Die Erfindung betrifft weiterhin ein Filtrationsmodul zur Abtrennung von Biomolekülen aus einer Flüssigkeit bestehend aus einem Gehäuse und mindestens einer Membran.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtren- nung von Biomolekülen aus einer Flüssigkeit mit Hilfe von Membranen mit chemisch aktivierten mikroporösen Membrankör- pern an die Affinitätsliganden, die zur Wechselwirkung mit den abzutrennenden Biomolekülen befähigt sind, angekuppelt sind.

Gelförmige kugelförmige Träger für Affinitätsliganden wer- den seit längerem in vielen Bereichen der Biotechnologie zur Reinigung und Abtrennung der verschiedensten Biomolekü- le eingesetzt. Ein Beispiel dafür sind die Affinitätsträger auf Agarosebasis welche in Suspension in den Handel kommen.

Das Suspensionsmedium kann dabei Wasser oder ein anderes Lösungsmittel sein. Nur wenige Matrices werden in lyophili- sierter Form angeboten.

Weiterhin ist es schwierig bis unmöglich einmal in wässri- gem Medium gequollene Matrices wieder zu trocknen, da die

Gelkügelchen dabei irreversibel geschädigt werden. Die Auf- bewahrung und der Transport solcher Gele stellen also ein erhebliches logistisches Problem dar.

Aus der EP 0 787 523 AI ist bekannt, zur affinen Stofftren- nung an ein Trägermaterial Liganden zu kuppeln, die die Funktion haben, eine einzelne Zielsubstanz oder auch eine ganze Klasse von Substanzen adsorptiv spezifisch zu binden.

Weiter ist aus der DE 196 17 775 AI bekannt, Membranadsor- ber bzw. Membranen zu verwenden, die Liganden tragen, die zur Wechselwirkung mit mindestens einem Stoff einer mit ihm in Kontakt stehenden flüssigen Phase befähigt sind. Der Transport der flüssigen Phase durch die Membran hindurch erfolgt dabei konvektiv aufgrund einer Druckdifferenz.

Nachteilig bei der bekannten Abtrennung von Biomolekülen ist, dass die Träger bzw. Membranen mit den angekuppelten Affinitätsliganden aufwendig an einer Austrocknung gehin- dert werden müssen, um einen Verlust der Bioaktivität der Liganden zu vermeiden. Ein wassernasser Zustand der Membra- nen birgt zudem die Gefahr eines mikrobiellen Angriffes und bedingt die Notwendigkeit ein Konservierungsmittel zuzuset- zen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Membranen zur Abtrennung von Biomolekülen aus einer Flüssigkeit mit Hilfe von Affinitätsliganden bereitzustellen, so dass deren umständliche und kostenintensive nasse Lagerung vermieden werden kann.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass der Membrankörper mit dem Affinitätsliganden unter Beibehaltung der Aktivität des Af- finitätsliganden getrocknet lagerbar ist.

Dadurch, dass der Membrankörper praktisch ohne signifikan- ten Aktivitätsverlust trocken lagerbar ist, können die La- ger-und Transportkosten wesentlich verringert werden. Die Abtrennung der Biomoleküle vereinfacht sich.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass mit Affinitätsliganden, wie Proteinen, beladene Membranen längere Zeit ohne signifikanten Aktivitätsverlust trocken gelagert werden können. Dabei handelt es sich um mikroporöse Membranen der Fa. Sartorius AG Göttingen, die unter dem Handelnamen Sartobind erhältlich sind. Unter "trocken"soll dabei verstanden werden, dass das Porenvolumen der Membran bzw. des Membrankörpers im wesentlichen durch Luft ausgefüllt ist. Dies schließt nicht aus, dass die innere Oberfläche von einer schwer flüchtigen organischen Substanz bedeckt ist.

Geeignet sind Membranen mit mikroporösen adsorptiven Membrankörpern auf Basis von beispielsweise Celluloseacetat (CA), Cellulosenitrat (CN), Polyamid, PESU, PP, PVDF. Die Porengröße beträgt zwischen 0,01 bis 15 um. Bevorzugt wird eine Porengröße zwischen 0,2 und 5 um. Der Membrankörper weist weiterhin eine Dicke zwischen 100 und 500 um, vor- zugsweise von 200 bis 300 um auf.

Die Membranen sind vorzugsweise chemisch aktiviert, so dass die Affinitätsliganden chemisch angekuppelt werden. Es ist aber auch eine physikalische Anbindung der Affinitätsligan- den an die Membran möglich.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der Membrankörper eine Imprägnierung mit Glycerin auf. Die Glycerinimprägnierung trägt dazu bei, dass beim Trocknungs-

prozess die Struktur der mikroporösen Membran bzw. des Membrankörpers nicht beschädigt wird.

Mögliche Affinitätsliganden sind dem Fachmann bekannt. Als Beispiele für adsorptive Liganden werden genannt : Thiophile, hydrophobe der verschiedenen Kettenlängen und Konfigu- rationen Reversed Phase, reaktive und andere Farbstoffe, niedermolekulare ungeladene oder geladene organische Moleküle, - Aminosäuren und Analoga, Coenzyme, Cofaktoren und deren Analoga, Substrate und deren Analoga, endokrine und exokrine Substanzen wie Hormone und hor- monähnlich wirkende Effektoren und deren Analoga, Enzym-Substrate,-Inhibitoren und deren Analoga, Fettsäuren, Fettsäurederivate, konjugierte Fettsäuren und deren Analoga.

Nukleinsäuren DNA, und deren Analoga und Derivate, RNA und deren Analoga und Derivate, Monomere und deren Analoga und Derivate, Oligo-bis Polymere und deren Analoga und Derivate, hochmolekulare Kohlenhydrate linear oder verzweigt ; un- substituiert oder substituiert, Glycokonjugate, wie - Heparin, - Amylose, Zellulose, Chitin, Chitosan, - Monomere und Oligomere, - deren aller Derivate und Analoga, - Lignin und dessen Derivate und Analoga.

Hochmolekulare Liganden wie - Proteine und ihre Oligomere, Multimere, Unterein- heiten, sowie Teile davon, - Peptide, Polypeptide deren Analoga und Derivate, - Lectine, - Antikörper und Teile davon, - Fusionsproteine, - Haptene, Enzyme und Untereinheiten sowie Teile davon, Strukturproteine, Rezeptoren und Effektoren sowie Teile davon, Xenobiotika Pharmazeutika und Pharmazeutische Wirkstoffe alkaloid Antibiotika Biomimetika Weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtungen bzw. ein Filtrationsmodul anzugeben, dass zur kostengünsti- gen und effektiven Abtrennung von Biomolekülen geeignet ist.

Diese weitere Aufgabe wird erfindungsgemäß in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 9 dadurch gelöst, dass die Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 8 ausgebildet ist.

Durch die Ausbildung der Membrane nach einem der Ansprüche 1 bis 8 weist das Filtrationsmodul die oben genannten Vor- teile auf.

Insbesondere kann durch die Verwendung einer Mehrzahl von Membranen eine selektive Trennung verschiedener Biomoleküle erreicht werden. Die Membranen können zudem dem jeweiligen Trennproblem relativ einfach angepasst werden. Die Membra-

nen können mehrlagig in einem Gehäuse angeordnet werden.

Sie können aber auch hintereinander in unterschiedlichen Gehäusen oder Gehäusekammern angeordnet werden Die bekannten Verfahren zur Abtrennung von Biomolekülen weisen die oben genannten Nachteile auf.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein effizientes und kostengünstiges Verfahren zur Abtren- nung von Biomolekülen aus einer zu prozessierenden Flüssig- keit anzugeben, das auf eine umständliche nasse Lagerung und Transport verzichten kann.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 12 dadurch gelöst, dass folgende Schritte durchgeführt werden : a) Ankuppeln des Affinitätsliganden in einem Lösungsmittel an den Membrankörper, b) Spülen des Membrankörpers mit mindestens einem Spülmedi- um, c) weitgehendes Entfernen des letzten Spülmediums durch ei- nen Trocknungsvorgang, d) trockene Zwischenlagerung der Membranen bei Bedarf und e) Filtrieren der Flüssigkeit durch die Membranen, so dass die Biomoleküle abgetrennt werden.

Durch die mögliche trockene Lagerung der Membran ohne Akti- vitätsverlust wird sowohl die Lagerung als auch der Trans- port vereinfacht und damit kostengünstiger.

Um die Gefahr eines mikrobiellen Angriffs bei Verwendung von Wasser als Spülmedium weitgehend auszuschließen, wird die Membran vorzugsweise auf eine Wasseraktivität von < 40% getrocknet. Unter Wasseraktivität ist dabei der Gleichge-

wichtspartialdruck des Wassers bezogen auf reines Wasser der gleichen Temperatur zu verstehen.

Dem letzten Spülmedium nach Schritt b) kann noch in einem Schritt bl) eine schwer flüchtige, mit dem Spülmedium mischbare, organische Substanz bzw. Komponente als Impräg- nierungsmittel zugefügt werden. Das Imprägnierungsmittel verbleibt bei dem Trocknungsvorgang in der Membrane. Es kann auf der Porenoberfläche einen Film bilden oder die Membranmatrix in einem gequollenen Zustand erhalten.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefüg- ten Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft veranschaulicht sind.

Figur 1 : Eine schematische Darstellung eines Filtermo- duls mit einer in einem Gehäuse angeordneten Membran, Figur 2 : eine schematische Darstellung eines Filtermo- duls zum Abtrennen von Biomolekülen mit in Ge- häusen hintereinander geschalteten Membran und Figur 3 : eine Schematische Darstellung eines Filtermo- duls zum Abtrennen von Biomolekülen mit in ei- nem Gehäuse mehrlagig angeordneten Membranen.

Ein Filtermodul 1 zum Abtrennen von Biomolekülen aus einer Flüssigkeit besteht im Wesentlichen aus einem Gehäuse 2 und einer Membran 3 mit einem Membrankörper 4.

Das Gehäuse 2 weist einen Zufluss 5 und einen Abfluss 6 auf. Die Membran 3 mit ihrem mikroporösen adsorbtiven Memb- rankörper 4 ist auf Basis von beispielsweise Celluloseace- tat, Cellulosenitrat, Polyamid, PESU, PP, PVDF ausgebildet

und weist eine Porengröße zwischen 0,01 bis 15 um, vorzugs- weise 0,2 bis 5 um auf. Der flächig ausgebildete Membran- körper 4 weist dabei eine Dicke zwischen 100 und 500 um, vorzugsweise 200 bis 300 um auf. An den Membrankörper 4 sind dem Fachmann bekannte (nicht dargestellte) Affinitäts- liganden gekuppelt. Die Affinitätsliganden werden so ausge- sucht, dass sie zu einer Wechselwirkung mit dem aus der zu prozessierenden Flüssigkeit abzutrennenden Biomolekül befä- higt sind.

Die Membran 3 kann entsprechend Fig. 1 einlagig in dem Gehäuse 2 angeordnet sein. Mehrere Gehäuse 2 mit Membranen 3 können dabei hintereinander angeordnet werden.

Des ist aber auch möglich, die Membranen 3"mehrlagig in einem Gehäuse 2'anzuordnen. An die Membran 3, 3'wird der nicht dargestellte Affinitätsligand chemisch angekuppelt, die Membran 3, 3'mit Glycerin imprägniert und anschließend einem Trocknungsprozess unterzogen. Dabei wird der Membran 3, 3'weitgehend das Wasser entzogen. Nach einer Trockenla- gerung bzw. nach einem Transport wird der Membran 3, 3'ü- ber den Zufluss 5 die zu prozessierende Flüssigkeit zuge- führt und konvektiv durch die Membran transportiert, so dass sie über den Abfluss 6 abfließen kann. Die abzutren- nenden Biomoleküle werden dabei an die Affinitätsliganden angebunden.

Beispiel : Die nachfolgend mit PBS bezeichnete Lösung wurde, wie in J.

Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis"Molecular Cloning"A Laboratory Manual, second edition Cold Spring Harbour Labo- ratory Press 1989, Book 3, Appendix B. 12 beschrieben, wie folgt hergestellt : 9/1 Substanz 8, 0 Natriumchlorid NaCl 0,20 Kaliumchlorid KC1 1,44 di-Natriumhydrogenphosphat Na2HPO4 0, 24 Kaliumdihydrogenphosphat KH2P04 pH 7,4 + 0,2

Eine mit Aldehydgruppen funktionalisierte mikroporöse Membrane des Typs Sartobind@ Aldehyde Membrane code 19306 wurde mit Protein A umgesetzt. Dazu wurde Protein A der Fa.

Repligen, Bezeichnung rPrA Lot Nr. 011038 zu 10 mg/ml in PBS gelöst. Drei Filterronden mit 25 mm Durchmesser wurden mit 2 ml dieser Lösung in einer kleinen Plastikpetrischale für 3 h bei Umgebungstemperatur geschüttelt. Zur Reduktion der entstandenen Schiffschen Basen wurde 1% Endkonzentrati- on Cyanoborhydrid zugesetzt. Nach Ablauf der Umsetzung wur- den die Membranen entnommen und in eine frische Petrischale überführt. Zur Reduktion der restlichen Aldehydgruppen wur- den 5 ml einer Lösung von Natrium-Borhydrid in PBS mit ei- ner Endkonzentration von 1% zugesetzt und die Membranen für weitere 15 min geschüttelt. Die Membranen wurden danach nacheinander mit PBS, einer Lösung von 0.1 M Glyzin pH 2,7, 1 mM HC1, 1 mM NaOH und 1 M NaCl in 0.01 M Kalium-phosphat pH 7.0 gespült. Die Membranen wurden mit einer Lösung von 22% w/v Glycerol in 0.01 M Kalium-phosphat pH 7.0 impräg- niert. Die Membranen wurden dann bei Umgebungstemperatur in einem Luftstrom für 3 h getrocknet und bei 4°C unter weit- gehendem Luftabschluss gelagert.

Nach bestimmten Zeiten wurden Membranen entnommen und auf ihre Bindungskapazität für humane Immunglobuline des Typs IgGlund IgG2 getestet.

Dabei wurden drei der oben beschriebenen Membranen mit 25 mm Durchmesser in ein Spritzenvorsatz Best. Nr. 16517 der

Fa. Sartorius AG eingebaut und mit einer Einwegspritze ver- sehen.

Humanes abgelaufenes Plasma einer örtlichen Blutbank wurde 1 : 40 mit PBS verdünnt und diese Lösung über 0.2 um membran- filtriert. 10 ml dieser so erhaltenen Lösung wurde in die Spritze gefüllt und durch Schwerkraft über die drei einge- bauten Membranen filtriert. Dann wurde mit 10 ml PBS ge- spült und die gebundene Menge IgG durch 10 ml 0.1 M Glyzin pH 2.7 eluiert. Die Absorption der Elutionslösung bei 280 nm wurde in einem Spektralphotometer bestimmt und an Hand einer Eichgeraden mit Rinderserumalbumin als Verbleichssub- stanz die Proteinbindekapazität der Membrane bestimmt.

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der folgenden Tabel- le dargestellt.

Tabelle : Zeitliche Veränderung der IgG Bindekapazität von Protein A beladenen aldehyd-funktionalisierten Membranen Zeit (Tage) Bindekapazität (ug/cm2) 0 42 41 47 20 43 45 40 56 37 Alle Werte sind Mittelwerte aus mindestens 2 Messungen.