한다.

종래에 화장료 원료로서 사용된 용암해수염의 경우에는 매우 낮은 농도에서만 세포독성 실험을 진행하였으나， 본 발명자들은 고농도로 농축된 용암해수염은 일정 농도 이상 사용하게 될 경우， 세포독성을 나타내는 것을 확인하고 상기와 같이 용암해수염의 세포독성 저감화 방법을 발명하게 되었다. 본 발명에서 상기와 같은 방법으로 제조된 용암해수염을 '용암해수염 koj i ' 라고 칭하였다. 또한， 상기 '세포독성' 은 인체에 대한 독성을 의미하며， 바람직하게는 멜라닌생성세포 (melanocytes) , 인간섬유아세포 ( f ibrobl ast ) , 각질형성세포 (kerat inocyte)와 같은 인간 피부 세포에 대한 독성일 수 있으며 더욱 바람직하게는 인간 섬유아세포에 대한 독성을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 용암해수염은 화산활동으로 인한 용암지대에 유입된 해수가오래기간 현무암층으로 자연여과되어 형성된 지하수인 용암해수를 증발 또는 건조시켜 얻어지는 미네랄 해수염인 것을 특징으로 한다. 상기 용암해수염은 일반해수염보다 미네랄 성분이 풍부하나 고농도로 농축시 세포독성을 나타내는 문제점이 있다.

구체적으로, 상기 용암해수염은 제주도 동부지역 북제주군 구좌읍 한동리에서 지하 100 내지 200m를 굴착하여 지하 (평균 해수면 기준) 30 내지 150m에서 취수한 용암해수염수를 멸균 필터를 이용하여 제균한 후， 가열 증발， 진공 증발， 천일건조 또는 통풍건조등의 방법을 이용하여 수득한 용암해수염인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서， 상기 누룩곰광이는 일반적으로 발효에 이용되는 어떠한 누룩곰팡이일 수 있으며， 바람직하게는 황국균 (Aspergi l lus oryzae)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서， 상기 누룩곰광이 발효물은 밭벼를 누룩곰광이로 고체발효시켜 얻는 것을 특징으로 한다.

상기 '고체발효' 란 수분이 적은 고체상태의 원료에 미생물을 접종하여 발효하는 것으로, 본원발명에서는 고체원료인 밭벼에 황국균을 접종하여 30 내지 35 ^° C에서 60 내지 65시간 동안 85%습도조건에서 고체발효 하였다.

본 발명에 있어서, 상기 세포독성 저감화 방법은 40 내지 44 ^° C에서 40 내지 50 시간 동안 고온반웅한 후 4 내지 6 ^° C에서 20 내지 30시간 저온 반웅하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 고체발효에서 발현된 효소들의 반웅을 유도하여 다양한 쌀 유래 ol igo pept ide들이 형성되게 하기 위하여 고온 발효를 먼저 실시하였으며， 상기 제시된 온도보다 더 높거나 낮을 경우 효소반웅속도가 떨어져 효율적으로 반웅을 유도하기가 어렵다. 또한， 고온발효 후에 진행하는 저온 반웅은 숙성 (aging) 단계로서， 해수염의 세포독성을 순화시키기 위해 진행되며， 상기 저온 단계의 온도 및 시간 범위를 벗어날 경우， 세포독성을 위한 효율성이 떨어지게 된다. 상기 고온 및 저온 반웅 후， 2500 내지 3500 rpm에서 5 내지 15분간 원심분리하여 상등액을 0.45 막에 여과하여 최종적으로 여액을 제조하였다. ^"

본 발명의 실험예에 따르면， 본원발명의 제조방법으로 제조된 용암 해수염의 세포독성을 확인하기 위하여 실험한 결과, 본원발명의 제조방법을 거치지 않은 용암해수염 (비교예 1)보다 본원발명의 용암해수염 koj i (실시예 1)가 높은 농도로 처리할수록 세포독성 정도가 더 낮은 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때， 본원발명의 제조방법으로 제조된 용암해수염의 경우 높은 농도에서도 세포독성이 없어 화장료 원료로서 안전하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본원발명의 제조방법으로 제조된 세포독성이 저감화된 용암해수염을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 용암해수염은 화장품 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 1 중량 ¾로 포함하는 것을 특징으로 한다. 0.01% 미만 첨가 시에는 기대하는 피부 효과를 보기 어려우며 1% 이상 첨가 시에는 일반 화장품 제형의 안정성이 낮아지는 문제점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 광노화 개선용으로 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면， 본 발명의 용암해수염 koj i는 멜라닌생성， 티로시나아제 발현을 억제할 뿐만 아니라 자외선에 의해 증가된 MMP-1를 억제하고 자외선에 의해 감소된 type 1 procol lagen를 효과적으로 회복시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때， 본 발명의 용암해수염 koj i를 화장료 조성물로서 이용할 경우， 피부 미백 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 광노화에 의하여 손상된 피부를 개선시킬 수 있음을 알 수 있다. 따라서， 본원발명의 용암해수염 koj i는 다양한 용도의 화장료 조성물로서 이용될 수 있음을 보여준다.

【유리한 효과】

본 발명의 세포독성 저감화 방법은 높은 농도에서 세포독성을 나타내는 용암해수염의 세포독성을 저감화 시킬 수 있으며, 상기 세포독성 저감화 방법으로 제조된 용암해수염은 미백 및 피부노화, 특히 광노화에 의한 피부노화를 개선시킬 수 있다. 또한， 본 발명의 용암해수염은 다양한 효과를 나타내므로 기능성 화장품에 첨가되어 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 본원발명의 세포독성이 저감화된 용암해수염을 제조하는 공정을 도시화 한 것이다.

도 2는 세포독성 실험에 대한 결과를 나타내는 도면이다 ( (a) : 멜라닌생성세포 (B-16 F10), (b): 인간 섬유아세포 (Hs68)).

도 3은 멜라닌 생성 억제 효과 실험에 대한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4는 티로시나아제 발현 억제 효과 실험에 대한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는 광노화 억제 효과에 대한 결과를 나타내는 도면이다 ((a): Type 1 procollagen, (b): MMP—l).

【발명의 실시를 위한 형태】

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 용암해수염 koji의 제조

본원발명의 바이오 제주 용암해수염은 고체 발효한 제주 발벼와 용암해수염과 반웅하여 제조한다.

구체적으로는， 상기 고체 발효한 제주 발벼는 제주도 밭에서 재배된 상남 밭벼 품종을 구입하여 세척하였다. 세척된 쌀을 2시간 동안 침지하고 최종 수분함량이 40~55%가 되게 가수한 후， 121 ^° C, 60분간 멸균하였다. 이후， Potato dextrose 한천배지에서 키운 황국균 (Aspergil lus oryzae)을 포자 현탁액으로 제조하여 멸균된 밭벼 원료에 넣어 33 ^° C, 60~65시간， 85%의 습도에서 고체 발효를 하였다. 고체 발효한 제주 밭벼 100~110g에 제주 용암해수염을 30~33g을 넣고 물을 170~187g 첨가하여 40~44 ^° C, 48시간동안 고온 반응하고， 4~6 ^° C, 24시간 저온 반웅하였다. 3000rpm, 10분간 원심분리한 상등액을 0.45um 막 여과를 하여 여액을 제조하였다. 상기 여액으로 세포독성 평가 (ΜΊΤ assay) , 보습， 피부장벽， 광노화 억제실험에 사용하였다. 공정도는 도면 1와 같다. 비교예 1: 제주 용암해수염의 제조

용암해수염을 10중량 %로 물에 녹인 후， 0.45um 막 여과를 하여 여액을 제조하였다. 상기 여액으로 세포독성 평가， 보습, 피부장벽 광노화 억제 실험에 사용하였다. 실험예 1: 세포독성 평가

본 발명에서 제조한 상기 용암해수염 (비교예 1)과 바이오 제주 용암해수염 (용암해수염 koji, 실시예 1)이 세포독성이 있는지의 여부를 평가하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 멜라닌생성세포 (B-16 F10)와 인간 섬유아세포 (Hs68) 를 96well plate에 1.0 x 10 ⁶ cells/mL로 접종한 후， 5) C0 ₂ , 37 ^° C 하에서 24 시간 배양하였다. 그 다음 비교예 1과 실시예 1을 각각 0.09， 0.3， 0.6, 0.9， 1.8%의 농도로 serum이 없는 DMEM 배지에 세포에 처리하여 24시간 배양하였다. 상기 농도는 용암해수염과 용암해수염 koji의 염 농도를 동일하게 처리한 조건에서 실험을 수행하였다. 배양이 끝난 후, 각각의 well에 3-(4，5- dimethylthiazol-2yl )-2,5-diphenyl-2H-tetrazol ium bromide (MTT) solution을 넣고 4시간 동안 배양하였다. 이 후， well의 배지를 제거하고， 각 well당 dimethyl sulfoxide (DMSO)을 넣고 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 도 2에 나타난 바와 같이， 본 발명의 용암해수염 koji(실시예 1)는 용암해수염 (비교예 1)에 비해 세포독성이 없는 것으로 나타났다. ((a): 멜라닌생성세포 (B-16 F10), (b): 인간 섬유아세포 (Hs68)) 실험예 2: 멜라닌 생성 억제 평가

본 실험은 murine melanoma (B-16 F10) 세포를 10%의 FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 96-well pi ate에 well 당 1 x 10 ⁴ 개로 접종한 후 5% C0 ₂ , 37 ^° C 하에서 24시간 배양하였다. 이후 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 배양하였다.

Phenol red와 serum이 없는 한 세포는 phosphate buffered saline(PBS)으로 씻고 트립신 (trypsin)으로 회수하였다. 회수한 세포를 혈구계 (hematocytometer)로 계수하여 각 처리 그룹별로 lx 10 ⁶ cel ls/mL으로 동일한 세포수가 되도록 모아 lOOOrpm, 10분간 원심분리하여 세포만을 얻었다. 회수된 세포를 60 ^° C에서 1시간 건조시키고 10% DMS0가 포함된 1M NaOH용액 100 ^을 넣어 세포내의 멜라닌을 얻었다. 이 멜라닌 액을 Microplate reader로 490nm에서 흡광도를축정하여 멜라닌 생성 억제율을 평가하였다..

그 결과를 하기 도 3에 나타내었다. 도 3에서 나타나는 바와 같이， 물질 처리에 의해 멜라닌 양이 농도 의존적으로 감소함을 관찰하였다. 특히， 실시예 1(제주 용암해수염 koji)의 경우， 0.9 % 처리 의 경우， 우수한 멜라닌 생성 억제를 보였다. 실험예 3: 세포내 티로시나아제 유전자발현 평가

멜라닌생성세포를 이용하여 비교예 1 (용암해수염 추출액) 및 실시예 1(제주 용암해수염 koji발효 추출액)에 의한 멜라닌 생성에 중요한 효소인 티로시나아제의 발현 억제효과를 확인하였다.

본 실험은 murine melanoma(B-16 F10) 세포를 10%의 FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well 당 5 x 10 ⁵ 개로 접종한후 5% C0 ₂ , 37 ^° C 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 멜라닌 생성 유도를 위하여， 0.1 uM α-MSH를 처리하고， 이후 시료를 0.09 %， 0.9 % 첨가한 후 24시간 배양하였다. 양성대조군으로 알부틴 lOOmg/ 을 처리하였다. 배양한 세포는 phosphate buffered saline으로 씻고 lmC Triz 을 넣어 회수하였다. 0.2 mi Chloroform(Trizol의 1/5 비율)을 넣어 흔합하여 4 ^° C에서 14000 rpm, 15 분간 원심분리로 상층액을 얻었다. 동 상층액에 isopropanol 넣고 10분간 반응시킨 후， 14000 rpm, 15 분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상층액을 제거하고 200 μί 100% EtOH를 이용하여 2회 씻어준다. 이후 침전물을 상온에서 완전히 말려 DEPC water 20~30/^« 에 녹였다. DEPC에 녹인 RNA를 정량하여 각 그룹 당 RNA 동량을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 타겟으로 시아닌 염료인 SYBR GREEN master mix를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반웅 (PCR)을 실시하여 촤종적으로 티로시나아제의 유전자 발현 정도를 평가하였다. 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다. 도 4에서 나타나는 바와 같이, 물질 처리에 의해 티로시나아제의 발현이 감소함을 관찰하였다. 특히， 실시예 1

(용암해수염 koji)을 0.9 % 처리한 경우， 알부틴보다 더 우수한 발현 억제 효능을 보였다. 실험예 4: 광노화 억제 평가

상기 제 ^' 조한 비교예 1 및 실시예 1을 이용하여 사람 섬유아세포에서 UVB로 유도된 type 1 procollagen과 MMP-1 메신저 RNA 발현저해 효과를 확인 하였다. 구체적으로， 사람 섬유아세포를 6 well 세포 배양 접시에 4X10 ⁵ 의 밀도로 접종한 후 37 ^° C, 5% C0 ₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. UVB를 15mJ 조사한 후 용암해수염 (비교예 1)을 0.09%， 용암해수염 koji (실시예 1)를 0.09¾» 및 0.9% 및 retinoK이하 RL)을 대조군으로 첨가하여 24 시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 트리졸 (RNA iso, DAKA A, 일본) 1 m£을 첨가하여 RNA를 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260nm에서 RNA를 정량한 후， cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고 사이버그린 (SYBRGreen supermix, Ap lied Biosystems, 미국)을 프라이머 및 cD 와 함께 첨가하여 에세이하였다. 프라이머와 반응 조건은 하기의 표 1과 같으며， type 1 procollagen과 MMP-1 유전자의 발현양은 β-actin 유전자에 대해 보정을 하여 나타내었다. 【표 1】

그 결과， 도면 5에 나타낸 바와 같이 용암해수염 (비교예 1)과 용암해수염 koji (실시예 1)에서 농도 의존적으로 UVB에 의해 type 1 procollagen의 회복 효능과 증가한 MMP-1의 억제 효능올 확인하였고， 용암해수염과 비교해 보았을때 용암해수염 koji에서 월등한 효능을 볼 수 있었다. 참조문헌

(특허문헌 0001) KR 10-1463012 B

(특허문헌 0002) KR 10-1450051 B

(특허문헌 0003) KR 10-0947638 B

(특허문헌 0004) KR 10-1402025 B

(특허문헌 0005) KR 10-1347694 B