[0001] 本发明涉及刺激响应载体领域， 尤其涉及一种含偶氮苯衍生物的脂质体及其制 备方法和应用。

背景技术

[0002] 纳米技术的突破对多个行业产生了重要的影响 ， 尤其是对材料科学、 生物技术 和药物治疗。 不同的纳米载体， 如脂质体、 聚合物、 胶束和碳基纳米材料正逐 渐应用到医学领域， 例如治疗性药物大分子的运输 （药物和基因） 。 但是， 目 前治疗性药物大分子的运输仍面临着很大的挑 战， 因为我们所需要的药物运输 体系最好能够实现药物的定吋、 定点和定量释放。 对用于药物运输体系， 目前 已经有一定的研究， 例如： 通过智能化微米 /纳米粒子 （MNPs) 来实现。 所述 M NPs是指能够以某种具体的方式响应外部 /内部刺激， 进而实现内部药物的可控释 放的微米 /纳米粒子的总称。 光照由于其强度、 波长、 照射吋间等参数可以精确 调节， 并且对生物体是非侵入性的， 所以， 能够对光刺激进行响应的 MNPs具有 广阔的应用前景。

[0003] 因此， 需要一种能够对光刺激进行响应的含偶氮苯衍 生物的脂质体。

技术问题

[0004] 本发明的目的在于提供了一种含偶氮苯衍生物 的脂质体及其制备方法和应用， 所述含偶氮苯衍生物的脂质体能够对光刺激进 行响应。

问题的解决方案

技术解决方案

[0005] 为实现上述目的， 本发明提供了一种含偶氮苯衍生物的脂质体， 所述含偶氮苯 衍生物的脂质体中的偶氮苯衍生物、 磷脂和胆固醇的摩尔比为： 1-2： 1-2： 1-2

[0006] 所述偶氮苯衍生物的结构式如下：

[0007] 其中， 1^为。1~6的直链烷基； 1 ₂ 为。12~16的直链疏水性烷基； X为： 0或 NH

[0008] 其中， 所述含偶氮苯衍生物的脂质体还包括： 包封在所述含偶氮苯衍生物的脂 质体内的药物。

[0009] 其中， 所述药物为阿霉素。

[0010]

[0011] 为了进一步实现发明目的， 本发明还提供了一种含偶氮苯衍生物的脂质体 的制 备方法， 所述偶氮苯衍生物的结构式如下：

[0012] 其中， 1^为。1~6的直链烷基； 1 ₂ 为。12~16的直链疏水性烷基； X为： 0或 NH

[0013] 所述含偶氮苯衍生物的脂质体的制备方法包括 以下步骤：

[0014] A、 将摩尔比为： 1~2： 1-2： 1~2的偶氮苯衍生物、 磷脂和胆固醇溶于有机溶 剂中， 旋干， 得脂质薄膜；

[0015] B、 加入水化试剂， 然后进行超声处理， 得含偶氮苯衍生物的脂质体。

[0016] 其中， 所述有机溶剂为按 2: 1体积比配置的氯仿和甲醇混合液。

[0017] 其中， 所述水化试剂为 pH = 7.4的柠檬酸溶液或 pH = 7.4的磷酸缓冲液。 [0018] 其中， 所述步骤 B具体为：

[0019] 在瓶壁上有脂质薄膜的瓶中加入适量水化试剂 ， 用探头式超声波细胞破碎仪超 声 10~40min， 然后静置于 25~42°C环境中， 得含偶氮苯衍生物的脂质体悬液。

[0020] 其中， 所述含偶氮苯衍生物的脂质体的制备方法还包 括以下步骤：

[0021] C、 利用 pH梯度法， 将阿霉素包封在含偶氮苯衍生物的脂质体中， 得内包阿霉 素的含偶氮苯衍生物的脂质体。

[0022] 其中， 所述步骤 C具体为：

[0023] 将阿霉素加入至含偶氮苯衍生物的脂质体悬液 中， 充分溶解， 然后用 NaOH调 p H至 7.4， 8 000~12 000g离心， 所得上层液体即为内包阿霉素的含偶氮苯衍生 物 的脂质体。

[0024] 为了进一步实现本发明的目的， 本发明还提供了上述含偶氮苯衍生物的脂质体 在制备药物过程中的应用。

发明的有益效果

有益效果

[0025] 本发明的含偶氮苯衍生物的脂质体能够对紫外 光进行响应， 当所述含偶氮苯衍 生物的脂质体包封有药物吋， 可通过紫外线的照射来实现该含偶氮苯衍生物 的 脂质体内部药物的可控释放， 从而减轻药物的副作用， 提高治疗效果。 本发明 的含偶氮苯衍生物的脂质体的制备方法简单， 效率高。

对附图的简要说明

附图说明

[0026] 图 1是本发明第一具体制备实施例制备所得偶氮� �衍生物的结构式。

[0027] 图 2是本发明第二具体制备实施例制备所得偶氮� �衍生物的结构式。

[0028] 图 3是本发明第三具体制备实施例制备所得偶氮� �衍生物的结构式。

[0029] 图 4是本发明第三具体制备实施例制备所得偶氮� �衍生物在经紫外光照射后的 紫外-可见吸收光谱变化图。

[0030] 图 5是本发明第四具体制备实施例制备所得内包� �霉素的含偶氮苯衍生物的脂 质体的光控释放曲线。 实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0031] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细 说明， 以下实施例是对本发明的 解释， 本发明并不局限于以下实施例。

[0032] 在本发明的第一实施例中， 一种偶氮苯衍生物， 结构式如下图 1所示：

[0033] 其中， 1^为。1~6的直链烷基； 1 ₂ 为。12~16的直链疏水性烷基； X为： 0或 NH

[0034] 本发明的偶氮苯衍生物的一端的直链疏水性烷 基链能够插入脂质体的磷脂双分 子层中， 另一端的亲水性阳离子季铵盐基团则能朝向磷 脂双分子层膜外的水溶 液， 从而在脂质体中形成规律性的排布。 本发明的偶氮苯衍生物在紫外光照射 下可以发生可逆的构象改变， 在未经紫外线照射吋， 保持反式构型， 经紫外线 照射后， 变换成顺式构型。

[0035] 优选的， 所述 1^为。2~4的直链烷基， 即， 乙烷基、 丙烷基或正丁烷基。

[0036] 优选的， 所述 1^ ₂ 为。12、 C14或 C16的直链疏水性烷基。

[0037]

[0038] 在本发明的第二实施例中， 一种制备上述偶氮苯衍生物的方法， 包括以下步骤 [0039] A、 使化合物 1和化合物 2反应， 得化合物 3 ;

[0040] B、 将化合物 3和 N-溴代琥珀酰亚胺在惰性气体氛围下溶于四氯� ��烷并在过氧化 苯甲酰的催化下发生溴化反应， 得化合物 4;

[0041] C、 使化合物 4与第一底物反应， 得所述偶氮苯衍生物；

[0042] 所述化合物 1的结构式如下：

[0043] 所述化合物 2的结构式如下: 所述化合物 3的结构式如下:

所述化合物 4的结构式如下:

[0046] 所述 X ,为 OH或 NH ₂ ；

[0047] 所述 X ₂ 为与 X ,反应形成 X的 COOH或 COC1;

[0048] 所述第一底物的结构式为：

[0049] 需要说明的是， 所述惰性气体包括氦气、 氩气、 氖气或氙气中的至少一种。

[0050] 在本发明的一具体实施例中， 所述 X ₁ 为NH _2; 所述 ₂ 为。00; 所述步骤 A包 括以下步骤：

[0051] Al、 将化合物 1溶于二氯甲烷， 然后加入三乙胺， 得第一反应溶液；

[0052] A2、 将化合物 2溶于二氯甲烷， 得第二反应溶液；

[0053] A3、 将第二反应溶液滴入第一反应溶液中， 常温搅拌过夜；

[0054] A4、 除去步骤 A3的产物中的二氯甲烷， 得固体；

[0055] A5、 将固体溶于二氯甲烷， 并通过柱层析进行分离纯化， 所述流动相为按 1:1 体积比配制的石油醚和二氯甲烷混合液， 得化合物 3。

需要说明的是， 在所述步骤 A中， 二氯甲烷主要作为反应溶剂， 三丁胺为催化 剂； 步骤 A4可通过真空干燥或旋蒸实现。 另外， 在本方案中， 化合物 1中的 NH ₂ 和化合物 2中的 COC1反应， 从而生成化合物 3， 这种方法与通过化合物中的 OH或 ΝΗ ^Π化合物 2中的 COOH反应生成化合物 3的方法相比， 反应效率更高， 制备得 到化合物 3的得率更高。

[0057] 在上一具体实施例的基础上， 本发明提出另一具体实施例， 所述步骤 Α还包括 以下步骤：

[0058] A0、 将正十二烷酸加入氯化亚砜， 加热至 60-70°C， 搅拌过夜， 进而除去未反 应的氯化亚砜， 得化合物 2。

[0059] 需要说明的是， 步骤 AO中可通过真空干燥或旋蒸等方法除去氯化亚� ��。

[0060] 在本发明的另一具体实施例中， 所述步骤 B包括以下步骤：

[0061] Bl、 将化合物 3、 N-溴代琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰在氩气氛围� ��溶于四氯甲 烷， 加热回流反应 12-72小吋；

[0062] B2、 将反应体系冷却至 0°C， 抽滤得粉末；

[0063] B3、 用乙醚洗涤粉末， 得化合物 4。

[0064] 需要说明的是， 步骤 B1中的过氧化苯甲酰为催化剂； 步骤 B2抽滤所得粉末为 化合物 4的粗产物； 步骤 B3中用乙醚洗涤粉末， 主要是通过乙醚将未反应的杂质 去除， 从而起到纯化的作用。 [0065] 在本发明的另一具体实施例中， 所述步骤 C包括以下步骤：

[0066] Cl、 将化合物 4溶于乙醇， 再加入第一底物， 回流反应 6-48小吋；

[0067] C2、 将步骤 C1的产物蒸干， 再用按 5: 1体积比配制的乙醚和二氯甲烷混合液溶 解， 过滤收集固体沉淀。

[0068] 需要说明的是， 步骤 C2中， 可通过旋蒸将步骤 C1的产物蒸干； 步骤 C2所得固 体沉淀为本发明所述偶氮苯衍生物的粗产物。

[0069] 基于上一具体实施例， 本发明提出另一具体实施例， 所述步骤 C还包括以下步 骤：

[0070] C3、 用按 5: 1体积比配制的乙醚和二氯甲烷混合液洗涤固� �沉淀， 得所述偶氮 苯衍生物。

[0071] 需要说明的是， 所述按 5: 1体积比配制的乙醚和二氯甲烷混合液能够溶� �未发 生反应的杂质， 从而起到提纯的作用。

[0072]

[0073] 在本发明的第一具体制备实施例中， 所述偶氮苯衍生物的结构式如图 1所示， 该偶氮苯衍生物的制备方法包括以下步骤：

[0074] SOU 使化合物 1 (4-甲基 -4'羟基偶氮苯） 与化合物 2 (正十四烷酸） 在浓硫酸 的催化和加热条件下发生脂化反应， 生成化合物 3 (4-甲基 -4'正十四烷酸偶氮苯 酯） ；

[0075] S02、 将 4-甲基 -4'正十四烷酸偶氮苯酯、 N-溴代琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰在 氩气氛围下溶于四氯甲烷， 加热回流反应 24小吋；

[0076] S03、 将步骤 S02的反应体系冷却至 0°C， 抽滤得粉末；

[0077] S04、 用乙醚洗涤步骤 S03所得粉末， 除去未反应的杂质， 得化合物 4 (4-溴甲 基 -4'正十四烷酸偶氮苯酯） ；

[0078] S05、 将 4-溴甲基 -4'正十四烷酸偶氮苯酯溶于乙醇， 然后加入三乙胺， 回流反 应 12小吋；

[0079] S06、 将溶液蒸干， 再用按 5: 1体积比配制的乙醚和二氯甲烷混合液溶解， 过滤 收集固体沉淀， 即得图 1所示偶氮苯衍生物， 即 4- (Ν,Ν,Ν-三乙胺甲基溴化物） - 4'-正十四烷酸偶氮苯酯。 [0080]

[0081] 在本发明的第二具体制备实施例中， 所述偶氮苯衍生物的结构式如图 2所示， 该偶氮苯衍生物的制备方法包括以下步骤：

[0082] SO 使化合物 1 (4-甲基 -4'羟基偶氮苯） 与化合物 2 (正十六烷酸） 在浓硫酸 的催化以及加热条件下发生脂化反应， 生成化合物 3 (4-甲基 -4'-正十六烷酸偶氮 苯酯） ；

[0083] S02、 将 4-甲基 -4'-正十六烷酸偶氮苯酯、 N-溴代琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰在 氩气氛围下溶于四氯甲烷， 加热回流反应 48小吋；

[0084] S03、 将步骤 S02的反应体系冷却至 0°C， 抽滤得粉末；

[0085] S04、 用乙醚洗涤步骤 S03所得粉末， 除去未反应的杂质， 得化合物 4 (4-溴甲 基—4'_正十六烷酸偶氮苯酯） ；

[0086] S05、 将 4-溴甲基 -4'-正十六烷酸偶氮苯酯溶于乙醇， 然后加入三甲胺， 回流反 应 24小吋；

[0087] S06、 将溶液蒸干， 再用按 5: 1体积比配制的乙醚和二氯甲烷混合液溶解， 过滤 收集固体沉淀， 即粗产物。

[0088] S07、 用按 5: 1体积比配制的乙醚和二氯甲烷混合液洗涤固� �沉淀 3次， 得图 2所 示偶氮苯衍生物， 即 4- (Ν,Ν,Ν-三甲胺甲基溴化物） -4'-正十六烷酸偶氮苯酯。

[0089]

[0090] 在本发明的第三具体制备实施例中， 所述偶氮苯衍生物的结构式如图 3所示， 该偶氮苯衍生物的制备方法包括以下步骤：

[0091] S01、 将 2g正十二烷酸加入 10mL氯化亚砜中， 65°C搅拌过夜， 旋蒸出去未反应 得氯化亚砜， 得到 2g无色油状粗产物， 即化合物 2 (正十二酰氯） ；

[0092] S02、 将 0.62g化合物 1 (4-甲基 -4'氨基偶氮苯） 溶于 20mL二氯甲烷， 然后加入 0

.59g三乙胺， 得第一反应溶液；

[0093] S03、 将 0.97g无色油状粗产物 （正十二酰氯） 溶于 5mL二氯甲烷， 得第二反应 溶液；

[0094] S04、 将第二反应溶液慢慢滴入第一反应溶液中， 25°C搅拌过夜；

[0095] S05、 真空干燥除去步骤 S04的产物中的二氯甲烷， 得黄色固体； [0096] S06、 用二氯甲烷溶解步骤 S05所得黄色固体， 同吋加入 200-300目的硅胶搅拌

， 旋蒸除去二氯甲烷后上样， 加流动相进行柱层析， 所述流动相为按 1:1体积比 配制的石油醚和二氯甲烷混合液； 得纯化后的化合物 3 (4-甲基 -4'正十二酰氨基 偶氮苯） 1.12g;

[0097] S07、 将 0.5g 4-甲基 -4'正十二酰氨基偶氮苯、 0.34g N-溴代琥珀酰亚胺和 15mg 过氧化苯甲酰在氩气氛围下溶于四氯甲烷， 加热回流反应 48小吋；

[0098] S08、 将步骤 S07产物冷却至 0°C， 抽滤得黄色粉末；

[0099] S09、 用乙醚洗涤黄色粉末， 除去未反应的杂质， 得化合物 4 (4-溴甲基 -4'-正 十二酰氨基偶氮苯） ；

[0100] S10、 将 250mg 4-溴甲基 -4，-正十二酰氨基偶氮苯溶于 6mL乙醇， 然后加入 lmL 三丁胺和 2mL乙醇， 回流反应 24小吋；

[0101] Sl l、 将步骤 S10的产物蒸干， 再用 20mL按 5:1体积比配制的乙醚和二氯甲烷混 合液溶解， 过滤收集橘黄色固体沉淀；

[0102] S12、 用 20mL按 5:1体积比配制的乙醚和二氯甲烷混合液洗涤橘 黄色固体沉淀三 次， 得 120mg图 3所示偶氮苯衍生物， 即 4- (Ν,Ν,Ν-三丁胺甲基溴化物） -4'-正十 二酰氨基偶氮苯。

[0103]

[0104] 为了进一步证明本发明的偶氮苯衍生物的光响 应特性， 本发明的发明人设计了 以下试验， 以氯仿或乙醇为溶剂， 将所述偶氮苯衍生物配置成约 Ιμηιοΐ/L的溶液 ， 并测定其紫外可见吸收光谱， 然后用紫外光照射不同的吋间， 测各个吋间点 的吸收光谱， 然后按不同的紫外光照射吋间， 分别作吸光度和波长的曲线。 其 中， 以第三具体实施例所得偶氮苯衍生物的结果如 图 4所示。 如图 4所示， 随着 紫外线照射吋间的延长， 该偶氮苯衍生物在 350nm处的吸光度值不断降低， 说明 该偶氮苯衍生物可以发生快速的反式 -顺式异构， 可作为一种光控幵关。

[0105] 需要说明的是， 本发明的其他偶氮苯衍生物， 例如上述第一具体制备实施例、 第二具体制备实施例中所得的偶氮苯衍生物， 在上述试验中的结果与图 4类似 （ 图未示） ， 说明本发明的偶氮苯衍生物可以发生快速的反 式 -顺式异构， 可作为 一种光控幵关。 [0107] 在本发明的第三实施例中， 一种制备含上述偶氮苯衍生物的脂质体的方法 ， 包 括以下步骤：

[0108] A、 将摩尔比为： 1~2： 1-2： 1~2的偶氮苯衍生物、 磷脂和胆固醇溶于有机溶 剂中， 旋干， 得脂质薄膜；

[0109] B、 加入水化试剂， 然后进行超声处理， 得含偶氮苯衍生物的脂质体。

[0110] 需要说明的是， 在第三实施例中， 所述磷脂为磷脂酰胆碱、 磷脂酰乙醇胺、 磷 脂酸、 磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰甘油、 磷脂酰肌醇、 或它们的任意组合物。 所述 机溶剂包括氯仿、 二氯甲烷、 甲醇、 乙醇和乙醚中的至少一种。 所述水化试剂 用于给含偶氮苯衍生物的脂质体提供稳定的环 境， 形成脂质体悬液。

[0111] 第三实施例中通过超声分散法制备含偶氮苯衍 生物的脂质体， 制备方法简单， 效率高。

[0112] 若要制备包封有药物的含上述偶氮苯衍生物的 脂质体， 根据药物性质的不同， 可在第三实施例的方法的基础上， 通过不同的处理获得。

[0113] 在本发明的一个实施例中， 当药物为水溶性药物吋， 可将适量的药物溶于活性 溶液中， 例如 pH=7.4的磷酸盐缓冲液 （PBS) ， 然后将该溶液加入瓶壁上有脂质 薄膜的瓶中， 用探头式超声波细胞破碎仪超声 10~40min， 然后静置于 25~42°C环 境中静置 1~6小吋。 将所得产物加入透析袋中， 并在 pH=7.4的磷酸盐缓冲液 （PB S) 中透析， 除去未被包封的药物， 最终获得内包药物的含偶氮苯衍生物的脂质 体悬液。

[0114] 需要说明的是， 本实施例中， 所述溶有药物的活性溶液的量， 可根据瓶中瓶壁 上的脂质薄膜的覆盖范围进行调整； 所述透析袋的分子量大小根据药物的分子 量进行选择。

[0115] 在本发明的另一个实施例中， 当药物为脂溶性药物， 例如阿霉素吋， 可将适量 的 300 mM的柠檬酸溶液 （pH = 7.4) 加入瓶壁上有脂质薄膜的瓶中， 用探头式超 声波细胞破碎仪超声 10~40min， 然后静置于 25~42°C环境中静置 1~6小吋。 然后 用 pH梯度法包封阿霉素 （DOX) ， 获得内包阿霉素的含偶氮苯衍生物的脂质体 悬液。 [0116] 需要说明的是， 本发明所述的内包药物可为水溶性药物， 例如： 盐酸吉西他滨 、 卡铂、 盐酸阿糖胞苷、 盐酸氮芥、 盐酸米托蒽醌； 也可为脂溶性药物， 例如 阿霉素、 紫杉醇等。

[0117]

[0118] 在本发明的第四具体制备实施例中， 所述偶氮苯衍生物为上述第三具体制备实 施例制备所得的产物； 所述药物为阿霉素。

[0119] 1) 将磷脂、 胆固醇、 偶氮苯衍生物按照 1:1:1的摩尔比 （各 0.02mmol) —起溶 于按 2:1体积比配置的 20mL氯仿和甲醇混合液， 充分溶解后， 在 37 °C恒温水浴下 用旋转蒸发器除去有机溶剂， 圆底烧瓶底形成一层均匀脂质薄膜。

[0120] 2) 然后加入 10 mL， 300 mM的柠檬酸溶液 （pH = 7.4) ， 将脂质薄膜水化下来 ， 接着用探头式超声波细胞破碎仪超声 30 min (功率 100mW， on 30s , off 30s) ， 然后置于 37 °C水浴中放置 2小吋以完成封闭过程， 所得即为脂质体悬液。

[0121] 3) 用 pH梯度法包封阿霉素 （DOX) ： 称取 2 mg DOX， 加入到脂质体悬液中 ， 充分溶解， 用 l.O M NaOH调 pH至 7.4。 将脂质体溶液 10 000 g离心 10 min， 除 去超声过程中探头上掉下来的钛颗粒以及未分 散的脂质， 上层液体即为内包阿 霉素的含偶氮苯衍生物的脂质体悬液。

[0122]

[0123] 为了验证所得内包阿霉素的光响应脂质体的光 控释放效果， 本发明的发明人设 计了另外一个验证试验。

[0124] 实验组： 将第四具体制备实施例制备的内包阿霉素的含 偶氮苯衍生物的脂质体 悬液 5mL分散在 45mL pH=7.4的 PBS缓冲液中， 然后将所得的溶液放置在黑暗环 境中， 每小吋用紫外光照射 10min， 每 2个小吋测定一次 PBS缓冲液中被释放出的 阿霉素含量。

[0125] 对照组： 将第四具体制备实施例制备的内包阿霉素的光 响应脂质体 5mL分散在 45mL pH=7.4的 PBS缓冲液中， 然后将所得的溶液放置在黑暗环境中， 同样每 2个 小吋测定一次 PBS缓冲液中被释放出的阿霉素含量。

[0126] 实验组、 对照组各做 3个重复。

[0127] 以每个吋间点 PBS缓冲液中被释放出的阿霉素含量与该 PBS缓冲液中的总阿霉 素量的比值为纵坐标， 吋间为横坐标， 作曲线， 结果如图 5所示。

[0128] 如图 5所示， 在紫外线光照下， 内包阿霉素的光响应脂质体的磷脂双分子层中 的偶氮苯化合物发生反式 -顺式异构， 对磷脂膜造成扰动， 并在磷脂双分子层中 形成通道， 进而使得阿霉素被释放出， 加速内包阿霉素的光响应脂质体内部的 阿霉素的释放。

[0129] 因此， 本发明的偶氮苯化合物能够对光刺激进行响应 ， 基于本发明的偶氮苯化 合物制备的含偶氮苯衍生物的脂质体可制备成 内包药物的 MNPs， 具有广阔的应 用前景。

[0130]

[0131] 以上仅为本发明的优选实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利用本 发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效 流程变换， 或直接或间接运用在 其他相关的技术领域， 均同理包括在本发明的专利保护范围内。

工业实用性

[0132] 本发明的含偶氮苯衍生物的脂质体能够对紫外 光进行响应， 当所述含偶氮苯衍 生物的脂质体包封有药物吋， 可通过紫外线的照射来实现该含偶氮苯衍生物 的 脂质体内部药物的可控释放， 从而减轻药物的副作用， 提高治疗效果。 本发明 的含偶氮苯衍生物的脂质体的制备方法简单， 效率高。