Lipopeptide zur Therapie und Prophylaxe allergischer Erkrankungen

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, von einem Sporen-Keimungs-Protein der Spezies Bacil- lus cereus abgeleitete Lipopeptide, Verfahren zur Herstellung von synthetischen Analoga, die Nutzung ihrer immunstimulatorischen Wirkung zum Zweck der Reifung des Immunsystems und darauf aufbauend deren Verwendung als Wirkstoffe zur Therapie und Prophylaxe zahlreicher allergischer Erkrankungen bei Mensch und Tier, vorzugsweise von allergischem Asthma, sowie Formulierungen von entsprechenden pharmazeutischen Mitteln.

Erstmals wird eine TLR-1 , -2, -6 vermittelte Stimulation des angeborenen Immunsystems durch Lipopeptide aus Bakterien-Sporen sowie durch synthetische Analoga derselben auf molekularer Ebene nachgewiesen.

Stand der Technik

Als Allergie wird eine überschießende Abwehrreaktion des Immunsystems auf bestimmte, unter normalen Umständen harmlose Reize aus der Umwelt (Allergene) bezeichnet. Die allergische Reaktion äußert sich in typischen, durch entzündliche Prozesse ausgelösten Symptomen. Es kommt zu milden bis schwerwiegenden Beeinträchtigungen an verschiedenen Organen des Körpers. Je nach Krankheitsform können verschiedene Organe einzeln oder in Kombination betroffen sein. Während allergische Symptome an den Schleimhäuten typischerweise eher akut auftreten, können Erkrankungen wie Asthma bronchiale oder atopische Dermatitis einen chronischen Verlauf nehmen. In der Regel entwickeln Allergiker im Laufe der Krankheit Hyper- sensitivitäten gegen eine wachsende Anzahl von Substanzen.

Die Mechanismen bei der Entstehung von Allergien entsprechen den bei der Bekämpfung von Krankheitserregern ablaufenden pathophysiologischen Vorgängen. Nach den immunologischen Wirkmechanismen werden mehrere Subtypen der Allergie unterschieden. Dabei versteht man heute unter Allergien im engeren Sinne oft nur die Typ-I-Allergie. Diese Form wird durch eine unangemessene Reaktion des humoralen Immunsystems, dessen eigentliche Bestimmung in der Abwehr von Parasiten besteht, verursacht und ist durch die Bildung von Allergen-spezifischen Immunglobulin-E-Antikörpern (IgE) gekennzeichnet.

Kleinste Mengen eines Allergens reichen aus, um die Sensibilisierung auszulösen. Dabei wer- den die in den Körper gelangten Allergene von dendritischen Zellen aufgenommen und prozessiert. Die somit aktivierten dendritischen Zellen präsentieren über ihre MHC-I I-Oberflächenre- zeptoren Bruchstücke der Allergene an naive T-Zellen, die durch CD4-Costimulation und unter dem Einfluss von Zytokinen, u.a. des Zytokins lnterleukin-4 (IL-4), zu aktivierten T _H 2-Zellen rei- fen. Gleichzeitig kommen naive B-Zellen in Kontakt mit dem Allergen. Treffen diese aktivierten B-Zellen dann auf die Allergen-spezifisch aktivierten T _H 2-Zellen, so kommt es zu einer T-ZeII-B- Zell-Interaktion, infolgedessen die B-ZeIIe zur IgE-sezernierenden Plasma-Zelle wird und beginnt, in großen Mengen Allergen-spezifisches IgE zu bilden.

Die gebildeten IgE-Antikörper liegen zum Großteil gebunden auf den Zelloberflächen von Mastzellen und basophilen Granulozyten vor. Gleichzeitig werden sie auch an antigenpräsentieren- de Zellen gebunden und verstärken somit die Präsentation der Allergene an das Immunsystem. Die IgE-Konzentration im Serum ist dagegen vergleichsweise niedrig.

Die Sensibilisierungsphase resultiert in einer, durch die vermehrte Anzahl von Allergen-spezifi- sehen IgE-Antikörpern repräsentierten, erhöhten Allergiebereitschaft, läuft jedoch ohne Krankheitssymptome ab. Kommt es jedoch zu einem zweiten Kontakt mit dem Allergen, gegen das die Sensibilisierung erfolgt ist, wird dieses durch die IgE-Antikörper auf den Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden. Die folgende Ausschüttung von Histaminen, Zytokinen, Leukotrienen u.a. teils toxischen Verbindungen durch die aktivierten Leukozyten führt zur weiteren Aktivierung des Immunsystems und zur Anlockung von entzündungsauslösenden Eosinophilen. Binnen kurzem kann eine erhöhte vaskuläre Permeabilität, die Erschlaffung der glatten Muskulatur sowie die Stimulierung der kutanen Nervenendigungen beobachtet werden, die die typischen allergischen Symptome bei Heuschnupfen, Bindehautentzündung, allergischem Asthma, Nahrungsmittelallergien oder auch einem anaphylaktischen Schock bedingen.

Die Bindung von Allergen an die IgE-Antikörper auf den Mastzellen forciert gleichzeitig, unter Beteiligung des Zytokines IL-4 und der Expression von CD40-Liganden, die Produktion von weiteren Allergen-spezifischen IgE-Antikörpern durch die Plasma-B-Zellen.

Neben dieser Sofortreaktion können bei den meisten Allergien, v.a. im fortgeschrittenen Stadium, chronische Symptome auftreten. Diese werden von der Aktivierung derAllergen-spezifi- sehen T-Zellen durch antigenpräsentierende dendritische Zellen sowie von der IL-5 vermittelten chemotaktischen Rekrutierung und Einwanderung von Eosinophilen, Basophilen und Monozyten an den Ort der allergischen Reaktion bestimmt. Gleichzeitig werden weitere, besonders langlebige Mastzellen aktiviert. Dieser chronische Verlauf ist von der aktuellen Präsenz des Allergens unabhängig und trägt zur Aufrechterhaltung der entzündlichen Immunreaktion bei. Zu den Ursachen allergischer Erkrankungen, v.a. der stetigen Zunahme der Zahl der Betroffenen, sind bisher keine schlüssigen Erklärungen erbracht worden. Eine Reihe von Faktoren ist jedoch in den näheren Fokus gerückt. Unbestritten gibt es eine genetische Disposition zu einem erhöhten Allergierisiko. Auch die veränderten Umweltbedingungen mit zunehmender Umweltverschmutzung sowie Klimaveränderungen mit den damit verbundenen Verschiebungen in Flora und Fauna kommen als Ursache in Betracht. Eine wichtige Rolle wird auch den veränder- ten Lebens- und Ernährungsgewohnheiten zugesprochen. Beispielsweise finden zunehmend künstliche Zusätze in Lebensmitteln und Pflegprodukten Verwendung. Neuartige Arzneimittel mit oftmals unbekannten Nebenwirkungen werden zugelassen.

Ein wesentlicher Schritt bei der Entstehung der Allergien ist die Prägung des Immunsystems, insbesondere die Reifung bzw. Differenzierung der T _H 1- und T _H 2-Zellen. Für die Bildung der allergievermittelnden IgE-Antikörper sind IL-4 produzierende T _H 2-Zellen notwendig, während lnterferon-γ produzierende T _H 1-Zellen hemmend auf die Bildung von IgE-Antikörpem wirken. Für eine funktionierende Immunabwehr sind beide Zelltypen in einem ausgewogenen Verhältnis notwendig.

Man geht davon aus, dass das Immunsystem während der Schwangerschaft eher T _H 2-lastig ist und in den ersten Lebensjahren des Kindes durch den Kontakt mit mikrobiellen Komponenten, v.a. Bakterien, in die Richtung einer effizienten zellbasierten T _H 1 -Antwort gelenkt wird, die weniger mit allergischen Reaktionen assoziiert ist.

Durch das veränderte urbane Wohnumfeld, das Leben in Kleinfamilien und die Verwendung medizinisch wirksamer und desinfizierender Substanzen schon in normalen Reinigungsmitteln, hat die Belastung durch bakterielle und parasitäre Krankheitskeime jedoch stark abgenommen. Deshalb sieht eine große Zahl von Wissenschaftlern eine Ursache der beobachteten Zunahme allergischer Erkrankungen in der mangelnden Aktivierung des Immunsystems im Kleinkindalter („Hygienehypothese").

Die verfügbaren Möglichkeiten zur Prävention von Neusensibilisierungen sowie zur Therapie von bereits ausgeprägten Allergien sind begrenzt. Neben der symptomatischen Therapie von Allergiepatienten wird einerseits die weitestgehende Vermeidung des Allergens empfohlen.

Im Rahmen der Hyposensibilisierung erfolgt dagegen die direkte Konfrontation mit abge- schwächten Dosen des betreffenden Allergens (G. B. Pajno et al. 2001. Clinical and Experimental Allergy 31 : 1392-1397; L Jacobsen et al.2007. Allergy62(8):943-948; C. Mölleret al. 2002. J AI- lergy Clin Immunol 109(2):251 -256; A. Bufe et al. 2009. J Allergy Clin Immunol 123(1 ): 167-173). Dieser immuntherapeutische Ansatz ist jedoch unterschiedlich erfolgreich. Vor allem bei dem häufig auftretenden bronchialen Asthma ist diese Therapieform eher unwirksam.

Andere Ansätze verfolgen, aufbauend auf der„Hygienehypothese", die Unterstützung des T _H 1/T _H 2-Shifts durch eine Konfrontation mit immunmodulierenden, krankheitsunabhängigen Substanzen.

In epidemiologischen Studien konnte beispielsweise der Einfluss einer ländlichen Umgebung, speziell der Kontakt zu Tieren, auf die Verminderung des Risikos zur Ausprägung von allergi- schem Asthma und Heuschnupfen bei Kindern belegt werden. Eine prominente Studie zu diesem Thema ist die ALEX-Studie (J. Riedler et al. 2001. Lancet 358: 1129-1133).

In WO 2001/049319 wird die Herstellung einer wässrigen Suspension von Mikroorganismen aus Stallluft und deren Verwendung zur prophylaktischen Behandlung von Kindern mit erhöh- tem Allergierisiko oder ersten Anzeichen eines Allergiesyndroms beschrieben. WO 2006/029685 beschreibt einen wässrigen Extrakt aus Stallstaub. Im Mausmodell konnte durch die Inhalation dieses Extraktes eine deutliche Reduktion der Symptome des allergischen Asthmas sowie die Unterdrückung derT _H 2-dominierten Immunantwort gezeigt werden (M. Peters et al. 2006. Thorax 61 :134-139). Welche Substanzen aus der Vielzahl von potentiell immunstimulatorisch wirksa- men Bestandteilen von Bakterien, Viren, Pilzen, Pflanzen und Tieren letztendlich den Schutzeffekt auslösen, ist jedoch bis heute nicht bekannt.

Während diese beiden Arbeiten von einer begrenzten Anzahl von Behandlungen ausgehen, weisen andere Studien auf die Notwendigkeit der lebenslangen Exposition in der ländlichen Umgebung hin, um eine effektive Prophylaxe zu ermöglichen (J. Douwesetal. 2008. Eur Respir J 32:603-611).

Im Vergleich zu dieser relativ unspezifischen Mikroben-Belastung verfolgen einige andere Behandlungsansätze die gezielte Stimulation der Immunantwort über die Toll-like-Rezeptoren (TLR).

TLR sind Strukturen des angeborenen Immunsystems. Als auf den Zellen des Immunsystems gebundene Membranproteine dienen sie der Erkennung von funktionalen Strukturen, welche ausschließlich auf oder in Krankheitserregern vorkommen. Jeder der bisher 13 (für Mammalia) bekannten Rezeptoren erkennt ein ganz spezifisches Muster einer Erregerklasse. So ist TLR 1 in Verbindung mit TLR 2 als Rezeptor für Zellwandbestandteile von Bakterien beschrieben. TLR 2 erkennt gram-positive Bakterien, wie z.B. Mykobakterien. In Verbindung mit TLR 6 rea- giert dieser Rezeptor auf Lipopeptide von Mykoplasmen und Zymosan aus Hefen und Pilzen. Weitere TLRs erfassen virale Komponenten in den Zellen (TLR 3, 7, 9), andere bakterielle Bestandteile wie z.B. Lipopolysaccharide aus der Zellmembran gram-negativer Bakterien (TLR 4) oder Flagellin (TLR 5) (H. Heine et al. 2003. IntArchAllergy lmmunol 130:180-192).

Über eine biochemische Signalkaskade wird in den TLR-Trägerzellen ein entsprechender intra- zellulärer Mechanismus, meist die Expression bestimmter, der Antigen-spezifischen Abwehr von Krankheitserregern dienender Gene, ausgelöst. Infolgedessen wird in der ersten Stufe der Infektionsabwehr die unspezifische Immunantwort initiiert, der im weiteren Verlauf mit der Bildung spezifischer Antikörper die Reaktion durch das erworbene Immunsystem folgt.

Dendritische Zellen, denen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Allergien beigemessen wird, tragen in der Regel alle Typen der TLR. Bei ihrer Aktivierung exprimieren sie die entspre-

- A - chenden MHC-Komplexe und costimulierenden Enzyme. Nach Wanderung in die Lymphknoten stimulieren sie dort die Reifung der Antigen-spezifischen T-Zellen.

Eine gezielte Stimulation bestimmter TLR sollte deshalb geeignet sein, die Reifung des Immunsystems zu unterstützen, um später eine angemessene Antwort des Organismus auf Fremd- Stoffe zu induzieren.

WO 2004/074435 beansprucht die gezielte Beeinflussung des Differenzierungsprozesses von T-Helfer-Zellen über die TLR von dendritischen Zellen. Durch die Applikation eines TLR-Ago- nisten, in Kombination mit synthetischen Peptiden, Nanopartikeln, virenähnlichen Partikeln oder T-ZeII- oder B-Zell-Epitopen in gebundener/ ungebundener Form, soll die Behandlung von Im- mundefekten und Allergien ermöglicht werden. Als TLR-Agonisten werden Mikroben wie Viren, Bakterien, Parasiten sowie Teile oder molekulare Komponenten davon eingesetzt.

Als ein weiterer Ansatz wird z.B. die Behandlung und Prophylaxe von Allergien mit spezifischen, von für den Menschen nicht pathogenen Mikroorganismen abgeleiteten DNS-Abschnitten, bevorzugt Oligonukleotiden, die mindestens eine nicht-methylierte CpG-Sequenz enthalten, be- schrieben. Oftmals werden diese Wirkstoffe mit weiteren Bestandteilen, wie Allergenen, Adju- vantien und viralen Komponenten, kombiniert. Als bakterielle Komponenten werden bei diesem Therapie-Ansatz sehr häufig Mykobakterien-Stämme eingesetzt. Die hiervon abgeleiteten kurzen DNS-Sequenzen werden vom Toll-Iike-Rezeptor9 der dendritschen Zellen erkannt und stimulieren die T _H 1 -Immunantwort bei gleichzeitiger Inhibierung der allergiekorrelierten T _H 2-Reak- tion (US 2006/0217328, US 2006/0251677, WO 2008/014979, WO 2007/095976).

Drei dieser Präparate befinden sich momentan in klinischen Studien. Die Firma Cytos verwendet bei CYT003-QbG10 eine Zusammensetzung aus einem virus-ähnlichen Partikel, einer immunstimulierenden DNS-Sequenz aus Mycobacter/a-Spezies, einem nicht spezifizierten TLR- Liganden und gegebenenfalls einem Antigen, vorzugsweise einem Allergen wie z.B. Pollen- extrakt, zur Behandlung von Allergien und Asthma (WO 2005/004907, Cytos-Pressemitteilung vom 13.01.2009). Dynavax testet mit TOLAMBA ^® und AIC zwei Präparate aus einer kurzen synthetischen DNS-Sequenz, die mit dem Hauptallergen des Traubenkrautes konjugiert ist, zur Behandlung des von Traubenkraut ausgelösten Heuschnupfens (WO 2006/096497, Dynavax- Pressemitteilungen vom 06.03.2006 und 04.10.2006) und von allergischem Asthma (WO 2008/ 073661).

Vor dem Hintergrund der Hygienehypothese bieten sich zur Unterstützung des T _H 1/T _H 2-Shifts und damit zur Prophylaxe und Therapie von Allergien auch die TLR 1 , 2 und 6 an. Die bei ihrer Aktivierung exprimierten Zytokine entsprechen eher dem für die Ausdifferenzierung der T _H 1- Lymphozyten-Zellen notwendigen Muster. Zudem findet man TLR 2 auch in den Epithelien der Luftröhre und der Lungenbläschen, was diesen Rezeptor vor allem für die Behandlung von allergischem Asthma qualifiziert (C. Zuany-Amorim 2002. Nat Rev Drug Discov 1 :797-807).

Zur Stimulierung des TLR 2-Rezeptors werden oftmals ganze Mikroorganismen, Teile von Mikroorganismen oder von diesen abgeleitete Lipoproteine bzw. Lipopeptide eingesetzt (EP 1387167, WO 2004/092210, US 2008/0241139). Bevorzugt werden für den Menschen nicht pathogene Bakterien-Stämme wie Borrelia spp, Escherichia spp, Heliobacter spp, Leptospira spp, Listeria spp, Mycobacterium spp, Mycoplasma spp, Pseudomonas spp, Salmonella spp, Staphylococ- cus spp, Streptococcus spp, besonders bevorzugt Bacillus thuringiensis, Borrelia burgdorfei, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma fermentans, Treponema pallidium und Escherichia coli verwendet. Auch Lipopolysaccharide werden für eine selektive Immunstimulation der TLR- Rezeptoren zur Behandlung von Allergien beschrieben (WO 2008/059035, US 2008/0119145).

TLR können auch durch synthetische Verbindungen aktiviert werden. So reagiert das TLR 1 / TLR 2-Heterodimer ebenfalls auf triacylierte synthetische Lipopeptide, wie die Pam ₃ Cys-Deri- vate (EP 0210412). TLR6/TLR 2-Heterodimere sind sensitiv für diacylierte synthetische Lipo- peptide, wie die Pam ₂ Cys-Derivate (EP 0519327).

Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurden bereits verschiedene, acylierte Lipopeptide als Adjuvantien enthaltende Medikamente und Impfstoffe zur Verwendung im Rahmen von immun- modulatorischen Therapien entwickelt. Typischerweise werden hierzu die Lipopeptide, bevorzugt Pam ₃ Cys- und Pam ₂ Cys-Derivate als TLR 2 targetierende Substanz, mit einer antigenen Komponente für B-Lymphozyten oder für cytotoxische T-Zellen sowie weiteren Hilfsstoffen kombiniert, um synergistische Effekte zu induzieren (WO 2007/103322, WO 2006/104389, US 7,387,271).

Auch die Formulierung als Liposomen, die Lipopeptide, bevorzugt Pam ₃ Cys, neben Antigenen und gegebenenfalls Zytostatika enthalten, werden für die Behandlung von verschiedenen Er- krankungen und Allergien beansprucht (WO 2005/063201 , WO 2005/063288).

Ebenfalls werden Konjugate aus Pam ₃ Cys-Derivaten und Antigenen als Impfstoffe beschrieben. So in WO 2007/078879 eine Kombination aus einem Membran-Proteinen des Influenza-Virus und einem Pam ₃ Cys-Derivat, in WO 2007/079448 ein lineares Tandem-Molekül aus einem B- Zell-Epitop, einem T-Zell-Epitop und Pam ₃ Cys oder in WO 2004/014956 und WO 2004/014957 ein Molekül aus einem B-ZeII- bzw. CTL-Epitop und einem T-Helfer-Zell-Epitop, die durch ein Pam ₃ Cys-Lipopeptid miteinander verbrückt sind.

WO 2007/118901 beschreibt die gezielte Unterdrückung der T _H 2-korrelierten Immunantwort durch ein tracheales Cytotoxin oder ein Muramyl-Tetrapeptid unter Zusatz von Pam ₃ Cys zur Behandlung von Allergien, Asthma und anderen T _H 2-korrelierten Erkrankungen. Auch auf der Ebene der Allergen-spezifischen Antikörper werden Pam ₃ Cys-Konjugate zur Behandlung von allergischen Erkrankungen eingesetzt. W0 1996/12740 beschreibt ein synthetisches lineares Konjugat aus einem Lipopeptid als Immunstimulator, einem bakteriellen T-Helferzell-Epitop und einem immunogenen Peptid, das an Membran-gebundenes IgE binden kann.

Zur Behandlung von bereits ausgeprägten allergischen Erkrankungen wird, im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Methoden zur Stimulation der TLR-Rezeptoren, auch die Unterdrük- kung der TLR-vermittelten Immunreaktion und der damit verbundenen Entzündungsreaktion vorgeschlagen (WO 2005/039504, WO 2007/047396, WO 2005/115430, WO 2005/067959). In WO 2007/098371 wird die Linderung der Entzündungsreaktionen über den TLR 5 mittels FIa- gellin-Präparaten erreicht.

Pharmazeutische Mittel mit einem kovalent an ein Lipid, bevorzugt an ein Pam ₂ Cys- oder Pam ₃ Cys-Derivat, gekoppelten Oligopeptid, ohne weitere Zusätze von spezifischen Antigenen oder B-ZeII- bzw. T-Zell-Epitopen, werden sehr wenig beschrieben. In den meisten Fällen wird Pam ₃ Cys lediglich als stimulierendes Adjuvans in eine Mischung aus Antigenen, Epitopen und Mikroorganismen bzw. Bestandteilen von Mikroorganismen gegeben. Die kovalente Kopplung erfolgt, wenn überhaupt, dann in der Regel bei Wirkstoffen zur spezifischen Immunisierung über die Aktivierung des adaptiven Immunsystems.

Am nächsten kommen dieser Konstruktion die in W0 1996/22067 beschriebenen Konjugate mit einer Bibliothek von kurzen Bruchstücken eines CTL-Epitopes, die kovalent an ein Pam ₃ Cys- Derivat gekoppelt sind und die in WO 2007/078879 beschriebenen kovalenten Verbindungen aus einem Membran-Protein des Influenza-Virus und einem Pam ₃ Cys-Derivat, zur Verwendung als Impfstoffe. Von Mühlradt et al. wird ein diacyliertes Dihydroxypropylcystein-Peptid mit einem von Mycoplasma fermentans abgeleiteten Peptid (MALP-2) für verschiedene Anwendungen in der Immunologischen Medizin beansprucht (W0 1998/027110, W0 1999/059610, WO 2002/ 028887, WO 2003/084568, WO 2004/108145). US 5,688,771 beschreibt die Kopplung von Pep- tidoglykanen mit einer lipophilen Alkyl-Kette als Immunmodulator.

Anwendungen solcher Verbindungen zur Therapie und Prophylaxe von allergischen Erkrankungen über die gezielte Modulation der TLR-Rezeptoren wurden bisher nicht beschrieben.

Aufgabenstellung

Allergien sind ein großes Gesundheitsproblem mit einem facettenreichen Krankheitsbild. In den Industrieländern ist in den letzten Jahren eine eindeutige Zunahme der Häufigkeit allergischer Erkrankungen beobachtet worden. Heute weisen über 20% der Bevölkerung in den westlichen Industrienationen an allergischen Erkrankungen auf (World Health Organization 2002. Preven- tion of Allergy and Allergie Asthma). Allein in Europa gibt es 80 Millionen Allergiker (GA ² LEN - Global Allergy and Asthma European Network, www.ga2len.net, 2008). Bis 2025 werden ca.400 Millionen Menschen weltweit an allergischem Asthma leiden. Besonders besorgniserregend ist die Zunahme des Anteils der betroffenen Kinder.

Üblicherweise werden drei Ansätze zur Behandlung allergischer Erkrankungen verfolgt: i) Ver- hindern von Allergenkontakt soweit möglich, ii) Verordnung von Medikamenten, die die Krankheitssymptome lindern und iii) die herkömmliche Immuntherapie, auch als Desensibilisierung bezeichnet.

Die medikamentöse Symptombehandlung mit Kortisonpräparaten und Histaminhemmern ermöglicht nur eine kurzfristige Zustandsbesserung, was für die Patienten eine wiederholte An- wendung, oft sogar mehrmals täglich, bedeutet. Außerdem sind die herkömmlichen Wirkstoffe oft mit beträchtlichen Nebenwirkungen behaftet. Die Desensibilisierung andererseits, ist sehr zeitaufwändig. 3 - 5 Jahre Behandlungsdauer mit bis zu δOAllergeninjektionen sind für die Patienten recht unangenehm, so dass nur wenige Allergiker diese Therapieform nutzen.

Auch gibt es keine effektiven Möglichkeiten der Prophylaxe, um bereits das Risiko für eine Al- lergieentstehung wirksam zu senken.

Somit besteht ein großer Bedarf nach neuen wirkungsvollen Präventions- und Behandlungsstrategien.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, neue pharmazeutische Wirkstoffe zur Vorbeugung und Behandlung von allergischen Erkrankungen, bevorzugt von allergischem Asthma, zur Verfügung zu stellen, welche die genannten Nachteile der herkömmlichen Mittel umgehen. Dabei ist der auf der„Hygienehypothese" basierende Weg über die Aktivierung und Reifung des angeborenen Immunsystems ein völlig neuer Ansatz.

Die Aufgabe wird gelöst durch eine Auswahl erstmals beschriebener, von der Struktur eines Keimungs-Proteins aus den Sporen der Spezies Bacillus cereus abgeleiteter Lipopeptide, mit immunstimulatorischer Wirkung sowie durch deren synthetische Analoga mit der allgemeinen Struktur, wie sie in Anspruch 1 dargestellt ist. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Verbindung sind in den Ansprüchen 2 bis 9 beansprucht. Die Ansprüche 10 und 11 betreffen ein Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäßen Verbindungen, die Ansprüche 12 bis 15 die Ver- wendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und die Ansprüche 16 bis 27 pharmazeutische Präparate, enthaltend die erfindungsgemäßen Verbindungen, deren Herstellung und Verwendung. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht. Das wesentliche Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in einer Serie aus, von einem Sporen-Keimungs-Protein der Spezies Bacilluscereus abgeleiteten Lipopeptiden und deren synthetischen Analoga, wobei im Hinblick auf die immunmodulatorische Wirkung dieser Verbindungen die Stereoselektivität besonders zu berücksichtigen ist. Mit der vorliegenden Erfindung wird erstmals eine TLR-1 , -2, -6 vermittelte immunstimulatorische Wirkung auf das angeborene Immunsystem durch Lipopeptide aus Bazillen-Sporen auf molekularer Ebene nachgewiesen. Die abgeleiteten wirkungsrelevanten Sequenz-Motive bzw. Peptide sind bisher keinem immunologisch aktiven Epitop zugeordnet worden.

Die Erfindung beinhaltet weiterhin die Nutzung der immunstimulatorischen Wirkung dieser Ver- bindungen zum Zweck der Reifung des Immunsystems durch Simulation einer natürlichen Umgebung und aufbauend darauf deren Nutzung zur Therapie und Prophylaxe von zahlreichen allergischen Erkrankungen bei Mensch und Tier, vorzugsweise von allergischem Asthma.

Detaillierte Beschreibung

In genetischen Studien konnten verschiedene, die Asthma-Anfälligkeit modulierende TLR iden- tifiziert werden. Damit wird eine Verbindung zwischen der mikrobiologischen Umgebung und dem angeborenen Immunsystem bei Asthmatikern postuliert.

Im Rahmen der Suche nach neuen Wirkstoffen zur Prophylaxe und Therapie von allergischen Erkrankungen, besonders bevorzugt von allergischem Asthma, wurde deshalb die immunstimulierende Wirkung verschiedener synthetischer Analoga von natürlich vorkommenden Lipoprotei- nen als mögliche TLR-Agonisten untersucht.

Lipoproteine sind Bestandteile von gram-negativen Bakterien, gram-positiven Bakterien und Mykoplasmen. Sie repräsentieren zwischen 1 % und 3,5% des Genoms von Bakterien. Bakterielle Lipoproteine weisen keine Sequenzhomologie auf. Sie sind jedoch durch die ungewöhnliche Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-propyl]-[f?]-cystein am N-Terminus, an die zwei oder drei Fettsäuren gebunden sind, gekennzeichnet.

Lipoproteine und deren synthetische Analoga sind wirksame Immunmodulatoren der frühen angeborenen Immunantwort. Als Adjuvantien unterstützen sie auch die effektive Reaktion des adaptiven Immunsystems. Sie werden von den Toll-like-Rezeptoren TLR 1 , TLR 2 und TLR 6 in der Regel über die Ausbildung von Homo- oder Heterodimeren erkannt. Über eine interzelluläre Signalkaskade werden v.a. die Elemente der angeborenen Immunität wie Makrophagen, poly- morph-nucleäre Zellen und dendritische Zellen aktiviert, die erste Antikörper bilden. Im weiteren Verlauf setzt dann die spezifische Antikörperbildung ein. Die hierbei beteiligten Zytokine sind z.B. der Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und verschiedene Interleukine (IL-1α, IL-1 ß, IL-6, IL-8, IL-12). Durch dieses eher einer T _H 1 -dominierten Immunantwort entsprechende Zytokin- muster wird in den meisten experimentellen Modellen eine Immundeviation weg von der T _H 2- Ausprägung erklärt.

Die DOLOP-Datenbank (DOLOP - A Database of Bacterial Lipoproteins. http://www.mrc-lmb. cam.ac.uk/genomes/dolop) enthält eine Sammlung von bisher beschriebenen bakteriellen Lipo- proteinen. Die putativen Aminosäure-Sequenzen der Proteine beruhen zum Großteil auf Vorhersagen, basierend auf dem aufgeklärten Genom der Spezies. Wenigen erfassten Lipoproteinen liegt auch eine vollständige Strukturaufklärung zugrunde.

Aus dieser Datenbank wurden zunächst Lipoproteine von häufig auftretenden Bakterien-Spezies ausgewählt. Ausgehend von der Hygienehypothese und den bisher publizierten Arbeiten zur präventiven antiallergischen Wirksamkeit von Staubextrakten, lag der Schwerpunkt dabei auf in üblichen Konzentrationen für den gesunden Menschen nicht pathogenen Mikroorganismen, die besonders häufig in Tierställen vorkommen.

Diese Erreger, deren Sporen und Zerfallsprodukte liegen in der Regel als aerogene Partikel vor und werden bei der Atmung in die Bronchien und das Lungengewebe aufgenommen. Durch wiederholten Kontakt lernt das Immunsystem, zwischen der ubiquitären mikrobiellen Belastung und nicht pathogenen Substanzen zu unterscheiden. Dieser Reifungsprozess kann möglicherweise eine allergische Fehlregulation der Immunantwort verhindern.

Von den ausgewählten Lipoproteinen wurden anfangs Peptide, die die N-terminal letzten 15 Aminosäuren enthalten und später auch andere Analoga synthetisiert. Zur Simulation der Lipid- Komponenten wurden diese Peptide an ihrem N-terminalen Ende kovalent an S-[2,3-Bis(palmi- toyloxy)-(2RS)-propyl]-N-palmitoyl-[fi]-cystein (Pam ₃ Cys) gekoppelt. Dabei steht Pam ₃ Cys stellvertretend für verschiedene Lipid-Komponenten, da in früheren Untersuchungen gezeigt werden konnte, dass ein Ersatz der Palmitinsäure durch ähnlich große Fettsäuren keine relevanten Ak- tivitätsänderungen bewirkt. Ebenso konnte in den Untersuchungen gezeigt werden, dass die an die diacylierte Lipoaminosäure (Pam ₂ Cys) gebundenen Peptide eine vergleichbare biologische Aktivität aufweisen.

In einem Assay wurde die Fähigkeit dieser synthetischen Analoga zur Stimulierung von Rezeptoren der angeborenen Immunität in Abhängigkeit von der Konzentration bestimmt. Der Nach- weis der immunstimulatorischen Aktivität der Lipopeptide erfolgte anhand der IL-8-Sekretion durch THP-1 -Zellen, eine humane monozytäre Leukämie-Zelllinie. Die THP- 1 -Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der jeweiligen Lipopeptide inkubiert. Anschließend wurde die IL-8-Konzentration in den Überständen mit ELISA bestimmt (Durchführung entsprechend Ausführungsbeispiel B). Tab. 1 : Auswahl der getesteten Lipopeptide häufig auftretender Bakterien-Spezies.

Die meisten der untersuchten Lipopeptide, wie auch das synthetische Pam ₃ Cys-Derivat, erreichen ihre halbmaximale Aktivität im IL-8-Assay im Konzentrationsbereich von 10 bis 10O nM (Fig. 1 - Fig. 3).

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das von dem Keimungs-Protein GerD der Sporen von Bacillus cereus ATCC 10987 abgeleitete Lipopeptid sbLP11 (SEQ ID NO: 1) gegenüber den anderen untersuchten synthetischen Lipopeptiden eine bis zu 1.000-fach erhöhte stimula- torische Aktivität aufweist, d.h. seine halbmaximale Aktivität im IL-8-Assay bereits im Konzentrationsbereich von 10 bis 10O pM erreicht (Fig. 2, Fig. 4).

Bisher konnte eine immunstimulierende Wirkung bakterieller Sporen noch nie auf der molekularen Ebene nachgewiesen werden. Zudem ist der willkürlich ausgewählte Sequenz-Ausschnitt des Lipoproteins bisher nicht als immunogenes Epitop bekannt.

Auch in einer Kollektion von Lipopeptiden, die den Keimungs-Proteinen von Sporen verschiedener Bacillus-Spez\es zugeordnet werden, zeigten die von den Bacillus ceretvs-Klonen abgeleiteten Lipopeptide (SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2) eine überraschenderweise deutlich höhere Aktivität bei der Stimulation der IL-8-Sekretion als andere Keimungs-Proteine (Fig. 5, Fig. 6).

Tab. 2: Auswahl der getesteten, von den Keimungs-Proteinen

bakterieller Sporen abgeleiteten Lipopeptide (15-mere).

Spezies Lipoprotein Aminosäure-Sequenz

Bacillus cereus (ATCC 14579) GerD AQGKETKSELDYDQT

Bacillus cereus (ATCC 10987) GerD AQEKEAKSELDYDQT

Bacillus subtilis GerD APKDQAADMDYDQTK

Bacillus licheniformis GerD APTDQAAEMDYDQTK

Bacillus clausii GerD AQTEAQQNADYEGTK

Bacillus halodurans GerD APQAQGGNQPPDYES

Bacillus subtilis GerAC WDSENIEELSLVIGI

Bacillus subtilis GerBC WDVKDIEQLSFARGL

Bacillus subtilis GerKC WDKRELTDLAIISAI

Bacillus anthracis GerAC WDRRELEHVLFINTL

Zur Verifizierung der außergewöhnlichen immunologischen Aktivität des identifizierten Lipopep- tides sGerD aus Bacillus cereus (SEQ ID NO: 1) und der Übertragbarkeit dieser Wirkung auch auf andere synthetische Analoga wurden weitere Untersuchungen zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung vorgenommen.

Tab. 3: Synthetische Analoga zur Untersuchung der

Struktur-Aktivitäts-Beziehung von sGerD.

Modifikation Sequenz

Verkürzung Pam ₃ Cys-AQEKEAKSELDYDQT

Pam ₃ Cys-AQEKEAKSELDYD

Pam ₃ Cys-AQEKEAKSEL

Pam ₃ Cys-AQEKEAKS

Pam ₃ Cys-AQEKEA

Alanin-Scan Pam ₃ Cys-AAEKEAKSELDYD

Pam ₃ Cys-AQAKEAKSELDYD

Pam ₃ Cys-AQEAEAKSELDYD

Pam ₃ Cys-AQEKAAKSELDYD

Pam ₃ Cys-AQEKEAASELDYD

Pam ₃ Cys-AQEKEAKAELDYD

Pam ₃ Cys-AQEKEAKSALDYD

Pam ₃ Cys-AQEKEAKSEADYD

Pam ₃ Cys-AQEKEAKSELAYD

Pam ₃ Cys-AQEKEAKSELDAD

Pam ₃ Cys-AQEKEAKSELDYA

Ableitung eines Pam ₃ Cys-GQEKEAKSELDYD

Sequenz-Motivs Pam ₃ Cys-ANEKEAKSELDYD

Pam ₃ Cys-AQEKEAKEKEEK

Pam ₃ Cys-AEEKEAEEK

Pam ₃ Cys-GEEKEEK

Pam ₃ Cys-Sar-AQEKEAKSELDYD

Einfluss der AQEKEAKSELDYDQT

Lipoaminosäure K(εPam)-AQEKEAKSELDYD

Pam-AQEKEAKSELDYD

Einfluss der Amid- Pam ₂ Cys-AQEKEAKSELDYD

gebundenen Fettsäure

Die I L-8-stimulierende Aktivität der 13 Aminosäuren enthaltenden Lipopeptid-Variante (SEQ ID NO: 3) entsprach der des sGerD mit 15 Aminosäuren (SEQ ID NO: 1 ). Eine weitere Verkürzung des Lipopeptides führte zu einer deutlichen Reduktion der immunmodulatorischen Aktivität (Fig. 7, Fig. 8).

Im Alanin-Scan mit der von sGerD abgeleiteten Tridekapeptidsequenz (SEQ ID NO: 3) als Basis, wurde durch den Austausch der Aminosäuren auf den Positionen 3, 4, und 5 der auf Pam ₃ Cys folgenden Aminosäure-Sequenz, die Zytokin-Sekretion merklich reduziert (Fig. 9, Fig. 10). Offensichtlich stellt das Motiv EKE mit der Aufeinanderfolge entgegengesetzt geladener Aminosäuren, neben der charakteristischen Lipoaminosäure mit 2 oder 3 Fettsäuren, ein entscheidendes Strukturmerkmal für die immunstimulierende Wirkung des Lipopeptides sGerD dar.

Weitere Variationen zeigten, dass die Lipopeptide sGerD mit sterisch anspruchslosen, kleinen Aminosäuren wie Alanin oder Glycin an der Position 1 der auf Pam ₃ Cys folgenden Aminosäure- Sequenz außergewöhnlich aktiv sind. Offensichtlich verbessern diese Aminosäuren die

Interaktion mit der Bindungstasche des Rezeptors.

Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden weitere Struktur-Analoga der bisher untersuchten Lipopeptide abgeleitet und hinsichtlich ihrer immunstimulatorischen Wirkung charakterisiert. Die gefundenen Strukturmotive wurden konsequent umgesetzt, um die Löslichkeit sowie die Resor- bierbarkeit der Verbindungen und damit deren Bioverfügbarkeit weiter zu erhöhen.

Insgesamt zeigen die Lipopeptide mit den auf diese Weise abgeleiteten Strukturmotiven eine verstärkte Wirkung. Die halbmaximale Aktivität im IL-8-Assay liegt für alle Verbindungen unterhalb von 0,1 nM. Als besonders wirksam erwiesen sich die beiden Lipopeptide Pam ₃ Cys- AEEKEAEEK (SEQ ID NO: 4) und Pam ₃ Cys-GEEKEEK (SEQ ID NO: 5) mit einer gegenüber der sGerD-Originalsequenz stark veränderten Aminosäure-Folge (Fig. 11 ).

Eine weitere Untersuchung betraf den Effekt der Palmitinsäure-Substituenten. Sowohl für das Pam ₃ Cys-Derivat als auch für das Pam ₂ Cys-Derivat des auf 13 Aminosäuren verkürzten sGerD- Lipopeptides (SEQ ID NO: 3) wurden deutlich erhöhte stimulatorische Aktivitäten nachgewiesen (Fig. 12). Die Kopplung des dritten Fettsäure-Restes über eine Amid-Bindung an den N-Termi- nus des 2,3-Dihydroxypropylcysteins ergibt somit gegenüber dem Lipopeptid mit freiem N-Ter- minus keinen entscheidenden Vorteil in der immunologischen Wirksamkeit von sGerD.

Dagegen ist die immunmodulatorische Aktivität von sGerD wesentlich von der Existenz des an beiden OH-Gruppen mit einem Fettsäure- Rest veresterten 2,3-Dihydroxypropylcysteins abhängig. Die nicht acylierten und die mono-N-palmitoylierten Peptide weisen keine IL-8-stimulieren- den Aktivitäten auf (Fig. 13). Das gilt sowohl für die 15 Aminosäuren enthaltende Originalsequenz von sGerD (SEQ ID NO: 1) als auch für die auf 13 Aminosäuren verkürzte Variante (SEQ ID NO: 3).

Weiterhin ergab eine Untersuchung zum Einfluss der Stereoisomerie der erfindungsgemäßen Lipopeptide eine deutlich höhere immunmodulatorische Wirkung der Verbindungen, die das R/R-Isomer des Dihydroxypropylcystein-Grundkörpers enthalten. Ausgehend von diesen Untersuchungen konnte überraschenderweise gefunden werden, dass sowohl die abgeleiteten Lipopeptide sGerD aus Bacilluscereus (SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) als auch weitere spezifisch modifizierte Analoga, die nicht mehr der Originalsequenz entsprechen, vorzugsweise die Verbindungen mit den Sequenzen nach SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5, eine außergewöhnlich hohe immunstimulatorische Aktivität aufweisen. Dabei zeigen die Lipopeptide, die das Rf?-Isomer des Dihydroxypropylcystein-Grundkörpers enthalten, eine ganz besondere Aktivität.

Dies überrascht um so mehr, als dass bisher die immunstimulatorische Wirkung von Bacillus- Sporen auf molekularer Ebene nicht nachgewiesen wurde.

Bei dem Mikroorganismus Bacilluscereus handelt es sich ein gram-positives Bakterium, das natürlich im Erdboden, also auch im Staub vorkommt. Die ubiquitär vorhandenen Mengen sind für gesunde Menschen und Tiere nicht pathogen. In sehr hohen Konzentrationen kann das Bakterium als Lebensmittelvergifter, v.a. in Reis und Milch, wirken.

In der Literatur finden sich einzelne Hinweise auf Impfstoffe gegen dieses Bakterium. Dabei müssen stets Adjuvantien eingesetzt werden, um eine ausreichende immunstimulatorische

Wirkung dieses Bakteriums oder seiner Teile zu erzielen (WO 2004/030608, WO 2008/054892, US 2003/0190322). In einer Patentschrift wird die Verwendung von Bacillus cereus-Sporen als Transportsystem für immunogene Polynucleotid-Sequenzen beansprucht (WO 2006/087576).

Die eigenständige immunmodulatorische Wirkung der Bacillus cereus-Sporen an sich, bestimm- ter Teile davon oder einzelner Lipoproteine bzw. Lipopeptide aus diesen Sporen, ist bisher nicht beschrieben. Auch wurde die Verwendung von ausgewählten kurzen Aminosäure-Sequenzen dieser Lipoproteine, die keinem speziellen Immunitäts-relevanten Epitop zugeordnet werden können, bisher nicht in Erwägung gezogen.

In der vorliegenden Erfindung wurde erstmals ein bis zu 25 Aminosäuren langes Peptid, das von der Aminosäure-Sequenz am N-terminalen Ende des insgesamt 25 kDalton großen Keimungs-Proteins GerD der Bacillus cereus-Sporen abgeleitet ist, ausgewählt und kovalent an ein di- oder triacyliertes Dihydroxypropylcystein (Pam ₂ Cys oder Pam ₃ Cys) gekoppelt, um damit eine unspezifische immunstimulatorische Wirkung bei Menschen und Tieren über einen der Toll-like-Rezeptoren TLR 1 , TLR 2 oder TLR 6 zu erzielen. Diese Stimulation soll durch Simulation einer natürlichen Umgebung zur Reifung des Immunsystems beitragen und darauf aufbauend das Risiko zur Ausprägung einer manifestierten allergischen Erkrankung minimieren. Die vorliegende Erfindung betrifft daher Verbindungen nach der Formel

Ri-O- CH ₂

R2-0— *CH

CH ₂

S

sowie deren Verwendung als Immunstimulanzien zur Therapie und Prophylaxe zahlreicher allergischer Erkrankungen, vorzugsweise von allergischem Asthma.

Dabei stehen R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen,

R3 für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen oder H und R4 für ein vom Keimungs-Protein GerD der Bacillus cereus-Sporen abgeleitetes, aus 1 bis 25 Aminosäuren bestehendes physiologisch verträgliches und in der behandelten Spezies nicht per se immunogenes Peptid.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen betreffen erfindungsgemäße Lipopeptide mit zwei oder drei gesättigten Ci ₆ -Acyl-Substituenten für R1 , R2 und gegebenenfalls R3 sowie einem Peptid entsprechend den folgenden Formeln (II) - (IX).

SEQ ID NO: 1

CH ₃ -(CH ₂ ) ₁₄ ' -O-- CH ₂ CH ₂

SEQ ID NO: 3

SEQ ID NO: 4

SEQ ID NO: 5 Dabei hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, die erfindungsgemäßen Peptide C-terminal durch 1-5 hydrophile Aminosäuren, besonders bevorzugt durch die Aminosäure-Sequenz KKM zu verlängern, um die Bioverfügbarkeit der erfindungsgemäßen Lipopeptide zu erhöhen.

Die Definition der Verbindungen nach den Formeln (I) bis (IX) schließt alle pharmazeutisch akzeptablen Salze, Stereoisomeren, Stereoisomeren-Gemische und Prodrug-Verbindungen der erfindungsgemäßen Lipopeptide ein.

Zusätzlich zum Nachweis der immunstimulatorischen Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Lipopeptide über die in vtfro-Stimulierung der IL-8-Sekretion wurden ihre vollständige Allergie- protektive Wirkung sowie die physiologische Verträglichkeit im standardisierten Tiermodell des allergischen Asthmas belegt.

In den immunologischen und zellbiologischen Funktionsuntersuchungen (Ausführungsbeispiele C und D) konnte gezeigt werden, dass durch die intranasale Applikation der erfindungsgemäßen Lipopeptide sowohl die Asthma-bedingten Symptome, die Entzündungsreaktion als auch die allergene Sensibilisierung bis nahezu auf das Niveau nicht sensibilisierter Mäuse (entsprechende Vergleichswerte sind in M. Peters etal. 2006. Thorax 61 : 134-139 beschrieben) zurückgedrängt werden konnten. Die T _H 1 -stimulierte Immunantwort wurde dabei nur unwesentlich verstärkt.

Einschränkende Nebenwirkungen wurden im Mausmodell nicht beobachtet.

Eine besondere Wirksamkeit zeigten die erfindungsgemäßen Lipopeptide unmittelbar auf das Lungengewebe. Die Konzentration der Allergen-spezifischen Antikörper war in der Lungenflüssigkeit deutlich höher als im Serum. Dies legt die Inhalation als besonders wirksame Applikationsform der erfindungsgemäßen Lipopeptide nahe.

Diese überraschenden Erkenntnisse über die herausragende immunmodulatorische Aktivität der erfindungsgemäßen Lipopeptide und deren Wirksamkeit bei der Therapie und Prophylaxe allergischer Erkrankungen, bevorzugt von allergischem Asthma, erschließen völlig neue Möglichkeiten für deren Anwendung als Wirkstoffe zur Behandlung von und Impfung gegen Allergien. Ein besonderer Vorteil besteht in der Nutzung natürlicher Mechanismen wie der Reifung des Immunsystems, um die Entstehung von Allergien zu verhindern

Das Wirkspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst aufgrund des unspezifischen Immunisierungsansatzes über die TLR-Rezeptoren 1 , 2, und 6 die gesamte Breite der bekannten allergischen Erkrankungen, insbesondere Allergien und Hypersensitivitäten gegen Umweltstoffe und Lebensmittel, die sich durch Symptome an den Schleimhäuten (allergische Rhinitis, Mundschleimhautschwellungen, Konjunktivitis), den Atemwegen (Asthma bronchiale), der Haut (atopische Dermatitis, Neurodermitis, Kontaktekzem, Urtikaria), im Gastrointestinal- trakt (Erbrechen, Durchfälle) oder als akuter Notfall (anaphylaktischer Schock) äußern.

Besonders wirksam sind die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Behandlung von allergischen Reaktionen der Atemwege, insbesondere allergischem Asthma und allergischer Rhinitis, die u.a. durch Hausstaub und Pollen verursacht werden.

Typische medizinische Indikationen sind beispielsweise die Prophylaxe bei Individuen mit eindeutiger genetischer Disposition sowie die Behandlung von Menschen und Tieren bei ersten Symptomen einer aufkommenden Hypersensitiviät.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von synthetischen Lipopeptiden nach Formel (I), die erfindungsgemäß als Immunstimulanzien zur Therapie und Prophylaxe von allergischen Erkrankungen eingesetzt werden können.

Ein möglicher Weg ist die konvergente Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei die ungewöhnliche Aminosäure Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propy l]- [R]-cystein (Fmoc-Dhc-OH) in Lösung oder an fester Phase mit einem an einem Synthese-Harz aufgebauten Seitenketten-geschützten Peptid verknüpft wird. Diese Vorstufe kann nachfolgend an den Hydroxygruppen bisacyliert werden. Nach der Fmoc-Abspaltung von weiteren Seitenketten-Schutzgruppen wird die Zielverbindung vom Harz getrennt. Bei der Synthese des Pam ₃ Cys-Derivates erfolgt vor der Abspaltung vom Harz noch die Acylierung der freigewordenen N-terminalen Aminogruppe.

Bei einer weiteren Herstellungsvariante wird die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen mit dem Baustein Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?)-propyl ]-[f?]-cystein (Fmoc-ftR-Dhc-OH) durchgeführt. Dabei wird die Zielverbindung als stereochemisch definiertes Derivat erhalten, welches aus L-Aminosäuren, aus der modifizierten Aminosäure S-[2,3-di (hydroxy)-[2R]-propyl]-[R]-cystein sowie aus zwei oder drei Acyl-Resten aufgebaut ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen synthetischen Lipopeptide nach Formel (I) zur Herstellung pharmazeutischer Präparate für die Behand- lung und Vorbeugung von Erkrankungen von Menschen und Tieren, die mit Allergien in Zusammenhang stehen. Diese immunmodulatorisch wirksamen Zusammensetzungen, enthaltend wenigstens ein erfindungsgemäßes synthetisches Lipopeptid nach Formel (I), enthalten weiterhin mindestens ein oder kein die immunologische Wirkung verstärkendes Adjuvans, mindestens einen oder keinen nicht-toxischen, inerten, pharmazeutisch geeigneten Träger sowie mindestens einen oder keinen nicht-toxischen, inerten, pharmazeutisch geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoff.

Pharmazeutisch geeignete Materialien sind die im Bereich der Pharmazie und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Stoffe, insbeson- dere die in einschlägigen Arzneibüchern gelisteten, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes synthetisches Lipopeptid nach Formel (I), können beispielsweise als Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Pulver, Suppositorien, Pflaster, Injektabilia, Lösungen, Suspensio- nen, Emulsionen, Pasten, Salben, Gele, Cremes, Lotionen, Puder oder Sprays formuliert sein, vorzugsweise als Suspension oder Lösung zur intranasalen Inhalation.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen bei Menschen und Tieren, die mit Allergien in Zusammenhang stehen. Hierzu verabreicht man einer Person oder einem Tier, die oder das einer derartigen Behandlung bedarf, eine immun- stimulatorisch wirkende Menge einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes synthetisches Lipopeptid nach Formel (I). Der Wirk- stoff oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann lokal oder systemisch, oral oder parenteral (insbesondere mucosal, transdermal und durch subkutane, intramuskuläre, intravenöse oder intralymphatische Injektion) verabreicht werden, vorzugsweise intrapulmonal oder intranasal.

Näheres zu besonders bevorzugten Ausführungsformen sowie weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind.

Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Abbildungen

Fig. 1 Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von Bakterien abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1 -Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration (sbLP 1 - 7).

Fig. 2 Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von Bakterien abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration (sbLP 8 - 14).

Fig. 3 Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von Bakterien abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1 -Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration (sbLP 15- 21).

Fig. 4 Immunstimulierende Aktivität des synthetischen, vom Sporen-Keimungs-Protein GerD der Spezies Bacilluscereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD (sbLP11) im Vergleich zu PaOi ₃ CyS-SK ₄ , gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1 -Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration.

Fig. 5 Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von den Keimungs-Proteinen verschiedener Bacillus-Spezies abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1 -Zellen bei einer Konzentration von 1 nM.

Fig. 6 Immunstimulierende Aktivität synthetischer, von den Keimungs-Proteinen GerD verschiedener ßac///ι/s-Spezies abgeleiteter Lipopeptide, gemessen anhand der IL-8- Sekretion von THP- 1 -Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration.

Fig. 7 Immunstimulierende Aktivität verkürzter Struktur-Analoga des von Bacilluscereus

abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1- Zellen bei einer Konzentration von 1 nM.

Fig. 8 Immunstimulierende Aktivität verkürzter Struktur-Analoga des von Bacilluscereus

abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1-

Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration.

Fig. 9 Immunstimulierende Aktivität von im Alanin-Scan modifizierten Struktur-Analoga des von Bacilluscereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8- Sekretion von THP-1 -Zellen bei einer Konzentration von 1 nM.

Fig. 10 Immunstimulierende Aktivität von im Alanin-Scan modifizierten Struktur-Analoga des von Bacilluscereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8- Sekretion von THP- 1 -Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration. Fig. 11 Immunstimulierende Aktivität von entsprechend der abgeleiteten Motive modifizierten Struktur-Analoga des von Bacillυscereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekretion von THP-1 -Zellen in Abhängigkeit von der Konzentration.

Fig. 12 Immunstimulierende Aktivität der Pam ₂ Cys- und Pam ₃ -Cys-Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8-Sekre- tion von THP-1 -Zellen bei einer Konzentration von 1 nM.

Fig. 13 Immunstimulierende Aktivität 2,3-Dihydroxypropylcystein-freier Struktur-Analoga des von Bacillus cereus abgeleiteten Lipopeptides sGerD, gemessen anhand der IL-8- Sekretion von THP-1-Zellen bei einer Konzentration von 10 μM im Vergleich zurAktivi- tat von sGerD bei 1 nM.

Fig. 14 Behandlungsprotokoll zum Asthma- und Sensibilisierungsmodell in der BALB/c- Labormaus.

Fig. 15 Atmungs-Hyperreagibilität der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Fig. 16 Modulation der eosinophilen Granulozyten in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 17 Modulation der Lymphozyten in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 18 Modulation der neutrophilen Granulozyten in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 19 Anzahl der Makrophagen in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labor- mause nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 20 IgE-Konzentration in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 21 IgE-Konzentration im Serum der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Fig. 22 IgGI -Konzentration in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 23 IgGI -Konzentration im Serum der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 24 lgG2a-Konzentration in der bronchoalveolären Lavage der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 25 lgG2a-Konzentration im Serum der sensibilisierten Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Fig. 26 Modulation der lnterleukin-5-Produktion durch die Milz-Zellen der sensibilisierten

Labormäuse nach Behandlung mit verschiedenen Dosen des Lipopeptides LPM im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Sequenzprotokoll - freier Text

Tab.4: Erläuterung der Bezeichnungen in Feld <223>

SEQ ID NO: <223> Erläuterung

1 -5 Pam ₂ Cys or Pam ₃ Cys Pam ₂ Cys oder Pam ₃ Cys kovalent gekoppelt am N-terminalen Ende des Peptides

3 shortened synthetic am C-terminalen Ende um 2 Aminosäuren

analog to SEQ ID NO: 1 verkürztes Peptid der SEQ ID NO: 1

4 - 5 modified synthetic analog Peptid mit von den verkürzten natürlichen

to SEQ ID NO: 1 - 3 Aminosäuresequenzen von Bacilluscereus

(SEQ ID NO: 1 -3) abgeleiteten Strukturmotiven

Ausführungsbeispiele

Beispiel A - Herstellung der synthetischen bakteriellen Lipopeptide

Pam ₂ Cys-AQEKEAKSELDYD und Pam ₃ Cys-AQEKEAKSELDYD

In diesem Ausführungsbeispiel wird die allgemeine Methodik zur Herstellung der erfindungs- gemäßen Lipopeptide mit den Methoden der Festphasensynthese beschrieben. Strukturmodifikationen können durch das Auslassen einzelner Syntheseschritte bzw. das Hinzufügen von, dem erfahrenen Synthesechemiker bekannten, Schritten vorgenommen werden.

Wird bei der Synthese der außergewöhnlichen Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[f?]- cystein (Dhc) der racemische Synthesebaustein RS-2,3-Epoxy-1-propanol verwendet, erhält man ein Diastereomeren-Gemisch der Zielverbindung. Durch Einsatz des Enantiomers R-2,3- Epoxy-1-propanol wird das immunmodulatorisch aktivere f?R-Stereoisomer von Dhc erhalten.

Die Synthese der Peptide erfolgt nach klassischen, literaturbekannten Methoden in Lösung oder in einem automatisierten Verfahren an der festen Phase. Die Verfahrenschritte für die Synthese an fester Phase sind für nahezu alle Aminosäure-Sequenzen gleich. Aus diesem Grund wird in dem Beispiel lediglich der prinzipielle Syntheseablauf beschrieben, ohne auf Besonderheiten einzelner Peptide einzugehen. a) Synthese des Peptides AQEKEAKSELDYD mit automatisierter Festphasensynthese

Das Peptid AQEKEAKSELDYD wird an einem Syntheseroboter ausgehend von einem mit Fmoc-L-Asp beladenen Synthese-Harz nach der Fmoc-Peptidsynthese-Methode aufgebaut. Dazu wird das beladene Tritylchlorid-Polystyrol-Harz (8 mg; 7 μmol) in einen Reaktor eingewogen. Die Aminosäuren werden in einer 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung (0,5 M in N ₁ N-Di- methylformamid) zu 0,5 M Lösungen gelöst. Anschließend werden die befüllten Reaktoren und Vials auf die vorgesehenen Positionen des Syntheseroboters gestellt.

Im ersten Schritt erfolgt die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe nach dem in Tab. 5 dar- gestellten Programmablauf.

Tab. 5: Zyklus zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe.

Syntheseschritt Reagenzien Volumina [μl_] Dauer [min]

Start Harz quellen N,N-Dimethylformamid 800 2

1. Deblockierung 30% Piperidin in 200 5

N,N-Dimethylformamid

2. Waschen, 3 x N,N-Dimethylformamid 300 1

3. Deblockierung 30% Piperidin in 200 10

N,N-Dimethylformamid

4. Waschen, 7 x N,N-Dimethylformamid 300 1

Anschließend wird das entsprechende Peptid auf dem Harz aufgebaut.

Dies erfolgt durch die schrittweise Verknüpfung der jeweiligen Aminosäuren. Unmittelbar nach jeder Kupplung wird die N-Fmoc-Schutzgruppe der soeben gekoppelten Aminosäure abgespalten, um die Anbindung der nächsten Aminosäure an der freigewordenen Amino- gruppe zu ermöglichen.

Der Programmablauf des Syntheseroboters ist in der folgenden Tabelle dargestellt.

Tab.6: Zyklus zur Synthese der Peptide.

Syntheseschritt Reagenzien Volumina [μL] Dauer [min]

1. Kupplung 3 M N,N-Diisopropylethylamin 25 120

3 M N,NT-Diisopropylcarbodiimid 25

in N.N-Dimethylformamid, 100

Aminosäure-Lösung

2. Waschen, 3 x N,N-Dimethylformamid 300 1

3. Deblockierung 30% Piperidin in 200 5

N,N-Dimethylformamid

4. Waschen, 3 x N,N-Dimethylformamid 300 1

5. Deblockierung 30% Piperidin in 200 10

N.N-Dimethylformamid

6. Waschen, 7x N.N-Dimethylformamid 300 1

7. weiter bei Schritt 1. b) Synthese von N,N'-Bis(fluorenylmethoxycarbonyl)-[f?]-cystein-bis-tert.-bu tylester

(Fmoc-Cys-OtBu) ₂

L-Cystin-bis-tert.-butylester (5,5 g; 13 mmol) und Fmoc-N-hydroxysuccinimidylester (7,04 g; 21 mmol) werden in Tetra hydrofu ran (15 ml_) gelöst. Unter Rühren wird N-Ethylmorpholin (3,83g; 4,2 mL; 30 mmol) in Tetrahydrofuran (7,5 mL) dazugeben.

Die Reaktionslösung wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Hilfe des Rotationsverdampfers bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat (10O mL) gelöst und im Scheidetrichter mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 3 x 8O mL) sowie Wasser (3 x 8O mL) gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer eingedampft und als Rückstand ein Öl erhalten.

Dieser Rückstand wird in Dichlormethan / Methanol (1 :4; 385 mL) mit Hilfe eines Ultraschallbades gelöst und umkristallisiert (18 h; -20 ⁰ C). Der erhaltene farblose Niederschlag wird über eine Filtemutsche abfiltriert, mit tert.-Butylalkohol /2-Propanol (1 :1 ; 2 x 10O mL) gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute (Fmoc-Cys-OtBu) ₂ : 7,48g (72%); [M+H] ⁺ : 797 c) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propy l]-[/R]-cystein- tert.-butylester (Fmoc-f?S-Dhc-OtBu)

Das (Fmoc-Cys-OtBu) ₂ (4,96 g; 6,2 mmol) wird in Dichlormethan (39 mL) gelöst. Anschließend werden Zink (2,84 g; 43,4 mmol) sowie eine Lösung aus Methanol, Salzsäure (32%) und Schwefelsäure (98%) (100:7:1 ; 20,7 mL) unter starkem Rühren zugeben.

Nach 15 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird f?S-2,3-Epoxy-1-propanol (45,9 g;

41 ,3 mL; 62 mmol) zu dem Reaktionsgemisch geben. Das Ganze wird im Ölbad (5 h; 40 ⁰ C) weiter gerührt. Anschließend wird die Lösung am Rotationsverdampfer auf das halbe Volumen eingedampft, mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 5,2 mL) versetzt und 16 h bei -2°C aufbewahrt.

Das Produkt wird mit Dichlormethan (3 x 50 mL) extrahiert. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft.

Ausbeute (Fmoc-RS-Dhc-OtBu): 5,67 g (96%); [M+H] ⁺ : 474

In analoger Weise wird das f?f?-Stereoisomer von Fmoc-Dhc-OtBu unter Einsatz von R-2,3- Epoxy-1-propanol erhalten. d) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propy l]-[f?]-cystein (Fmoc-RS-Dhc-OH)

Fmoc-RS-Dhc-OtBu (5,67 g; 12 mmol) wird in Trifluoressigsäure (99%; 142 mL) gelöst und das Reaktionsgemisch 1 h bei Raumtemperatur gerührt.

Die Lösung wird anschließend am Rotationsverdampfer eingedampft, mit N-Hexan (50 mL) und Diethylether (30 mL) versetzt und wieder am Rotationsverdampfer eingedampft.

Der zähflüssige, ölige Rückstand wird anschließend in tert.-Butylalkohol/ Wasser (80%; 10O mL) gelöst und lyophilisiert (64 h).

Ausbeute (Fmoc-RS-Dhc-OH): 3,03 g (60%); [M+H] ⁺ : 418 e) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propy l]-[R]-cysteinyl- AQEKEAKSELDYD

Ein mit dem Seitenketten-geschützten Peptid AQEKEAKSELDYD beladenes Synthese-Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μl_) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen.

Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropyl- ethylamin (3 M in N,N-Dimethylforrnamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 7 Equivalente), Nα-Fluorenyl- methoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propyl]-[f?]-cyste in (15 mg in 100 μl einer 0,5 M 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung in N,N-Dimethylformamid; 36,6 μmol; 7 Equivalente) und Di- isopropylcarbodiimid-Lösung (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μl_; 36,6 μmol; 7 Equivalente) zu dem Harz pipettiert.

Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 x600 μl_) und Dichlormethan (3x600 μL) gewaschen. f) Veresterung von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propy l]-[/ ^: ?]- cysteinyl-AQEKEAKSELDYD mit Palmitinsäure

Das mit Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propy l]-[f?]-cysteinyl-

AQEKEAKSELDYD beladene Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen.

Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropyl- ethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 24,4 μL; 73,2 μmol; 14 Equivalente), Palmitinsäure

(1 M in N,N-Dimethylformamid / Dichlormethan (1 :1 ; 104 μL; 104 μmol; 20 Equivalente) und

Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 24,4 μL; 73,2 μmol; 14 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Nach 5 min wird 4-Dimethylaminopyridin (1 M in N,N-Dimethylform- amid; 30 μL; 30 μmol; 5,7 Equivalente) zugeben.

Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 x600 μL) und Dichlormethan (3 x600 μL) gewaschen.

Die Veresterung wird ein weiteres Mal unter den gleichen Versuchsbedingungen wiederholt. g) Abspaltung der Fmoc- sowie der Seitenketten-Schutzgruppen

Das mit Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)- propyl]-[f?]-cysteinyl- AQEKEAKSELDYD beladene Harz (5,22 μmol) wird mit Dichlormethan (100 μL) versetzt und

5 min in einem Reaktor quellen gelassen.

Nach dem Abfiltrieren des Dichlormethan-Überstandes wird Piperidin (30% in N,N-Dimethyl- formamid; 200 μL) zum Harz pipettiert und die Mischung 10 min bei Raumtemperatur belassen. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 x600 μL) gewaschen. Anschließend wird nochmals Piperidin (30% in N,N-Dimethylformamid; 200 μL) zu dem Harz pipettiert und die Suspension 20 min bei Raumtemperatur belassen. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3x 600 μL), Dichlormethan (3 x 600 μL) und Diethylether (4 x 600 μL) gewaschen.

Die Vollständigkeit der Reaktion wird mit Hilfe des Ninhydrin-Testes kontrolliert. h) Abspaltung des Lipopeptides S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl- AQEKEAKSELDYD vom Synthese-Harz

Die Abspaltlösung Trifluoressigsäure/Triisopropylsilan / Wasser (92,5:5:2,5; 300 μL) wird zu dem Harz (2,6 μmol) pipettiert und die Suspension 2 h bei Raumtemperatur belassen.

Anschließend wird die Abspaltlösung mit Druckluft in ein Reagenzglas filtriert. Nachfolgend werden weitere 200 μL Abspaltlösung zu dem Harz pipettiert und die Suspension nochmals 30 min bei Raumtemperatur belassen.

Nach erneuter Filtration der Abspaltlösung mit Druckluft wird das Harz mit Dichlormethan (200 μL) gewaschen. Die Filtrate und die Waschlösung werden vereinigt und am Rotations- Verdampfer eingedampft. Der Rückstand wird mit Diethylether (3 x 300 μL) digeriert und anschließend zentrifugiert. Das Sediment wird in tert.-Butylalkohol /Wasser (4:1 ; 2 mL) aufgenommen und gefriergetrocknet (18 h).

Ausbeute (Pam ₂ -(2RS)-Dhc-AQEKEAKSELDYD): 5,6 mg (98%);

M: 2180; [M+2H] ²⁺ : 1091 ; [M+3H] ³⁺ : 728 i) Acylierung von S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2f?S)-propyl]-[f?]-cysteinyl-AQEKE AKSELDYD mit Palmitinsäure

Das mit S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2f?S)-propyl]-[f?]-cysteinyl-AQEKE AKSELDYD beladene Harz (2,6 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen.

Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropyl- ethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 14 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N,N-Dimethylformamid / Dichlormethan (1 :1 ; 52 μL; 52 μmol; 20 Equivalente) und Di- isopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 14 Equivalente) zu dem Harz pipettiert.

Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 x600 μL) und Dichlormethan (3x 600 μL) gewaschen.

Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgt nach dem unter h) beschriebenen Verfahren.

Ausbeute (Pam ₃ -(2RS)-Dhc-AQEKEAKSELDYD): 5,6 mg (89%);

M: 2418; [M+2H] ²⁺ : 1210; [M+3H] ³⁺ : 807 Beispiel B - Bestimmung der immunstimulierenden Aktivität synthetischer bakterieller

Lipopeptide anhand der IL-8-Sekretion von THP-1 -Zellen

Die Charakterisierung der immunstimulatorischen Aktivität von Lipopeptiden erfolgte anhand der IL-8-Sekretion von THP-1 -Zellen, eine humane monozytäre Leukämie-Zelllinie (DSMZ Braunschweig, No. ACC 15). Die THP-1 -Zellen wurden bei 37°C in RPMI-1640-Zellkultur- medium mit 10% fetal bovine serum (PAN Biotech) in einer mit 5% CO ₂ angereicherten Atmosphäre kultiviert.

Zur Durchführung der Bestimmungen wurden je 180 μl_ der Zellkultur (5 x 10 ⁴ Zellen) in die Wells einer Mikrotiterplatte gegeben. Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurden die Zellsuspensio- nen mit den Lipopeptid-Lösungen versetzt.

Dazu wurde zunächst eine 1 mM Lipopeptid-Stammlösung in DMSO hergestellt. Diese wurde 1 :20 mit tert.-Butylalkohol /Wasser (4:1 , v/v) und anschließend 1 :500 mit dem Zellkulturmedium weiter verdünnt. Die abschließende Verdünnung zu der im Test gewünschten Endkonzentration erfolgte durch die Wahl des zu der Zellsuspension zugegebenen Volumens dieser 10O nM Lipo- peptid-Lösung. Als Kontrolle wurde eine Lipopeptid-freie Lösung, die dieselben Mengen an DMSO und tert.-Butylalkohol enthält, mitgeführt.

Nach 5 h Inkubation der Lipopeptide mit der Zellsuspension wurden die Zellkulturüberstände abgenommen und bis zur Messung bei -80 ⁰ C eingefroren.

Die Bestimmung der IL-8-Konzentration erfolgte in einem Sandwich-ELISA nach dem Prinzip eines nicht-kompetitiven Assays. Der ELISA wurde in Mikrotiterplatten mit einem maximalen Volumen von 300 μL pro Well bei Raumtemperatur durchgeführt (Nunc-lmmuno™96Micro- Well™Plates/MaxiSorp™). Je Platte wurden zwei IL-8-Lösungen bekannter Konzentration (Recombinant Human lnterleukin-8-Standard / Sigma / Produkt-Nr. 1 1645) als interner Standard mitgeführt. a) Beschichtung der Mikrotiterplatte mit humanem anti-IL-8-Antikörper

Die Mikrotiterplatten wurden mit einem Antikörper gegen humanes IL-8 beschichtet. Dieses sogenannte„Coating" beruht auf einer unspezifischen hydrophoben, nicht kovalenten Wechselwirkung zwischen dem Trägermaterial der Mikrotiterplatte und dem Antikörper.

Dazu wurde eine Lösung des primären Antikörpers (human anti-IL-8-Antikörper / Konz. 0,5 mg/mL / BD Biosciences Pharmingen / Produkt-Nr. 554716) mit PBS-Puffer (pH 7,2 /

Gibco™lnvitrogen Corporation / Produkt-Nr. 14200-067) auf 1 μg/mL verdünnt. In jedes Well der Mikrotiterplatte wurden 100 μL dieser Lösung pipettiert. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte mit einem Deckel versehen und 16 h bei Raumtemperatur inkubiert. b) Waschschritt

Nach der Inkubation wurden die restlichen freien Antikörper durch Waschen entfernt.

Dazu wurde die Platte 3 mal mit 250 μl_ Waschpuffer (50 mM Tris (pH 8,0) + 0,2% Tween 20 in Reinstwasser) je Well gewaschen, wobei die Waschlösungen nach jeweils 30 s Verweil- zeit durch Dekantieren und Ausklopfen der Platte entfernt wurden. c) Blockierschritt

Um spätere unerwünschte Adsorptionen von Bestandteilen aus der Testsubstanz zu vermeiden, wurden evtl. unbeschichtete Flächen in den Mikrotiterplatten mit BSA-Lösung (Bovine Albumin / Sigma / Produkt-Nr. A7906) abgesättigt.

Dazu wurden 200 μl_ des Blockierungspuffers (4% ige BSA-Lösung in 9 Teilen Reinstwasser und einem Teil PBS-Puffer pH 7,2) in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettiert und die Platten 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. d) Waschschritt

Der überschüssige Blockierungspuffer wurde entsprechend Schritt b) entfernt. e) Zugabe der Zellkulturüberstände

Anschließend wurden die Zellkulturüberstände in die beschichtete Mikrotiterplatte gegeben, wo die in den Wells immobilisierten Antikörper das lnterleukin-8 aus der antigenhaltigen Probe spezifisch binden.

Dazu wurden 50 μL Blockierungspuffer je Well vorgelegt, je 50 μl_ der zu untersuchenden Probe zugegeben und das Ganze 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Jede Probe wurde in einer Dreifachbestimmung untersucht. f) Waschschritt

Nach der Antigen-Antikörper-Reaktion wurde ungebundenes Probenmaterial entsprechend Schritt b) aus der Mikrotiterplatte entfernt. g) Inkubation mit Sekundärantikörper

Anschließend wurde ein biotinylierter Sekundärantikörper in die Wells gegeben, der gegen eine andere Determinante des lnterleukins-8 gerichtet ist und an diese bindet.

Die Lösung des sekundären Antikörpers (Biotin mouse anti-human IL-8-Antikörper / Konz. 0,5 mg/mL / BD Biosciences Pharmingen / Produkt-Nr. 554718) wurde dazu mit Blockie- rungspuffer auf eine Konzentration von 1 μg/mL verdünnt. Pro Well wurden 100 μL dieser

Lösung pipettiert und die Mikrotiterplatte 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. h) Waschschritt

Nach der Reaktion wurden die überschüssigen Antikörper entsprechend Schritt b) aus der Mikrotiterplatte entfernt. i) Inkubation mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase

Zuletzt erfolgte die Zugabe des mit Meerrettichperoxidase konjugierten Streptavidins, das an die Biotinmoleküle des sekundären Antikörpers bindet.

Dazu wurde die Streptavidin-HRP-Lösung (Streptavidin-HRP (Horseradish Peroxidase) / Konz. 1 ,25 mg/mL / PiERCE ENDOGEN / Produkt-Nr. 21126) mit Blockierungspuffer auf 0,25 μg/mL verdünnt. Je 100 μl_ dieser Lösung wurden in die Wells pipettiert und das Ganze 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. j) Waschschritt

Nach der Reaktion wurde das überschüssige Enzym entsprechend Schritt b) entfernt. k) Zugabe der Substratlösung 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin

Das als Substrat zugegebene 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin wird von der an die biotinylierten Sekundärantikörper gebundenen Peroxidase zu einem blauen Endprodukt umgesetzt.

Dazu wurden 100 μl_ der Substratlösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin / Sigma / Produkt-Nr. T 0440) pro Well pipettiert und die Mikrotiterplatte 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 M Schwefelsäure beendet. Dies führte zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. I) Detektion

Die optische Dichte der Lösung wurde bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Reader Spectra MAX 340 (Molecular Devices) gemessen. Die IL-8-Konzentration wurde aus der Kalibrierkurve ermittelt.

Beispiel C - Nachweis der Allergie-protektiven Potenz der erfindungsgemäßen Lipopeptide im standardisierten Tiermodell - Methoden

Die vollständige Allergie-protektive Potenz, Aktivität und Wirkung der erfindungsgemäßen Lipopeptide wurde durch immunologische und zellbiologische Funktionsuntersuchungen im standardisierten Tiermodell des allergischen Asthmas bei der Maus in vivo bestimmt. Im folgenden werden zunächst die Methoden zur Sensibilisierung und Induktion von allergischem Asthma bei Mäusen, zur Behandlung mit den Lipopeptid-Lösungen und zur Analyse der allergischen und entzündlichen Reaktionen beschrieben.

Das Behandlungsprotokoll mit dem zeitlichen Ablauf des Modellversuches ist in Fig. 14 gra- phisch dargestellt. a) Sensibilisierung und Induktion von allergischem Asthma bei Mäusen mit Ovalbumin (OVA)

Die Versuchstiere, sieben Wochen alte weibliche Mäuse des Inzuchtstammes BALB/c (CharlesRiver, Sulzfeld), wurden 14 Tage an die Umgebung gewöhnt. Sie hatten nach Belieben Zugriff auf Wasser und Nahrung.

Die Sensibilisierung der Mäuse erfolgte durch zweimalige intraperitoneale Injektion eines

Gemisches von 20 μg Ovalbumin (Grade V / Sigma) und 2,2 mg Aluminiumhydroxid (Imject- Alum/ Pierce) in einem Gesamtvolumen von 200 μl_ PBS-Puffer. Aluminiumhydroxid wurde als Adjuvans verwendet, da von diesem bekannt ist, dass es T _H 2-stimulierte Immunantworten auslöst, die durch die Produktion der Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 und von Antikörpern des Isotyps IgE und IgGI (entsprechend lgG4 beim Menschen) charakterisiert sind.

Um anschließend eine allergische Reaktion in der Lunge der Mäuse hervorzurufen, also das akute allergische Asthma auszulösen, wurden die Mäuse am Tag 28 und Tag 38 jeweils für 20 min mit einem Aerosol einer 1 % igen Ovalbumin-Lösung behandelt. Hierzu wurden die Mäuse in eine 11 L-Plexiglas-Kammer gesetzt, an die ein Pari-Boy-Turbo Aerosol Generator der Firma Pari angeschlossen war.

Nach der zweiten Applikation des OVA-Aerosols konnten bei den Mäusen einige Tage lang die Symptome des akuten allergischen Asthmas diagnostiziert werden:

1) verstärkte Reaktion gegen Methacholin (bronchiale Hyperreaktivität)

2) verstärkte Infiltration von eosinophilen Granulozyten und Lymphozyten in das

Atemwegslumen

3) Produktion von Ovalbumin-spezifischen Antikörpern der Isotypen IgE und IgGI

4) Produktion von lnterleukin-5 nach in vitro ReStimulierung der Milz-Zell-Lymphozyten mit Ovalbumin b) Messung der bronchialen Hyperreaktivität

Ein entscheidender diagnostischer Parameter, um eine allergisch asthmatische Erkrankung sicher zu diagnostizieren, ist die bronchiale Hyperreaktivität. Hierbei handelt es sich um eine Überempfindlichkeit der glatten Muskulatur der Bronchien gegen unspezifische Reizungen. Zur Diagnose beim Menschen werden geringe Konzentrationen Histamin appliziert. An- schließend wird der Atemwegswiderstand gemessen. Asthmatische Personen zeigen eine von der Histaminkonzentration abhängige stärkere Bronchokonstriktion und damit einen höheren Atemwegswiderstand als gesunde Personen.

Zur Provokation bei Mäusen verwendet man anstelle von Histamin Methacholin, da die Bronchien von Mäusen nicht auf Histamin reagieren. Die Mäuse werden in einen Ganz- körper-Plethysmographen (Buxco Electronics), durch dessen Kammern ein kontinuierlicher Luftstrom fließt, gesetzt. Aus den durch die Atmung bedingten Druckänderungen wird für jeden Atemzyklus der sogenannte Penh-Wert berechnet, der mit dem Atemwegswiderstand korreliert. Bei hyperreaktiven Mäusen erhöht sich der Atemwegswiderstand mit der Metha- cholin-Konzentration, was sich durch die Erhöhung des Penh-Wertes ausdrückt.

Die Messung der bronchialen Hyperreaktivität erfolgte 24 Stunden nach der letzten OVA- Aerosol Exposition. Für die Messung wurden die Mäuse nach einer Gewöhnungszeit von 10 min im Plethysmographen 7 min lang mit PBS-Aerosol in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgte jeweils für 7 min die Exposition mit aufsteigenden Methacholin-Konzentrationen (6 mg/mL, 12 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL / Sigma). Der Penh-Wert wurde kontinuierlich gemessen und über Perioden von 30 s gemittelt. Der höchste Penh-Mittelwert einer Konzentrationsstufe wurde dann gegen die Methacholin-Konzentration aufgetragen. Die Fläche unter dieser Dosis-Wirkungs-Kurve ist umso größer, je stärker die Mäuse auf Methacholin reagieren, sie korreliert also mit der Hyperreagibilität der Tiere. Untersuchung der zellulären Zusammensetzung der bronchoalveolären Lavage (BAL)

Die bei gesunden Probanden bzw. unbehandelten Mäusen im Lungengewebe und im Lumen der Atemwege vorgefundenen Leukozyten sind fast ausschließlich Makrophagen. Andere Leukozyten-Typen sind in der Regel nicht nachweisbar. Im Zusammenhang mit allergischem Asthma kommt es aus noch nicht ganz geklärten Ursachen zur massiven Infiltration der Atemwege durch eosinophile Granulozyten und in geringerem Maße durch Lymphozyten und Neutrophile.

Um die Zusammensetzung des Leukozyten-Infiltrats in den Atemwegen zu untersuchen, wurden die Mäuse drei Tage nach der letzten OVA-Aerosol Exposition getötet. Die Trachea wurde freigelegt und das Lumen der Atemwege über eine 24G Venen-Verweilkanüle zwei- mal mit jeweils 1 mL isotonischem Puffer gewaschen (bronchoalveoläre Lavage). Die Gesamtzahl der Leukozyten, die auf diese Weise aus der Lunge herausgespült wurden, wurde mittels Neubauer Zählkammer mikroskopisch ausgezählt.

Anschließend wurden die Leukozyten mit einer Zyto-Zentrifuge der Firma Shandon auf Objektträger zentrifugiert und mit dem HAEME-Schnellfärbungs-Kit der Firma Labor+Technik Eberhard Lehmann, wie in der Produktbeilage beschrieben, angefärbt. Nach erfolgter Fär- bung wurden 300 Zellen auf dem Objektträger mikroskopisch ausgezählt und nach den gängigen Kriterien in die unterschiedlichen Leukozyten-Subpopulationen eingeteilt. d) Messung von OVA-spezifischen Antikörpern des Isotyps IgE, IgGI und lgG2a

Die Sensibilisierung gegen ein Allergen kann durch die Bestimmung von Allergen-spezifi- sehen Antikörpern der Klassen IgGI , lgG2a und IgE gemessen werden, zu deren Quantifizierung ein Labor-internes Standard-Serum verwendet wird. Im verwendeten murinen Allergiemodell korreliert der Anstieg des spezifischen Immunglobulin-Titers jedoch auch mit dem Anstieg der Gesamt-Immunglobulin-Konzentration, wie bereits in der Literatur gezeigt wurde. Daher wurden zur Beschreibung des Sensibilisierungs-Grades die Gesamt-Immunglobu- lin-Titer mittels kommerziell erhältlicher„Sandwich"-ELISA Testsysteme quantifiziert. Für die

Messung von IgE wurde ein optE I A Testsystem der Firma BD Biosciences eingesetzt. Für die Bestimmung von IgGI und lgG2a wurden Testsysteme der Firma Bethyl-Laboratories verwendet. Die Testdurchführung richtete sich nach den Herstellerangaben.

Zur Bestimmung der Antikörper im Serum der Mäuse wurde den Mäusen zwei Tage nach der letzten Applikation von OVA-Aerosol Blut aus der Schwanzvene entnommen. Nach dem

Gerinnen des Bluts wurde das Serum durch Zentrifugation gewonnen. Zur Bestimmung der Antikörper in der BAL-Flüssigkeit der Mäuse wurde diese, wie oben beschrieben, gewonnen.

Zur Quantifizierung wurde auf jeder ELISA-Platte eine Verdünnungsreihe eines Standard- Serums mit bekannten IgGI-, lgG2a- bzw. IgE-Konzentrationen mitgeführt. Durch den Ver- gleich der Messwerte für die unbekannten Proben mit denen des Standards, kann die Konzentration in den Serum- und BAL- Proben berechnet werden. e) Messung der in vitro IL-5 Produktion von Milz-Zellen nach Restimulation mit OVA

Die Eosinophilie in den Atemwegen, als Folge der allergischen Sensibilisierung, ist von der Sekretion von T _H 2-Typ-Zytokinen, speziell IL-5, durch die Lymphozyten abhängig. Somit kor- reliert die Ausschüttung von IL-5 mit der Intensität der eosinophilen Atemwegsinflammation.

In den Atemwegen gesunder Tiere wird kein IL-5 produziert.

Um die Fähigkeit der Milz-Zellen zur Produktion des Zytokines IL-5 zu bestimmen, wurden die Mäuse drei Tage nach der letzten OVA-Aerosol Exposition getötet und die Milz entnommen. Durch mechanische Zerkleinerung wurde daraus eine Zellsuspension erzeugt. Die Ery- throzyten wurden aufgelöst. Die Milz-Zellen wurden dann in einem Zellkulturmedium (RPMI-

1640 mit 10% fetal calf serum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Strepto- mycin / alle Biochrom) inkubiert (Zelldichte 5 x 10 ⁶ Zellen pro mL Medium).

Zur Stimulation der spezifischen Zytokin-Produktion wurde OVA bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/mL zugegeben. Nach 48 h Inkubation wurden die Überstände entnommen und die IL-5-Konzentration mit einem optEIA-Kit (BD Biosciences) entsprechend der Produktbeschreibung bestimmt. f) Behandlung von Mäusen mit Lipopeptid-Lösungen über die Atemwege

Die Lipopeptide wurden in DMSO zu einer 5 mg/ml_ enthaltenden Stammlösung gelöst und anschließend mit PBS-Puffer auf die benötigten Konzentrationen (0,1 mg/mL, 0,4 mg/mL,

1 mg/mL) verdünnt.

Um einen Dosis-abhängigen Effekt der immunstimulatorischen Wirkung zu erfassen, wurden Gruppen gebildet, die mit unterschiedlichen Dosen des Lipopeptides (5 μg, 20 μg, 50 μg) behandelt wurden. Pro Konzentrationsstufe wurden 5 Tiere behandelt. Eine Kontrollgruppe (5 Tiere) wurde mit einer Lipopeptid-freien DMSO-Lösung (4% ig in PBS-Puffer), eine weitere

(5 Tiere) mit reinem PBS-Puffer anstelle des Lipopeptides behandelt.

Die erfindungsgemäßen Lipopeptide wurden den Mäusen intranasal in gelöster Form appliziert. Hierzu wurden die Tiere mit einem Gemisch aus Ketamin und Rompun narkotisiert. Anschließend wurden je 50 μL Lösung pro Tier intranasal appliziert.

Die Behandlungen erfolgten parallel zur Sensibilisierung mit OVA, insgesamt 14 mal zu den im Behandlungsschema (Fig. 14) spezifizierten Zeitpunkten. g) Statistische Auswertung

Die Ergebnisse der Versuche wurden mit Hilfe der Methoden der robusten Statistik ausgewertet. Die Signifikanz der erzielten Effekte wurde mit dem Mann-Whitney-U-Test geprüft. In den Diagrammen wurden die Einzelwerte sowie der Median dargestellt.

Beispiel D - Nachweis der Allergie-protektiven Potenz der erfindungsgemäßen Lipopeptide im standardisierten Tiermodell - Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Lipopeptide bei der Behandlung allergischer Erkrankungen zu zeigen, wurden diese im standardisierten Mausmodell für allergisches Asthma mit den im Ausführungsbeispiel C beschriebenen Methoden getestet. Beispielhaft für die erfindungsgemäßen Lipopeptide werden hier die Effekte einer Behandlung mit F?R-Pam ₃ Cys- AQEKEAKSELDYD (LPM, SEQ ID NO: 3) dargestellt. a) Asthma-Symptome

Der am weitesten gehende Versuch zum Nachweis der biologischen Wirkung der erfin- dungsgemäßen Lipopeptide ist die Untersuchung der durch das OVA-Aerosol ausgelösten

Asthma-Symptome, speziell der bronchialen Hyperreaktivität. Fig. 15 zeigt, dass die allergiebedingte Empfindlichkeit der Atemwege bei den asthmatischen Mäusen durch die parallel zur OVA-Sensibilisierung erfolgte Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Lipopeptid stark abgesenkt werden konnte. Der größte Effekt konnte bei einer Lipopeptid-Dosis von 5 μg erzielt werden.

Dieses Ergebnis weist daraufhin, dass das Lipopeptid schon in niedriger Konzentration äußerst wirksam zur Prävention und Behandlung von allergischen Erkrankungen eingesetzt werden kann. Zu hohe Dosierungen schränken den Erfolg durch zusätzliche Reizungen der Atemwege geringfügig ein. Jedoch ist auch bei 50 μg Lipopeptid noch eine deutliche Verminderung der Asthma-Symptome gegenüber der Kontrollgruppe erkennbar. Entzündung in den Bronchien und Leukozyten

Bei asthmatischen Mäusen reflektieren eosinophile Granulozyten in den Bronchien, zusätzlich zur bronchialen Hyperreaktivität, den Zustand einer Atemwegsinflammation. Bei sensibilisierten Mäusen nimmt ihre Anzahl stark zu, während sie bei gesunden Mäusen in den Atemwegen nicht nachweisbar sind.

Fig. 16 belegt, dass durch die Behandlung der Mäuse mit dem erfindungsgemäßen Lipopeptid die Zahl der in die Lungenflüssigkeit infiltrierenden eosinophilen Granulozyten stark reduziert werden kann. Bei allen Applikations-Dosen sind diese nur noch geringfügig in der BAL zu finden.

In Folge der Sensibilisierung wurden auch einige Lymphozyten, die bei gesunden, nicht sen- stilisierten Mäusen ebenfalls nicht nachweisbar sind, in die Atemwege infiltriert. Durch die

Behandlung mit den Lipopeptid-Lösungen war ein leichter Rückgang der ausgeschütteten Zellen dieses Leukozyten-Typs erkennbar (Fig. 17).

Dagegen sind durch die Lipopeptid-Behandlung vermehrt neutrophile Granulozyten als Teil der T _N 1 -vermittelten angeborenen schnellen Immunabwehr in den Atemwegen nachweisbar. Auf die Behandlung mit PBS oder der DMSO-Kontroll-Lösung reagierten die Neutrophilen der sensibilisierten Mäuse nicht (Fig. 18).

Makrophagen, die einerseits Fremderreger beseitigen und andererseits durch die Antigen- präsentation auch die adaptive Immunantwort in Gang setzen, sind bei gesunden Tieren der einzige stets nachweisbare Leukozyten-Subtyp. Ihre Anzahl ist in Folge der Sensibilisierung nur unwesentlich erhöht. Zwischen den mit den Lipopeptid-Lösungen behandelten Tieren und den Kontrollgruppen war kein signifikanter Unterschied nachweisbar (Fig. 19). c) allergische Sensibilisierung

Die Asthma-Symptome bei den Mäusen wurden durch die Sensibilisierung mit einem Allergen ausgelöst, was zu einer Bildung Allergen-spezifischer IgE-Antikörper führt.

Fig. 20 und Fig. 21 zeigen, dass die Intensität der Sensibilisierung als Vorstufe der akuten allergischen Erkrankung, durch die erfindungsgemäßen Lipopeptide beeinflusst werden kann. Die Konzentration der IgE Antikörper in der BAL konnte durch die Lipopeptid-Behand- lung stark reduziert werden. Der größte Effekt wurde wieder für die niedrigste Lipopeptid- Dosis beobachtet. Auf den IgE-Spiegel im Serum hat die Behandlung dagegen nur einen geringen Effekt.

Offensichtlich wirken die angewandten Lipopeptid-Lösungen vorzugsweise lokal. Dies legt die Inhalation der erfindungsgemäßen Lipopeptide als wirksamste Applikationsform nahe.

Ein signifikanter Einfluss der Lipopeptid-Behandlung auf die Ausschüttung der IgGI -Antikörper als Teil der T _H 2-stimulierten Immunantwort konnte sowohl im Serum als auch in der BAL nicht festgestellt werden (Fig. 22, Fig. 23).

Der Einfluss auf die lgG2a-Antikörper als Teil der T _H 1 -stimulierten Immunantwort war in der

BAL und im Serum vergleichbar (Fig. 24, Fig. 25). Die durch die Lipopeptide bewirkte geringfügig erhöhte Ausschüttung konnte erwartet werden, da hiermit bakterielle Komponenten simuliert werden. d) IL-5 Produktion durch die Milz-Zellen (in vitro)

Die Ausschüttung der Eosinophilia in das Lumen der Atemwege als Folge der allergischen

Sensibilisierung ist von der Sekretion von T _H 2-Typ-Zytokinen, speziell IL-5, durch die Lymphozyten abhängig. Die Ausschüttung von IL-5 korreliert damit mit der Intensität der eosinophilen Entzündungsreaktion. Die Immunzellen von nicht sensibilisierten Tieren schütten kein IL-5 aus.

Wie auch bei der Sekretion der Eosinophilia in die Lungenflüssigkeit konnte die IL-5 Produktion der Milz-Zellen durch die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Lipopeptiden nahezu gestoppt werden (Fig. 26). Die effektivste Wirkung konnte bei den Applikationsmengen 5 μg und 20 μg erzielt werden.

Insgesamt konnte durch die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Lipopeptiden die allergische Reaktion gegen das OVA deutlich eingedämmt werden. Dabei korrelieren die biochemischen Effekte ausgezeichnet mit den phänomenologischen Beobachtungen.