[0001] 本发明属于基因工程技术领域， 尤其涉及一种特异促进 CTLA-4基因高表达的 慢病毒表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

[0002] 机体的抗肿瘤免疫机制包括细胞免疫和体液免 疫两个方面， 但是以细胞免疫为 主， 在细胞免疫机制中起主要作用的效应细胞为 T细胞， 其中 CD8+T细胞是肿 瘤免疫中最主要的效应执行细胞。 T细胞活化需要双信号识别， 肿瘤抗原首先与 抗原提呈细胞或者靶细胞上的 MHC分子结合后， 与 T淋巴细胞表面抗原识别受 体 （TCR) 结合为 T细胞活化提供第一信号； T细胞表面的 CD28与抗原提呈细 胞表面或者靶细胞表面 B7分子结合提供第二信号。 双信号识别后， T细胞完全 活化， 活化的 T细胞首先自我增殖， 产生大量的抗原特异性 T细胞， 迁移到肿 瘤局部起到杀伤作用。 活化的 T细胞 2~3天后 CTLA-4等负调控分子幵始表达上 调。

技术问题

[0003] CTLA-4为跨膜蛋白， 属于 CD28家族成员。 CTLA-4的配体为 B7家族成员， 其与 CD28分子竞争性地与 B7-1和 B7-2结合， 抑制活化的 T细胞增殖， 对免 疫起负调控作用。 CTLA-4与 B7分子的亲和力是 CD28的 20倍以上， 在生理情 况下， 防止免疫过度放大， CD28或 CTLA-4与 CD80/86结合对免疫细胞的功能 发挥反作用， 在正常人体中起到精细的免疫调节作用， 维持着健康与疾病的动 态平衡。 但常常会被肿瘤细胞利用， 达到免疫逃逸的目的。 因此对 CTLA-4在肿 瘤发生发展中作用的研究可以很好地促进肿瘤 治疗领域的发展， 但现有技术缺 乏特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体使得相关研 究进展受阻。

问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 为解决现有技术中存在的问题， 发明人在载体的选择、 重组构建方法等方面进 行了大量的探索研究， 发现将包含 EcoR I酶切位点和 Spe I酶切位点的 CTLA-4基 因 cDNA序列插入 pLVX-IRES-Puro表达载体的多克隆位点中可成功构� ��特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体， 从而完成本发明。

[0005] 本发明提供一种特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体， 包括 pLVX-I RES-puro表达载体的基本序列、 抗性基因序列、 多克隆位点序列、 启动子序列 和 CTLA-4基因 cDNA序列； 所述多克隆位点包括 EcoR I酶切位点和 Spe I酶切位点 ， 所述 CTLA-4基因 cDNA序列包括 EcoR I酶切位点、 CTLA-4基因编码序列和 Spe I酶切位点， 所述 CTLA-4基因 cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。

[0006] 采用上述技术方案， 本发明提供的 CTLA-4基因 cDNA序列插入 pLVX-IRES-Pur o表达载体构建得到的慢病毒表达载体具有转� �效率高， 用量少， 可持续、 高效 、 稳定地提高 CTLA-4基因表达的优点， 可作为有力工具应用于制备治疗 CTLA-4 基因表达对阿尔兹海默症等疾病药物的研究和 幵发中。

[0007] 作为本发明的进一步改进， 所述 CTLA-4基因编码序列通过 PCR扩增获得， PCR 引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物的序列为： 5'- GCGAATTCATGGCTTGCCTTGGATTTC -3' , 即 SEQ ID NO: 1， 所述下游引物 的序列为： 5，- GACTAGTTCACATTCTGGCTCTGTTG -3，， 即 SEQ ID NO: 2。 采用上述 PCR引物序列， 通过 PCR可以扩增出 CTLA-4基因编码序列， 并可成功 插入至 pLVX-IRES-Puro表达载体中持续表达 CTLA-4基因， 减少了序列合成费用 ， 成本较低。

[0008] 相应的， 本发明还提供特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体的构建 方法， 包括如下步骤：

[0009] A) CTLA-4基因引物设计： 根据 CTLA-4基因编码序列， 使用 Oligo 7分析 后选取 5，- GCGAATTCATGGCTTGCCTTGGATTTC -3'， 即 SEQ ID NO: 1作为 上游弓 I物， 选取 5，- GACTAGTTCACATTCTGGCTCTGTTG -3'， 即 SEQ ID NO

： 2作为下游引物， 然后合成所述上游引物和所述下游引物； 所述上游引物和所 述下游引物无引物二聚体， 且退火温度差距较小；

[0010] B) CTLA-4基因 cDNA序列的获得： 用所述上游引物和所述下游引物进行 PCR 扩增， 获得大量 CTLA-4基因编码序列， 然后将该序列进行加 A尾反应后， 用 T4 DNA连接酶连接到 pGM-T载体上得到连接产物， 将该连接产物转化到感受态大 肠杆菌 DH5CC中， 均匀涂布到含氨苄青霉素 LB培养基平板上， 挑取阳性单克隆菌 落培养保存菌液并进行 PCR初步鉴定， 将初步鉴定结果说明 CTLA-4基因 cDNA序 列插入成功的菌液进行测序鉴定； 用液体 LB培养基培养测序鉴定正确的大肠杆 菌， 并抽提其中带 CTLA-4基因 cDNA序列的 pGM-T载体， 用限制性内切酶 EcoR I 酶和 Spe I酶双酶切， 电泳、 切胶回收 500 bp左右的片段， 此片段即为 CTLA-4基 因 cDNA序列；

[0011] C)

特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒载体的构建和鉴定： 提取质粒 pLVX-IRES- Puro, 用限制性内切酶 EcoR I酶和 Spe I酶双酶切， 电泳、 切胶回收载体， 再用 T4 DNA ligase将所述 CTLA-4基因 cDNA序列连接 ajpLVX-IRES-Puro表达载体中， 得到连接产物， 将该连接产物转化到感受态大肠杆菌 DH50C中， 均匀涂布到含氨 苄青霉素 LB培养基平板上， 挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行 PCR初步 鉴定， 将初步鉴定结果说明 CTLA-4基因 cDNA序列插入成功的菌液进行测序鉴 定；

[0012] D)

特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒载体的抽提： 将测序结果证实 CTLA-4基因 cDNA序列插入成功的菌液扩增培养， 对重组质粒进行抽提， 得到特异促进 CTL A-4基因高表达的慢病毒表达载体。

[0013] 本发明利用基因工程技术构建特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体 ， 经鉴定构建成功后， 包装成病毒转导入 Jurkat细胞， 嘌呤霉素筛选细胞后， 使 用实吋荧光定量 PCR和 Western Blot技术分别从 mRNA和蛋白水平验证 CTLA-4基 因表达的变化， 实验结果证明本发明提供的 CTLA-4基因 cDNA序列成功插入至 p LVX-IRES-Puro表达载体中， 能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 CTLA-4基因高 表达。

[0014] 本发明还提供特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体在制备治疗 CTLA

-4基因表达异常相关疾病的药物中的用途。

发明的有益效果 有益效果

[0015] 本发明提供的特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体具有转染效 率高 ， 用量少， 能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 CTLA-4基因高表达的优点， 可作 为有力工具应用于与 CTLA-4相关的药物研究和幵发中； 本发明还提供了特异促 进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法 ， 操作效果好， 减少了序列 合成费用， 成本较低。

对附图的简要说明

附图说明

[0016] 图 1为 pLVX-IRES-Puro表达载体的质粒图谱。

[0017] 图 2为嘌呤霉素筛选细胞后荧光定量 PCR检测结果示意图。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0018] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步 的说明。

[0019] Jurkat细胞购自上海生命科学院细胞资源中心， 293FT细胞购自 Thermo Fisher公 司， Premix PrimeSTAR HS酶、 慢病毒表达载体 pLVX-IRES-Puro、 病毒包装辅助 试剂盒、 Lenti-X GoStix试剂盒均购自 Takara公司， RNeasy Mini

Kit购自 QIAGEN公司， pGM-T载体购自天根公司， Endo-Free Plasmid Mini Kit II 贝勾自 Omega bio-tek公司。

[0020] 实施例一 CTLA-4基因引物的设计。

[0021] 根据 CTLA-4基因编码序列 （GenBank NM_001037631.2) ， 使用 01igo7对其进 行分析， 寻找上游引物和下游引物 （要求尽可能无引物二聚体且退火温度差距 较小） ， 然后在上游引物和下游引物的 5'端分别加入保护碱基与酶切位点 EcoR I 和 EcoR I, 设计得到的引物序列如表 1所示。 设计的 PCR引物由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成。

[0022] 表 1 CTLA-4基因的 PCR弓 |物序列 [表 1]

[0023] 实施例二特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒载体的构建

[0024] 将合成的弓 I物稀释后， 用 Premix PrimeSTAR HS酶对 CTLA-4基因的编码序列进 行扩增， 电泳回收后然后将其进行加 A尾反应后， 用 T4

DNA连接酶连接到 pGM-T载体上得到连接产物 （CTLA-4-T载体） ， 将该连接产 物转化到感受态大肠杆菌 DH50C中， 均匀涂布到含氨苄青霉素 LB培养基平板上， 于 37°C培养 12 h， 同吋设置阴性对照组 1 (将感受态细胞均匀涂布在不含氨苄青 霉素的平板上） 、 阴性对照组 2 (将感受态细胞均匀涂布在含 100 g/ml氨苄青霉 素的平板上） 、 阳性对照组 1 (将双酶切空载体的连接产物均匀涂布在含 100 g/ml氨苄青霉素的平板上） 、 阳性对照组 2 (将空载体均匀涂布在含 100 g/mL 氨苄青霉素的平板上） 。 实验组长出了单菌落， 阴性对照组 1长出了菌落； 阴性 对照组 2、 阳性对照组 1、 阳性对照组 2没长出菌落。

[0025] 从实验组中挑取 8个单菌落培养保存后， 各取 0.5 培养液， 用 CTLA-4基因的 引物进行 PCR扩增来初步鉴定， 结果表明 8个单菌落的培养液均能成功扩增出 CT LA-4基因， 接着将重组载体送至上海生工公司测序。

[0026] 取测序结果正确的菌， 置于液体 LB培养基中培养 14 h， 然后提取包含 CTLA-4 基因序列的重组 T载体， 将其和 pLVX-IRES-Puro载体分别先用 EcoR I酶和 Spe I酶 进行双酶切， 电泳回收， 并用 T4 DNA连接酶连接回收产物用， 再次转化到感受 态大肠杆菌 DH50C中， 均匀涂布到含氨苄青霉素 LB培养基平板上， 于 37°C培养 12 h， 同吋设置阴性对照组 1 (将感受态细胞均匀涂布在不含氨苄青霉素的� �板上 ) 、 阴性对照组 2 (将感受态细胞均匀涂布在含 100 g/ml氨苄青霉素的平板上） 、 阳性对照组 1 (将双酶切空载体的连接产物均匀涂布在含 100 g/ml氨苄青霉素 的平板上） 、 阳性对照组 2 (将空载体均匀涂布在含 100 g/mL氨苄青霉素的平板 上） 。 实验组长出了单菌落， 阴性对照组 1长出了菌落； 阴性对照组 2、 阳性对 照组 1、 阳性对照组 2没长出菌落。

[0027] 从实验组中挑取 6个单菌落培养保存后， 各取 0.5 培养液， 用 CTLA-4基因的 引物进行 PCR扩增来初步鉴定。 结果表明全部 6支培养液均能成功扩增出 CTLA-4 基因， 接着将这些重组载体菌液送至上海生工公司测 序， 测序结果与预期完全 相符， 获得 pLVX-CTLA-4质粒。

[0028] 取出之前保存的重组质粒菌液， 取 20 接种到 15 ml LB培养基 （含 100 g/ml 氨苄青霉素） 中， 37°C， 300 rpm培养 16 h， 用 Endo-Free Plasmid Mini Kit II进行 抽提重组质粒 pLVX-CTLA-4， 测其纯度和浓度， 结果如表 2所示。

[0029] 表 2重组质粒的纯度和浓度

[] [表 2]

[0030] 实施例三 慢病毒包装

[0031] 培养 293FT细胞， 取生长状态良好的细胞接种到六孔中， 每孔 106个细胞， 用慢 病毒包装辅助试剂盒， 取抽提的重组质粒 pLVX-CTLA-4

2 g转染到 293FT细胞， 48h后收集含病毒的上清培养基， 用 0.45μηι的筛子过滤病 毒液， 用于感染 Jurkat细胞， Lenti-X

GoStix试剂盒检测病毒的滴度为 5xl06〜5xl07 IFU。

[0032] 实施例四 慢病毒转导 Jurkat细胞

[0033] 接种 Jurkat细胞于 6孔板中， 每孔 1000000个细胞， 12h后细胞密度约为 50<¾， 分 别取病毒液， 用 DMEM完全培养基 10倍稀释病毒， 再加入聚凝胺 （polybrene) 至终浓度为 8 g/mL。 去 6孔板中的培养基， 加入含病毒的 DMEM完全培养基 （ 含 10%胎牛血清） ， 24h后弃去含病毒的 DMEM完全培养基， 更换新鲜的 DMEM 完全培养基， 24h后用 0.5 g/ml浓度的嘌呤霉素筛选细胞。 筛选 10d， 每隔 3d更换 培养基一次， 并不断的增加嘌呤霉素的浓度至 1.00 g/ml。 [0034] 实施例五 荧光定量 PCR检测 CTLA-4基因表达量。

[0035] 根据 GAPDH和 CTLA-4基因 mRNA序列， 利用引物设计软件 Oligo 7.0设计弓 |物 [] [表 3]

[0036] 分别接种 Jurkat细胞、 pLVX空载体对照 Jurkat细胞组、 pLVX-CTLA-4高表达细 胞至 6孔板。 细胞密度达到 δΟ^^Ο^吋， 用 RNeasy Mini

Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent

Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， 逆转录条件： 37°C， 15min; 85°C， 5s; 4°C， ∞。 反转录结束后， 加入 9( L的 RNase Free dH20稀释 cDNA， -20°C保存， 以便后面 检测使用。 取各组细胞的 cDNA

Ιμΐ为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR (QPCR) 检测 CTLA-4相对表 达量， 设置反应条件： 95。C 30s， 1循环， 54。C 30s 40循环， 95。C 5s， 60°C lmin ， 95°C 15s， 利用 SYBR Primescript RT-PCR Kit检测各组细胞 CTLA-4基因相对表 达量。 将 pLVX-CTLA-4细胞连续培养 20代后， 重复以上实验。 汇总后的结果如 图 2所示。 可以看到， 不管是刚筛选完， 还是已经培养 20代后的 pLVX-CTLA-4细 胞， 其 CTLA-4基因的表达量较 Jurkat细胞都有 300倍左右的升高， 而 pLVX空载体 细胞的 CTLA-4基因表达量与 Jurkat细胞相比基本没有变化， 说明本发明提供的 C TLA-4基因 cDNA序列成功插入至 pLVX-IRES-Puro表达载体中， 能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 CTLA-4基因高表达。

[0037] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明 所作的进一步详细说明， 不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护范围。

工业实用性

本发明提供的特异促进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体具有转染效 率高 ， 用量少， 能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 CTLA-4基因高表达的优点， 可作 为有力工具应用于与 CTLA-4相关的药物研究和幵发中； 本发明还提供了特异促 进 CTLA-4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法 ， 操作效果好， 减少了序列 合成费用， 成本较低。