La presente invención se refiere una mezcla de crambescidinas con un potente efecto antagonista sobre los canales de calcio. Además la presente invención se refiere a un procedimiento de extracción de un extracto de dichas crambescidinas y al uso del mismo para la elaboración de un medicamento como antagonista de los canales de calcio.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los antagonistas de los canales de calcio son medicamentos usados en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares como angina, arritmias (ritmos irregulares) e hipertensión. El calcio es necesario para la contracción de las células del músculo liso, del músculo esquelético y del músculo cardiaco. En el caso del músculo cardiaco, la contracción se produce por la alteración del movimiento del calcio a través de los canales en las células cardiacas. Los antagonistas de los canales de calcio ayudan a suprimir irregularidades en el ritmo cardiaco.

El calcio es importante también para los vasos sanguíneos, ayudando al control de la presión arterial. Los antagonistas de los canales de calcio provocan la relajación de la musculatura lisa arterial, siendo usados en el tratamiento de la hipertensión. El verapamílo, el nifedipina y el diltiazem son antagonistas de los canales de calcio con similares, aunque no idénticos, sitios de acción. Como el músculo cardíaco depende de la entrada de calcio a sus células para funcionar adecuadamente, los antagonistas de los canales de calcio pueden afectar al funcionamiento normal del corazón. Efectos colaterales peligrosos incluyen supresión de la función cardiaca, llevando a insuficiencia cardiaca congestiva, frecuencias cardiacas bajas y disminución de la tensión arterial. Debido a io anterior, se hace necesario el poder obtener nuevos compuestos que ejerzan un papel antagonista sobre los canales de calcio y que no tengan efectos negativos sobre el funcionamiento del corazón.

Los océanos y los mares son una fuente de un extenso grupo de productos naturales con estructura única, que son principalmente acumulados en invertebrados como las esponjas y los moluscos (Burkhard et al. Drug. Dis. Today 2003, 8(2), 536-544). Varios de estos compuestos muestran una pronunciada actividad farmacológica y son candidatos interesantes para nuevos medicamentos en varias áreas de tratamiento (Newman et al. J. Nat. Prod. 2003, 66, 1022-1037). Las esponjas han provisto más productos naturales que cualquier otro organismo, debido en parte a su propensión a producir metabolítos bíoactívos (Faulkner et al. Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 1 -48).

Por lo tanto, existe la necesidad de obtener nuevos compuestos capaces de modular los canales de calcio (VDCC), los cuales puedan ser útiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

En este mismo sentido unos productos naturales que se postulan como antagonistas de los canales de calcio son las crambescidinas, procedentes principalmente de la esponja Crambe crambe. Dentro de este tipo de productos naturales está la crambescidína 800, conocida por su efecto protector frente al estrés oxidativo en células neuronales (J. Nat. Med. 2007, 61(3), 288-295), como agente antímaláríco (J. Antibiot. 2006, 59(9), 583-590) o al igual que la crambescidína 816, como modulador de los canales de calcio (J. Nat. Prod. 1993, 56(7), 1007-1015). Sin embargo la extracción de este tipo de productos naturales supone llevar a cabo procedimientos complicados, mediante los cuales no se llegan a obtener grandes rendimientos y en la mayoría de los casos el poder purificar el extracto de dicha esponja se hace complicado. La obtención de las crambescidinas 800 y 816 de fuentes naturales por extracción y purificación es un proceso arduo y largo debido a la complejidad estructural de estos alcaloides y a la mezcla de compuestos similares (p.ej. otras crambescidinas, crambescinas, crambidina y ptilomicalina A) que suelen presentar las esponjas y estrellas de mar que las contienen. Las principales características estructurales que presentan las crambescidinas 800 y 816 son grupos polares (un catión guanidinio, alcoholes y aminas) y, a la vez, una cadena hidrocarbonada apolar larga.

En la actualidad existen procedimientos para el aislamiento y purificación de estos compuestos naturales por separado, como es el caso de US5756734 o US5952332, en los cuales se exponen procedimientos para la obtención de las crambescidinas, ya sean las 800, 816 o por ejemplo la 830, por separado pero nunca como una mezcla de la 800 y 816 con composición definida.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A tenor de todo lo anteriormente expuesto, la presente invención se refiere a una mezcla de las crambescidinas 800 y 816 en una proporción definida, que muestra un efecto sorprendente frente a la actividad que mostrarían cualquiera de ellas por separado en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Además la presente invención describe un método eficaz y novedoso de aislamiento de las crambescidinas 800 y 816 como una mezcla. Finalmente se demuestra el potente efecto como antagonista de los canales de calcio que muestra esta mezcla de crambescidinas en proporción definida, para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Por lo tanto un primer aspecto de la presente invención se refiere a una mezcla de las crambescidinas 800 y 816:

Crambescidina 800

Crambescidina 816 en proporción 1 :3.

Según otra realización preferida, dicha mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 para su uso como medicamento.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o veterinaria, que comprende la mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3, junto con uno o más excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables y al menos un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.

De manera preferida, la composición farmacéutica o veterinaria además comprende otro principio activo.

Según otra realización preferida, la composición farmacéutica o veterinaria se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, oral, sublingual, nasal, íntratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 o de la composición farmacéutica o veterinaria para la elaboración de un medicamento.

Según una realización preferida, se refiere al uso para la fabricación de un medicamento como antagonista de los canales de calcio.

Una realización preferida se refiere al uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades de la aneurisma, angina de pecho, ateroesclerosis, ictus cerebral, arritmia cardiaca, infarto de miocardio, hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca congestiva o enfermedad vascular periférica, cefalea en racimos, migraña, parto prematuro, síndrome de Raynaud y el tétano.

Además también de manera preferida, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, oral, sublingual, nasal, íntratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un extracto que comprende una mezcla de crambescidinas 800 y 816 que comprende las siguientes etapas:

a. extracción a partir de la una esponja; y b. purificación.

Según una realización preferida, la etapa de extracción comprende al menos una etapa de extracción con un disolvente orgánico. De manera preferida, se llevan a cabo 3 tipos de extracción con disolvente orgánico.

Según una realización preferida, cada tipo de extracción se lleva a cabo desde 1 a 4 veces.

Según otra realización preferida, uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con acetona.

Según otra realización preferida, uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con dietil éter.

Según otra realización preferida, uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con butanol.

Según otra realización preferida, se llevan a cabo 3 extracciones. De manera preferida, la primera extracción se realiza con acetona, la segunda con butanol y la tercera con dietil éter.

Según otra realización preferida entre la extracción con acetona y la extracción con butanol se suspende el extracto con agua Mili Q.

Según otra realización preferida, la esponja es Crambe crambe.

Según una realización preferida, la etapa de purificación comprende hacer pasar el extracto obtenido de la etapa de extracción, por al menos 1 columna cromatográfica. De manera preferida se hace pasar al extracto procedente de la etapa de extracción por 3 columnas cromatográfícas. Según otra realización preferida, una de las columnas cromatográficas es de tipo Sephadex LH-20.

Según otra realización preferida, otra de las columnas cromatográficas es de tipo XBridge RP 18.

Según otra realización preferida, otra de las columnas cromatográficas es de tipo μ-Bondapak.

Según otra realización preferida, la primera columna es de tipo Sephadex LH- 20, la segunda columna por la que se hace pasar el extracto es de tipo μ- Bondapak y la tercera es de tipo XBridge RP 18.

Según otra realización preferida, en todas las columnas se eluye con al menos metanol.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al extracto, mezcla de las crambescídínas 800 y 816, obtenible mediante el procedimiento de extracción anterior.

Según una realización preferida, dicho extracto comprende una mezcla de crambescídínas 800 y 816 en proporciones 1 :3.

Según otra realización preferida, dicho extracto, mezcla de crambescídínas 800 y 816 en proporción 1 :3 obtenible por el procedimiento anteriormente descrito para su uso como medicamento.

Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o veterinaria, que comprende el extracto de la mezcla de crambescídínas 800 y 816 en proporción 1 :3 obtenible por el procedimiento anteriormente descrito, junto con uno o más excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables y al menos un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.

De manera preferida, la composición farmacéutica o veterinaria además comprende otro principio activo.

Según otra realización preferida, la composición farmacéutica o veterinaria se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, oral, sublingual, nasal, íntratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.

Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere al uso del extracto, mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 obtenible por ei procedimiento descrito anteriormente o de la composición farmacéutica o veterinaria que lo comprende para la elaboración de un medicamento.

Una realización preferida se refiere al uso para la fabricación de un medicamento como antagonista de los canales de calcio.

Otra realización preferida se refiere al uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades de la aneurisma, angina de pecho, ateroesclerosis, ictus cerebral, arritmia cardiaca, infarto de miocardio, hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca congestiva o enfermedad vascular periférica, cefalea en racimos, migraña, parto prematuro, síndrome de Raynaud y el tétano.

En la presente invención el término "composición farmacéutica o veterinaria" se refiere a un conjunto de componentes que está formada ai menos por el extracto de la invención, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud, por ejemplo una aplicación cosmética, aunque puede no implicar un efecto fisiológico en el organismo sino una mejora en el bienestar del sujeto relacionada con su psicología. Por tanto, dicha composición farmacéutica puede ser un producto de higiene personal, un producto cosmético o un producto que puede constituir la base para la elaboración de los productos anteriores o la base para la elaboración de un medicamento.

El "producto de higiene personal" se define como las sustancias o preparados que, sin tener la consideración legal de medicamentos, productos sanitarios, cosméticos o biocidas, están destinados a ser aplicados sobre la piel, dientes o mucosas del cuerpo humano con finalidad de higiene o de estética, o para neutralizar o eliminar ectoparásitos.

El "producto cosmético" se define como toda sustancia o preparado destinado a ser puesto en contacto con las diversas partes superficiales del cuerpo humano (epidermis, sistema piloso y capilar, uñas, labios y órganos genitales externos) o con los dientes y las mucosas bucales, con el fin exclusivo o principal de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto, y/o corregir los olores corporales, y/o protegerlos o mantenerlos en buen estado.

El término "medicamento" tiene un significado más limitado que el significado de "composición farmacéutica", tal como se define en la presente invención, ya que el medicamento implica necesariamente un efecto terapéutico es decir, un efecto fisiológico en el metabolismo del sujeto.

El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades en seres humanos o que puedan usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas y/o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezclas para piensos medicamentosos" -elaboradas para ser incorporadas a un pienso.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del extracto de la invención, estabiliza dicho extracto o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásíco, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

La composición de la invención puede comprender además un vehículo farmacológicamente aceptable. Además, el vehículo debe ser farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de las secuencias de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación del extracto de la invención así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El vehículo farmacológicamente aceptable podría ser, pero sin limitarse, una nanopartícula, un liposoma, una micela o una microemulsión.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención se puede preparar mediante uno o más de estos procedimientos:

(i) hacer reaccionar el compuesto de la invención con el ácido deseado

(íi) convertir una sal del compuesto de la invención en otro, mediante reacción con un ácido apropiado o mediante una columna de intercambio iónico adecuada.

Las dos reacciones se llevan a cabo típicamente en solución. La sal puede precipitar en solución y se puede recoger mediante filtración o se puede recuperar soluciones del compuesto de la invención y el ácido o base deseado, según sea apropiado. La sal puede precipitar de una solución y recogerse mediante filtración o se puede recuperar mediante evaporación del disolvente. El grado de ionización en la sal puede variar entre completamente ionizado a casi no ionizado.

Sal farmacéuticamente aceptable por adición de ácidos, se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad biológica y las propiedades de las bases libres, que no son indeseables ni biológicamente ni de otra manera, y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, pero sin limitación, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, acido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como, pero sin limitación, ácido acético, ácido 2,2- dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzenosulfónico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido canfónico, ácido alcanfor-10-sulfónico,ácído cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1 ,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2- hidroxietanosulfónico, ácido fumárico, ácidogalactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido 2- oxoglutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiónico, ácido láurico, ácido maleico, ácido oleico, ácido cerótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido propiónico, ácido piroglutámico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4- aminosalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico, ácido trifluoroacético, ácido undecilénico, y similares.

Sal farmacéuticamente aceptable por adición de bases se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad biológica y las propiedades de los ácidos libres, que no son indeseables ni biológicamente ni de otra manera. Estas sales se preparan a partir de la adición de una base inorgánica o de una base orgánica al ácido libre. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, pero sin limitación, sales de sodio, de potasio, de litio, de amonio, de calcio, de magnesio, de hierro, de zinc, de cobre, de manganeso, de aluminio y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero sin limitación, sales de aminas primarias, secundarías y terciarias; aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas, guanidinas sustituidas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como amoníaco, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-metilaminoetanol, 2-dietílaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procalna, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etílendíamina, glucosalina, metilglucamina, teobromina, trietanolamina, trometamina, purinas, piperazina, A/-etilpiperidina, guanidina, resinas de poliamina y similares.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Expresión de canales de calcio en útero de rata.

Figura 2 A y B Contracciones inducidas por KCI.

Figura 3 A y B Contracciones inducidas por oxitocína y metacolina.

Figura 4 A y B.Contracciones inducidas por veratridina.

Figura 5.Efectos inducidos por la mezcla de crambescidinas 800 y 81 6 sobre las contracciones fásicas espontáneas del miometrio.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Procedimiento de aislamiento de un extracto de ia mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3.

Se sacó una muestra de esponja Crambe crambe de su medio, y se introdujo en una botella de cristal color topacio que contenía 750 mL de acetona en la cual se maceró durante 48 horas a temperatura de 7-8 ^e C. Después de ese tiempo se filtró a través de placa de vidrio y se volvió a poner en maceración durante otras 48 horas con nueva acetona (750 mL). Este procedimiento de macerado se repitió cuatro veces. Los filtrados de acetona se fueron llevando a sequedad cada vez. El resto sólido de la esponja extraída se dejó secar a temperatura ambiente (1 02 g).

Lo extraído de la esponja se suspendió de nuevo en 250 mL de agua Mili Q (18 Mohms), se transfirió a un embudo de decantación y se extrajo con n-BuOH (3 x250 mL). A continuación se lavó el agua con Et ₂ 0 (2 250 mL). Se reunieron todos los extractos orgánicos y se los llevó a sequedad conformando lo que constituye el extracto de la esponja (10,4 g) de un color rojo muy fuerte.

A continuación se realizó una cromatografía en columna Sephadex LH-20 al extracto eluyendo con MeOH. Para ello se utilizó una columna de dicha gel de las siguientes características: Longitud: 66 cm; diámetro interno 3,6 cm; volumen de muestra (en MeOH): 20 mL; volumen muerto: 275 mL; volumen de fracción 20 mL; flujo: 3 mL/min. En estas condiciones el producto deseado eluyó en las fracciones 2 a 14, con un fí _F de 0.46. La detección se hizo por cromatografía en capa fina desarrollando con la mezcla n-BuOH/AcOH/H ₂ O (6:1 .5:2.5; v/v/v), utilizando como revelador inmersión de la TLC en solución de ácido fosfomolíbdico (30 g) en etanol (hasta 1 L) y posterior calentamiento de la TLC.

A continuación se purificaron las fracciones provenientes de la columna Sephadex LH20 a través de una columna μ-Bondapakde Waters (7,8 ^χ 300 mm, 10 μιη de diámetro de partícula). Se eluyó con MeOH/NaCI 0.1 M (9:1 , v/v), a un flujo de 1 .5 mL/mín y detección por UV a 230 nm (PDA 996 de Waters). La fracción a purificar (184 mg) se disolvió en 1 ,5 mL de MeOH y se inyectaron 100 μΐ cada vez. Se empezó a recolectar a los 5 minutos y se hizo hasta el minuto 15, tomando fracciones cada 30 segundos. El producto eluyó en las fracciones 8 y 9.

A continuación se eluyó el producto a través de una columna Waters XBridge RP 18 (10 x 250 mm, 5 μιτι de diámetro de partícula). La elución se hizo con gradiente de MeOH/NaCI 0.1 M (60:40). El flujo fue de 5 mL/min y la detección por UV a 212 nm (PDA 996 de Waters). El gradiente fue de 60:40 (MeOH/NaCI 0.1 M) hasta 75:25 (<MeOH/NaCI 0.1 M) en 45 minutos y luego de 60:40 (MeOH/NaCI 0.1 M) durante 15 minutos para estabilizar la columna. La muestra (100 mg) se disolvió en 2 mL de MeOH y se inyectaron 100 μί cada vez. El producto eluyó del minuto 26 al minuto 35. Al final de procedimiento anteriormente descrito se obtuvieron 57,5 mg de la mezcla de crambescidínas 800 y 816 en proporción 1 :3.

Ejemplo 2: Ensayos biológicos de actividad dei extracto mezcla de crambescidinas 800 v 816 en proporción 1 :3.

ACTIVIDAD

El extracto de composición definida (mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3, respectivamente) posee actividad biológica como bloqueador/agonista parcial de los canales de calcio dependientes del voltaje en útero de rata.

Estudios de expresión génica

El análisis de la expresión de los canales de Ca ²⁺ en el útero se ha llevado a cabo mediante técnicas de RT-PCR, estudiando la presencia de los ARNm que codifican los distintos tipos de canales de Ca ²⁺ existentes. La metodología que se ha seguido ha sido la siguiente:

1 ) Extracción de ARN total a partir de la muestra.

2) Obtención de ADNc a partir del ARN total obtenido de las muestras, en una reacción con transcriptasa inversa.

3) Amplificación con los cebadores adecuados y mediante PCR de los ADNc procedentes de los ARNm de los distintos canales de sodio y de la β- actina (cuyo ARNm en el útero se mantiene en una tasa prácticamente constante).

4) Separación de los productos de amplificación mediante electroforesis en geles de agarosa y tinción con bromuro de etidío para su visualización a la luz UV.

5) Identificación de los fragmentos amplificados mediante la determinación de la secuencia del fragmento amplificado. Estudios funcionales

Para el estudio de la actividad farmacológica de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 se analizaron sus efectos sobre la contractilidad del miometrio de rata. La elección de esta preparación farmacológica se basa en el hecho de ser uno de los únicos músculos lisos que posee canales de Ca ²⁺ , K ⁺ y Na ⁺ funcionalmente activos por lo que proporciona un modelo sencillo para el estudio de los efectos de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 sobre canales dependientes de voltaje.

Empleamos ratas Wístar vírgenes con un peso comprendido entre 200 y 250 g. Todas las ratas utilizadas se encontraban de forma espontánea en la fase estro del ciclo hormonal. La determinación de la fase del ciclo ováríco se realizó mediante frotis vaginal. Se obtuvieron segmentos de músculo liso uterino longitudinal que se montaron en la copa de un baño de órganos conteniendo solución fisiológica de Krebs a una temperatura de 37 °C. Los segmentos uterinos, de aproximadamente 1 cm de longitud y 2-3 mm de anchura, se sometieron a una tensión inicial de 1 g y se fijaron a transductores ¡sométricos Grass FT-07, con el fin de detectar la contracción muscular y los cambios que se produzcan en la misma.

Para el estudio de la mezcla de crambescidinas800 y 816 se procedió a la adición de dosis acumulativas crecientes del compuesto (10 nM-0.3 mM) en preparaciones precontraídas por agonistas que actúan por distintos mecanismos:

1 ) KCI 40 mM, como modelo de contracción mediada primariamente por apertura de canales de Ca ²⁺ dependientes de voltaje de tipo L. En segmentos uterinos montados en paralelo se analizaron los efectos de la nifedipina (inhibidor altamente selectivo de canales de Ca ²⁺ dependientes de voltaje de tipo L, que son los predominantes en el músculo liso uterino) o su solvente. 2) veratridina 60 μΜ, con el fin de estudiar su posible efecto sobre los canales de Na ⁺ dependientes de voltaje. En segmentos uterinos montados en paralelo se analizaron los efectos de la tetrodotoxina (inhibidor altamente selectivo de canales de Na ⁺ ) o su solvente.

3) Contracciones inducidas por oxitocina (1 nM) y metacolina (10 μΜ). La oxitocina y la metacolina inducen contracciones a través de la activación de receptores específicos de membrana ligados a proteína G.

4) Contracciones espontáneas. En una solución fisiológica con Ca ²⁺ 1.9 mM, el segmento aislado de útero de rata desarrolla una motilidad espontánea. Resultados previos de nuestro grupo han demostrado que estas contracciones son dependientes de la presencia de calcio extracelular e inhibidas de forma dependiente de la dosis por la nifedipina, lo que demuestra su dependencia de la entrada de Ca ²⁺ en el citoplasma celular a través de canales dependientes de voltaje.

En cada preparación uterina se ha estudiado un único compuesto y la primera dosis se adicionó al baño 30 min después de la adición del agonista (en el caso de la oxitocina y la metacolina), 90 min después de la adición del agonista (en el caso de la veratridina) o tras la obtención de una meseta estable de contracción (en el caso del KCI). En todos los casos se realizaron experiencias control en segmentos uterinos montados en paralelo en las que se estudiaron a) los efectos del solvente de la mezcla de crambescidinas 800 y 816, adicionado a la preparación a los mismos tiempos que el compuesto y b) la respuesta del agonista a los mismos tiempos, sin adición de producto ni solvente. Igualmente, se han realizado controles inicíales y finales de KCI (40 mM) y metacolina (MCh, 10 μΜ) con el fin de identificar la existencia de posibles efectos inespecíficos conducentes a un bloqueo general de la contractilidad del segmento uterino.

Resultados

Los canales de Ca ²⁺ dependientes de voltaje son proteínas localizadas en la membrana celular que juegan un papel primordial en la regulación de un gran número de funciones celulares. Se trata de proteínas muy complejas, constituidas por una subunidad muy voluminosa, denominada cci , y varias subunídades auxiliares denominadas α ₂ , β, γ y δ. La subunidad ai que constituye el canal propiamente dicho, está constituida por cuatro motivos, cada uno de ellos con seis segmentos transmembrana de hélices en alfa. Existe una gran homología estructural entre los distintos canales iónicos dependientes de voltaje, como los de Na\ Ca ²⁺ y K ⁺ , lo que habla de su origen evolutivo, ya que todos parecen derivar de un gen ancestral común que ha sufrido una serie de duplicaciones a lo largo de la evolución.

La diversidad estructural de los canales de Ca ²⁺ deriva fundamentalmente de la existencia de distintas subunídades cc-i . Actualmente se conocen 10 subunídades cc-i , cada una de ellas codificada por un gen diferente. Recientemente se ha establecido una nomenclatura para estos canales que establece la existencia de tres subfamilias (Tabla 1 ). La subfamilia Ca _v 1 está constituida por cuatro miembros (Ca _v 1 .1 , Ca _v 1 .2, Ca _v 1 .3 y Ca _v 1 .4) e incluye los conocidos clásicamente como canales tipo L. La subfamilia Ca _v 2 está constituida por tres miembros (Ca _v 2.1 , Ca _v 2.2 y Ca _v 2.3) e incluye los conocidos clásicamente como canales tipo P/Q, N y R. La subfamilia Ca _v 3 está constituida por tres miembros (Ca _v 3.1 , Ca _v 3.2 y Ca _v 3.3) e incluye los conocidos clásicamente como canales tipo T.

Nombre Nombre del Nombre del

Nombre Nombre del

IUPHAR del gen gen de clásico gen de rata

receptor humano ratón

L Ca _v 1 .1 CACNA 1S Cacna ls Cacna ls

L Ca _v 1 .2 CACNA 1C Cacna lc Cacna lc

L Ca _v 1 .3 CACNA 1D Cacna ld Cacna ld

L Ca _v 1 .4 CACNA 1F Cacnalf Cacnalf

P/Q Ca _v 2.1 CACNA 1A Cacna 1a Cacna 1a

N Ca _v 2.2 CACNA 1B Cacna 1b Cacna 1b R Ca _v 2.3 CACNA 1E Cacnale Cacnale

T Ca _v 3.1 CACNA1G Cacnalg Cacnalg

T Ca _v 3.2 CACNA1H Cacnalh Cacnalh

T Ca _v 3.3 CACNA1I Cacnali Cacnali

Tabla 1. Canales de calcio dependientes de voltaje.

Se ha realizado un estudio previo con el fin de analizar la expresión y función de los canales de Ca ²⁺ en el útero de rata. La expresión de canales de Ca ²⁺ en el útero se ha realizado mediante amplificación por PCR a partir del ADN copia (ADNc), utilizando cebadores específicos para cada uno de los canales descritos en rata. Los resultados obtenidos demuestran que en el útero de animales no preñados, en la fase estro del ciclo hormonal, se expresan los canales Ca _v 1.1 , Ca _v 2.1 y los tres canales de la subfamilia Ca _v 3 (Figura 1 ). Entre ellos, cabe destacar la expresión del canal Ca _v 1.1 , responsable de las corrientes de Ca ⁺ tipo L que se han demostrado como mayoritarias y de carácter esencial en la regulación de la contracción uterina.

Paralelamente, se han realizado estudios de contractilidad sobre segmentos aislados de miometrio de rata no preñada, con el fin de estudiar la acción farmacológica de la mezcla de crambescidinas 800 y 816. La adición del compuesto sobre contracciones inducidas por KCI (que son debidas a la entrada de Ca ²⁺ a través de canales de tipo L) produjo una relajación dependiente de la dosis, aunque se necesitaron concentraciones muy superiores a las indicadas por Berlink y col. (J. Nal Prod. 1993, 56, 1007- 1015) para la aparición de los efectos. En segmentos uterinos montados en paralelo, la nifedipina mostró una potencia y eficacia muy superior, con una IC50 del orden nanomolar (Figura 2).

La adición de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 sobre contracciones inducidas por oxitocina (1 nM) o metacolina (10 μΜ) no indujo inhibición de las respuestas a estos agonistas. Por el contrario, a concentraciones iguales o superiores a 10 μΜ, la mezcla de crambescidinas 800 y 816 incrementó la contracción previa (Figura 3).

Se estudio a continuación los efectos de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 sobre las respuestas a la veratridina. La adición de veratridina (60 μΜ) en segmento aislado de útero de rata induce una contracción en la que pueden diferenciarse claramente dos fases. La primera fase, en la que se observan contracciones rítmicas de amplitud y frecuencia irregular y que se extiende durante un periodo de 40-60 min desde la adición del agonista al baño de órganos. En aproximadamente un 30% de los segmentos se produce una remisión completa de la respuesta. Se inicia entonces una segunda fase en la que la veratridina produce contracciones rítmicas de amplitud creciente, manteniéndose una frecuencia de contracción muy regular a lo largo de toda la experiencia. Esta respuesta es totalmente inhibida por la tetrodotoxina, demostrando su dependencia de la apertura de canales de Na ⁺ para permitir la entrada subsiguiente de Ca ²⁺ . Por el contrarío, la mezcla de crambescidinas 800 y 816 se mostró totalmente incapaz de inhibir la respuesta a la veratridina, lo que demuestra que no es capaz de interaccionar con canales de sodio. De forma similar a lo ocurrido con otros agonistas, la mezcla de crambescidinas 800 y 816 a concentraciones superiores a 1 μΜ, incrementó la contracción previa (Figura 4).

Se analizaron también los efectos inducidos por la mezcla de crambescidinas 800 y 816 sobre las contracciones fásicas espontáneas del miometrío (Figura 5). También en este caso, la mezcla de crambescidinas 800 y 816 indujo contracciones tónicas dependientes de la concentración. Estos resultados, en su conjunto, sugieren que la mezcla de crambescidinas 800 y 816 se comporta como un agonista parcial de canales de calcio dependientes de voltaje, necesitándose estudios más profundos para determinar de forma precisa su mecanismo de acción sobre estos canales.