ZHANG QUAN (CN)
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CHENGDU YIPING MEDICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO LTD (CN)
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| CN1737956A | 2006-02-22 | |||
| CN1706865A | 2005-12-14 | |||
| US5200270A | 1993-04-06 | |||
| JPH01179401A | 1989-07-17 |
中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 (CN)
| 权利要求 1. 一种磁性复合物， 其以纳米级的 Fe304粒子为内核， 外层为 下面的式 1所示的化合物， 上面的式 1中， Z 为选自如下的一个或多个相同或不o -l 同的化学功能团或功能 片段： 聚碱性氨基酸、 碱性氨基酸数目的含量大于 50 %的氨基酸 片段、 连接有荧光标记物的聚碱性氨基酸、 抗癌药物、 生物素、 转铁蛋白、 甲基； b为选自如下的生物功能团与嵌段共聚物的连接键：酯键（一 C00- ) 、 酰胺键（一 CON ―， R,= H , CH3， 或- CH2 - ) 、 二硫 键（― S—S— ) 、 醚键（—0— ) 、 ， CH3， 或 CH3CH2 ) 、 1， 3-三氮唑环 （ ； 式 1 中包含嵌段共聚物的结构， 第一嵌段为聚乙二醇， 其平 均聚合度 X为 1 - 300; 第二嵌段为聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙烯酸甘油单酯， y = 1 - 500 , r-H或 CH3， 其中第二嵌段与 Fe304粒子内核表面结合， Z形成磁性复合物 的最外层， 所述磁性复合物的平均粒径在一个纳米至几十个微米 的范围内。 2. 根据权利要求 1所述的磁性复合物， 其特征在于， 所述磁性 复合物的平均粒径为 3 ~ 300 nm， 所述碱性氨基酸选自组氨酸、 精 氨酸、 以及赖氨酸中的一种或多种， 所述聚碱性氨基酸或碱性氨基 酸数目的含量大于 50 %的氨基酸片段的长度为 3 - 39个氨基酸。 3. 根据权利要求 2所述的磁性复合物， 所述聚碱性氨基酸或 碱性氨基酸数目的含量大于 50 %的氨基酸片段选自 RRRRRRRRR、 KKKKKKKKKK 、 RRRRRAAGG 、 RRRRRAAGGKKK 、 RRRRRAAGGKRRR 、 RRRRRAAG CC 、 GRKKR QRRRGCG 、 GRRRQRRKKRGCG 、 GCGGGYGRKKRRQRRR、 以及 RRRQIKIWFQNRRMKWKK , 具体地， 选自 RRRRRRRRR, GRKKRRQRRRGCG 、 以及 GCGGGYGRKKRRQRRR。 4. 根据权利要求 1所述的磁性复合物， 其中， 所述荧光标记 物为荧光素系列、 Cy系列荧光染料、 或 Alexa F luor系列荧光染 料， 具体地， 所述荧光素系列选自 FITC、 TRITC、 FAM、 或其类似 物， 所述 Cy系列荧光染料选自 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7、 或其类似物， 更具体地， 所述荧光标记物选自 FITC、 TRITC、 FAM、 或其类似物。 5. 根据权利要求 1所述的磁性复合物， 其中， 所述 Z为选自 如下的两个或多于两个的不同的化学功能团或功能片段： 聚碱性 氨基酸、 碱性氨基酸数目的含量大于 50 %的氨基酸片段、 连接有 荧光标记物的聚碱性氨基酸、 抗癌药物、 生物素、 转铁蛋白、 甲 基； 其中， 所述聚碱性氨基酸或碱性氨基酸数目的含量大于 50 % 的氨基酸片段与抗癌药物或与生物素或与曱基的摩尔比为 50: 1 到 1: 50。 6. 根据权利要求 1所述的磁性复合物， 其中， 所述抗癌药物 为甲氨蝶呤和 /或环磷酰胺。 7. 权利要求 1所述的磁性复合物的制备方法，包括如下步骤： 1 ) 制备用无机酸或有机酸稳定的 Fe304磁流体， 2 )向 1 )中制备的磁流体中加入式 1所示的化合物的水溶液， 进行反应，反应温度为 O'C到 90 °C，反应时间为 1分钟到 50小时。 8. 权利要求 1所述的磁性复合物的制备方法，包括如下步骤： 1 ) 制备用无机酸或有机酸稳定的 Fe30 流体， 2 )用式 1中的嵌段共聚物结构所示的嵌段共聚物包裹 1 ) 中 制备的磁流体的 Fe304粒子， 3 )将聚碱性氨基酸通过上述嵌段共聚物上的活性反应基团键 连到包裹 Fe304粒子的嵌段共聚物的表面上， 反应温度为 O 'C到 90°C， 反应时间为 1分钟到 50小时。 9. 根据权利要求 7或 8所述的方法， 其中， 所述无机酸为高 氯酸、 盐酸、 硝酸、 或硫酸； 所述有机酸为甲酸、 乙酸、 或三氟 醋酸。 10. 权利要求 1 - 6 中任一项所述的磁性复合物作为药物载 体、 RNA栽体、 或 DNA载体的用途， 具体地， 所述药物为抗癌药 物、 抗病毒药物、 治疗糖尿病的药物、 或治疗心脑血管疾病的药 物， 具体地， 所述抗癌药物为曱氨蝶呤和 /或环磷酰胺。 11. 权利要求 1 - 6中任一项所述的磁性复合物在制备抗癌药 物、 抗病毒药物、 治疗糖尿病的药物、 或治疗心脑血管疾病的药 物中的用途。 12. 一种药物组合物， 其含有权利要求 1 - 6中任一项所述的 磁性复合物， 以及药学上可接受的辅料。 13. 一种治疗和 /或预防癌症的方法， 包括给予有效量的权利 要求 6所述的磁性复合物的步骤。 |
技术领域
本发明属于药物和药剂学领域， 涉及一种磁性复合物， 具体 地， 所述磁性复合物为核-壳结构， 即外层为化学键连聚碱性氨基 酸或其衍生物的嵌段共聚物， 内核为金属氧化物粒子。 本发明还 涉及所述磁性复合物的制备方法和用途。 背景技术
细胞膜是细胞内外环境的屏障， 细胞内的组分需要通过分泌、 胞吐等作用才能被排出体外， 而细胞外成分需通过受体、 离子通道 等作用， 才能被转运到细胞内。 正是因为细胞膜对物质的选择性通 透作用， 使得大分子药物艮难穿过生物膜到达病灶区， 如脑血管疾 病常常需要生长因子、 超氧化物歧化酶等保护剂， 由于其难以透过 血脑屏障， 不能达到有效的治疗浓度。 因此， 许多易降解的药物、 多肽、 蛋白质及各类 RM、 DNA以及其片段在药学领域的应用大大 受限。
多肽类药物、 RNA、 DNA及其片段难以进入细胞且容易被机体或 细胞降解， 因而难以表达， 所以需要有携带其进入细胞， 并使其不 易被降解， 表达提高的载体。 目前， 核酸 /药物的载体主要有病毒 载体和非病毒载体两类。 病毒型载体转染效率较高， 但存在导向性 差、携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性等安 全性隐患。例如， 2000 年，宾州大学有病人在基因治疗使用病毒载体 中死亡。 2002年在法 国又发生先天免疫不全症基因治疗临床试验发 生白血病的副作用。 这两件失败的案例皆被归因于病毒载体的不安 全性。
非病毒载体材料主要有脂质体载体材料和聚合 物载体材料两 类， 具有价格低、 操作简单、 安全性高等特点， 因此得到广泛研究 和应用。 脂质体或脂质复合物利用磷脂具有亲水头疏水 尾， 可在水 溶液中形成水分子层球体的特点， 将 DNA用脂质体包裹起来， 可免 受核酸酶的降解。 国内外已有一些优良的脂质体和脂质体转染试 剂 盒出售， 该载体具有操作简单， 免疫原性低的特点， 但它的缺点是 具有一定毒性且转染率较低。例如，厦门太阳 马生物工程公司对 DNA 转染试剂有过研究， 它的主要成分是阳离子脂质体的聚合物， 但由 于其产品毒性高， 转染效率低而不能为市场所接受。 美国 Invi trogen公司的各种系列的基因栽体。大部分采用 的是阳离子脂 质体和中性磷脂为基本材料， 毒性很高。 聚合物载体材料包括天然 形成的和人工合成的阳离子高分子聚合物， 如多聚赖氨酸（PLL ) 、 聚乙烯亚胺（PEI ) 、 聚酰胺-胺树形高分子 （dendrimer ) 、 脱乙 酰壳多糖（chi tosan )、阳离子聚酯（PAGA )、阳离子聚磚酸酯（PPE ) 和聚乙烯基吡啶盐等。 PLL是较早用于基因转移的阳离子聚合物， 与去唾液酸糖蛋白结合后对肝细胞进行基因靶 向。 它能够被体内的 胰蛋白酶降解生成人体内存在的氨基酸， 因此没有滞留的危害性。 与阳离子脂质体不同， 如果不加入裂解胞内体的试剂或溶酶体类 (如氯喹等）的试剂， 未使用受体介导的 PLL转入基因的效率相当 低（可参考 M. D. Brown, et al. Bioconjugate Chemi s try, 2000, 11， 880-891. ) 。 就转移效率而言， PEI是功能最强的同时也是研 究最多的一种阳离子聚合物，但 PEI在体内或体外应用时表现出较 大的细胞毒性， 因此限制了它的临床应用。 PEI 25 kDa有较高的转 染效率， 但细胞毒性非常大； 低分子量的 PEI细胞毒性小， 却几乎 没有转染效果（可参考 A. Kichler, The Journa l of Gene Medicine, 2004, 6, S3-S10. ) 。
聚合物 /磁性纳米粒子复合材料结合了聚合物和磁性 机粒子 的优点， 兼具磁响应性和聚合物的功能性， 已成为核酸 /药物输送 载体研究的热点。在丙烯酸甘油单酯或甲基丙 烯酸甘油单酯与丙烯 酸或曱基丙烯酸的二嵌段共聚物的存在下，碱 性共沉淀 Fe 2 7Fe 3+ (摩 尔比为 1 : 2 )得到分散于水中的二嵌段共聚物包裹 Fe 3 0 4 纳米粒子 的复合纳米粒子， 其中聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙烯酸甘油单 酯 嵌段附着于 Fe 3 0 4 纳米粒子表面上， 而聚丙烯酸或聚曱基丙烯酸嵌 段处于复合纳米粒子的表面 （参考中国专利 ZL200410058599. 0 ) 。 该复合纳米粒子没有携带核酸 /药物的功能基， 在中性或酸性条件 下复合纳米粒子的表面带负电荷， 具有细胞毒性。 因此， 不适合作 为核酸 /药物的载体。 发明内容
本发明的一个方面涉及一种磁性复合物， 其以纳米级（平均 粒径为一纳米至几百纳米，例如大于等于 c -
H H小于 1000纳米， 如 1纳米至 100纳米， ） 的 Fe 3 0 4 粒子为内核， 外层为O CI下面的式 1 所示的化合物， H H
2
式 1
上面的式 1中，
z 为选自如下的一个或多个相同或不同的化学功 能团或功能 片段： 聚碱性氨基酸、 碱性氨基酸数目的含量大于 50 %的氨基酸 片段、 连接有荧光标记物的聚碱性氨基酸、 抗癌药物、 生物素、 转铁蛋白、 甲基； b为选自如下的生物功能团与嵌段共聚物的连 键：酯键（一 C00- ) 、 酰胺键 （一C0NR―， H， CH 3 , 或 - CH 2 - ) 、 二硫 键（一 S— S―) 、 醚键（一0— ) 、 ,
CH 3 , 或 CH 3 CH 2 等）、 1， 3-三氮唑环（ ； 式 1 中包含嵌段共聚物的结构， 第一嵌段为聚乙二醇， 其平 均聚合度 X为 1 - 300;
第二嵌段为聚丙烯酸甘油单酯或聚曱基丙烯酸 甘油单酯， y =
1 - 500, r=H或 CH 3 ，
其中第二嵌段与 Fe 3 0 4 粒子内核表面结合， Z形成磁性复合物 的最外层， 所述磁性复合物的平均粒径在一个纳米至几十 个微米 的范围内。
所述碱性氨基酸数目的含量大于 50 %的氨基酸片段， 具体 地， 可以为碱性氨基酸数目的含量大于 60 %、 大于 70 %、 大于 80 %、 大于 90 %、 大于 95 %、 或者大于 99 %的氨基酸片段。
在本发明的一个实施方案中，所述 Fe 3 0 4 粒子的平均粒径为几 纳米至几十纳米， 具体地， 为十几纳米。
在本发明的一个实施方案中， 所述磁性复合物的平均粒径为 3 ~ 300 nm, 所述碱性氨基酸选自组氨酸、 精氨酸、 以及赖氨酸中 的一种或多种， 所述聚碱性氨基酸或碱性氨基酸数目的含量大 于 50 %的氨基酸片段的长度为 3 - 39个氨基酸。
在本发明的一个实施方案中， 所述聚碱性氨基酸或碱性氨基 酸数目的含量大于 50 %的氨基酸片段选自 RRRRRRRRR( SEQ ID NO: 1 ) 、 KKKKKKKKKK ( SEQ ID NO: 2 ) 、 RRRRRAAGG ( SEQ ID NO: 3 ) 、 RRRRRAAGGKKK ( SEQ ID NO: 4 ) 、 RRRRRAAGGKRRR ( SEQ ID NO: 5 ) 、 RRRRRAAGKCC ( SEQ ID NO: 6 ) 、 GRKKRRQRRRGCG ( SEQ ID NO: 7 ) 、 GRRRQRR KRGCG ( SEQ ID NO: 8 ) 、 GCGGGYGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO: 9 ) 、 以及 RRRQIKIWFQNRRMKWKK ( SEQ ID NO: 10 ) ， 具 体地， 选自 RRRRRRRRR ( SEQ ID NO: 1 ) 、 GRKKRRQRRRGCG ( SEQ ID NO: 7 ) 、 以及 GCGGGYGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO: 9 ) 。
在本发明的一个实施方案中，所述荧光标记物 为荧光素系列、 Cy系列荧光染料、 Alexa Fluor系列荧光染料， 具体地， 所述荧 光素系列选自 FITC、 TRITC、 FAM、 或其类似物， 所述 Cy系列荧 光染料选自 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7、 或其类似物， 更具体地， 所述荧 光标记物选自 FITC、 TRITC、 FAM、 或其类似物。
在本发明的一个实施方案中， 所述 Z为选自如下的两个或多 于两个的不同的化学功能团或功能片段： 聚碱性氨基酸、 碱性氨 基酸数目的含量大于 50 %的氨基酸片段、连接有荧光标记物的聚 碱性氨基酸、 抗癌药物、 生物素、 转铁蛋白、 甲基； 其中， 所述 聚碱性氨基酸或碱性氨基酸数目的含量大于 50 %的氨基酸片段 与抗癌药物或与生物素或与甲基的摩尔比为 50: 1到 1: 50。
化学键连聚碱性氨基酸嵌段共聚物包裹 FeA粒子中嵌段共 聚物的第二嵌段聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙 烯酸甘油单酯的作 用是与 Fe 3 0 4 粒子表面结合； 磁性复合物的次外层为聚乙二醇， 使 磁性复合物具有好的生物相容性； 聚碱性氨基酸游离在磁性复合 物的最外层， 能够携带磁性复合物穿过细胞膜， 甚至是核膜进入 细胞核， 甚至通过血脑屏障 （BBB ) ， 可作为各类核酸 /药物的输 送载体。
键连聚碱性氨基酸的大分子缀合物能与键连药 物 （如甲氨蝶 呤、 环磷酰胺） 或生物活性物质 （如生物素、 转铁蛋白） 的聚乙 二醇-聚（甲基） 两烯酸甘油单酯嵌段共聚物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子 (二者组合摩尔比例可以从 50: 1到 1: 50 ) ， 因此， 不仅可以利 用游离在磁性复合物最外层的生物活性物质， 实现对特定组织和 器官的靶向作用， 而且也可以携带药物进入细胞内。 聚碱性氨基 酸为阳离子聚合物， 能与带负电荷的 DNA分子形成复合物， 键连 聚碱性氨基酸的大分子缀合物又能与聚乙二醇 单甲醚-聚（甲基） 丙烯酸甘油单酯嵌段共聚物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子（二者组合摩尔比 例可以从 50: 1到 1: 50) ， 所以， 可以通过调节聚乙二醇单甲醚- 聚（甲基） 丙烯酸甘油单酯嵌段共聚物中聚乙二醇单甲醚 的分子 量来起到保护和屏蔽聚碱性氨基酸和核酸免受 酶解的作用。
本发明合成的键连聚碱性氨基酸的嵌段共聚物 包裹 Fe 3 0 4 粒 子的磁性复合物具有较低的细胞毒性， 在实验的条件下， 磁性复 合物和人宫颈癌 HeLa细胞共同孵育 24小时，细胞存活率高于 90% (见附图 1) 。 并且表面键连聚碱性氨基酸的磁性复合物具有 高 的穿过细胞膜的能力， 甚至是能够穿过核膜进入细胞核内 （见附 图 2， A~B) 。 通过荧光共聚焦显微镜测试证明了表面无聚碱 性 氨基酸修饰的荧光标记磁性复合物能不够穿过 细胞膜 (见附图 3， A-D) , 而表面有聚碱性氨基酸修饰的荧光标记磁性复 合物能够 穿过细胞膜 （见附图 4, A-D) 。 本发明的另一个方面涉及上述的磁性复合物的 制备方法， 包 括如下步骤：
1) 制备用无机酸或有机酸稳定的 Fe 3 0 4 磁流体（可参考， 例 如： R. Massart, IEEE Transactions on Magnetics, 1981， MAG-17, 1247-1248. ) ，
2)向 1)中制备的磁流体中加入式 1所示的化合物的水溶液， 进行反应，反应温度为 O'C到 90'C,反应时间为 1分钟到 50小时。
优选地， 所述式 1所示的化合物的摩尔数： Fe 3 0 4 的摩尔数大 于 1。
或者包括如下步骤：
1 ) 制备用无机酸或有机酸稳定的 Fe 3 0 4 磁流体，
2 )用式 1中的嵌段共聚物结构所示的嵌段共聚物包裹 1 ) 中 制备的磁流体的 Fe 3 0 4 粒子，
3 )将聚碱性氨基酸通过上述嵌段共聚物上的活 反应基团键 连到包裹 Fe 3 0 i子的嵌段共聚物的表面上， 反应温度为 O'C到 90 e C , 反应时间为 1分钟到 50小时。
优选地， 所述嵌段共聚物的摩尔数： Fe 3 0 4 的摩尔数大于 1。 在本发明的一个实施方案中， 所述无机酸为高氯酸、 盐酸、 硝酸、 或硫酸， 所述有机酸为甲酸、 乙酸、 或三氟醋酸。
本发明所用嵌段共聚物的合成可用现有任何合 成嵌段共聚物 的方法， 如活性自由基聚合（包括原子转移自由基聚合 （ATRP ) 、 可逆加成-裂解链转移自由基聚合（RAFT ) 等） 、 阴离子聚合等。 本发明的还一个方面涉及所述的磁性复合物作 为药物载体、 RNA载体、 或 DNA载体的用途。 具体地， 所述药物为抗癌药物、 抗病毒药物、 治疗糖尿病的药物、 或治疗心脑血管疾病的药物， 具体地， 所述抗癌药物为甲氨蝶呤和 /或环磷酰胺。
本发明的还一个方面涉及所述的磁性复合物在 制备抗癌药 物、 抗病毒药物、 治疗糖尿 的药物、 或治疗心脑血管疾病的药 物中的用途。
本发明的还一个方面涉及一种药物组合物， 其含有本发明任 一项所述的磁性复合物， 以及药学上可接受的辅料。
本发明的还一个方面涉及一种治疗和 /或预防癌症的方法，包 括给予有效量的本发明的磁性复合物的步骤， 其中， 所述磁性复 合物作为抗癌药物的载体； 具体地， 所述抗癌药物为甲氨蝶呤和 / 或环磷酰胺。 给药方式可以为注射或者口服， 给药量可以参照抗 癌药物（例如甲氨蝶呤和 /或环磷酰胺）的给药量确定， 或者由医 生根据患者的具体情况（例如患者的病情、 年龄、 性别等）确定。 附图说明
F i g. 1 : 人宫颈癌 HeLa细胞在不同浓度磁性复合物存在条件 下培养 24小时后的相对存活率。
F i g. 2: 聚碱性氨基酸 - PEG- PGA-Fe 3 0 4 磁性复合物进入人宫 颈癌 HeLa细胞的显微镜照片（普鲁士蓝染色铁，藏 T染鈿胞核）。 图 2A: 400 X； 图 2B: 为高倍显微镜照片 （Ι ΟΟΟ χ ) 。
F i g. 3: 荧光共聚焦显微镜照片证明 FITC-PEG-PGA-Fe 3 0 4 不 能穿过 Caco-2细胞膜。 图 3A: FITC荧光成像； 图 3B: 罗丹明- 鬼笔环肽染色的细胞膜； 图 3C: Hoeches t 33258 染色的细胞核； 图 3D: 前三种成像的合并图。
F i g. 4: 荧光共聚焦显微镜照片证明 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGA- Fe 3 0 4 能穿过 Caco-2细胞膜。 图 4A: FITC荧光成像； 图 4B:罗丹明 -鬼笔环肽染色的细胞膜;图 4C: Hoeches t 33258 染 色的细胞核； 图 4D: 前三种成像的合并图。 具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述， 但是 本领域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不 应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常 规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂 商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。 下面的实施例中所用缩写为： PEG, 聚乙二醇； mPEG, 聚乙二 醇单甲醚； CH 3 S0 3 -PEG-0H , 单端甲磺酰基聚乙二醇； N 3 -PEG-0H， 单端叠氮基聚乙二醇； NH 2 -PEG- 0H， 单端氨基聚乙二醇； FMAL-PEG-Br , 一端呋喃保护马来酰亚胺端基， 另一'端为 α-溴异 丁酸酯的聚乙二醇； MAL， 马来酰亚胺端基； SA, 丙烯酸 1, 1-二 甲基 -1， 3-二氧戊烷 -4-甲醇酯； SMA， 甲基丙烯酸 2， 2-二甲基 -1， 3-二氧戊烷 -4-曱醇酯； PGA , 聚丙烯酸甘油单酯； PGMA , 聚曱 基丙烯酸甘油单酯； PMDETA, 1, 1, 4, 7, 7 -五甲基二乙烯三胺； Fmoc , 芴甲氧羰基； Boc， 叔丁氧羰基； Pbf , 2， 2， 4， 6， 7-五曱基二氢苯 并呋喃 -5-磺酰基； Tr t， 三苯甲基； FITC, 异硫氰酸荧光素； MTX， 甲氨蝶呤。 此外， 在下面的实施例中， 为了表述的方便， 有时也 将所用到的碱性氨基酸数目的含量大于 50 %的氨基酸片段称为 聚碱性氨基酸。在下面的实施例中， 与 FITC连接的聚碱性氨基酸 以 "GCGGGYGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO: 9 ) " 为例， 没有连接 FITC 的聚碱性氨基酸以 "GRKKRRQRRRGCG ( SEQ ID NO: 7 ) ，， 为例。 实施例 1 : CH 3 S0 3 - PEG- 0H的制备
将 3. 8 mL甲基磺酰氯溶于 50 mL四氢呋喃中， 然后緩慢滴加 到溶有 10 g PEG (平均分子量为 200 ) 和 7 mL三乙胺的 200 mL 四氢呋喃中， 3 小时后滴加完毕， 室温搅拌过夜。 过滤反应液， 滤液旋转蒸发除去溶剂， 经硅胶柱分离得到 CH 3 S0 3 - PEG-0H。 实施例 2 : Ns-PEG-OH的制备
将 2. 8 g CH3SO3-PEG-OH (平均分子量为 200 )和 1 g叠氮钠 溶于 25 mL水中， 反应液在 80°C下反应 24小时。 反应结束后冷 却至室温， 减压蒸出溶剂水， 加入 100 mL二氯曱烷， 有机相用无 水硫酸钠干燥过夜， 过滤， 旋蒸除去溶剂， 经硅胶柱分离得到
N厂 PEG-OHo 实施例 3: NH 2 -PEG-0H的制备
将 1 g N3-PEG-OH (平均分子量为 200 ) 置于反应瓶中， 加入 0. 1 3 g 水， 再将 1. 3 g三苯基膦溶于 35 mL 四氢呋喃中， 加入 到反应瓶中， 室温搅拌 1 0小时。 反应结束后， 过滤， 旋蒸除去溶 剂， 经硅胶柱分离得到 NH 2 -PEG-0H。 实施例 4: 其它分子量的 NH 2 - PEG- 0H的制备
分别用平均分子量为 600、2000和 5000的 PEG代替实施例 1、 实施例 1和实施例 3中的平均分子量为 200的 PEG, 执行相同的 操作， 分别制得相应分子量的 NH 2 -PEG-0H。 实施例 5 : FMAL-PEG-0H的制备
将 2. 84 g 4， 10 二氧杂三环 [5. 2. 1. 0 (2， 6) ]癸- 8 -烯 -3， 5- 二酮溶于 70 mL曱醇中，溶液被冷却至 0 °C，然后，再将 3. 31 g 实 施例 3制备的 NH 2 -PEG-0H (平均分子量为 200 ) 溶于 30 mL甲醇 滴加入上面的反应液中， 反应液在 0 °C下搅拌 1 0分钟， 室温搅拌 45分钟， 最后回流 4小时， 冷却至室温， 旋蒸除去溶剂， 残留物 溶于 200 mL二氯甲烷中， 用饱和食盐水洗涤三次， 有机相用无水 硫酸镁干燥过夜， 过滤， 旋蒸除去溶剂， 经硅胶柱分离得到 实施例 6: FMAL-PEG-Br的制备
将 2. 4 g 实施例 5制备的 FMAL- PEG-0H ( PEG平均分子量为 200 ) 溶于 70 mL干燥的四氢呋喃中， 然后加入 1.2 mL三乙胺。 反应液冷却至 0°C， 再将 1.0 mL α-溴异丁酰溴溶于 20 mL干燥 的四氢呋喃中， 滴加入反应液中， 0°C反应 1 小时， 室温搅拌 24 小时， 过滤除去白色沉淀， 旋蒸除去溶剂， 经硅胶柱分离得到 FMAL-PEG-Br。 实施例 7: 其它分子量的 FMAL- PEG- Br的制备
分别用 PEG平均分子量为 600、 2000和 5000的 FMAL- PEG- 0H 代替实施例 6中 PEG平均分子量为 200的 FMAL-PEG-OH, 其它操 作同实施例 6， 分别制得相应分子量的 FMAL-PEG- Br。 实施例 8: MAL-PEG-PGA的制备
将 0.2 g 实施例 6制备的 FMAL-PEG-Br， 58 mg CuBr, 3.04 g SA溶于 1.5 mL苯甲醚中， 在氩气保护下加入 87 μΐ PMDETA, 溶液变为浅绿色，浸入已预热到 65°C的油浴中，搅拌反应 3小时， 得绿色粘稠物。 以四氢呋喃溶解所得绿色聚合物， 溶液过中性 A1 2 0 3 柱， 收集滤液， 旋蒸充分浓缩， 以十倍量石油醚（ 60-90。C ) 沉淀之， 得微黄色聚合物。 然后， 将此聚合物溶于 20 mL曱苯中， 加热回流 7小时， 旋蒸除去溶剂。 最后将得到的聚合物溶于 1.0 mol/L 盐酸 /二氧六环（1: 3， v/v)中， 在 0°C下搅拌反应 1 小时 后， 室温搅拌 24 小时， 转移到透析袋中 （分子量上限为 3500 ) 反复透析， 得无色透明溶液。 冷冻干燥得白色固体 MAL-PEG-PGA。 实施例 9: MAL-PEG-PGMA的制备
用 SMA代替实施例 8中的聚合单体 SA，其它操作同实施例 8。 制得白色粉末状固体 MAL-PEG-PGMA。 实施例 10: 其它分子量的 MAL-PEG-PGA和 MAL- PEG-PGMA的 制备
分别用 PEG平均分子量为 600、 2000和 5000的 FMAL-PEG-Br 代替实施例 8和实施例 9中的 FMAL-PEG-Br， 执行相同的操作， 分别制得相应分子量的 MAL- PEG- PGA和 MAL- PEG- PGMA。 实施例 11: 聚碱性氨基酸的制备
选用 MBHA树脂， 采用 Fmoc合成策略， 按聚碱性氨基酸的序 列 GRKKRRQRRRGCG ( SEQ ID NO: 7) ， 从 C端向 N端延长， 用 25% 哌啶 /N，N-二甲基甲酰胺溶液脱保护， 缩合方法采用苯并三氮唑 -^ ^，1^'-四甲基脲六氟磷酸酯 0^1 1 11)/ 1-羟基苯并三氮唑 (HOBt)法。 检测方法采用茚三酮指示剂。 所用氨基酸的 α-氨基都 用 Fmoc 保护， 有侧链保护基的氨基酸为： Fmoc-Lys (Boc)-0H、 Fmoc-Arg(Pbf) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc- Cys (Trt) - 0H。 三 氟乙酸 /水 /间甲酚 / 1, 2-乙二硫醇 =90/5/3/2 (体积比）将聚碱性 氨基酸从树脂上裂解下来，然后用反相液相色 谱法进行分离纯化， 得到纯品聚碱性氨基酸。 实施例 12: FITC-聚碱性氨基酸衍生物的制备
采用固相合成聚碱性氨基酸， 用 FITC封端，衍生物氨基酸序 列为 FITC- (ω-GHBA) -GCGGGYGRKKRRQRRR( SEQ ID NO: 9), ω-GHBA: ω-氨基己酸， 其它操作与实施例 11相同， 制得 FITC-聚碱性氨基 酸。 实施例 13: 聚碱性氨基酸 - PEG-PGA缀合物的制备 0. 1 g实施例 8制备的 MAL-PEG-PGA溶于 4 mL去离子水中， 加入 40 mg 聚碱性氨基酸（GRKKRRQRRRGCG, SEQ ID NO: 7 ) ， 室温搅拌过夜， 反应液转移到透析袋中 （分子量上限为 3500 )反 复透析， 冷冻干燥得到聚碱性氨基酸 -PEG- PGA缀合物。 实施例 14: FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合物的制备 用 FITC-聚碱性氨基酸衍生物代替实施例 13中的聚碱性氨基 酸，其它操作与实施例 13相同，制得 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGA 缀合物。 实施例 15:其它分子量的聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合物的制 垒
分别用 PEG平均分子量为 600、 2000和 5000的 MAL-PEG-PGA 代替实施例 13中 MAL-PEG-PGA,其它操作同实施例 13，分别制得 相应分子量的聚碱性氨基酸 -PEG- PGA缀合物。 实施例 16: 其它分子量的 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合 物的制备
分别用 PEG平均分子量为 600、 2000和 5000的 MAL-PEG-PGA 代替实施例 14中 MAL-PEG-PGA,其它操作同实施例 14，分别制得 相应分子量的 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合物。 实施例 17: 其它分子量的聚碱性氨基酸 - PEG PGMA缀合物的 制备
分别用 PEG平均分子量为 600、 2000和 5000的 MAL-PEG-PGMA 代替实施例 15中 MAL-PEG-PGA,其它操作同实施例 15，分别制得 相应分子量的聚碱性氨基酸 -PEG-PGMA缀合物。 实施例 18 : 其它分子量的 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG- PGMA缀 合物的制备
分别用 PEG平均分子量为 600、2000和5000的1^^-?£0-?01^ 代替实施例 16中 MAL-PEG-PGA,其它操作同实施例 16，分别制得 相应分子量的 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGMA缀合物。 实施例 19 : 高氯酸稳定的磁流体水溶液的制备
将 2 g FeC l 2 · 4H 2 0溶于 25 mL 1 mo l /L盐酸中的溶液和 5. 4 g FeCls · 6H 2 0溶于 25 raL去离子水中的溶液置于三口瓶内混合， 通氩气。 向三口瓶内滴加 160 mL 1. 5 mo l /L氨水， 溶液中产生黑 色沉淀， 室温下继续搅拌反应 24小时。通过磁铁吸住沉淀倾去上 层清液并用水洗涤 3次。在氩气保护下向三口瓶内滴加 2. 0 mo l /L HC10 4 50 mL, 室温搅拌 15分钟。 静置 10分钟， 按上法倾去上层 清液， 复原装置， 再通氩气 30分钟， 从恒压漏斗滴加 2. 0 mo l /L HCIO4 50 mL , 室温搅拌 15分钟。 停止搅拌后将反应物离心 30分 钟， 倾去溶液， 沉淀迅速转移到透析袋中， 用去离子水反复透析， 制得高氯酸稳定的磁流体水溶液，测得 Fe 3 0 4 的浓度为： 32 mg/mL。 实施例 20: 直接法制备聚碱性氨基酸- PEG- PGA- Fe 3 0 4
将 0. 12 g 实施例 13制备的聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合物溶 于 3 mL去离子水中， 用盐酸调节 pH值至酸性。 抽真空充氩气， 重复三次移除反应瓶内的氧气， 加入 0. 4 raL 高氯酸稳定的磁流 体。 反应 12小时， 磁性分离， 得到聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合 物包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物 （聚碱性氨基酸 -PEG-PGA- Fe 3 0 4 ) 水溶液。 实施例 21 : 间接法制备聚碱性氨基酸 -PEG-PGA-Fe 3 0 4
将 0. 12 g实施例 8制备的 MAL-PEG- PGA溶于 3 mL去离子水 中， 抽真空充氩气， 重复三次移除反应瓶内的氧气， 加入 0. 4 mL 高氯酸稳定的磁流体。反应 12小时，磁性分离，得到 MAL-PEG- PGA 包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物（ MAL-PEG-PGA- Fe 3 0 4 )水溶液。 聚碱 性氨基酸 ( GRKKRRQRRRGCG, SEQ ID NO: 7 ) 溶于 0. 2 mL去离子 水中， 用盐酸调节溶液 pH 值至酸性， 然后向溶液中加入 2 mL MAL-PEG-PGA-Fe 3 0 4 水溶液，反应液在室温下搅拌过夜，磁性 分离， 得到聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合物包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物 (聚碱性氨基酸 -PEG-PGA-Fe 3 0 4 ) 水溶液。 实施例 22 : 直接法制备 FITC-聚碱性氨基酸 - PEG- PGA- Fe 3 0 4 用 FITC-聚碱性氨基酸 - PEG-PGA缀合物代替实施例 20中的聚 碱性氨基酸- PEG- PGA缀合物， 其它操作同实施例 20。 直接法制备 得到 FITC-聚碱性氨基酸- PEG-PGA缀合物包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复 合物 （FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGA-Fe 3 0 4 ) 水溶液。 实施例 23 : 直接法制备聚碱性氨基酸- PEG-PGMA-Fe 3 0 4 和 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG- PGMA-Fe 3 0 4
分别用聚碱性氨基酸 -PEG- PGMA 缀合物和 FITC-聚碱性氨基 酸 -PEG-PGMA 缀合物代替实施例 20 中的聚碱性氨基酸 -PEG-PGA 缀合物， 其它操作同实施例 20。 直接法分别制备得到聚碱性氨基 酸 -PEG-PGMA缀合物包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物（聚碱性氨基酸 -PEG-PGMA-Fe 3 0 4 ) 水溶液和 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGMA 缀合 物包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物 （ FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGMA-Fe 3 04 ) 水溶液。 实施例 24 : mPEG-PGA和聚碱性氨基酸 -PEG- PGA缀合物组合 包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备
mPEG-PGA和聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒 子的磁性复合物的制备： mPEG-PGA ( mPEG的平均分子量 2000 )的 合成可参考： S. Wan, e t a l . J, Ma t er. Chem. , 2005 , 15， 3424-3430。将 mPEG- PGA和聚碱性氨基酸- PEG-PGA缀合物分别按 摩尔比从 50: 1至 1 : 50的各种比例， 组合包裹 Fe 3 0 4 粒子， 操作 同实施例 20。 分别制备得到 mPEG-PGA和聚碱性氨基酸- PEG- PGA 缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物。 实施例 25 :其它分子量的 mPEG-PGA和聚碱性氨基酸 -PEG-PGA 缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备
分别用 mPEG平均分子量为 200和 5000的 mPEG-PGA代替实施 例 24中的 mPEG-PGA , 其它操作同实施例 24。 分别制备得到相应 分子量的 mPEG- PGA 和聚碱性氨基酸- PEG- PGA 缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物。 实施例 26 : mPEG-PGMA和聚碱性氨基酸- PEG-PGMA缀合物组 合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备
分别用 mPEG- PGMA ( mPEG的平均分子量为 2000 )和聚碱性氨 基酸- PEG-PGMA缀合物代替实施例 24中的 mPEG-PGA和聚碱性氨 基酸- PEG-PGA 缀合物， 其它操作同实施例 24。 分别制备得到 mPEG-PGMA和聚碱性氨基酸 -PEG- PGMA缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子 的磁性复合物。 实施例 27 : 其它分子量的 mPEG-PGMA 和聚碱性氨基酸 -PEG-PGMA缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备
分别用 mPEG平均分子量为 200和 5000的 mPEG- PGMA代替实 施例 26中的 mPEG-PGMA,其它操作同实施例 26。分别制备得到相 应分子量的 mPEG-PGMA和聚碱性氨基酸 -PEG-PGMA缀合物组合包 裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物。 实施例 28: MTX- PEG- PGA缀合物和聚碱性氨基酸- PEG-PGA缀 合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备
MTX-PEG-PGA缀合物和聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合物组合包 裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备： MTX-PEG-PGA缀合物 （PEG的 平均分子量 200 ) 的合成， 可参考： Q. Zhang, et a l. J. Mater. Chem. , 2009， 19, 8393- 8402。 将 MTX-PEG-PGA缀合物和聚碱性 氨基酸 -PEG-PGA缀合物分别按摩尔比从 50: 1至 1: 50的各种比 例， 组合包裹 Fe 3 0 4 粒子， 操作同实施例 20。 分别制备得到 MTX-PEG-PGA 缀合物和聚碱性氨基酸 -PEG-PGA 缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物。 实施例 29: 其它分子量的 MTX-PEG-PGA缀合物和聚碱性氨基 酸- PEG-PGA缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备
分别用 PEG平均分子量为 2000和 5000的 MTX- PEG-PGA缀合 物代替实施例 28 中的 MTX-PEG-PGA缀合物， 其它操作同实施例 28。 分别制备得到相应分子量的 MTX-PEG-PGA缀合物和聚碱性氨 基酸 -PEG-PGA缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物。 实施例 30: MTX-PEG-PGMA缀合物和聚碱性氨基酸- PEG-PGMA 缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备
分别用 MTX-PEG-PGMA缀合物 （PEG的平均分子量为 200 ) 和 聚碱性氨基酸 -PEG-PGMA缀合物代替实施例 28中的 MTX- PEG- PGA 缀合物和聚碱性氨基酸 -PEG-PGA缀合物， 其它操作同实施例 28。 分别制备得到 MTX-PEG-PGMA缀合物和聚碱性氨基酸 -PEG- PGMA缀 合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物。 实施例 31 : 其它分子量的 MTX- PEG- PGMA缀合物和聚碱性氨 基酸 -PEG- PGMA缀合物组合包裹 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物的制备 分别用 PEG平均分子量为 2000和 5 000的 MTX-PEG-PGMA缀合 物代替实施例 30中的 MTX-PEG-PGMA缀合物， 其它操作同实施例 30。分别制备得到相应分子量的 MTX-PEG-PGMA缀合物和聚碱性氨 基酸 -PEG-PGMA缀合物组合包泉 Fe 3 0 4 粒子的磁性复合物。 实施例 32 : 磁性复合物细胞毒性的实验
将实施例 20中所得的聚碱性氨基酸-？80-?0人 6 3 0 4 和实施例 21 中提到的 MAL- PEG-PGA- Fe 3 0 4 分别加入到培养液中进行细胞培 养实验， 然后用 MTS方法测定细胞的相对存活率， 具体实验方法 可参考： S. Wan, e t a l . J. B i omed. Ma ter. Res . A, 2007, 80， 946-954 。 图 1 为 MAL-PEG- PGA-Fe 3 0 4 和聚碱性氨基酸 -PEG-PGA-Fe 3 0 4 细胞毒性的比较。 磁性复合物和人宫颈癌 HeLa细 胞共同孵育 24小时， 细胞存活率高于 90%。
类似地， 验证了其它实施例中制备的本发明的磁性复合 物， 结果显示， 细胞的存活率较高， 显示这些磁性复合物的毒性非常 小或没有毒性。 实施例 33: 染色法证明磁性复合物穿过细胞膜的实验
实施例 20中所得的聚碱性氨基酸 -PEG-PGA- Fe 3 0 4 加入到培养 液中进行细胞培养实验， 然后用普鲁士蓝染色法判定细胞内铁是 否存在， 藏红 T 复染细胞核。 图 2 ( A~ B ) 为聚碱性氨基酸 -PEG-PGA-Fe 3 0 4 进入细胞核的染色照片， 可以看出， 表面修饰聚 碱性氨基酸的磁性复合物能够携带 Fe 3 0 4 粒子进入细胞核。
类似地， 验证了其它实施例中制备的本发明的磁性复合 物， 结果显示， 它们均可以穿过细胞膜。 实施例 34: 荧光标记法证明 FITC- PEG- PGA-Fe 3 0 4 不能穿过 Caco-2细胞膜的实验
采用与实施例 20或 21类似的方法合成 FITC-PEG-PGA-Fe 3 0 4 , 除了将聚碱性氨基酸替换为 FITC, 然后将其加入到培养液中进行 细胞培养实验， 然后通过荧光共聚焦光谱成像判定细胞内荧光 物 质的存在。 图 3(A~D)证明 FITC- PEG- PGA-Fe 3 0 4 不能穿过 Caco-2 细胞膜。 实施例 35 : 荧光标记法证明 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGA-Fe 3 0 4 穿过细胞膜的实验
实施例 22中所得的 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG- PGA-Fe 3 0 4 加入 到培养液中进行细胞培养实验， 然后通过荧光共聚焦光谱成像判 定细胞内荧光物质的存在。 图 4 (A~D) 为 FITC-聚碱性氨基酸 -PEG-PGA-Fe 3 0 4 进入 Caco-2细胞内的荧光共聚焦照片，可以看出， 表面修饰 FITC标记聚碱性氨基酸的磁性复合物能够携带 Fe 3 0 4 粒 子进入到细胞内。
类似地， 验证了其它实施例中制备的本发明的磁性复合 物， 结果显示， 它们均可以穿过细胞膜。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述， 本领域技 术人员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进 行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发 明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物 给出。
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