Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zum Ent- fernen von Proteasen aus Flüssigkeiten, insbesondere aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen, mit einer Mehrzahl in Reihe geschalteter Membranen.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Entfer- nen von Proteasen aus Flüssigkeiten, insbesondere aus bio- logischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen durch Mikrofiltration mit mikroporösen chemisch aktivierten Memb- ranen.

Die Stabilität pharmazeutischer proteinhaltiger Lösungen ist von verschiedenen Faktoren und vor allem von der Art der Vorbehandlung abhängig. Es ist von größtmöglicher Be- deutung, dass Kontaminationen aller Art aus diesen Lösungen entfernt werden, da die regulatorischen Behörden zahlreiche Kontrollen dieser Prozeduren vorschreiben.

Eine Verunreinigung mit Bakterien oder Pilzen kann bei- spielsweise leicht dadurch verhindert werden, dass die Lö- sung durch eine sterilfiltrierende mikroporöse Membran mit bspw. nomineller Porenweite von 0,2 um filtriert wird. Vi- ren können durch chemische Behandlung oder durch Anwendung

eines stark basischen Ionenaustauschers abgereichert wer- den. Endotoxine können ebenfalls durch einen basischen Io- nenaustauscher oder durch Ultrafiltration entfernt werden.

Proteasen sind Enzyme, welche Proteine und Polypeptide abbauen. Dies geschieht durch hydrolytische Spaltung zwischen benachbarten Aminosäuren, welche die Bausteine der Proteine darstellen. Dies führt zur Reduktion des formulierten Proteins, z. B. eines Antikörpers und zum Auftreten von Abbauprodukten, die unerwünschte Effekte in dem mit der Formulierung behandelten Patienten erzeugen.

Während der Aufarbeitung (Down Stream Processing) eines Proteins, z. B. eines gentechnisch hergestellten Antikör- pers, der in einer Tierzellkultur produziert wird, kann der Antikörper in der Zelle akkumulieren und muss vor der Auf- arbeitung aus der Zelle in das Prozessmedium für die weite- re Aufarbeitung freigesetzt werden. Während dieser Zelldes- integration werden gleichzeitig zelleigene Proteasen frei- gesetzt, welche sofort die Zielproteine abbauen können.

Um die Wirkung dieser Proteasen zu unterbinden und zumin- dest zu verlangsamen, ist es bekannt, kleine synthetische Moleküle mit inhibitorischer Wirkung und sehr hoher Affini- tät zum aktiven Zentrum der Proteasen zuzusetzen. Nachtei- lig dabei ist die potentielle Gefährlichkeit solcher Sub- stanzen, ihre geringe Löslichkeit und geringe Stabilität in wässrigen Medien. Deshalb ist eine schnelle und effiziente Verteilung solcher Substanzen in großen Volumina umständ- lich.

Weiterhin ist es bekannt, auf dem Fachmann auf diesem Ge- biet bekannten chromatographischen Trägern, wie kugelförmi- gen Gelen, geeignete Inhibitoren zu immobilisieren. Da die Entfernung wünschenswerterweise möglichst weit"up stream"

in der Reinigungssequenz erfolgen soll, um den Produktver- lust gering zu halten, werden für die Aufarbeitung Säulen mit großen Querschnitten benötigt. Dies macht den Schritt kosten-und arbeitsintensiv.

Aus der US 6,258, 238 B1 ist es bekannt, einen kationischen Protease-Inhibitor durch Bulk-Adsorption an der Oberfläche einer semipermeablen Membran, die mindestens aus einem elektronegativen Polymer besteht, anzuordnen.

Nachteilig dabei ist, dass die dabei verwendete Membran bzw. der verwendete Membrankörper nicht elektrisch neutral sondern durch ein verwendetes Monomer negativ geladen ist.

Weiterhin ist es schwierig geeignete Inhibitoren für andere Proteaseklassen zu finden.

Weiterhin ist aus der DE 44 32 628 AI eine modular aufge- baute Dead-End-Filtrationseinheit zur selektiven Abtrennung von Stoffen aus Fluiden durch Filtration an porösen Memb- ranabsorbern bekannt. Entsprechend einer spezifischen Ad- sorption werden die einzelnen abzutrennenden Stoffe in den Filterkassetten bzw. Membranen festgehalten. Mit entspre- chenden Eluationsmitteln werden die adsorbierten Stoffe se- lektiv desorbiert, eluiert und aufgefangen. Bei der aus der DE 44 32 628 AI bekannten Vorrichtung bzw. bekannten Ver- fahren werden keine Inhibitor-Membranen verwendet, sondern ionenaustauschende bzw. farbstoffligandentragende Membra- nen. Bei einer derartigen adsorptiven Anwendung ist es schwierig alle Klassen von bekannten Proteasen an den Memb- rankörper adsorptiv anzubinden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Membranen zur Entfernung einer Vielzahl von Proteasen aus Flüssigkei- ten bereitzustellen, so dass Ihre Wirkung bezüglich der Flüssigkeiten unterbunden oder zumindest verlangsamt wer-

den. Die Entfernung der Proteasen soll schnell, effizient und kostengünstig erfolgen. Dabei soll es möglich sein, saure Proteasen, Metallo-Proteasen, Cystein-Proteasen und Serin-Proteasen selektiv zu entfernen.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass Proteasen selektiv bin- dende Inhibitoren durch chemisch aktivierte Gruppen an den Membrankörper angekoppelt sind.

Die Verwendung derartiger Membranen hat den Vorteil, dass der konvektive Fluss durch solche Membranen höher ist im Vergleich zu entsprechenden Säulen, da die Diffusionslimi- tierung des Massentransportes praktisch vernachlässigbar ist. Die Menge an Inhibitor und die zur Kopplung benötigte Membranfläche kann auf die zu entfernende Menge Proteasen abgestimmt werden. Die Membran kann nach Gebrauch verworfen werden, was Reinigungs-und Validierungs-Kosten spart.

Saure Proteasen, die einen Asparaginsäure-Rest im aktiven Zentrum besitzen, können durch einen entsprechenden Inhibi- tor an den Membrankörper adsorbiert werden. So kann bei- spielsweise Pepstatin, dass effizient Pepsin inhibitiert, angekoppelt werden. Metallo-Proteasen, die ein Übergangsme- tall, wie z. B. Zink, im aktiven Zentrum besitzen, können beispielsweise durch Bestatin, Diprotin oder EDTA, die an die Membrankörper angekoppelt werden, adsorbiert werden.

Cystein-Proteasen, die einen Cystein-Rest im aktiven Zent- rum besitzen, beispielsweise Papain aus der Papaya-Frucht, können durch Antipain, Chymostatin oder E 64, die an den Membrankörper angekoppelt werden, adsorbiert werden.

Serin-Proteasen, die wegen ihres ubiquitären Vorkommens wichtigste Familie, können ebenfalls durch entsprechende

Inhibitoren, die an den Membranköper angekoppelt werden, gebunden werden. Als effiziente Inhibitoren kommen TLCK und p-Aminobenzamidin in Frage. Die oben erwähnten Inhibitoren sind kleine Moleküle, zum Teil peptidartige Peptid-Analoga.

Sie sind alle kommerziell erhältlich.

Für die Cystein-und Serin-Proteasen existieren weiterhin große proteinartige Inhibitoren, wie Aprotinin, Sojabohnen- , Trypsin-Inhibitoren oder alpha-2-Makroglobulin. Zudem ist eine riesige Anzahl weiterer Inhibitoren in der Literatur beschrieben, die auf die erfindungsgemäße Weise verwendbar sind.

Die bekannten Vorrichtungen weisen die oben beschriebenen Nachteile auf.

Weitere Aufgabe der Erfindung ist es daher, die bekannten Vorrichtungen so zu verbessern, dass eine Vielzahl von Pro- teasen aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen effektiv und kostengünstig entfernt werden können.

Diese weitere Aufgabe wird erfindungsgemäß in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 10 dadurch gelöst, dass die Membranen nach einem der Ansprüche 1 bi, s 9 ausgebildet sind.

Durch die Ausbildung der Membranen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 weist die Vorrichtung die oben genannten Vorteile auf. Insbesondere wird durch die Reihenschaltung bzw. An- ordnung einer Mehrzahl von Membranen hintereinander gewähr- leistet, dass die zu prozessierende Flüssigkeit nacheinan- der alle Membranen sequentiell durchströmt. Die Membranen können dem jeweiligen Trennproblem relativ einfach ange- passt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wei- sen die einzelnen Membranen jeweils einen Membrankörper mit einem anderen angekoppelten Inhibitor auf.

Auf diese Weise kann das jeweilige Proteasespektrum der verschiedenen zu prozessierenden Flüssigkeiten für die Auf- arbeitung berücksichtigt werden.

Zur einfachen Handhabung werden die einzelnen Membranen zur sequentiellen Durchströmung in geeignete Gehäuse eingebaut.

Die bekannten Verfahren zur Entfernung von Proteasen weisen die oben genannten Nachteile auf.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein effizientes und kostengünstiges Verfahren zum Entfernen einer Vielzahl von Proteasen anzugeben.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 13 dadurch gelöst, dass an die Membranen Inhibi- toren über chemisch aktivierte Gruppen angekoppelt werden, durch die die Proteasen durch selektive Anbindung adsor- biert und dadurch aus der Flüssigkeit entfernt werden.

Durch die selektive Anbindung wird eine effektive und kos- tengünstige Entfernung einer Vielzahl von Proteasen ermög- licht.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und der beigefüg- ten Zeichnung, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft veranschaulicht sind.

Figur 1 : Eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Entfernen von Proteasen.

Eine Vorrichtung 1 zum Entfernen von Proteasen besteht im Wesentlichen aus einem Gehäuse 2 und vier in Reihe angeordneten mikroporösen Membranen 3,4, 5,6.

Die erste Membran 3 weist einen ersten Membrankörper 7 auf, an dem ein saure Proteasen bindender Inhibitor über eine chemisch aktivierte Gruppe angekoppelt ist. Beispielsweise ist Pepstatin als effizienter Inhibitor für Pepsin geeig- net.

Die zweite Membran 4 weist einen zweiten Membrankörper 8 auf, an dem ein Metallo-Proteasen bindender Inhibitor über eine chemisch aktivierte Gruppe angekoppelt ist. Für die Metallo-Proteasen kommen beispielsweise Bestatin, Diprotin oder EDTA als anzukoppelnde Inhibitoren in Frage.

Die dritte Membran 5 weist einen dritten Membrankörper 9 auf, an dem ein Cystein-Proteasen bindender Inhibitor über eine chemisch aktivierte Gruppe angekoppelt ist. Als Inhi- bitoren sind beispielsweise Antipain, Chymostatin oder E 64 geeignet.

Die vierte Membran 6 weist einen vierten Membrankörper 10 auf, an dem ein Serin-Proteasen bindender Inhibitor über eine chemisch aktivierte Gruppe angekoppelt ist.

Als Inhibitoren kommen beispielsweise TLCK oder p- Aminobenzamidin in Frage.

Die zu prozessierende Flüssigkeit wird über einen am Gehäu- se 2 angeordneten Anschluss 11 der ersten Membran 3 zuge- führt, wobei an den Inhibitor des ersten Membrankörpers 7 die entsprechenden sauren Proteasen gebunden werden. Die weiter zu prozessierende Flüssigkeit wird anschließend der zweiten Membran 4 zugeführt, wobei an den Inhibitor des

zweiten Membrankörpers 8 die entsprechenden Metallo- Proteasen gebunden werden. Die weiter zu prozessierende Flüssigkeit wird anschließend der dritten Membran 5 zuge- führt, wobei an den Inhibitor des dritten Membrankörpers 9 die entsprechenden Cystein-Proteasen gebunden werden.

Schließlich wird die weiter zu prozessierende Flüssigkeit der vierten Membran 6 zugeführt, wobei an den Inhibitor des vierten Membrankörpers 10 die entsprechenden Serin- Proteasen gebunden werden.

Aus der zu prozessierenden Flüssigkeit sind nunmehr die vorgesehenen Proteasen selektiv entfernt, so dass diese ü- ber einen Abfluss 12 einer weiteren Verwendung zugeführt werden kann. Die Membranen 3,4, 5,6 mit den gebundenen Proteasen werden weggeworfen bzw. entsorgt.

Die folgenden Beispiele zeigen die Möglichkeit der Kupplung verschiedener Inhibitoren an eine chemisch aktivierte Memb- ran bzw. Membrankörper und stellen deshalb keinerlei Ein- schränkung der Erfindung dar. Die Prozeduren folgen dabei im Wesentlichen dem Protokoll beschrieben in : G. T. Herman- son, A. K. Mallia, P. K. Smith, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press 1992, p. 119 Beispiel 1 : Der Serin-Protease Inhibitor p-Aminobenzamidin (Sigma, Dei- senhofen Best. Nr. A-7148 wurde in 0,05 M Kalium-Phosphat- Puffer pH 8,0 zu 20 mg/ml gelöst. Zehn epoxy aktivierte Membranen der Abmessung 25 mm Durchmesser des Typs 18706 der Fa. Sartorius AG wurden in dieser Lösung bei 45°C über Nacht inkubiert. Die Membranen/Membrankörper wurden mit PBS mehrfach gewaschen. Drei Membranen mit einem Durchmesser von 25 mm wurden in einen Filterhalter (Sartorius Teil Nr.

16517 eingelegt. Trypsin vom Rinderpankreas (SIGMA Best.

Nr. T-8003 Lot Nr. 28F-8065 wurde in PBS zu 1 mg/ml gelöst.

10 ml dieser Lösung wurde über die Membranen mittels Schwerkraft filtriert. Die Membranen wurden mit 10 ml PBS gewaschen. Das gebundene Trypsin wurde mit 3 ml 0,1 M Gly- zin eingestellt auf pH 3,0 mit HC1 eluiert. Die enzymati- sche Aktivität des Trypsins in den verschiedenen Fraktionen wurde mit dem synthetischen Substrat Benzoyl-Arginin- Ethylester (BAEE) einem bekannten Substrat für Trypsin in einem UV-Spektrophotometer bestimmt. Diese wurden mit Ak- tivitäten von Trypsinlösungen bekannter Konzentration verglichen.

In eine Quarzküvette wurde folgendes pipettiert : 0,85 ml einer Lösung von 0,05 M Tris eingestellt mit HCl auf pH 8,5, 0,2 ml einer Lösung von 2 mg/ml BAEE in Wasser und 0,05 ml Probe. Die Zunahme der Absorption bei 253 nm wurde über 30 Sekunden verfolgt.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten und sind in Tabel- le 1 dargestellt.

Tabelle 1 : Bindung von Trypsin an eine mikroporöse mit Epo- xygruppen funktionalisierte Membrane Fraktion Volumen Aktivität ug Trypsin ug Trypsin ml E253/min angeboten gebunden Ausg. lsg. 10 0, 24 2000-- Durchlauf 10 0, 144 930 Der Versuch wurde mit gleichem Ergebnis 2 x wiederholt.

Das Beispiel zeigt klar die Bindung von Trypsin an der mit dem Inhibitor beladenen Membrane/Membrankörper.

Beispiel 2 : Der Cystein-Protease Inhibitor Leupeptin (Sigma, Deisenho- fen Best. Nr. L-2023) wurde in 0,05 M Kalium-Phosphat- Puffer pH 8,0 zu 20 mg/ml gelöst. Zehn epoxy aktivierte Membranen/Membrankörper der Abmessung 25 mm Durchmesser des Typs 18706 der Fa. Sartorius AG wurden in dieser Lösung bei 45°C über Nacht inkubiert. Die Membranen wurden mit PBS mehrfach gewaschen. Drei Membranen mit einem Durchmesser von 25 mm wurde in einen Filterhalter (Sartorius Teil Nr.

16517 eingelegt. Papain aus Papaya carica (Merck Art. Nr.

7144 Ch. 911 F739244,30 000 USP-U/mg) wurde zu 2 mg/ml in folgendem gelöst : 1,1 mM EDTA, 0,67 mM Mercaptoethanol, 5,5 mM Cystein 50 mM Na-Azetat pH 5, 5 ; = Komplett und min- destens 30 min bei RT stehen gelassen. Die enzymatische Ak- tivität des Papains in den verschiedenen Fraktionen wurde mit dem synthetischen Substrat Benzoyl-Arginin-Nitroanilid (BANA), einem bekannten Substrat für Papain in einem UV- Spektrophotometer bestimmt. Diese wurden mit Aktivitäten von Papainlösungen bekannter Konzentration verglichen.

In eine Quarzküvette wurde folgendes pipettiert : 0,5 ml Enzymlösung 0, 05 ml 25 mg/ml BANA in DMSO, 0,45 ml Komplett.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten und sind in Tabel- le 2 dargestellt.

Tabelle 2 : Bindung von Papain an eine mikroporöse mit Leupeptin funktionalisierte Membrane Fraktion Volumen Aktivität ug Papain pg Papain ml E253/min angeboten gebunden Ausg. lsg. 5 0, 05 1900-- Durchlauf 5 0, 03 760

Der Versuch wurde mit gleichem Ergebnis 2 x wiederholt.

Das Beispiel zeigt klar die Bindung von Papain an der mit dem Inhibitor beladenen Membrane/Membrankörper.