本发明属于生物材料领域， 涉及创面处置， 具体涉及一种利用天然成分为原料制备 的医用黏合剂及其制备方法和用途。

背景技术

闭合外科伤口是手术治疗中必不可少的环节， 临床上超过 60%的伤口会利用缝线和 皮肤订书钉进行缝合。然而， 因为拆线导致二次就诊不仅增加了患者的就医 次数， 还可 能因为张力导致疤痕增生、 挛缩， 异物感染等风险。 而采用生物医学胶等无缝合方法， 可以简化手术步骤， 缩短恢复时间， 提高患者护理质量。

对于难愈合创口、 穿刺造成的深度创口以及湿性环境不易包扎的 创口， 是否能采用 医用黏合剂以封堵创伤面、 促进组织再生以及加速愈合， 目前未见研究成果。

致密结缔组织是指由少量基质和细胞， 多且致密的纤维组成的， 纤维粗大， 排列致 密， 以支持和连接为主要功能的组织， 包括真皮、 肌腱和韧带等。 肌腱包括将小腿肌肉 与跟骨相连的跟腱， 以及将膝盖骨与胫骨相连的髌腱。韧带包括位 于关节腔周围的囊外 韧带， 和位于关节腔内的囊内韧带。

致密结缔组织的损伤是常见的骨科疾病。 许多原因会导致致密结缔组织受到损伤， 包括过度使用、 扭伤、 疾病和一般老化， 等。 随着人类寿命的延长与越来越多的中年人 参与运动或者剧烈运动， 肌腱损伤和韧带损伤的发病率正逐年增高。肌 腱损伤可以分为 急性和慢性损伤， 其原因包括内在或外在的因素， 无论是内在因素或内外因素组合都会 引起肌腱损伤。肌腱损伤主要发生在运动和工 作场所， 这通常会导致患处疼痛、 僵硬和 肌腱强度损伤。 跟腱和髌腱损伤是最常见的两种运动肌腱损伤 。

肌腱损伤或韧带损伤在临床上仍是一个严重的 并且悬而未决的问题。目前对于肌腱 或韧带的断裂或撕裂， 通常使用缝合等外科方法治疗。 因为缺少血供等原因导致肌腱或 韧带损伤后易并发感染且愈合缓慢。而且目前 没有一种手术方案能使受损的肌腱或韧带 恢复到正常的组织结构和机械强度。 同时， 肌腱损伤会导致长期的不健全状态， 且无论 采用什么样的护理方法， 其造成的残疾可能会持续数月。现有的用于肌 腱病症的治疗管 理手段， 只有少数临床对照试验已经完成。大多数手段 仍然属于临床前的研究， 并且有 些治疗手段的结果具有争议。在大鼠的由胶原 酶诱导的跟腱炎模型中， 体外冲击波治疗 已被证明通过诱导 TGF- 0 (Transforming growth factor-beta, 转化生长因子 和 IGF-1 ( Ins v Lin-like growth factor 1， 胰岛素样生长因子 1 ) 的表达促进肌腱的 愈合； 在大鼠跟腱炎模型， 17赫兹脉冲磁场和电磁场可以提高胶原纤维的� ��列； 此外， 某些细胞因子和生长因子例如 TGF- P和 IGF-1，以及基因治疗和组织工程用的间充质干 细胞 (mesenchymal stem cell， MSC) 被用于肌腱损伤的治疗， 并表现出较好的前景。 但生长因子的价格昂贵并且容易降解， 给患者带来很大的经济负担。

利用医用黏合剂对致密结缔组织进行黏合治疗 以替代缝合治疗方法， 目前未见报道。 由于肌腱或韧带组织会随着人体活动而不断受 力，用于黏合肌腱或韧带组织的医用黏合 剂除了需要具备较强的黏合性以外， 还必须具备抵抗张力的效果。 同时， 基于术后恢复 的角度考虑，所使用的黏合剂必须具有良好的 生物兼容性， 易于被组织吸收和较高的生 物安全性。

对于致密结缔组织创面或伤口的临床处置合修 复，现有技术中缺乏供应充足， 生物 兼容性好， 黏结强度高， 且易于生物降解的医用黏合剂。 现有的医用黏合剂技术中， 在 临床替代缝合被广泛应用的主要是氰基丙烯酸 酯和血纤维蛋白。氰基丙烯酸酯有明显的 细胞毒性，黏合过程中因为剧烈的氧化还原反 应产热， 黏合后则出现显着的刚性和难降 解等缺陷， 使其难以应用于大面积、 位置显着的张力区伤口， 同时， 产热、 细胞毒性和 动物实验中的致瘤性限制了其进一步应用。而 血纤维蛋白虽在美容缝合中可与缝线搭配 使用， 以减少缝针的次数和瘢痕增生，但因为其固化 缓慢，机械强度差，很难单独使用。 可见， 上述两种医用黏合剂的应用范围狭窄， 完全不适合用于致密结缔组织的黏合剂。

大銳 (Andrias davidianus Blanchard) 为大型两栖纲、 有尾目、 隐觸銳科， 俗名 “娃娃鱼”， 属国家二级保护动物。 大銳在遇到外部刺激时， 身体表层会分泌出一种黏 液。 目前有研究成果显示可以利用大銳皮肤黏液干 粉制备黏合剂或止血剂。关于利用大 銳皮肤黏液干粉制备黏合剂， 中国发明专利 (CN104815349B)有公开一种大銳黏液制备 黏合剂的方法， 其仅初步披露大銳黏液经过 Y射线消毒后用于制造黏合剂的黏合性能， 未对这种方法产制出的大銳黏液有任何材料学 描述及检测。另一件中国发明专利公开第 CN106581736A号仅简单披露一种制造大銳黏液干粉 末的方法， 缺乏科学实证支持该方 法带来的效果。 另一件中国发明专利公开第 CN108421080A号披露了大銳分泌物水凝胶 制备方法，在制备成胶的过程中需要施加外部 压力，溶剂体系仅为水，且仅能成薄膜状， 使用不便， 且缺乏科学实证支持该方法带来的动物体内实 验效果。

以上显示大銳皮肤黏液制备的医用黏合剂仍有 缺陷亟待解决。 发明内容

综合上述现有技术的缺陷，本发明提供一种含 有大銳皮肤黏液成分的医用黏合剂及 其制备方法和用途， 以解决前述的技术问题。本发明提出的医用黏 合剂， 利用大銳皮肤 黏液具有强力黏合性能的特点， 将其制备成冻干粉末并灭菌后， 应用于手术创面或其他 伤口的愈合治疗， 其用途包括皮肤系统、骨骼系统和肌肉系统的 各式组织， 尤其对致密 结缔组织带来显着的效果。

本^明提供的医用黏合剂具备较好的安全性、� �好的生物兼容性、 可降解、 促再生 效果， 同时具有抗菌、 止血效果， 适合作为手术创面或伤口处的组织黏合剂或敷 料， 是 一种满足前述医用黏合剂需求的材料。

根据上述目的， 本发明提供一种医用黏合剂， 其中含有大銳皮肤黏液干粉和水性溶 液； 大銳皮肤黏液干粉和水性溶液的重量份数比例 介于 1 : 1至 1 : 6。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述医用黏合剂为凝胶状。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述大銳皮肤黏液干粉在医用黏合剂中的 重量含量百分比介于 14. 2%至 50%。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述医用黏合剂所含水性溶液的组份选自 蒸馏水、生理缓冲液、氯己定、血液、血浆、 血细胞制剂、富血小板血浆 (platelet-rich plasma, 简称 PRP) 、 富血小板血浆纤维蛋白 (platelet-rich fibrin， 简称 PRF) 或 上述任意组合。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述水性溶液所含生理缓冲液的组份选自 生理盐水、 磷酸盐缓冲液、 Tris缓冲液、 柠檬酸盐缓冲液或上述任意组合。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述凝胶状的医用黏合剂具有多孔结构。 根据本发明的目的，在优选实施方式中，前述 多孔结构的孔洞平均直径小于 116 ^y m。 根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述多孔结构的孔洞平均直径在 6 y m-37 y m之间。 根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述医用黏合剂所含的大銳皮肤黏液干粉 的颗粒尺寸为 -20目。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述医用黏合剂所含的大銳皮肤黏液干粉 的颗粒尺寸为 -60目至 +300目。

根据上述目的， 在另一方面， 本发明提供一种医用黏合剂的用途， 将医用黏合剂应 用在创面的黏合、 修复和愈合。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述用途所适用的创面包含位于表皮、 真 皮及皮下结缔组织的创面。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述用途所适用的创面包含位于骨骼肌、 肌腱、 韧带、 骨骼及 /或骨骼周围结缔组织的创面。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 使用本发明医用黏合剂的用途时， 是在创 面直接施用大銳皮肤黏液干粉以及水性溶液， 从而在创面直接形成医用黏合剂。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 使用本发明医用黏合剂的用途时， 是预先 使用大銳皮肤黏液干粉以及水性溶液制备成医 用黏合剂，再用于敷贴创面或用于封堵创 面。

根据上述目的， 在另一方面， 本发提供一种制备前述医用黏合剂的制备方法 ， 通过 以下步骤得到： 提供大銳皮肤黏液干粉； 对所述大銳皮肤黏液干粉进行灭菌； 以及

将灭菌后的所述大銳皮肤黏液干粉和水性溶液 混合， 进行成胶作用， 以形成凝胶状 的医用黏合剂， 其中医用黏合剂所含大銳皮肤黏液干粉和水性 溶液的重量份数比例为 1 : 1至 1 : 6, 大銳皮肤黏液干粉在医用黏合剂中的重量含量 百分比介于 14. 2%至 50%。

根据本发明的目的， 在优选实施方式中， 前述医用黏合剂的制备方法中， 提供大銳 皮肤黏液干粉的步骤更包含： 从活体大銳皮肤取得大銳皮肤黏液； 将大銳皮肤黏液进行 冷冻干燥；以及对冷冻干燥后的大銳皮肤黏液 进行研磨及粉碎，形成大銳皮肤黏液干粉。

根据本发明的目的， 根据优选实施方式， 前述医用黏合剂的制备方法中， 大銳皮肤 黏液干粉的颗粒尺寸为 -20目。

根据本发明的目的， 根据优选实施方式， 前述医用黏合剂的制备方法中， 大銳皮肤 黏液干粉的颗粒尺寸为 -60目至 +300目。

根据本发明的目的， 根据优选实施方式， 前述医用黏合剂的制备方法中， 灭菌是利 用环氧乙烷达成。

根据本发明的目的， 根据优选实施方式， 前述医用黏合剂的制备方法中， 水性溶液 的组份选自蒸馏水、 生理缓冲液、 氯己定、 血液、 血浆、 血细胞制剂、 富血小板血浆、 富血小板血浆纤维蛋白或上述任意组合。

根据本发明的目的， 根据优选实施方式， 前述医用黏合剂的制备方法中， 生理缓冲 液的组份选自蒸馏水、 生理缓冲液、 氯己定、 血液、 血浆、 富血小板血浆、 富血小板血 浆纤维蛋白或上述任意组合。 附图说明

图 1表示本发明医用黏合剂的制备方法步骤流程� �。

图 2表不本发明实施例 1描述的大銳（a） ;米用机械刮擦法获取大銳皮肤黏液（b）; 大銳皮肤黏液干粉（c） ; 医用黏合剂对组织的黏性拉丝的型态（d） ; 大銳皮肤黏液干 粉成胶的形态 （e） 。

图 3A表示本发明实施例 2通过不同过筛取得不同颗粒尺寸的大銳皮肤� �液干粉 （SSAD粉） 以及大銳皮肤黏液干粉经过成胶后， 水化成水凝胶状态的扫描电镜 （SEM） 图像。 从该图像中可以看出成胶后孔径的大小。

图 3B表示本发明实施例 2不同成胶时间 （2h和 12h） 医用黏合剂中多孔结构的孔 径分布。

图 3C表示本发明实施例 2之多种灭菌方案所达成的灭菌效果数据图（a� ��果及黏附 强度数据图 （b） 。

图 4A表示本发明实施例 3的医用黏合剂和两种常见商用市售医用黏合� �的体外黏 附性能比较，其中以猪皮为生物基质，做标准 伤口闭合检测医用黏合剂的黏附强度（n=4）: 改良的黏附强度标准试验方法 （ASTM F2458-05） 示意图 （i） ; 有代表性的应变 -应力 曲线（i i） ; 不同医用黏合剂黏附强度的定量比较（i i i） （统计上的差异： ** P á 0. 01， *** P < 0. 001） _o

图 4B表示本发明实施例 3医用黏合剂和两种常见商用市售医用黏合剂� �体外黏附 性能比较， 其中以猪皮为生物基质， 进行猪皮下脂肪面黏附后的剪切强度测试： 改良的 剪切试验标准方法 （ASTM F2255-05） 示意图 （i） ; 有代表性的应变-应力曲线 （i i） ； 不同医用黏合剂黏附强度的定量比较（i i i）（统计上的差异: ** P á 0. 01，*** P á 0. 001）。

图 4C表示本发明实施例 3医用黏合剂和两种常见商用市售医用黏合剂� �外黏附性 能比较， 其中以猪皮为生物基质，采用改良三点弯试验 法测定猪皮肤经过医用黏合剂黏 结后的弹性和延展性： 改良三点弯曲实验法检测猪皮肤黏接后弹性和 延展性的示意图 （i） ; 具有代表性的应变-位移曲线 （i i） ; 不同医用黏合剂在固定形变 （11. 5%） 需 要荷载力的定量比较（i i i） （统计上的差异： * P á 0. 05, ** P á 0. 01， *# P á 0. 001）。

图 5A表示本发明实验例 3医用黏合剂的细胞划痕实验结果。

图 5B表示本发明实验例 3医用黏合剂的细胞划痕实验的统计分析结果� �

图 5C表示本发明实验例 3医用黏合剂的 transwel l小室实验结果。

图 6表示本发明实施例 4中 SSAD治疗组与其他 4组伤口闭合方法的体内效果比较 图。 其中， 图 6a表示第 0、 1、 3、 5天大鼠皮肤切口图像； 图 6b表示切口损伤组织的 H&E染色图像， 并分别以标号指出表皮 （E） 、 真皮 （D） 、 痂 （SC） 、 切口位置（★） 、 伤口面积 （以框线标出） 、 未降解的氰基丙烯酸酯黏合剂 （CA） 和纤维蛋白胶 （FG） 。

图 7表示本发明实施例 5的糖尿病 SD大鼠体内全层皮肤缺损伤口愈合率及质量评 价。 图 7a表示肉眼观察第 3、 7、 14、 21天的伤口愈合情况） ； 图 7b表示第 3、 7、 14、 21天的伤口愈合统计分析结果； 图 7c表示各组缺损组织表皮愈合的组织学观察， 黑色 线条为皮肤厚度的测试线 （标尺 = 3 mm） ; 图 7d表示各组伤口的皮肤厚度定量检测统 计结果； 图 7e表示第 21天对皮肤缺损行马松（Masson）染色的结果， 并对应标记毛囊 （HF） 、 皮脂腺（SG） 、 血管（BV） ； 图 7f表示各视野内血管、 毛囊、 皮脂腺数量（标 尺 =50 y m） ;图 7g表示血管生成相关标记物⑶ 31和 a -SMAi3的染色结果， 以判断伤 口部位的血管新形情况。 （* p á 0. 05, ** p á 0. 01） 。

图 8表示本发明实施例 6体内医用黏合剂降解的组织学分析。

图 9表示本发明实施例 9医用黏合剂对肌腱治疗效果评估的大鼠跟腱� �断缺损模型 手术操作图。

图 10表示本发明实施例 9 , SD大鼠的最大脚印长度 （脚掌触地的最大长度） 对比 图片， 上侧 （右腿）为实验腿， （对比正常对照组可知， 脚印长度越短， 表示愈合越良 好） 。

图 11表示本发明实施例 9， SD大鼠实验侧的步长 （Stride length， 同一脚掌连续 两个脚印中点之间的距离） 图片 （对比正常对照组可知， 步长越大表示愈合越好） 。

图 12表示本发明实施例 9, 步行周期中的实验侧的站立时间 （是指脚掌在一个步 行周期中脚掌接触地面的时间） ， 横框越宽表示接触时间越长 （对比正常对照组可知， 接触时间越短愈合越好） 。

图 13表示本发明实施例 9, SD大鼠手术 28天后的大鼠右后腿（实验侧）跟腱切片 HE染色照片。 其中， 空白对照组 （a） 可见肌腱内胶原排列混乱， 细胞未见明显取向； SSAD治疗组 （b） ， 可见肌腱内胶原排列一致， 细胞可见明显取向。

具体实施方式

为了使本发明的目的、 技术特征及优点， 能更为相关技术领域人员所了解， 并得以 实施本发明， 在此配合所附的附图、 具体阐明本发明的技术特征与实施方式， 并列举较 佳实施例进一步说明。 以下文中所对照的附图， 为表达与本发明特征有关的示意， 并未 亦无需依据实际情形完整绘制。而关于本案实 施方式的说明中涉及本领域技术人员所熟 知的技术内容， 亦不再加以陈述。

原始采集到的大銳皮肤黏液为胶冻状， 难于彻底杀菌， 且不便于保存， 临床使用存 在一定的难度。为解决上述缺陷，本发明采用 的技术方案是提供含有大銳皮肤黏液干粉， 经过质量确认并充分灭菌后， 与水性溶液混合形成的医用黏合剂。医用黏合 剂含大銳皮 肤黏液干粉与水性溶液的重量比例介于 1 : 1至 1 : 6之间， 即 1份大銳皮肤黏液干粉与 1至 6份水性溶液相配合（下文说明中，将大銳皮� �黏液干粉以及水性溶液的重量比例， 简称为“粉水比例”） 。 经由上述配制， 大銳皮肤黏液干粉在医用黏合剂中的重量含量 介于 14. 2%至 50%。 水性溶液可以选用纯水或含有生物兼容性物质 的水溶液， 且此谓生 物兼容性物质主要是指，加入生物兼容性物质 配制后的水性溶液不导致大銳皮肤黏液中 的活性有效成分失活。 优选的， 水性溶液可选自以下任意一种或多种： 蒸馏水、 去离子 水、 生理盐水 （0. 9 % NaCl缓冲液） 、 磷酸盐缓冲液 （PBS） 、 Tris缓冲液 （TBS） 、 柠檬酸盐缓冲液、氯己定水溶液（优选浓度为 2 %）可被临床使用接受的水溶液。此外， 水性溶液亦包含人类全血， 以及含有水分的人类血液提取物， 包括血浆、 血清、 血浆、 血细胞制剂、 富血小板血浆（PRP） 、 富血小板血浆纤维蛋白 （PRF）等亦适用。 基于本 发明的目的， 创面或伤口处渗出的血液或体液亦可作为水性 溶液的一部分。

除了大銳皮肤黏液干粉以及水性溶液为必要组 份之外， 为制作易于保存、运送和临 床应用的产品，对于将进一步搭配其他组分或 原料制成适合使用的医用黏合剂产品，在 此不做限制。具体举例， 根据本发明优选实施方式， 本发明所提供的医用黏合剂的配方 中还可包含具有止血、 消炎或促进组织生长的其他成分， 本发明对此不加限制。

本发明中， 大銳皮肤黏液干粉及水性溶液的配比， 以及水性溶液所含有的成分和浓 度经设计， 使得医用黏合剂具备理想的多孔结构， 并且具备良好的生物兼容性， 适合应 用于人体及其他动物组织的黏合， 尤其是致密结缔组织、 皮肤组织、 皮下的脂肪组织、 骨骼系统或前述不同类型组织之间的黏合。

根据本发明的优选实施例之一， 医用黏合剂的制备方法包含如下步骤： 从大銳皮肤 取得黏液， 将黏液冷冻干燥； 将冷冻干燥后的大銳皮肤黏液进行研磨及粉碎 ， 过筛后得 到粒径符合要求的大銳皮肤黏液干粉， 作为品质确保的条件之一； 对大銳皮肤黏液干粉 进行灭菌， 保存备用。

以下依据附图说明优选技术方案。如图 1所示， 本发明提供一种医用黏合剂的制备 方法， 包括以下步骤。 步骤 1 : 从大銳皮肤取得黏液， 将黏液冷冻干燥； 步骤 2: 将冷 冻干燥后的黏液在冷冻状态下粉碎， 随后过筛得到特定粒径范围的粉末； 步骤 3: 对粉 末进行灭菌， 即得到大銳皮肤黏液干粉； 以及步骤 4: 将灭菌后的大銳皮肤黏液干粉及 水性溶液依 1 : 1至 1 : 6的重量配比混合形成凝胶状的医用黏合剂。 优选的， 制备医用 黏合剂所使用大銳皮肤黏液干粉与水性溶液的 混合比例为 1 : 2至 1 : 6。 前述步骤 1之收集黏液方法， 应严格按照中国的动物保护法进行， 可以无须杀害大 銳亦可避免大銳的永久残疾。可以采用刮擦法 或电刺激法。亦可将商业养殖的大銳处死 之后采集黏液。 本发明对此不做限制。

前述步骤 2, 将收集到的大銳皮肤黏液冻干， 在低温状态下经球磨机粉碎后研磨成 细粉。 为得到特定粒径（颗粒尺寸不超过特定规格） 的粉末， 可采用不同目数的筛子过 筛。

由于国际上对过筛目数的标准略有差异，本发 明优选采用中国常用的泰勒标准筛制 定义过筛目数， 其分度是以 200目筛孔尺寸 0. 074mm为基准， 详细计算方式为本领域技 术人员的常规知识， 不再赘述。然而， 利用此标准描述本发明大銳皮肤黏液冻干粉的 颗 粒尺寸时， 目数前加正负号表示研磨或粉碎后粉末能否漏 过该目数的网孔， 负数表示粉 末能漏过该目数的网孔， 表示过筛后取得的粉末颗粒尺寸小于网孔尺寸 ； 而正数表示粉 末不能漏过该目数的网孔， 即过筛后取得粉末的颗粒尺寸大于网孔尺寸。

其中， 为获得较好的大銳皮肤黏液干粉性能， 本发明大銳皮肤黏液冻干粉的颗粒尺 寸为 -20 目， 表示过筛目数大于 20目 （通过实验取得对应的实际粒径大致上小于 850 y m） _; 根据优选实施方式， 大銳皮肤黏液冻干粉的颗粒尺寸为 -60目至 300目 （通过 实验取得对应的实际粒径大致上介于 50〜 250 y m; ） 。 在具体作法上， 要取得颗粒尺 寸为 -20目的粉末， 是采用目数大于 20目的筛子过筛， 通常可得到粒径不超过 850 y m 的大銳皮肤黏液干粉。

完成步骤 2之后， 可将粉末储存在低于 -20 ^° C冰箱中备用。

前述步骤 3, 对步骤 2所得到的粉末进行灭菌与消毒。 此步骤是将制品应用至临床 使用的重要步骤， 攸关临床使用的性能。依据相关法规， 未经灭菌消毒的大銳皮肤黏液 相关产品无法直接应用于临床。 而且， 分泌于活体大銳体表的黏液， 经步骤 1所采集时 有可能含有对人体有潜在危害的病毒或病菌， 病毒或病菌无法经由步骤 2的冻干彻底灭 活， 若直接用于创口表面， 将增加伤口感染可能。 大銳皮肤黏液的主要成分是蛋白、 多 肽、黏多糖和抗菌肽等活性成分， 最优的灭菌方法是既不会破坏和改变生物大分 子的结 构， 也不会导致大銳皮肤黏液干粉的黏附性能和生 物活性降低。根据当前的技术， 大銳 皮肤黏液相关产品的消毒灭菌方法包括低温、 紫外线、钴射线、消毒剂灭菌法。优选的， 本发明步骤 3的灭菌与消毒选用环氧乙烷灭菌法。

前述步骤 4, 将大銳皮肤黏液干粉与水性溶液混合后成胶， 形成凝胶状的医用黏合 剂。水性溶液， 包含但不限于蒸馏水、 去离子水及 /或生理缓冲液， 例如生理盐水（NaCl 缓冲液） 、 磷酸盐缓冲液 （PBS） 、 Tris缓冲液 （TBS） 、 柠檬酸盐缓冲液； 还可包含 2%氯己定、 人类全血、 富血小板血浆（PRP） 、 富血小板血浆纤维蛋白 （PRF） 、 血浆及

/或血细胞制剂等， 并可视需求组合使用这些组份。

根据本发明之优选实施方式， 本发明进一步提供一种医用黏合剂的用途， 具体是指 在创面的黏合、 修复和愈合中的用途。 优选的， 根据本发明的医用黏合剂性能， 特别适 用于致密结缔组织的创面， 具体而言， 创面包含但不限于位于表皮、 真皮及皮下结缔组 织的创面； 必须特别强调的是， 医用黏合剂更尤其能够满足骨骼系统和肌肉系 统中的创 口黏合需求， 因此创面更包含但不限于位于骨骼肌、 肌腱、 韧带、 骨骼及 /或骨骼肌周 围结缔组织的创面。

基于上述用途， 进一步根据本发明的优选实施方式， 以两项方法作为范例， 说明使 用医用黏合剂的使用方法， 其包括但不限于： 方法一，根据创面或创口的出血及体液渗出液 ， 直接施用适量的大銳皮肤黏液干粉 以及适量水性溶液，以在创伤面直接成胶从而 形成凝胶状，以达到较好的伤口黏合效果。 其中，在施用水性溶液时，较优选的作法是将 创面或创口的出血和体液渗出液的体积一 并纳入估算后再施用适量水性溶液， 选择合适的粉水比例再施用， 以保持较理想的伤口 黏合效果。若创面或创口的出血和体液渗出液 的体积与所施用的大銳皮肤黏液干粉可以 顺利成胶并达到较好的伤口粘合效果， 则可不另外加施用水性溶液。

方法二， 按照 1份大銳皮肤黏液干粉， 与 1〜 6份重量比例的水性溶液相混合之后， 形成任意形状的凝胶， 其形状可符合创面或创口的特殊需形态（立体 形状、 表面积、 厚 度等） 以满足治疗需要。对于出血量较大或组织液渗 出较多的创口， 选择合适的粉水比 例， 使凝胶施用于创口后可以吸收创口的组织液进 一步溶胀形成凝胶状， 以起到止血， 湿性黏结和保持创口干燥的效果。

以下列举实施例具体说明本发明之技术方案与 对应达成之效果。

实施例 1 : 医用黏合剂制备

请参考图 2, 如前述步骤 1， 取出活体大銳 （如图 2a） ， 采用机械刺激法获取大銳 黏液（如图 2b） ， 并采集大銳黏液备用。 步骤 2, 将收集到的大銳黏液制成干粉（如图 2c） （白色粉末） 。 在此过程中， 在采集之后尽快将大銳黏液冻干， 从完成采集到开始 冻干的时间不超过 1小时 （以下简称并标示为“h” ） 。 冻干的速度设定为每小时下降 10〜 15 ^° C， 在 4 h内温度降到 -20 ^° C。 随后粉碎得到细粉， 去除粒径不符合要求的细粉， 得到粉末粒径不超过一定范围的干粉。 在本实施例中， 使用目数分别为 14、 20、 60、 100、 200、 300目的筛子过筛， 得到粒径小于筛孔直径的干粉， 将干粉置于密闭容器内 冷臧保存备用。

步骤 3, 采用环氧乙烷对前述干粉进行灭菌处理。 将前述得到的干粉封装入环氧乙 烷专用灭菌包装袋中，或装入开口容器并在容 器口疏松塞入棉球后封装入环氧乙烷专用 灭菌包装袋中。将该灭菌包装袋放入环氧乙烷 （E0）灭菌容器，使用环氧乙烷进行灭菌， 灭菌时间和温度以不破坏干粉性能为原则，不 特地加限制。随后将完成灭菌的干粉放置， 待残留的环氧乙烷挥发。 最后， 参考 《GB/T 16886. 7 -2001“医疗器械生物学评价” 》 第七部分： “环氧乙烷灭菌残留量评价环氧乙烷的残留” 检验环氧乙烷残留率。 检验合 格后， 即完成整体灭菌步骤。

此外，为说明本发明优选采用环氧乙烷的效果 ，针对不同灭菌方法进行评估和效果， 说明如下。 首先， 总体针对可能的灭菌方法评估， 采用低温、 紫外线的灭菌效果有消毒 不完全的疑虑， 杀菌处理时间较长，且经低温或紫外线消毒的 大銳皮肤黏液干粉易于发 生水解， 保存期限较短； 而 Y射线方法由于涉及放射线， 操作较为复杂， 且会降低大銳 皮肤黏液相关产品的黏附性能。

针对本发明提出之环氧乙烷灭菌方法， 优选参考 GB 18279-2000“医疗器械环氧乙 烷灭菌确认和常规控制” 国家标准执行具体灭菌步骤：将粉碎后的大銳 皮肤黏液冻干粉 封装入环氧乙烷专用灭菌包装袋中， 或装入开口容器后， 容器口疏松塞入棉球， 封装入 环氧乙烷专用灭菌包装袋中。 将该灭菌包装袋放入环氧乙烷（E0）灭菌容器� �� 使用环氧 乙烷， 灭菌参数为 100%环氧乙烷， 54摄氏度， 灭菌 60分钟， 解析 15小时。 灭菌后参 考 GB/T 16886. 7-2001“医疗器械生物学评价”第七部分： 环氧乙烷灭菌残留量评价环 氧乙焼的残留 （残留率应＜10ppm） 完成检验合格后， 即完成整体灭菌步骤。

依据临床安全性需求， 针对上述环氧乙烷的灭菌方法， 其灭菌性能与目前其他灭菌 方案的比较结果如图 3C所示。 结果显示， 环氧乙烷消毒方法和钴射线消毒方法， 其灭 菌效果优于低温灭菌 （包括 -20 ^° C、 -50 ^° C、 -80 ^° C和液氮） 和紫外线 （如图 3C-a） ， 而 钴射线消毒方法对于黏附性能有较大影响， 环氧乙烷消毒方法能兼顾良好的黏附性能 （如图 3C-b） ， 是对于大銳皮肤黏液干粉最佳的消毒灭菌方法 。

若无特别说明， 以下各实施例所使用的干粉（通常简称或标示 为“SSAD”）均为通 过上述步骤所得到。

如前述步骤 4, 将上述检验合格的大銳黏液干粉与选定的水性 溶液混合， 即可得到 凝胶状的医用黏合剂。本发明医用黏合剂适用 的大銳皮肤黏液干粉与水性溶液的重量比 例为 1 : 1至 1 : 6, 优选的重量比例为 1 : 2至 1 : 6， 即 1份大銳皮肤黏液干粉与 2至 6份重量份数的水性溶液混合后得到。 本实施例的凝胶状的医用黏合剂中， 大銳皮肤黏 液干粉的优选重量含量为 14. 2%至 50%。

本发明设计大銳黏液干粉和水性溶液的重量比 例， 赋予本发明医用黏合剂特殊、实 用且优良的凝胶性能。具体而言， 当大銳皮肤黏液干粉与水性溶液混合时， 多肽交联网 络膨胀而不是溶解， 混合后会改变大銳皮肤黏液干粉由氢键、 二硫键， 共辄键驱 动的纠缠蛋白网络， 形成凝胶体（如图 2d和 2e所示） ， 此过程称为“成胶”。 在成胶 过程中， 多肽链的氨基酸残基发生构象转变， 形成凝胶状的医用黏合剂， 酚醛羟基和氨 基作为氢键供体向高表面能或亲水界面转变， 通过氢键和范德瓦尔斯力促进生物黏附。 另外， 苯环在接触低表面能或疏水界面时，会通过 Jr - Jr电子或阳离子 - Jr相互作用与基 底形成强烈的相互作用。

基于上述本发明医用黏合剂之特性，鉴于人体 或动物的伤口界面富含蛋白质等细胞 外基质， 因此在制备凝胶时需要选择合适的粉水比例， 使医用黏合剂中的活性物质、 水 性溶液和伤口组织中细胞间质液， 发生协同作用， 使得医用黏合剂与伤口之间通过氢键 和范德华力形成最佳的黏附力。

由上可知， 水性溶液可以选择纯水亦可选择临床上可接受 的水溶液， 其中可适度包 含生物兼容性物质，生物兼容性物质的选择以 不会导致大銳皮肤黏液中的活性有效成分 失活和并不影响成胶为限。 因此， 除了使用人工制备的水性溶液之外， 创面或伤口中所 渗出的血液、 组织液亦可作为水性溶液或混合前述水溶液共 同形成水性溶液。

此外， 由于手术创面和伤口通常处于体表和外部接触 的接口位置， 同时面临外界温 度变化和人体组织恒温约 37 ^° C的环境， 在成胶上须要求良好性能。 因此， 于本实施例 中， 在 4 ^° C或 37 ^° C条件下分别评估医用黏合剂的成胶情况� � 将 100 mg大銳皮肤黏液干 粉和 200 y L PBS （水性溶液） 均匀混合后， 缓缓倒入模具内， 在 4 ^° C或 37 ^° C温度下静 置 3分钟以上， 直到其凝结成凝胶状作为医用黏合剂。实验表 明， 大銳皮肤黏液干粉与 水性溶液可以迅速形成具有粘性的凝胶。

实施例 2: 医用黏合剂结构分析

本发明提供的医用黏合剂在成胶后具有多孔结 构，使其在临床应用时， 可以利于组 织液中营养物质和代谢产物的交换。

以扫描电子显微镜 （Hitachi， S-3400N I I， Japan） 分析本发明实施例 1所得到的 不同颗粒尺寸 （粒径） 的大銳皮肤黏液干粉 （SSAD粉） 的多孔结构， 通过扫描电镜分 析显示为不均匀的块状， 如图 3A所示。然而， 当大銳皮肤黏液干粉与水性溶液混合时， 团块中的多肽链会膨胀， 并相互渗透形成具有三维蜂窝结构的， 凝胶状的医用黏合剂 （SSAD水凝胶） 。

扫描电镜分析显示，三维蜂窝结构的孔洞平均 直径随着使用的大銳皮肤黏液干粉粒 径的减小而相应减小； 孔洞平均直径与水粉比例的关联性没有统计学 意义， 未发现水分 比例会显著影响孔洞平均直径。其中粒径为 -14目的大銳皮肤黏液干粉水化形成凝胶的 孔洞平均直径为 116微米， 粒径 -60目的孔洞平均孔径为 37微米， 粒径 -300目的孔洞 平均孔径为 6微米。 此外， 随着成胶时间的增加， 多孔结构更加明显， 孔洞尺寸更加均 匀。 在凝胶化 12小时后的孔洞结构中， 空穴侧壁密度增大 （成胶 12h） ， 明显大于凝 胶化 2小时后的侧壁 （成胶 2h） ， 表明随着水化时间的延长， 多孔网络的结构趋于稳 定。 分析多孔结构的孔径和孔隙尺寸的一例结果如 图 3B所示。

实施例 3: 医用黏合剂对于组织黏附强度的体外测定

本实施例主要依据 ASTM （美国测试与材料协会） 标准进行测试， 以市售商用的医 用黏合剂氰基丙烯酸酯（cyanacrylate）和纤维蛋 白胶做为对照， 以评估黏附效果。 其 中因应材料和操作环境不同做出的改良， 应为本领域技术人员可理解且可接受， 不再赘 述。

本实施例使用万能试验机（MTS Criterion， Model 43, USA）进行实验室剪切试验。 具体做法是以猪皮用作组织基质， 将猪皮切成 1 X 8平方厘米的长方形。 分别利用氰基 丙稀酸酯 （Baiyun Medical Adhensive® 中国广州） （附图标示“商用胶” ） 、 纤维蛋 白胶 （FIBINGLURAAS® 中国上海） （附图标示“生物胶”）和大銳皮肤黏液干粉 制成的 医用黏合剂（附图标示“SAAD治疗组”） ， 用二种方式黏接： 其一为切口对位黏附（切 口边缘对切 _^边缘） ， 另一为皮下脂肪与皮下脂肪黏附， 其作法与结果分别示意如图 4A及 4B所示。

针对 SSAD治疗组， 试验的具体作法是称量 30 mg大銳皮肤黏液干粉涂在猪皮上， 用移液枪加入 60-180 y L的 PBS （重量比例约为 1 : 2至 1 : 6） ， 形成医用黏合剂。 另 一方面对照试验的生物胶组及商用胶组则根据 制造商的说明，分别使用纤维蛋白胶和氰 基丙烯酸酯， 按照前述的两种方式黏接猪皮。黏接两小时后 ， 在万能试验机上分别测试 黏接部位的黏接能力。

采用搭接剪切试验， 根据 ASTM F2255-05标准确定三组材料的抗剪强度。 针对切口 对位黏附方式（如图 4A-i图所示）的抗剪切黏附能力，在商用胶组� �达到 40. 71 土 3. 71 kPa， 生物胶组的黏附强度只有 3. 76 ± 0. 16 kPa， 而在 SSAD治疗组则是 26. 66 土 8. 22 kPa （如图 4A-i i及图 4A-i i i所示） 。 此结果显示， 与生物胶组相比， SSAD治疗组的 黏合强度 （P á 0. 05） 和商用胶组的效果差异 （p á 0. 01） 有显着统计意义。 其中， 生 物胶组试验结果显示纤维蛋白胶的低黏接性能 符合其使用说明：纤维蛋白胶不是单独使 用而是需要配合使用缝合线。 需特别说明的是， 搭接剪切试验的结果显示， 商用胶组的 断裂应变远高于 SSAD治疗组， 在试验过程中有部分表皮被破坏， 显示氰基丙烯酸酯黏 结剂对皮肤胶黏剂的黏附能力可能过高， 反而造成表皮受损的负面效应。此外， 虽然商 用胶组黏接能力在三组中最强， 但只有表皮层能够黏合， 皮下脂肪层不能黏合（图未示 出） 。

相比之下， 在使用皮下脂肪与皮下脂肪黏附（如图 4B-i所示）的方式黏接猪皮时， SSAD治疗组的黏附能力明显优于商用胶组和生� �胶组。根据如图 4B-i i及图 所 示， SSAD治疗组在皮下脂肪的黏附能力有显着的抗� �切黏附能力， 剪切黏附力约为 26. 11 土 7. 72 kPa， 而其余两种黏合剂的剪切黏附力则小于 7kPa。

生物胶黏剂除了具有良好的黏结性能外， 还要求具有良好的弹性和延展性， 因此， 除了黏附力之外， 本实施例进一步针对前述三种材料进行黏接后 弹性和延展性的试验， 结果如图 4C所示。 具体的试验方式是以猪皮为生物基质， 采用改良自三点弯曲法的三 点黏合测试， 测定猪皮肤经过黏结后的弹性和延展性。 三点黏合测试是在猪皮中间做 2 厘米切口 （如图 4C-i所示意）， 用 100N测力传感器以 lmm/min的速度将黏结样品加载 至完全分离， 检测造成相同位移需加载的应力 （载荷） ， 进而得到具有代表性的应变 _ 位移曲线 （如图 4C-i i所示） 以及固定形变所需的载荷力定量 （如图 4C-i i i） 。 比较 前述三种材料的测试结果显示， 在达到相同形变时， SSAD治疗组只需要 7. 84 ± 1. 17 N， 类似于生物胶组 （7 ± 0. 99N） ， 但显著低于商用胶组 （12. 33 ± 1. 53N） （图 4A、 4B、 4C所示统计上的差异： * P á 0. 05， ** P á 0. 01 , *** P á 0. 001） 。 试验结果表明氰基丙烯酸酯黏合剂提供刚性黏 接，而本发明的医用黏合剂可以为皮 肤提供一个柔韧的黏结，显示本发明医用黏合 剂的黏接性能更适合用作皮肤和组织胶黏 剂。

以上利用猪皮进行的黏附能力、 抗剪切能力、 弹性、 延展性测试， 比较本发明医用 黏合剂与目前临床上常用的二种医用黏合剂（ 氰基丙烯酸酯合成胶和纤维蛋白胶）， 整 体结果显示本发明提供的医用黏合剂在不同的 基质上表现出优越的黏合性能。

为测试本发明医用黏合剂对骨骼的粘合性能， 本实施例使用万能试验机 （MTS Criterion, Model 43, USA） 进行实验室剪切试验。 具体做法是以骨头作组织基质， 将 兔子股骨使用骨剪在中 1/2处剪断， 利用大銳皮肤黏液干粉制成的医用黏合剂，进 行对 位粘合， 粘合 lOmin后进行剪切试验， 最终得到的粘结强度结果为 38. 5 ± 11. 2KPa。

针对本发明医用黏合剂用于创面或伤口黏合的 性能（抑菌效果、抗氧化效果、 细胞 迀移效果） 进行了体外试验与比较， 分别以下列实验例说明。

实验例 1 : 抑菌效果实验

配置需氧菌实验所用的大銳皮肤黏液浸提液： 称取 lg无菌大銳皮肤黏液干粉， 加 入适量 LB （营养肉汤培养基） 培养基使銳皮肤黏液干粉充分吸水溶胀后， 再继续加入 培养基， 最终使液体培养基的量达到 10mL， 在 4 ^° C冰箱中放置 24小时完成浸提。

配置厌氧菌实验所用的大銳皮肤黏液浸提液： 称取 lg无菌大銳皮肤黏液干粉， 加 入适量 TSB （胰蛋白胨大豆肉汤培养基）培养基使其充分 吸水溶胀后， 再继续加入培养 基， 最终使液体培养基的量达到 10mL，在 4 ^° C冰箱中放置 24小时完成浸提。

需氧菌选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌， 培养方法如下： 配置需氧菌实验所用的浸 提液， 浸提 24小时之后， 将浸提液以 3000r/min离心 3分钟， 以获得最终浸提液。 在 50mL离心管中加入大銳皮肤黏液浸提液 10mL， 接种 500 y L菌液， 混合均匀， 立刻放入 培养箱中。

厌氧菌选用牙龈卟啉单胞菌， 培养方法如下： 配置厌氧菌实验所用的浸提液， 浸提 24小时之后， 将浸提液以 3000r/min离心 3分钟， 以获得最终浸提液。 在 50mL离心管 中加入大銳皮肤黏液浸提液 10mL， 按照 5%浓度羊血， 每管中加入 500 y L羊血， 再分别 接种同浓度 500 y L菌液， 混合均匀， 立刻放入厌氧培养箱中。

空白对照组的配置方法如下。 需氧菌： 离心管中加入 LB培养基 10mL， 接种与实验 组同浓度的菌液， 作为空白对照组。 厌氧菌： 离心管中加入 TSB培养基 10mL， 500 y L 羊血， 接种与实验组同浓度的菌液， 作为空白对照组。

细菌检测方法如下。大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌的检测： 吸亮度的测定采用酶标仪 （EnSpire， PerkinElmer， 新加坡） ， 操作方法为从第 0小时起， 每隔 2小时吸取各组 混合均匀的液体以 100 y L每孔加入 96孔板中， 设置三个副孔。 在 0D=600的条件下， 测定各组的吸亮度。 数据如表 1和表 2。

牙龈卟啉单胞菌的检测： 吸亮度的测定采用酶标仪， 操作方法为从第 0天起， 每天 吸取各组混合均匀的液体以 100 y L每孔加入 96孔板中， 设置五个副孔。 在 0D=600的 条件下， 测定各组的吸亮度。 数据如表 3。

上述实验证明， 大銳皮肤黏液浸提液对于常见的两种需氧菌（ 大肠杆菌、 金黄色葡 萄球菌） 具有较为明显的抑制作用， 抑菌时间可达到 16h。 大銳皮肤黏液浸提液对于牙 龈卟啉单胞菌 （厌氧菌） 的生长具有明显的抑制作用， 抑菌时间可达到 5天以上。

实验例 2 : 抗氧化实验

首先制备大銳皮肤黏液浸提液， 方法如下： 将 200 mg大銳皮肤黏液干粉放入 2 mL 的去离子水 （重量比例约为 1 : 10） 浸泡 7天， 使大銳皮肤黏液干粉中的可溶性物质充 分溶解，将液体取上清液得到大銳皮肤黏液浸 提液。现场配制 lmg/mL的 DPPH乙醇溶液。

实验组采用大銳皮肤黏液浸提液 lmL+DPPH乙醇溶液 lmL;对照组采用纯水 lmL+DPPH 乙醇溶液 lmL。 用乙醇将分光亮度计调零， 并于 0. 5小时， 1小时， 2小时分别测量在 517nm波长， 对照组的吸亮度值为 实验组的吸亮度值为 A ₂ 。 自由基清除率的计算公 式为式 I， 测定结果如表

自由基清除率 =100 X

表 4 自由基清除率计算表

本实验表明， 大銳皮肤黏液浸提液可以清除 DPPH溶液中大部分自由基， 具有抗氧 化的功能。 实验例 3: 细胞迀移实验

为模拟体外伤口愈合过程， 进行细胞划痕实验和 transwel l小室实验。

针对前述两种实验， 首先准备完全培养基： 取 88份 DMEM， 10份胎牛血清、 1份青 霉素和 1份链霉素， 均匀混合， 得到完全培养基。 接着， 按照 1 mg大銳皮肤黏液干粉 添加 1 mL完全培养基的比例， 将大銳皮肤黏液在完全培养基中浸泡 7天， 使大銳皮肤 黏液中的可溶性物质充分溶解， 得到浓度为 l mg/mL的大銳皮肤黏液浸提培养基， 并进 一步制备 5种不同浓度比例的含大銳皮肤黏液浸提培养� �，浓度分别为 0. 5 mg/mL, 0. 1 mg/mL、 0. 05 mg/mL、 0. 01 mg/mL、 0. 005 mg/mL。

在细胞划痕实验中， 分别采用 HUVES以及 L929两种细胞进行测试， 细胞的准备过 程为： 取对数生长期的脐静脉内皮细胞 （HUVES） 和成纤维细胞 （L929） ， 胰酶消化得 到单细胞悬浊液， 细胞计数 6 X 10 ⁵ 个 /mL; 而后将 lmL细胞悬浊液接种至 6孔板中， 再 加 lmL完全培养基， 37 ^° C孵箱中培养， 待细胞贴壁且长满 6孔板后， 用 200 y L的黄色 枪头进行划痕（横、 纵向各划一道， 使划痕呈“ +”， 以便后期观察时定位） ， 划痕后 用 PBS洗涤 2-3遍， 洗去漂浮的细胞， 最后分别往其中 5个小孔中加入前述 5种不同浓 度的大銳皮肤黏液浸提培养基 2 mL， 一个小孔加入不含大銳皮肤黏液浸提培养基的 完 全培养基 2 mL作为空白对照组。 所有的实验样本放入 37 ^° C孵箱中培养， 分别在 0 h和 24 h的时候在显微镜下进行观察拍照， 其中以 0. lmg/mL大銳皮肤黏液浸提培养基的实 验结果为代表， 呈现如图 5A所示， 其余浓度则未示出。

利用 Image-J软件对所采集图片进行面积计算与分析� � 结果如图 5B所示， 通过实 验证明， 不同浓度的大銳皮肤黏液浸提培养基对 HUVES以及 L929两种细胞的迀移均有 一定的促进作用， 其中以 0. lmg/mL的浓度效果最为显着， 其细胞生长及迀移明显快于 空白对照组， 且两者之间的差异具有统计学意义。

接着，通过 transwel l小室实验，进一步验证 5个不同浓度的大銳皮肤黏液浸提培 养基对于 HUVES以及 L929两种细胞的体外迀移速率的影响， 以反映其促进皮肤、 黏膜 再生的作用。

分别采用 HUVES以及 L929两种细胞进行测试， 细胞的准备过程为： 取对数生长期 的 HUVES和 L929， 胰酶消化得到单细胞悬浊液， 细胞计数 HUVES 2 X 10 ⁵ 个 /mL， L929 计数 3 X 10 ⁵ 个 /mL， 将 transwel l小室置于 24孔板中， 而后将 100 y L细胞悬浊液接种 至 transwel l上室中， 下室中分别加入 800 y L大銳皮肤黏液浸提培养基， 37 ^° C孵箱中 培养 24h后用镊子小心取出小室， 吸干上室液体， 移到预先加入约 800 y L甲醇的孔中， 室温固定 30分钟后取出小室，吸干上室中的固定液，将� ��室移到预先加入约 800 y L0. 1% 结晶紫染液的 24孔板中， 室温染色 15— 30分钟， 染色完成后用 PBS浸泡数次洗去多余 染液， 最后吸去上室中液体， 用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞； 待小室膜干 燥后用镊子小心揭下膜， 移至载玻片上用封片后， 于 200倍显微镜下观察， 如图 5C所 示； 而后对各组实验组样本随机截取的照片进行细 胞计数， 每个样本随机选取 5个视野 计数， 图 5C中所示是每个样本的 1个视野， 计数取得的细胞数量如表 5所示， 最后对 得出细胞数量后进行差异统计分析。

表 5; transwel l小室实验结果

实验结果证明，不同浓度的大銳皮肤黏液浸提 培养基对两种细胞的迀移速率均有不 同程度的影响。 其中对 HUVES而言， 0. 5mg/mL、 0. lmg/mL大銳皮肤黏液浸提培养基组 和空白对照组之间的差异具有统计学意义； 对 L929而言， 0. lmg/mL、 0. 05mg/mL、

0. 01mg/mL大銳皮肤黏液浸提培养基组和空白对照� �之间的差异具有统计学意义。其中 以 0. lmg/mL大銳皮肤黏液浸提培养基对两种细胞的促 进效果最为显着。 本实验例的实 验结果表明，不同浓度的大銳皮肤黏液浸提培 养基对两种细胞的迀移速率均有不同程度 的影响， 其中 0. lmg/mL大銳皮肤黏液的促进效果尤为显着。

以上体外细胞实验结果均说明， 大銳皮肤黏液浸提培养基的细胞兼容性较好， 对细 胞未见明显毒性， 且 0. lmg/mL大銳皮肤黏液浸提培养基能显着加快 HUVES以及 L929 的迀移。

实验例 4: 医用黏合剂对于活体伤口的组织黏附的评估和 效果

需要先说明的是， 本发明执行试验的动物均购自重庆医科大学实 验动物中心。所有 的动物研究都是按照 NIH关于实验室动物的护理和使用的指导方针进 行的 （NIH Publ ication No. 85-23 Rev. 1985） ， 并经重庆医科大学牙科学院动物护理与使用委 员会批准 （CQHS-REC-2018-01） 。

针对体内伤口附着及生物兼容性评价，本实验 使用 30只雄性 Sprague-Dawley（SD） 大鼠 （6-8周大鼠， 体重 200 g± 20 g） 。 通过腹腔注射戊巴比妥钠 （30 mg/kg） 麻醉 SD大鼠。 剃除背部毛发后用碘和乙醇消毒， 每只 SD大鼠背部切 4个 2厘米切口， 分别 采用使用 4-0不可吸收缝线缝合伤口 （缝线） 、 本发明的医用黏合剂（SSAD） 、 氰基丙 烯酸酯 （商用胶） 、 纤维蛋白胶 （生物胶） 或止血 （空白对照） 等方法治疗。

对于 SSAD治疗组的作法，是将 5 mg大銳皮肤黏液干粉涂在切口，然后用 15 y L -20 y L PBS滴在切口， 轻轻按下两个伤口边缘接触大约 30秒， 让大銳皮肤黏液干粉与 PBS 相互作用成胶并充分实现黏结效果。结果显示 ，商用胶组所使用的氰基丙烯酸酯与 SSAD 治疗组使用的医用黏合剂相比具有刚性结合特 性，而医用黏合剂则与正常皮肤一样具有 柔韧性。此外，虽然生物胶组的纤维蛋白胶也 具有一定的柔韧性，但因为黏结能力较低， 黏结切口在移动过程中容易破裂， 性能仍不及医用黏合剂。

所有伤口部位都进行了拍照观察， 以了解愈合过程并监测伤口闭合情况的变化（ 如 图 6a） 。 术后 5天， 所有未封闭治疗的空白对照组伤口均裂开 （如图 6a） ; 而进一步 相比于生物胶组和空白对照组 （单纯止血治疗） ， 商用胶组、 缝线组、 SSAD治疗组的 伤口均恢复， 其中又以 SSAD治疗组的伤口不仅恢复， 且几乎未见瘢痕， 愈合恢复效果 明显优于其他组。 此外， 在 SSAD治疗组的创面周围， 未观察到任何感染或炎症的可疑 迹象， 显示本发明医用黏合剂在伤口愈合上的优越效 果。

评估伤口愈合效果和本发明医用黏合剂治疗可 能对大鼠皮肤组织产生的副作用，手 术 5天后， 大鼠被处死， 收集皮肤（3 X 3厘米）样本用于苏木精和伊红染色分析（H& ;E; G1120, Solarbio， 中国） ， 进行了组织学研究， 结果如图 6b所示。 在 SSAD治疗组中， 经医用黏合剂处理的切口下方可见纵向的胶原 纤维、 散在的中性粒细胞和成纤维细胞。 上皮与基底膜连续融合， 组织深处未见裂隙。 此外， 在切口处观察到毛发再生， 无明显 瘢痕， 提示医用黏合剂促进伤口整体愈合， 无明显副作用。

在 SSAD治疗组以外的组别， 缝合伤口部位有较少不规则的胶原纤维、 中性粒细胞 及成纤维细胞， 同时毛发再生也较少。 值得重视的是， 与 SSAD治疗组相比， 其他组别 的缝合切口部位没有细胞， 而 SSAD治疗组组充满核蓝染的新生细胞。 商用胶组中， 经 氰基丙烯酸酯处理的切口， 在其切口底部可见明显的空泡， 其中可能充满不可降解的氰 基丙烯酸酯， 部分氰基丙烯酸酯周围环绕坏死细胞， 基底细胞区未见明显核蓝染细胞。 生物胶组的切口可见明显的溃疡表面， 及底部未降解的纤维蛋白胶残留。仅行止血处 理 的空白对照组， 切口充满大量肉芽组织， 伤口部位可见一定数量的多形性核白细胞、 巨 噬细胞、 成纤维细胞和血毛细血管。

商用胶组中的氰基丙烯酸酯在体内和体外黏接 的黏合力最高，甚至高于天然皮肤组 织的强度。 然而， 氰基丙烯酸酯对脂肪的黏合力较弱， 且形成黏结界面较硬， 且其细胞 毒性也不可忽视。生物胶组中的纤维蛋白基胶 黏剂具有与软组织相似的特性，但黏合力 低， 不能单独使用。 至于 SSAD治疗组的效果则显示， 其治疗的切口比常规缝合线治疗 的切口恢复更好， 未引起明显的伤口感染或炎症， 且具有促进细胞再生的功效。

实验例 5: 医用黏合剂对于体内伤口愈合的评估和效果

本实验例应用全层皮肤缺损， 评价医用黏合剂应用于糖尿病 SD大鼠体内创面的愈 合能力。 根据论文 （Biomaterials science. 2018 ; 6： 2757-72） 描述的方法， 糖尿病 大鼠成功构建后， 用 1%戊巴比妥钠 （腹腔注射） 麻醉， 然后将其背部表面毛发刮除干 净。 使用一次性活检穿刺器在背部皮肤上制作直径 10毫米的全厚度圆形伤口。 在伤口 处理上， 空白对照组采用用纱布覆盖； SSAD治疗组是按照 30 mg/平方厘米缺损面积， 计算大銳皮肤黏液干粉的用量， 将大銳皮肤黏液干粉均匀撒在伤口表面， 保持实验动物 的静止状态 2分钟以上， 使大銳皮肤黏液干粉吸收伤口的血液 （即为水性溶液的功能） 后成胶， 使之形成医用黏合剂并覆盖伤口。 术后第 0、 3、 7、 14、 21天， 对伤口闭合率 进行分析； 术后 21天， 对于伤口进行组织切片分析， 包括对皮肤厚度比 （STR） 、 平均 正常皮肤厚度及皮肤附件 （如： 毛囊、 皮脂腺、 汗腺） 数进行统计分析。

伤口闭合率是采用 Image J软件 （National Institute of Heath） 根据以下公式 （式 I I） 计算：

伤口闭合率 = ^{Slnitial Scurrent} X 100% （式 I I）

sInitial

其中， s _Initlal 为初始创面大小， s _eum „ _t 为当前创面大小。 每个条件至少要进行三次测 试。

皮肤厚度比 （STR） 是采用 Image J软件根据公式 （I I I） 计算：

皮肤厚度比 =：j^^ X 100% （式 I I I）

其中 T _s 为疤痕组°纟7^］平均皮肤厚度， T _NOTml 为平均正常皮肤厚度。每个条件至少进 行三次测试。

为进一步评价医用黏合剂对于体内创面愈合的 疗效，用一次性活检穿刺机在大鼠背 部制备直径为 1厘米的圆形全厚度皮肤创面。 SSAD治疗组采用如实施例 1所制备的医 用黏合剂， 用量按照 100mg/平方厘米缺损面积计算； 阴性对照组覆盖纱布， 不使用任 何黏合剂。 根据手术处置后 0、 3、 7、 14、 21天的时间间隔， 拍照观察治疗组伤口愈合 情况， 整体结果如图 7。 如图 7a及图 7b所示， 用医用黏合剂处理的伤口， 伤口闭合率明显提高。 在第 0 天的图像中， 两组缺损部位未发现明显的差异； 缺损术后第 3天起， 治疗组的创口闭合 率（30. 9 ± 8. 2%） 明显高于对照组（10. 4 ± 1. 5%） ; 第 7天时， 对照组显示创口闭合率 为 24. 4 ± 5. 5%， 而治疗组创口闭合率为 54. 5 ± 12. 4%; 第 14天， 治疗组创口闭合率为 80. 9 ± 7. 5%， 而对照组创口闭合率为 58. 2 ± 11. 4%; 在第 21天， 治疗组伤口几乎完全 愈合的 （98. 1%± 2. 6%） ， 且观察到再生的毛发遮盖住里创口， 而对照组创口闭合率为 71. 9%± 6. 4%。 整体而言， 治疗组的伤口外观明显改善， 而未经治疗的对照组则出现明 显的大而长的疤痕。

为了确定医用黏合剂治疗对表皮再生和结缔组 织收缩的影响， 在术后第 21天进行 H&E染色 （如图 7c） 。 H&E染色结果显示， SSAD治疗组皮肤再生较厚， 溃疡面积较小， 统计结果也证明比较结果有统计上的差异 （如图 7d） 。 针对 SD大鼠伤口部位切片进行 Masson染色（如图 7e）结果显示， 与正常皮肤相比， 由于 21天仍处于肉芽组织增生和 重塑阶段， SSAD治疗组的肉芽组织更成熟， 含有更多的血管。 除表皮愈合外， 治疗组 形成了成熟的真皮结构（包括毛囊和皮脂腺） ， 这与正常组织成分相似， 而空白对照组 无法观察到此现象 （如图 7f） 。

为了判断伤口部位的血管新形情况， 分析血管生成相关标记物⑶ 31和 a -SMA， 结 果如图 7g所示， 其中以 DAPI染色标记组织中细胞核的位置， 供做对比。 从图 7g可见， SSAD治疗组在术后 7天， ⑶ 31阳性细胞含量为 4. 42 ± 0. 55%， 空白对照组⑶ 31阳性细 胞含量为 1. 48 ± 0. 39%; 术后 14天， 大銳皮肤黏液水凝胶治疗组⑶ 31阳性细胞含量为 13. 03 ± 1. 03%， 空白对照组⑶ 31阳性细胞含量为 8. 30 ± 1. 59%， 差异均有统计学意义 （P á 0. 001） _; 证明 SSAD治疗组较空白对照组可显着增加损伤部位� �生血管的形成， 促进伤口愈合， 也证明本发明提供的医用黏合剂具有明显的促 进组织再生的效果。

实验例 6: 医用黏合剂在体内降解的评估和效果

在深吸入异氟醚全身麻醉下， SD大鼠俯卧位， 背部无菌准备手术。 在脊柱轴外的 备皮肤切口 （3厘米） ， 和底层皮下组织分离， 为植入医用黏合剂提供足够的空间。 取 100 mg大銳皮肤黏液干粉， 与 200-600 y L PBS混合后形成医用黏合剂， 植入皮下空间， 植入后缝合关闭皮肤。 术后 3、 7、 14天收集周围组织及全皮肤进行组织学分析， 评估 医用黏合剂的降解效果， 其降解效果如图 8所示。

医用黏合剂在体内植入 3、 7和 14天后， H&E和 Masson染色显示出轻度炎症反应 （分别如图 8a、 图 8b所示） 。 植入 3天后， 在植入的医用黏合剂最外层观察到中度急 性炎症反应， 有典型的炎性细胞染成深蓝色（即如图 8中颜色相对较深的细胞） 。 植入 7天后， 医用黏合剂结构开始失去完整性， 几乎被侵入的炎性细胞所填满， 几乎没有观 察到纤维囊， 说明宿主对医用黏合剂的反应较弱。 此外， 植入 14天后， 植入部位几乎 没有医用黏合剂残留， 皮肤结构与空白对照一样正常， 说明医用水性凝胶在体内可以完 全降解。

使用淋巴细胞 （⑶ 3） 和巨噬细胞 （⑶ 68） 标志物染色， 评估创口愈合区域的细胞 特征， 其结果如图 8c所示。 在图 8c中 i、 v、 ix为术后 3天切片同一视野下的局部放 大图； 同理， i i、 vi、 x表示术后 7天的图像； i i i、 vi i、 xi表示术后 14天的图像； iv、 vi i i、 xi i表示术后 21天的图像。 从图 8c可以发现， 植入后第 3天， 在医用黏合 剂治疗组在移植物周围淋巴细胞浸润率为 0. 23 ± 0. 06%， 仅见少量巨噬细胞浸润； 巨噬 细胞浸润在第 7天达到最大值 （3. 21 ± 0. 87%） ; 随着时间的推移， 淋巴细胞和巨噬细 胞的浸润的数量都减少， 到第 21天几乎完全消失， 同时， 以上过程进行了量化统计， 结果如图 8d和 8e所示， 各时间点之间都具备统计上差异； 这一观察结果证明大銳皮肤 黏液水凝胶作为医用黏合剂具有良好的生物兼 容性，在体内可完全降解且几乎无刺激性， 未见明显的免疫排斥反应。

采用液相色谱技术对大銳皮肤黏液干粉主要物 质含量进行检测， 发现其中 87%以上 为各种氨基酸。 见表 6。

表 6 大銳皮肤黏液干粉主要物质含量 _

排序 氨基酸 含量 （mg/kg） 含量百分

数 （％）

赖氨酸 84718.11+705.005 8. 47

2 苏氨酸 71375.08+714.28 7. 14

3 谷氨酸 69488.71+1151.98 6. 95

4 甘氨酸 68308.8+594.745 6. 83

5 天冬氨酸 62547.98+674.25 6. 25

6 亮氨酸 61047.84+453.635 6. 1

7 脯氨酸 59855.79+493.31 5. 99

8 异亮氨酸 59898.02+417.785 5. 99

9 酪氨酸 55928.19+4420.91 5. 59

10 缬氨酸 53311.17+1022.665 5. 33

11 丝氨酸 52322.74+99.4 5. 23

12 苯丙氨酸 50825.46+340.375 5. 08

13 丙氨酸 41874.33+328.675 4. 19

14 精氨酸 38365.15+389.165 3. 84

15 组氨酸 17974.12±178.975 1. 8

16 蛋氨酸 14394.41±129.13 1. 44

17 色氨酸 9372.815+5.325 0. 94

18 胱氨酸 1680.24+71 0. 17 实验例 7: 不同水性溶剂种类的评估和效果

采取电刺激法得到大銳皮肤黏液， 干粉碎后采用环氧乙烷灭菌， 放置 48小时得到 大銳皮肤黏液干粉。水性溶液分别采用生理盐 水（NaCl缓冲液）、磷酸盐缓冲液（PBS）、 Tris缓冲液 （TBS） 、 柠檬酸盐缓冲液、 2%氯己定、 血液以及富血小板血浆 （PRP） 、 富血小板血浆纤维蛋白 （PRF） 、 浓缩生长因子（CGF） ， 按照本发明实施例 1所述的方 法制备医用黏合剂。 大銳皮肤黏液干粉与上述水性溶液的重量比例 见表 7。

表 7: 本实施例中大銳皮肤黏液干粉与水性溶液的重 量比例

分别用上述不同水性溶液按照不同的粉水比配 置的医用黏合剂对多例大鼠进行治 疗， 治疗方法是将医用黏合剂黏附覆盖创面， 其均能黏附与覆盖创面， 显示良好的黏附 性能。 35天后， 取大鼠心脏、 肝脏、 脾脏、 肺、 肾进行组织学分析， 评价医用黏合剂 的生物兼容性。采集血样进行血生化分析，包 括： 乳酸脱氢酶（LDH）、血尿素氮（BUN）, 丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST） ， 以评估医用黏合剂对于生理数值的影 响。 在治疗期间和随后的观察 （损伤后 35天） 中， 未观察到对大鼠总体健康或行为的 影响。 此外， H&E染色对心脏、 肝脏、 脾脏、 肺和肾脏的组织学检查没有发现任何系统 性损伤。 此外， 还对医用黏合剂处理组大鼠的肾脏 （血尿素氮） 和肝脏 （谷草转氨酶、 谷丙转氨酶） 以及一般损害（乳酸脱氢酶） 的毒性作用进行了评估。 医用水性凝胶局部 给药后，这些参数与对照组相比均在正常参考 值范围内， 提示医用水性凝胶治疗后各主 要器官无明显损伤。

实验例 8: 医用黏合剂在体内生物兼容性的评估和效果

用本发明的多种不同水性溶液和不同粉水比例 的医用黏合剂对多例大鼠进行治疗， 治疗方法是将适量医用黏合剂缝合于大鼠皮下 。 治疗 35天后取大鼠心脏、肝脏、 脾脏、 肺、 肾进行组织学分析， 评价医用黏合剂的生物兼容性。 采集血样进行血生化分析， 包 括： 乳酸脱氢酶 （LDH） 、 血尿素氮 （BUN） 、 丙氨酸转氨酶 （ALT） 和天冬氨酸转氨酶 （AST） ， 以评估医用黏合剂对于生理数值的影响。 医用黏合剂可以黏附皮肤切口， 促 进糖尿病模型创面愈合。然而， 体内长期毒性的评估对于生物应用至关重要。 在治疗期 间和随后的观察（损伤后第 35天） 中， 未观察到对大鼠总体健康或行为的影响。 此外， H&E染色对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的� �织学检查没有发现任何系统性损伤。此外， 还对医用黏合剂处理组大鼠的肾脏（血尿素氮 ）和肝脏（谷草转氨酶、 谷丙转氨酶） 以 及一般损害（乳酸脱氢酶）的毒性作用进行了 评估。这些参数与对照组相比均在正常参 考值范围内， 提示医用黏合剂治疗后各主要器官无明显损伤 。

实验例 9: 医用黏合剂对肌腱治疗效果评估

采用 SD大鼠为实验动物， 其中正常组采用不进行任何手术的正常大鼠； SSAD治疗 组在切断跟腱后采用本发明的医用黏合剂进行 治疗；空白对照组在切断跟腱后采用磷酸 缓冲盐溶液（PBS）处理， 任其自然愈合。 具体做法是， 选用 3月龄 SPF级雄性 SD大鼠 20只 （重庆医科大学实验动物中心提供） ， 体重 （280 ± 30 g） 适应性喂养 7天。 根 据已经建立好的大鼠跟腱离断缺损模型， 执行腱离断手术步骤 （如图 9） : 任选大鼠一 条后腿为实验组 （例如右后腿） ， 切开皮肤分离出腱鞘膜 （如图 9a） 。 暴露跟腱和跖 肌腱 （如图 9b） 。 切断跟腱， 为了防止内固定， 跖跟腱也要切除 （如图 9c） 。 腱鞘膜 可以增强生长因子促跟腱愈合能力， 在切断肌腱及缝合时注意不过度损伤。

将大鼠随机分为 SSAD治疗组和空白对照组，每组各 10只， 并以上述手术方法切断 跟腱。 SSAD治疗组采用实施例 1所得到的医用黏合剂治疗： 取大銳黏液干粉 10mg置于 肌腱断端 （如图 9d） ， 与 30微升 PBS混合形成水凝胶包绕跟腱断端 （如图 9e） ， 关闭 创面 （如图 9f） 空白对照组采用 30微升 PBS滴注跟腱断端后关闭创面。

术后所有动物自由摄水及摄食 （标准饲料） ， 在室温 25 ^° C〜 28 ^° C， 湿度 75〜 80 % 清洁级环境中喂养。 在术后第 28天采用小动物步态仪分析术后各组大鼠的运� ��情况， 并取部分样品进行力学测试（n = 6） ， 剩余部分肌腱进行固定处理， 之后进行石蜡切片 和 HE及 Masson染色等。

对比 SSAD治疗组和空白对照组的肌腱强度。 力学测试的方法按照以下方法进行。 首先， 分离出完整的肌腱组织， 用两个并在一起的手术刀片沿肌腱组织上下各 5mm的安 全距离切掉周边的原有肌肉组织而保留所有肌 腱组织。将带有 5_肌肉的两端固定在万 能试验机 (MTS Criterion， Model 43， 美国) 。 力学测试所用的参数为 15毫米 /分钟， 当到达新生肌腱组织所能承受的最大力时肌腱 发生断裂，此时机器会记录力与位移的曲 线。根据最大拉力和预先测得的新生肌腱组织 的横截面积计算出最大断裂强度 (以 N/mm ² 为单位) ； 杨氏模量则可以根据曲线的斜率计算得到。

力学测试显示， 术后 21天， SSAD治疗组肌腱最大负荷拉力 (25.6N±8.2N) 明显 高于对照组 (13.8±3.9N) (P á 0.05) 。 同时， SSAD治疗组的肌腱横截面积 (10.5 ±4.7mm2) 仍小于对照组 ( 16.1 ±5.8mm2) 。 SSAD治疗组肌腱强度 (2.8± 1. IMPa) 高 于对照组 (0.9±0.2MPa) (P á 0.05) 。 SSAD治疗组肌腱刚度 ( 17.7±7.5N/mm) 高 于对照组 (6.9±1.2N/mm) (P á0.05) 。 SSAD治疗组弹性模量 ( 14.6±6.9Mpa) 高于 对照组 (3.0±0.6Mpa) 。

术后 28天， SSAD治疗组肌腱最大负荷拉力 (52.8N±9.8N) 高于对照组 (33.3土 8.3N) (P á 0.05) 。 同时， SSAD治疗组肌腱横断面积 (7.7±1. Imm2) 仍小于对照 组 (9.3±1.6mm2) 。 SSAD治疗组肌腱强度 (7.1±1.9Mpa)高于对照组 (3.6±0.9MPa) (P á 0.05) 。 SSAD治疗组 (28.6±7.8N/mm) 刚度明显高于对照组 ( 15.3±3. ON/mm) (P á0.05) 。 SSAD治疗组的弹性模量 (36.3±11.2Mpa) 高于对照组 ( 15.0±3.5Mpa) (P á 0.05) ₀

正常组的肌腱最大负荷拉力为 42.3±2.9N， 强度为 14.0±5.8Mpa， 刚度为 29.8土 7.3N/mm， 弹性模量为 44.4± 12.9Mpa。

SSAD治疗组肌腱最大负荷拉力甚至超过正常组� � 但 SSAD治疗组面积大于正常组 (7.7±1. Imm2 VS 3.5±1.2mm2) 。 正常组肌腱强度 ( 14.0 ± 5.8Mpa) 仍远高于 SSAD 治疗组 (7. l±1.9Mpa) ， 说明正常组肌腱质量高于 SSAD治疗组。 SSAD治疗组肌腱负 荷甚至超过正常肌腱的原因应该是早期肌腱愈 合伴有增生所致。说明本发明的医用黏合 剂可以提高愈合跟腱强度， 减少再次断裂的风险。

对比 SSAD治疗组、空白对照组和正常组的跑步态仪� �其中 SSAD治疗组和空白对照 组的动物模型均为左后腿正常， 右后腿手术。正常组的左右腿均未进行手术。 使用啮齿 类小动物步态仪 (Catwalk XT步态分析系统， 诺达思， 荷兰) 评估术后大鼠的行动能 力， 机器自带软件导出检测数据。 使用 SPSS statistics 25软件 (IBM公司， Armonk, NY, USA) 进行统计分析。 数据以均数土标准差表示。 用两独立样本 t检验计算是否有 统计学差异。

分别测定脚印面积、 最大接触面积、 占空比、 到达最大强度占比、 最大接触面积最 大强度、 最大接触面积平均强度、 最大强度、 平均强度、 前 15最大脚掌压强的平均强 度。 21天时， 空白对照组测量 10只大鼠， SSAD治疗组测量 10只大鼠。 28天时， 空白 对照组测量 4只大鼠， SSAD治疗组测量 5只大鼠。 同时测量 4只正常大鼠的步态数据。 数据用均值土标准差表示。根据已有文献报道 和与正常组大鼠对比， 跟腱愈合良好的表 现为： 除了到达最大强度占比变大外， 其余指标均变小。

术后 21天， SSAD治疗组大鼠脚印面积 (1.68±0.55 cm2)小于对照组 (2.15±0.33 cm2) (P á0.05) 。 SSAD治疗组大鼠占空比 (脚掌接触地面时间 /步行周期) (71.7土 3.8%) 低于对照组 (77.1±4.8%) (P<0.05) (如图 10) 。 SSAD治疗组大鼠的最大接 触面积最大强度 (176.3±32.3)，最大接触面积平均强度 (90.6±13.1)，最大强度 (186.0 ±25.0)，平均强度 (96.8±13.9)，前 15最大脚掌压强的平均强度 ( 168.8±32.4)小 于对照组的最大接触面积最大强度 (199.3±9.7%) ，最大接触面积平均强度 (103.0土 6.5) ，最大强度 (205.2±8.1) (如图 11) ，平均强度 (109.7±6.9) ，前 15最大脚掌 压强的平均强度 (196.2±13.1) 。 在 SSAD治疗组中脚掌触地到达最大强度时间占比 (63.8±12.7%) 大于在对照组 (47.7±13.9%) 中的时间占比。 SSAD治疗组与对照组 的大鼠体重相似， 排除了体重对足强度的干扰。

术后 28天， SSAD治疗组和对照组之间有统计学差异的指标� �括最大接触面积 (0.8 ±0. lcm ² VS 1.3±0.3cm ² ) (如图 12) ，最大强度 ( 154.9±21.0 VS 192±10.8) ，最 大接触面积平均强度 (67.5±2.7 VS 80.0±8.4) ，脚印面积 ( 1.2±0.2 cm2 VS 1.8 ±0.4cm2) ，最大强度 (173.3±16.8 VS 200.2±7.0) (如图 11) ，前 15最大脚掌压 强的平均强度 (146.2±13.6 VS 182.1±17.8) (P á 0.05) 。 正常组数据是脚印面 积 (0.45cm2±0.14cm2) ， 最大接触面积 (0.32cm2±0. Ilcm2) ， 占空比 (脚掌接触地 面时间 /步行周期) (62.1±2.9%) ， 脚掌触地到达最大强度时间占比 (70.7±12.8%) ， 最大接触面积最大强度 (83.4±20.2) ， 最大接触面积平均强度 (47.1±7.4) ， 最大 强度 (93.1±21.3) ， 平均强度 (51.8±7.1) ， 前 15最大脚掌压强的平均强度 (74.1 ±16.2) ， 无论是 21天还是 28天时， 在上述各项指标上 SSAD治疗组数据与正常组更 为接近， 说明本发明提供的医用黏合剂可以改善损伤肌 腱的运动功能。 21天大鼠右脚 步行占空比如图 10,是术后 21天大鼠右脚步行占空比 (脚掌触地时间 /步行周期) ， 将 三组大鼠步行周期拉长为相同长度， 可以看出脚掌触地时间是空白对照组 ñ SSAD治疗 组 ñ正常组， 即占空比是空白对照组 ñ SSAD治疗组 ñ正常组。 21， 28天的大鼠右脚脚印最 大压强图如图 11， 是术后 21天、 28天大鼠右脚脚印压强 3D图。 X轴表示脚印的长度， Y轴表示脚印的宽度， Z轴表示脚印的最大压强。结果显示最大压强� �空白对照组 ñ SSAD 治疗组 ñ正常组。 21天和 28天的大鼠右脚脚印最大面积图如图 12, 是术后 21天、 28 天的大鼠右脚脚印面积显示为空白对照组 ñ SSAD治疗组 ñ正常组。 所有步态指标具体数 据见表 8。

表 8 步态仪结果 _

指标 21天对照组 21天治疗组 ^~~ P 28天对照组 28天治疗组 P

脚印面积 2.1 ±0.33 1.7±0.55 0.036 1.8±0.4 1.2±0.2 0.026 最大接触面 1.6±0.2 1.3±0.4 0.113 1.3±0.3 0.8±0.2 0.018 积

占空比 77.1±4.8 71.7±3.8 0.016 68.5±5.1 67.2±5.2 0.771 到达最大强 47.7±13.9 63.8±12.7 0.016 49.7±19.2 68.4±13.6 0.190 度时间占比

最大接触面 199.3±9.7 176.3±32.3 0.065 192 ±10.7 154.9 ± 0.034 积最大强度 21.0

最大接触面 103.0±6.5 90.6±13.1 0.016 80.0±8.4 67.5±2.7 0.030 积平均强度

最大强度 205.2 ±8.1 186.0±25.0 0.050 200.3 ±7.0 173.3 ± 0.041

16.8

平均强度 109.7±6.9 96.8±13.9 0.026 86.8±10.8 72.7±4.2 0.053 前 15最大脚 196.2 士 168.8±32.4 0.036 182.1 士 146.2 ± 0.023 掌压强的平 13.2 17.8 13.6

均强度 手术 28天后， 取实验组和对照组两只大鼠的右后腿 HE切片染色。发现空白对照组 （如图 13a） 胶原纤维较少， 且无方向性， 内部有脂肪细胞浸润。 SSAD治疗组 （如图 13b） 胶原纤维丰富， 纤维呈一定方向性， 未见明显脂肪细胞浸润。 说明本发明对肌腱 的治疗效果明显。 以上结果均说明 SSAD治疗组的跟腱愈合优于空白对照组。 但由于恢 复时间较短 （28天） ， SSAD治疗组的大鼠运动能力暂未恢复到正常状� �。

从以上说明可知，本发明提供一种基于未经改 性的大銳皮肤黏液制备的医用黏合剂 及其用途， 可通过多元化的使用方式， 应用于创面的组织黏附， 并促进伤口愈合， 综合 性能优于现有的医用黏合剂。

医用黏合剂使用过程中， 水凝胶能迅速 （ á60秒）封闭大鼠背部出血的开放性的伤 口， 有效治疗糖尿病 SD大鼠全层皮肤缺损。 此外， 医用黏合剂在体内 2周内可完全降 解， 炎症异物反应低。 因此， 本发明提供的医用黏合剂具有操作方便、 易于改性、 生物 兼容性好等优点， 以及促进组织再生、促伤口愈合、抗氧化、抑 菌等综合效果， 为皮肤、 致密结缔组织、脆弱器官和不可触及的内部组 织的伤口提供了一个很有前途且实用的无 缝合选择。另考虑到大銳皮肤黏液的低廉的成 本和环保的加工步骤， 预期本发明提出的 医用黏合剂可作为一种有弹性和延展性的医用 胶黏剂的产品，克服既有产品的缺陷和限 制， 并被广泛运用。

以上所述仅为本发明之较佳实施例， 并非用以限定本发明之权利范围； 同时以上的 描述，对于相关技术领域之专门人士应可明了 及实施， 因此其他未脱离本发明所揭示之 精神下所完成的等效改变或修饰， 均应包含在申请专利范围中。