2. Sector de la técnica La invención va dirigida al sector de producción industrial de pasta de papel y, en particular a las fábricas Kraft que utilizan madera de frondosas como materia prima. Entre estas últimas, la madera de eucalipto es especialmente adecuada para la fabricación de ciertos tipos de pastas, entre otras razones por el rápido crecimiento de esta especie forestal. La fabricación de pasta Kraft de eucalipto (utilizando Eucalyptus globulus y otras especies) mediante blanqueo libre de C12 tiene gran importancia económica en nuestro país, que junto con Brasil y Portugal son los principales productores mundiales. Utilizando la invención descrita es posible mejorar la calidad de estas pastas reduciendo su contenido en esteroles libres y saponificados, y ampliar la utilización de secuencias de blanqueo totalmente libres de cloro (TCF). Otras especies forestales empleadas con fines papeleros, como es el caso del Populus tremuloides utilizado en América del Norte, poseen extractos lipofílicos con composiciones similares a la del eucalipto. Respecto a otras especies papeleras que poseen contenidos elevados de triglicéridos, hay que tener en cuenta que éstos son saponificados durante la cocción Kraft, pero que ésta no afecta a los esteroides implicados en la formación de depósitos. Por todo ello, el procedimiento biotecnológico descrito es aplicable para el control del"pitch"en pastas de diferentes especies de frondosas.

3. Estado de la técnica Las modernas tendencias respetuosas con el medio ambiente para la fabricación de pasta de papel implican el desarrollo de procesos de blanqueo"totalmente libres de cloro" (TCF), así como la progresiva aproximación a las condiciones denominadas de "efluente líquido cero" (ZLE). Los extraíbles lipofílicos, que tienden a acumularse en los circuitos, se encuentran entre los constituyentes de la madera más problemáticos con vistas al desarrollo de procesos TCF y ZLE. Estos compuestos forman los denominados depósitos de"pitch" (brea) que disminuyen la calidad del producto final y causan problemas en el funcionamiento de las fábricas produciendo importantes pérdidas

económicas (31). Durante el pulpeo de la madera y el refinado de la pasta, los extraíbles en los canales resiníferos y en las células del parénquima radial pueden liberarse formando"pitch"coloidal. Las partículas de"pitch", que suelen ser de pequeño tamaño, pueden coalescer en gotas mayores que se depositan sobre la superficie de las fibras o del equipo, o permanecen suspendidas en las aguas de lavado para ser descargados en los efluentes. La mayor necesidad de recircular el agua en las fábricas y reducir los efluentes para llegar a operar en condiciones de ZLE, está llevando a un incremento en las concentraciones de"pitch"que da lugar a un aumento de los depósitos. Además, algunos problemas de"pitch"se hacen más severos con la introducción de secuencias de blanqueo TCF.

Tradicionalmente los depósitos de"pitch"en la fabricación de pasta y posterior manufactura de papel han sido reducidos mediante el descortezado y el almacenamiento de los troncos y astillas de madera, y añadiendo agentes de control físico-químicos (1- 3,30). Sin embargo, los costes son altos y los resultados a menudo poco satisfactorios.

Como una alternativa en los últimos años se ha sugerido la eliminación biológica de los extraíbles de la madera mediante el tratamiento con microorganismos o el uso de enzimas para el control del"pitch" (8,18-22). Sin embargo, los preparados biotecnológicos actualmente disponibles en el mercado no son eficaces para el control del"pitch"durante la fabricación de pasta de madera de eucalipto, extensivamente utilizada como materia prima en España, Portugal, Brasil y otros países. Esto se debe a que están basados en enzimas u organismos que principalmente hidrolizan triglicéridos que sólo representan una fracción minoritaria de los extraíbles del Eucalyptus globulus (27). Además, cuando las pastas de frondosas con niveles mas elevados de glicéridos se obtienen tras cocción Kraft se produce la saponificación de estos compuestos en el medio alcalino (40), pero se conservan los compuestos lipofílicos no-saponificables.

Entre éstos se encuentran el sitosterol y los ésteres de esteroles, que son compuestos muy difundidos en la fracción extraíble de las maderas y llegan a ser los compuestos lipofílicos mayoritarios en diferentes especies de frondosas, como el Eucalyptus globulus o el Populus tremuloides, dónde se encuentran asociados a los problemas de "pitch" (9-11,27).

La presente invención incluye el examen de un amplio número de cepas de hongos en relación con su capacidad para eliminar extraíbles de la madera de eucalipto u otras

frondosas, con especial énfasis en los compuestos responsables de la formación de depósitos. Como resultado, se seleccionan cuatro cepas-de hongos para ser utilizadas en el tratamiento de la madera antes del pulpeo, cuya efectividad se evalúa por cocción Kraft de laboratorio seguida de análisis químico de las lejías negras, blanqueo TCF, y evaluación de las propiedades de reimo, mecánicas y ópticas de las pastas obtenidas.

A continuación se completan las referencias de publicaciones y patentes relacionadas : REFERENCIAS CITADAS 1. Allen, J., B. B. Sitholé, J. M. MacLeod, C. Lapointe, and F. J. McPhee. 1991.

The importance of seasoning and debarking in the Kraft pulping of aspen. J. Pulp Paper Sci. 17 : J85-J91.

2. Allen, L. H. 1980. Mechanisms and control of pitch deposition in newsprint mills.

Tappi J. 63 : 81-87.

3. Allen, L. H. 1988. Pitch control during production of aspen Kraft pulp. Pulp Paper Can. 89 : 87-91.

4. Behrendt, C. J., R. A. Blanchette, and R. L. Farrell. 1995. An integrated approach, using biological and chemical control, to prevent blue stain in pine legs.

Can. J. Bot. 73 : 613-619.

5. Breuil, C., R. Leone, J. Peng, and A. Serreqi. 1997. Some wood-inhabiting fungi can degrade aspen steryl esters and waxes. Proc. 9th ISWPC, Montreal, May 60-1- 60-3.

6. Brush, T., R. L. Farrell, and C. Ho. 1994. Biodegradation of wood extractives from Southern and Yellow pine by Ophiostoma piliferum. Tappi J. 77 : 155-159.

7. Calero-Rueda, O., C. Muñoz, A. T. Martínez, and M. J. Martínez. 1999. Control biológico del"pitch" : Caracterización de una lipasa/esterasa de Ophiostoma piceae.

Res. XVII Congr. Nac. Microbiología, Granada, 17-21 September.

8. Chen, T., Z. Wang, Y. Gao, C. Breuil, and J. V. Hatton. 1994. Wood extractives and pitch problems : Analysis and partial removal by biological treatment. Appita 47 : 463-466.

9. Chen, T., Z. Wang, Y. Zhou, C. Breuil, O. K. Aschim, E. Yee, and L. Nadeau.

1995. Using solid-phase extraction to assess why aspen causes more pitch problems than softwoods in Kraft pulping. Tappi J. 78 : 143-149.

10. del Río, J. C., A. Gutiérrez, and F. J. González-Vila. 1999. Analysis of impurities occurring in a totally-chlorine free-bleached Kraft pulp. J. Chromatogr. 830 : 227- 232.

11. del Río, J. C., A. Gutiérrez, F. J. González-Vila, and F. Martín. 1999.

Application of pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry to the analysis of pitch deposits and synthetic polymers in pulp and pulp mills. J. Anal. Appl.

Pyrolysis 49 : 165-177.

12. del Río, J. C., A. Gutiérrez, F. J. González-Vila, F. Martín, and J. Romero.

1998. Characterization of organic deposits produced in the Kraft pulping of Eucalyptus globulus wood. J. Chromatogr. 823 : 457-465.

13. Dorado, J., M. J. Martínez-Íñigo, F. W. Classen, T. A. van Beek, H. B. P. A.

Wijnberg, G. Lenon, and R. Sierra-Alvarez. 1998. Degradation and detoxification of pitch constituents in Scots pine by white-rot fungi, p. B41-B44. In Proceedings of the 7th International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. Canadian Pulp and Paper Association, Montreal, Canada.

14. Dueñas, M. and M. T. Tellería. 1988. Catálogo de los corticiáceos y poliporáceos, s. l. (Aphyllophorales, Basidiomycotina), de la micoflora Cántabro-Astur. Ruizia 5 : 1- 262.

15. Dutta, R. K., M. K. Roy, and H. D. Singh. 1992. Metabolic blocks in the degradation of p-sitosterol by a plasmid-cured strain of Arthrobacter oxydans. J.

Basic Microbiol. 32 : 167-176.

16. Esteve-Raventós, F., A. Ortega, and J. Gómez. 1996. Melanotus hepatochrous (Strophariaceae, Agaricales) found in Spain. Z. Mykol. 62 : 213-217.

17. Esteve-Raventós, F., F. C. Sánchez, M. Villarreal, and J. M. Barrasa. 1997. Il genere Descolea nella penisola Iberia. Riv. Micol. 3 : 251-260.

18. Farrell, R. L., R. A. Blanchette, T. S. Brush, Y. Hadar, S. Iverson, K. Krisa, P.

A. Wender, and W. Zimmerman. 1993. CartapipTM : A Biopulping Product for Control of Pitch and Resin Acid Problems in Pulp Mills. J. Biotechnol. 30 : 115-122.

19. Farrell, R. L., R. A. Blanchette, T. S. Brush, Y. Hadar, J. Merrit, R. Snyder, and P. A. Wendler. 1991. Process for reducing pitch content in pulpwood. Patent (European) No. 0387,187, AZ.

20. Fischer, K. and K. Messner. 1992. Reducing troublesome pitch in pulp mills by lipolytic enzymes. Tappi J. 75 : 130-135.

21. Fischer, K., L. Puchinger, and K. Schloffer. 1993. Enzymatic pitch control of sulfite pulp on pilot scale. J. Biotechnol. 27 : 341-348.

22. Fujita, Y., H. Awaji, H. Taneda, M. Matsukura, K. Hata, H. Shimoto, M.

Sharyo, H. Sakaguchi, and K. Gibson. 1992. Recent advances in enzymic pitch control. Tappi J. 75 : 117-122.

23. Gao, Y. and C. Breuil. 1995. Extracellular lipase production by a sapwood-staining fungus, Ophiostomapiceae. World J. Microbiol. Biotechnol. 11 : 638-642.

24. Gao, Y. and C. Breuil. 1998. Properties and substrate specificities of an extracellular lipase purified from Ophiostoma piceae. World J. Microbiol.

Biotechnol. 14 : 421-429.

25. Guillén, F., A. T. Martínez, and M. J. Martínez. 1992. Substrate specificity and properties of the aryl-alcohol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii.

Eur. J. Biochem. 209 : 603-611.

26. Gutiérrez, A., J. C. del Río, F. J. González-Vila, and F. Martín. 1998. Analysis of lipophilic extractives from wood and pitch deposits by solid-phase extraction and gas chromatography. J. Chromatogr. 823 : 449-455.

27. Gutiérrez, A., J. C. del Río, F. J. González-Vila, and F. Martín. 1999. Chemical composition of lipophilic extractives from Eucalyptus globulus Labill. wood.

Holzforschung 53 : 481-486.

28. Gutiérrez, A., J. C. del Río, F. J. González-Vila, and J. Romero. 1998. Variation in the composition of wood extractives from Eucalyptus globulus during seasoning.

J. Wood Chem. Teclmol. 18 : 439-446.

29. Gutiérrez, A., J. C. del Río, M. J. Martínez, and A. T. Martínez. 1999. Fungal degradation of lipophilic extractives in Eucalyptus globulus wood. Appl. Environ.

Microbiol. 65 : 1367-1371.

30. Hamilton, K. A. and J. A. Lloyd. 1984. Measuring the effectiveness of talc for pitch control. Appita 37 : 733-740.

31. Hillis, W. E. and M. Sumimoto. 1989. Effect of extractives on pulping, p. 880-920.

In J. W. Rowe (ed.), Natural Products of Woody Plants II. Springer-Verlag.

32. International Organisation for Standardization. Documentation and Information (ISO). 1998. ISO Standards Handbook. ISO, Geneva.

33. Leone, R. and C. Breuil. 1998. Filamentous fungi can degrade aspen steryl esters and waxes. Int. Biodeterior. Biodegrad. 41 : 133-137.

34. Moreno, G. 1980. Notas sobre la vegetación micológica centro occidental española.

Acta Bot. Malacitana 6 : 175-202.

35. Órsá, F. and B. Holmbom. 1994. A convenient method for the determination of wood extractives in papermaking process waters and effluents. J. Pulp Paper Sci.

20 : J361-J366.

36. Raimbault, M. and G. Viniegra-González. 1985. Modern and traditional aspects of solid state fermentation, p. 153-163. In D. S. Chahal (ed.), Oxford & IBH, New Delhi.

37. Rocheleau, M. J., B. B. Sitholé, L. H. Allen, and Y. Noel. 1999. Fungal treatment of aspen for wood resin reduction : Effect on aged aspen wood chips at room temperature and at 5°C. Holzforschung 53 : 16-20.

38. Sankaran, K. V., B. C. Sutton, and D. W. Minter. 1995. A Checklist of Fungi Recorded on Eucalyptus, p. 1-376. IMI, Egham.

39. Satyanarayana, T. and L. Chavant. 1987. Bioconversion and binding of sterols by thermophilic moulds. Folia Microbiol. (Prague) 32 : 354-359.

40. Sióstrüm, E. 1993. Wood Chemistry. Fundamentals and Applications. Academic Press, San Diego.

41. Tappi. 1996. Test Methods 1996-1997. TAPPI, Atlanta.

42. Tommerup, I. C., N. L. Bougher, and N. Malajczuk. 1991. Laccaria fi°aterna, a common ectomycorrhizal fungus with mono-and bi-sporic basidia and multinucleate spores : comparison with the quadristerigmate, binucleate spored L. laccata and the hypogeous relative Hydnangium carneum. Mycol. Res. 95 : 689-698.

43. Valmaseda, M., G. Almendros, and A. T. Martínez. 1991. Chemical transformation of wheat straw constituents after solid-state fermentation with selected lignocellulose-degrading fungi. Biomass Bioenergy 1 : 261-266.

44. Wassef, M. K. 1977. Fungal lipids. Adv. Lipid Res. 15 : 159-232.

45. Zadrazil, F. and P. Reiniger. 1988. Treatment of Lignocellulosics with White-Rot Fungi. Elsevier Appl. Sci., London.

PATENTES RELACIONADAS Behrendt, C. J., Blanchette, RA., Farrell, R. L. & Iverson, S. 1997. Method for improving the efficiency of chemical pulping processes by pretreating wood or pulpwood with white rot fungi. Patent WO, No., W09713025 : Notas : Clariant, Sandoz, Behrendt, C. J., Blanchette, R. A., Farrell, R. L. and Iverson, S.

La presente invención está relacionada con el emmpleo de ciertos hongos basidiomicetos, en particular, hongos tales como Phlebia tremellosa, Trichaptum biforme, Schizophyllum commune, y Phanerochaete gigantea, en el preacondicionamientode la madera o la pasta de madera para lograr un proceso mas uniforme y mas eficiente, con el resultado de un producto de mayor calidad. Se ha comprobado que este tratamiento aumenta la porosidad de los sustratos de madera, en particular en los sustratos no esterilizados de madera. Estos aumentos de la porosidad son acompañados por una mejor epenetración del líquido en las celulas en la pasta mas porosa de la la pasta o la madera para pasta en un proceso posterior de tratamiento químico. Aunque ciertos hongos seleccionados pueden penetrar profundamente y dejar vacíos donde se ha eliminado"pitch"y o resina, o se haya modificado la pared celular, se ha comprobado que es posible que estos vacíos no tengan sustancialmente ningun efecto sobre el contenido de lignina de la pasta o la madera para pasta. No obstante la madera resultante tratada con hongos, cuando esta se sujeta a un tratamiento químico posterior, muestra una mayor blancura, mayor rendimiento y una reducción concomitante en el número Kappa, sin aumento significante de viscosidad. La invención tambien esta relacionada con un método para reducir el consumo de energía electrica durante el refinamiento mecánico de la madera en pasta. Este método consiste en la inoculación de al menos un extremo del tronco con una cantidad efectiva para la reducción de"pitch"de al menos un de los hongos seleccionados del grupo anteriormente citado. Se deja el hongo crecer y penetrar dentro de la madera durante un tiempo suficiente para reducir"pitch"en la madera, y posteriormente ésta se sujeta a un proceso de refinamiento mecánico.

Blanchette, RA., Farrell, R. L., Burnes, T. A., & 1998. Pitch degradation with Pseudomonas fluorescens : Patent (WO) No., W09636765 (= USA 5,711,945) : Notas : University of Minnesota

Las bacterias Pseudomonas fluorescens y Xanthomonas campestris son utiles para la reducción del contenido de"pitch"en las pastas y las maderas para pasta empleados en la fabricación de productos celulosicas. Estas bacterias son también utiles para reducir las manchas de color causadas por hongos colorantes en la madera estructural mediante la inoculación de la madera estructural o los troncos de origen de los cuales se va a recortar.

Blanchette, RA., Farrell, R. L., & Iverson, S. 1994. Pitch degradation with white rot fungi : Patent (WO) No., W09421854 : Notas : Sandoz Los hongos Schizophyllum commune, Trichaptum biforme y Phanerochaete gigantea son utiles para la reducción del contenido de"pitch"de las pastas y las maderas para pasta empleados en la fabricación de productos celulosicos.

Behrendt, C. J., Blanchette, RA., & Farrell, R. L. 1995. Biological control for wood products and debarking : Patent (EU) No., EP0683023 : Notas : Sandoz Los hongos que crecen blancos o sin color y que reducen"pitch"se emplean para proteger la madera estructural antes y despues de su corte de los troncos contra la descoloración por hongos colorantes. El hongo Phanerochaete gigantea es también util para facilitar la eliminacón de cáscara.

Blanchette, RA., Farrell, RL., & Iverson, S. 1995. Pitch degradation with white rot fungus : Patent (EU) No., EP0683265 : Notas : Sandoz El hongo Phlebia tremellosa es útil en la reducción de del contenido de"pitch"de las pastas y madera para pasta empleado en la fabricación de productos celulosicas. Si se incuba durante un tiempo los suficientamente largo, este hongo tambien es capaz de degradar y/o modificar la lignina.

Blanchette, RA., Farrell, R. L., & Iverson, S. 1997. Pitch degradation with white rot fungi : Patent (EU) No., EP0689625 : Notas : Clariant Blanchette, RA., Farrell, R. L., Merritt, J. E., Hadar, Y., Snyder, R. A., & Wender, P. A. 1990. Process for reducing the pitch content in pulpwood. Patent (EU), No., EP0387187 :

Notas : Sandoz La invención está relacionada con la industria de fabricación de papel, y proporciona un proceso para la reducción del contenido de resina de la madera que consiste en aplicar una inoculación de un hongo penetrante a la madera y mantener unas condiciones ambientales efectivas para promover el crecimiento del hongo.

Farrell, R. L., Hadar, Y., Wender, P. A., & Zimmerman, W. 1992. New fungi for pitch reduction, their preparation and use. Patent (EU) No., EP0470929 : Notas : Sandoz Ascospores de los hongos que penetran la madera y degradan"pitch"de la clase Ascomycotina and Deuteromycotina, p. ej, Ophiostroma, pueden ser"screened"para proporcionar hongos que reunen las propiedades de un buen crecimiento sobre sustratos de madera no ésteriles y unos efectos sobre la blancura minimizados o hasta mejorados para el uso en la reducción de"pitch"en los sustratos de madera, p, ej, en los troncos y astillas de madera. Un método nuevo y mejorado para el aislamiento de estos ascospores que consiste en la efectiva suspensión en un aceite consumible por el hongo, p. ej, un aceite vegetal, y entonces el tratamiento del aceite con un agente de dispersión también se divulga.

Blanchette, RA., Farrell, R. L., & Iverson, S. 1995. Pitch degradation with white rot fungi : Patent (USA) No., 5,476,790 : Notas : Sandoz Ltd.

Los hongos Schizophyllum commune, Trichaptum biforme y Phanerochaete gigantea son utiles para reducir el contenido de"pitch"en pastas y madera para pastas empleadas en la fabricación de productos celulosicas.

Blanchette, R. A., Farrell, R. L., & Iverson, S. 1995. Pitch degradation with white rot fungus : Patent (USA) No., 5,472,874 : Notas : Sandoz Ltd.

El hongo Phlebia tremellosa es útil para reducir el contenido de"pitch"en pastas y madera para pastas empleadas en la fabricación de productos celulosicas.

Blanchette, RA., Farrell, R. L., & Behrendt, C. J. 1996. Biological control for wood products : Patent (USA) No., 5,532,164 : Notas : Sandoz Ltd.

Los hongos que crecen blancos o sin color y que reducen"pitch"se emplean para proteger la madera estructural antes y despues de su corte de los troncos contra la descoloración por hongos colorantes.

Blanchette, RA., Farrell, R. L., & Behrendt, C. J. 1996. Biological control for wood products and debarking : Patent (USA) No., 5,518,921 : Notas : Clariant Los hongos que crecen blancos o sin color y que reducen"pitch"se emplean para proteger la madera estructural antes y despues de su corte de los troncos contra la descoloración por hongos colorantes. El hongo Phanerochaete gigantea es también util para facilitar la eliminacón de cáscara.

Blanchette, RA., Burnes, T. A., Farrell, R. L., & Iverson, S. 1998. Pitch degradation with wood colonizing bacteria : Patent (USA) No., 5,766,926 : Notas : Clariant Las bacterias Pseudomonas fluorescens, Pantoea (Enterobacter) agglomerans, Bacillus cereus, y Xanthomonas campestris son utiles para la reducción del contenido de"pitch" en las pastas y las maderas para pasta empleadas en la fabricación de productos celulosicas. Estas bacterias son también utiles para reducir las manchas de color causadas por hongos colorantes en la madera estructural mediante la inoculación de la madera estructural o los troncos de origen de los cuales se va a recortar.

Blanchette, RA., Burnes, T. A., & Farrell, R. L. 1998. Pitch degradation with Pseudomonas fluorescens : Patent (USA) No., 5,711,945 : Notas : University of Minnesota Las bacterias Pseudomonas fluorescens y Xanthomonas campestris son utiles para la reducción del contenido de"pitch"en las pastas y las maderas para pasta empleadas en la fabricación de productos celulosicas. Estas bacterias son también utiles para reducir las manchas de color causadas por hongos colorantes en la madera estructural mediante la inoculación de la madera estructural o los troncos de origen de los cuales se va a recortar.

Blanchette, RA., Farrell, R. L., Hadar, Y., Merrit II, J. E., Snyder, R. A., Wender, P. A., & Zimmerman, W. 1998. Process for treating pulpwoods and pulps with a pitch degrading fungus of the genus Ophiostoma : Patent (USA) No., 5,853,537 : Notas : Clariant

Los hongos penetrantes de madera de las clases Ascomycotina y Deuteromycotina pueden emplearse con exito para degradar"pitch"en las formas de madera que se emplean para la afabricación de productos celulosicas. Estos hongos incluyen, pero no son limitados a, los hongos mancha azul. El proceso de selección de ascospores puede utilizarse para proporcionar hongos que muestran un buen crecimiento en sustrato de madera mientras tienen poco o ningun efecto sobre la blancura del sustrato, y hasta pueden tener un efecto positivo sobre la blancura. El tratamiento tiene una influencia positiva en las propiedades de robustez de los productos finales, tales como el papel. En una aplicación real la pasta o la madera para pasta se trata con un hongo degrador de "pitch"del género Ophiostoma.

Blanchette, RA., Iverson, S., & Behrendt, C. J. 1998. Pitch and lignin degradation with white-rot fungi : Patent (USA) No., US 5,705,383 : Notas : Clariant La presente invenciona está relacionada con el empleo de ciertos hongos en la reducción del contenido de"pitch"y/o lignina en los materiales celulosicas. En particular, los hongos de white rot Schizophyllum commune, Trichaptum biforme y Phanerochaete gigantea son utiles para la reducción de"pitch"y/o lignina, o ambos, lo que ahorra la energía eléctica durante el refinamiento quimico de la pasta y madera para pasta empleados en la fabricación de productos celulosicas.

Farrell, R. L., Hadar, Y., Wender, P. A., & Zimmerman, W. 1995. Composition containing strains of Ophiostoma piliferum and a method of using the composition to reduce the pitch content of pulpwood or pulp : Patent (USA) No., 5,476,789 : Notas : Sandoz Ltd.

Ascospores de los hongos que penetran la madera y degradan"pitch"de la clase Ascomycotina and Deuteromycotina, p. ej, Ophiostroma, pueden ser"screened"para proporcionar hongos que reunen las propiedades de un buen crecimiento sobre sustratos de madera no ésteriles y unos efectos sobre la blancura minimizados o hasta mejorados para el uso en la reducción de"pitch"en los sustratos de madera, p, ej, en los troncos y astillas de madera. Un método nuevo y mejorado para el aislamiento de estos ascospores que consiste en la efectiva suspensión en un aceite consumible por el hongo, p. ej, un aceite vegetal, y entonces el tratamiento del aceite con un agente de dispersión también se divulga.

Farrell, R. L., Hadar, Y., Wender, P. A., & Zimmerman, W. 1997. Fungi for pitch reduction and their preparation : Patent (USA) No., 5,609,724 : Notas : Sandoz Ascospores de los hongos que penetran la madera y degradan"pitch"de la clase Ascomycotina and Deuteromycotina, p. ej, Ophiostroma, pueden ser"screened"para proporcionar hongos que reunen las propiedades de un buen crecimiento sobre sustratos de madera no ésteriles y unos efectos sobre la blancura minimizados o hasta mejorados para el uso en la reducción de"pitch"en los sustratos de madera, p, ej, en los troncos y astillas de madera. Un método nuevo y mejorado para el aislamiento de estos ascospores que consiste en la efectiva suspensión en un aceite consumible por el hongo, p. ej, un aceite vegetal, y entonces el tratamiento del aceite con un agente de dispersión también se divulga.

Zimmerman, W. & Farrell, R. L. 1997. Mating process for preparing Ophiostoma piliferum fungi for pitch reduction : Patent (USA) No., 5,695,975 : Notas : Clariant Esta invención está relacionada con un método de obtención de un hongo de la especie Ophiostoma piliferum mediante la fertilización selectiva de cepas del hongo y una selección para un descendiente ascospore que se desarolla blanco o incoloro, y que tiene la capacidad de reducir"pitch"en las aspas de madera de Southern Yellow Pine.

Zimmerman, W. & Farrell, R. L. 1997. Fungi for pitch reduction and their preparation : Patent (USA) No., 5,607,855 : Notas : Sandoz Ltd.

Esta invención está relacionada con hongos con propiedades globales especialmente deseables para la reducción del contenido de"pitch"en pastas y madera para pasta, y la preparación y uso de estos hongos. En particular, la presente invención proporciona unos cultivos biologicamente puros del hongo Ophiostoma piliferum que se caracterizan por ser blancos o incoloros y su buen desarrollo virulento, pero que también muestran propiedades excepcionales para la degradación de"pitch".

4. Descripción de la invención 4.1. Breve descripción de la invención Se describe un procedimiento para la obtención de pastas de papel de alta calidad y bajo contenido en compuestos lipofílicos a partir de madera de Eucalyptus globulus y otras frondosas caracterizado por la realización de un pretratamiento microbiano de la madera antes del pulpeo y blanqueo. El pretratamiento biológico se lleva a cabo durante varias semanas en condiciones denominadas de fermentación en estado sólido, caracterizadas por un contenido en agua equivalente a la capacidad de retención de líquidos del sustrato. Su objetivo es eliminar la fracción lipofilica de la madera que, utilizando cromatografía de gases-espectrometría de masas, se ha encontrado está mayoritariamente constituida por sitosterol libre y esterificado con diferentes ácidos grasos. Estos compuestos lipofilicos son los principales responsables de la formación de depósitos de"pitch"durante la fabricación de pasta TCF de eucalipto. El interés del procedimiento descrito se debe a que los depósitos en la maquinaria y la pasta son causa de importantes pérdidas económicas pues obligan a realizar paradas en la producción y rebajan el valor del producto final. Con objeto de identificar los microorganismos más adecuados para la eliminación de los compuestos lipofílicos problemáticos de la madera de eucalipto, se llevó a cabo un"screening"de más de 70 especies de hongos pertenecientes a diferentes grupos taxonómicos : 33 basidiomicetos (incluyendo varias especies de los géneros Phlebia, Perziophora y Pleurotus), 20 ascomicetos (incluyendo nueve especies del género Ophiostoma, cuatro de Ceratocystis y tres de Mollisia) y 19 hongos conidiales (incluyendo varias especies del género Fusafiunz). Tras el tratamiento de la madera con estos hongos se estimó la variación del extracto total en acetona (fracción extraíble de la madera). Sin embargo, el criterio utilizado para la selección de las mejores cepas fue el descenso en sitosterol libre y esterificado estimado mediante cromatografía de gases de la fracción lipofilica (soluble en cloroformo) del extracto en acetona. De esta forma se encontró que varios ascomicetos eran capaces de reducir el contenido de la madera en ésteres de sitosterol pero que sólo los basidiomicetos eran capaces de eliminar eficazmente el sitosterol de la madera de eucalipto. Estos últimos producían simultáneamente un descenso en el contenido en lignina de la madera, lo que constituye una ventaja adicional pues puede permitir ahorros de energía o reactivos en el pulpeo y/o el blanqueo de la pasta. Al final del proceso de selección se escogieron las

siguientes cuatro cepas de basidiomicetos que se encuentran depositadas en las colecciones de cultivos del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC (IJFM) en Madrid y del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) en Baarn (Países Bajos) : Bjerkandera adusta IJFM A660 (CBS 230.93), Phlebia radiata IJFM A588 (CBS 184.83), Pleurotuspulmonarius IJFM A578 (CBS 507.85) y Poria subvermispora IJFM A661 (CBS 347.63). Con estos cuatro hongos se llevaron a cabo estudios adicionales consistentes en : i) un seguimiento detallado de la evolución de los diferentes compuestos lipofilicos en el curso de un tratamiento de siete semanas, realizando muestreos periódicos y análisis mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas; y ii) cocción Kraft, blanqueo TCF y evaluación de las pastas obtenidas. Los primeros estudios mostraron que los hongos producen un rápido descenso de los compuestos mayoritarios, esteroles libres y esterificados (mientras que la velocidad de degradación de hidrocarburos esteroidales y escualeno es mas moderada). Los resultados más prometedores, en términos de mayor degradación de esteroides totales y menor pérdida de peso, se obtuvieron con Phlebia radiata y Poria subvermispora tras 1-2 semanas de tratamiento de la madera. Sin embargo, la información más valiosa fue obtenida tras pulpeo y blanqueo de laboratorio ya que de esta forma fue posible valorar conjuntamente el grado de eliminación de los compuestos problemáticos (sitosterol y ésteres de esteroles) y las características papeleras de las pastas obtenidas. Estas últimas fueron definitivas con vistas a valorar la aplicabilidad industrial del procedimiento desarrollado. En estos ensayos se utilizaron astillas industriales procedentes de la fábrica de pasta Kraft de eucalipto y el tratamiento con los hongos se llevó a cabo en un prototipo de fermentador en estado sólido. El análisis cromatográfico de los compuestos lipofilicos mostró que el pretratamiento biológico de las astillas puede dar lugar a descensos de hasta un 75% en los contenidos de sitosterol y ésteres de esteroles en las lejías negras y pastas obtenidas tras tres semanas de pretratamiento, sin modificar sustancialmente y, en algunos casos, mejorando las propiedades papeleras y la blanqueabilidad de las pastas. Así, los pequeños descensos en la viscosidad de la pasta cruda desaparecen durante el blanqueo TCF y la menor resistencia del papel al rasgado, se compensa con los ahorros en energía de refino, la mayor blancura de la pasta cruda y la mejora en la resistencia del papel a la tracción. Es posible concluir que el procedimiento microbiano descrito resulta eficaz para la eliminación de los compuestos

que causan problemas de"pitch"en éste y otros tipos de pastas de alta calidad. En general, la elección del tratamiento biológico óptimo para el control biológico del "pitch"en diferentes pastas de frondosas deberá ser un compromiso entre una máxima eliminación de compuestos lipofilicos problemáticos, un mínimo descenso del rendimiento de la pasta, y la conservación o mejora de aquellas propiedades de interés para los diferentes tipos de papel a producir.

4.2 Descripción detallada de la invención Microorganismos ensayados Los trabajos para el desarrollo de esta invención se iniciaron con un amplio"screening" de hongos de las divisiones Ascomycota y Basidiomycota y del grupo de los denominados hongos imperfectos o deuteromicetos (que agrupa las formas conidiales de las dos divisiones anteriores). Durante este"screening"se investigó la capacidad de estos microorganismos para degradar los extraíbles lipofilicos de la madera de Eucalyptus globulus, a fin de identificar las mejores cepas para el control de los depósitos de"pitch"durante la fabricación de pastas de eucalipto y otras frondosas, particularmente cuando se utiliza cocción Kraft y blanqueo libre de Cl2.

El posterior"screening"se basó en gran parte en una investigación previa de las especies de hongos que crecen en diferentes plantaciones de eucalipto en España, y sobre la madera de eucalipto utilizada para fabricar pasta de papel. En el curso del estudio se recogieron, cultivaron e identificaron hongos pertenecientes a un total de 90 taxones. Algunos presentaron problemas de viabilidad y no pudieron ser mantenidos en colección, pero otros fueron satisfactoriamente conservados en cultivo e incluidos en los estudios de degradación de extraíbles. Una mayoría de las cepas aisladas e incluidas en el"screening"correspondían a especies de basidiomicetos tales como : Bjerkandera adusta, Byssomerulius corium, Coniophota puteana, Crepidotus variabilis, Cyathus olla, Dacrymyces capitata, Hypoderma medioburiense, Hypochnicium caucasicum, <BR> <BR> Melanotus hepatochrous, Omphalotus olea7ius, Peniophora cinerea, Peniophora<BR> <BR> inca7nata, Peniophora limitata, Peniophora meridionalis, Peniophora nuda, Phanerochaete avellanea, Polyporus arcularius, Pulcherricium caeruleum, Schizophyllum commune, Stereum hirsutum, Trametes versicolor y Tremella mesente7icae Entre las cepas estudiadas procedentes de plantaciones de eucalipto

existían varios ascomicetos, incluyendo : Mollisia discolor, Mollisia melaleuca, Mollisia sp. y Orbilia coccinela. También se aislaron y estudiaron varios hongos conidiales, tales como : Alternaria sp., Arthrinium phaeospermum, Colletotrichum sp., Epicoccum nigrum, Fusarium oxysporum, Paecilomyces sp. y Periconia igniaria.

A las cepas de las anteriores especies se les añadieron hongos aislados de materiales vegetales diversos procedentes de las colecciones del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC (IJFM) en Madrid y del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) en Baarn (Países Bajos). Estos incluían cepas aisladas de madera de eucalipto pertenecientes a : Bjerkandera adusta, Chaetospernium chaetosporum, Exophiala <BR> <BR> <BR> <BR> jeanselmei, Monocillium tenue, Mycosphaerella parkii, Penicillium megasporum, Pestalotiopsis crassiuscula y Phialophora mustea. Otros hongos habían sido aislados de diferentes plantas leñosas o herbáceas incluyendo : Ceratocystis allantospora, Ceratocystis crassivaginata, Ceratocystis deltoideospora, Ceratocystis tenella, IDichomitus squalens, <BR> <BR> <BR> <BR> Funalia trogii, Ganoderma au. rtrale, Geotrichuna candiduna, Ophiostoma ainoae, Ophiostoma huntii, Ophiostoma megalobrunneum, Ophiostoma microsporum, Ophiostoma olivaceum, Ophiostoma piceae, Ophiostoma piliferum, Ophiostoma rostrocoronatum, Ophiostoma valdiviansm, Phanerochaete chrysosporium, Phellinus <BR> <BR> <BR> <BR> torulosus, Phlebia chrysocrea, Phlebia radiata, Pleurotus ernzgii, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius y Poria (sinónimo : Ceriporiopsis) subvermispora. Finalmente, se incluyeron varias cepas de Fusarium decemcellula7e y Fusarium oxysporum con alta actividad lipasa. Los anteriores hongos se compararon con las cepas del ascomiceto Ophiostoma piliferum comercializadas por Clariant como Cartapip 58 y 97 (tras consulta realizada a Clariant-España en Barcelona). La capacidad de estos hongos para eliminar de la madera los compuestos implicados en la formación de los depósitos de "pitch"durante la fabricación de pastas Kraft de frondosas fue investigada bajo condiciones de fermentación en estado sólido, tal como se describe en el apartado siguiente.

Eliminación microbiana de la fración lipofílica de la madera Previamente se habían investigado por cromatografia de gases y otras técnicas, la composición de los extraíbles de la madera de eucalipto y de los depósitos de"pitch" formados durante la fabricación de pasta Kraft de eucalipto (Eucalyptus camaldulensis

y Eucalyptus globulus) y su blanqueo mediante procedimientos ECF (libres de cloro elemental) y TCF (10-12). De esta forma se encontró que el sitosterol libre y esterificado con varios ácidos grasos era el componente mayoritario de la fracción lipofilica de los extraíbles de estas maderas (Fig. 1A). También se comprobó que estos compuestos eran los responsables de la formación de depósitos en la pasta Kraft blanqueada, y en la maquinaria usada en el proceso TCF (Fig. 1B) y primeras fases del proceso ECF. Posteriormente el dióxido de cloro utilizado en el proceso ECF destruye el sitosterol y otros esteroides insaturados y en los depósitos sólo aparecen esteroides saturados (estigmastanol y varios hidrocarburos). En el curso de estos estudios se observó que el contenido en sitosterol de la madera no aparecía relacionado con el total de compuestos extraíbles con acetona, ya que existía una fracción de extraíbles polares (no implicados en la formación de depósitos) que incluía productos de degradación de la lignina. Una primera conclusión fue que los cambios en el contenido total de extraíbles (utilizando acetona) no constituían un criterio adecuado para evaluar la eficacia de los tratamientos biológicos, y que era necesario realizar un análisis cromatográfico que informase sobre el contenido en sitosterol libre y esterificado.

El"screening"incluyó cepas pertenecientes a 73 especies de hongos (33 basidiomicetos, 21 ascomicetos y 19 hongos conidiales). Se llevó a cabo en condiciones de fermentación en estado sólido (en experimentos duplicados a pequeña escala) utilizando madera de eucalipto reducida a pequeñas astillas, inoculada a partir de cultivos en agar malta e incubada a una temperatura alrededor de 26°C. La fermentación en estado sólido se caracteriza por la saturación del sustrato con agua y la existencia de un contenido mínimo de agua libre (36,45). Estas condiciones, en las que coexisten fases sólida, líquida y gaseosa en el interior del sustrato a tratar, resultan óptimas para la actividad degradativa de los hongos. Además, este tipo de tratamiento requiere un volumen moderado, comparado con el necesario para las fermentaciones en medio líquido, y puede ser adecuadamente aplicado a las pilas de astillas en las fábricas de pasta de papel. Utilizando cromatografía de gases-espectrometría de masas para analizar los compuestos lipofilicos, que constituyen la fracción soluble en cloroformo del extracto total en acetona, se observó que más de la mitad de las cepas ensayadas reducían el contenido de sitosterol y/o ésteres de sitosterol al crecer en las condiciones descritas. Un examen detenido de los cromatogramas permitió identificar varios

patrones de degradación de los compuestos lipofilicos presentes en la madera del eucalipto. Mientras ciertas especies reducían prácticamente por igual el contenido de los diferentes compuestos, otras causaban una degradación preferente de algunos de ellos (p. ej., de los ésteres de esteroles) o incrementaban la abundancia relativa de ciertos compuestos (p. ej., de los ácidos grasos libres o de ciertas cetonas o hidrocarburos esteroidales).

A partir de estos resultados se seleccionaron cepas de doce especies de hongos, ocho basidiomicetos (Bjerkandera adusta, Crepìdotus variabilis, Funalia trogii, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Pleurotus pulmonarius y Poria subvermispora), cuatro ascomicetos (Mollisia sp, Ophiostoma piliferum y Ophiostoma valdivianum) y un hongo conidial (Paecilomyces sp.) capaces de degradar los principales constituyentes de la fracción lipofílica de los extraíbles del eucalipto para realizar un estudio más detallado. Con este fin se llevaron a cabo experimentos por cuadruplicado durante 40 días, al final de los cuales además de la degradación de los diferentes constituyentes de la fracción lipofilica de los extraíbles se analizaron también los cambios en el contenido en lignina Klason (41) que pueden dar lugar a un ahorro de reactivos en el pulpeo de la madera o el blanqueo de la pasta. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que, mientras que todos los hongos reducían (en diferente medida) el contenido en ésteres de esteroles de la madera, el sitosterol libre no era degradado por los ascomicetos (que por el contrario incrementaban el contenido en sitosterol de la madera) pero si por los basidiomicetos (con niveles de degradación superiores al 95% en dos de las especies ensayadas).

Estudios independientes han mostrado que algunos hongos de tipo ascomiceto, y en particular especies de Ophiostoma (7,23), producen esterasas con actividad sobre ésteres de esteroles, lo que explica el descenso de este tipo de compuestos y el incremento en sitosterol libre tras tratar la madera con estos hongos. La capacidad para degradar el sitosterol aparece correlacionada con la capacidad para reducir el contenido en lignina de la madera (una segunda característica reservada para los hongos de tipo basidiomiceto). El potencial de los hongos de tipo ascomiceto (incluyendo algunas de las cepas de Ophiostoma piliferum comercializadas para el control del"pitch") para eliminar de la madera de eucalipto los compuestos lipofilicos implicados en la formación de depósitos resulta muy limitada. Por el contrario, el tratamiento de la

madera de eucalipto con algunos de los basidiomicetos permite eliminaciones casi completas de sitosterol y ésteres de esteroles, al mismo tiempo que rebaja su contenido en lignina.

En los tratamientos anteriores se había utilizado un tiempo fijo de 40 días para el tratamiento de la madera con objeto de apreciar las diferencias entre los distintos hongos. Sin embargo, tiempos más cortos pueden resultar ventajosos para la aplicación industrial. Para investigar esta posibilidad se realizó un seguimiento de la fracción lipofilica de los extraíbles durante el tratamiento de la madera de eucalipto (hasta un total de 7 semanas) con los cuatro hongos seleccionados en el estudio anterior <BR> <BR> <BR> <BR> (Bjerkandera adusta, Phlebia radiata, Pleurotus pulmonarius y Poria subvermispora).

El análisis cromatográfico de las muestras recogidas tras 0, 1,2,4 y 7 semanas de tratamiento de la madera con los cuatro hongos mostró que los distintos constituyentes de la de la fracción lipofilica eran degradados en forma diferente (Fig. 3). Los hongos produjeron un rápido descenso de los esteroles libres y esterificados mientras que la velocidad de degradación de los hidrocarburos esteroidales y el escualeno fue moderada y la cantidad de cetonas esteroidales (probablemente originadas durante la degradación oxidativa de los esteroles libres) y triglicéridos se incrementó en el curso del tratamiento de la madera. Algunas de las diferencias más importantes eran ya apreciables 14 días después de la inoculación con los hongos (Fig. 2). Al final del tratamiento se alcanzaba una degradación de los esteroides totales próxima al 95%. Sin embargo, al considerar la degradación de esteroides conjuntamente con la pérdida de peso de la madera (Fig. 4), se concluyó que los resultados más interesantes correspondían a 1-2 semanas de tratamiento de la madera con Phlebia radiata o Poria subvermispora, ya que permitían obtener una degradación del 70% de los esteroides totales con una pérdida de peso moderada de 2-4%. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Fabricnción de pastas Kraft libres de cloro con bajo contenido en compuestos lipofílicos Con objeto de comprobar el interés y viabilidad industrial del tratamiento biológico de la madera de eucalipto para el control del"pitch", se llevaron a cabo ensayos de cocción Kraft de laboratorio con astillas tratadas con los cuatro hongos seleccionados, seguida de blanqueo TCF y evaluación de las propiedades papeleras de las pastas obtenidas.

Estos ensayos se realizaron utilizando astillas industriales procedentes de la fábrica de pasta Kraft, que fueron tratadas con cepas de Bjerkande7a adusta, Phlebia radiata, Pleurotus pulmoraarius y Poria subve7mispo7a (21 días) en un fermentador rotatorio diseñado para este tipo de tratamientos (en el que se mantenía aireación continuada con aire húmedo, temperatura alrededor de 26°C, y suave agitación intermitente). Las astillas pretratadas fueron cocidas en el laboratorio bajo condiciones representativas del proceso Kraft, blanqueadas utilizando peróxido de hidrógeno en una secuencia TCF, refinadas en un molino PFI, y transformadas en formetas con objeto de evaluar diferentes parámetros ópticos y mecánicos siguiendo las correspondientes normas ISO (32). Al igual que en los casos anteriores, la eficacia de los hongos en la eliminación de sitosterol, ésteres de sitosterol y otros constituyentes de la madera de eucalipto fue estimada mediante extracción con acetona y análisis de la fracción lipofílica por cromatografía de gases-espectrometría de masas. En el caso de la pasta se llevó a cabo una extracción similar, pero para el análisis de las lejías negras procedentes de la cocción Kraft se llevó a cabo una extracción líquido/líquido. De esta forma pudo comprobarse la eliminación de los compuestos problemáticos de las muestras de madera, pasta cruda y lejía negra tras el pretratamiento con los hongos (un ejemplo del análisis cromatográfico, correspondiente a Phlebia radiata, se muestra en la Fig. 5).

Tras cuantificación de los resultados obtenidos en las diferentes muestras (Tabla 1), se puso de manifiesto que el tratamiento con los cuatro hongos ensayados permitía reducir los contenidos en esteroles libres y esterificados en pastas y lejías negras entre un 40% y un 75% del contenido encontrado en los correspondientes controles. Bajo las condiciones ensayadas (con respecto a duración del tratamiento biológico, tipo de madera y características de los procesos de cocción y blanqueo), el tratamiento de la madera con Phlebia radiata apareció como el más adecuado para la eliminación de los compuestos lipofilicos de la pasta y las lejías negras durante la fabricación de pasta TCF mediante pulpeo Kraft de madera de frondosas.

Una vez demostrada la reducción del contenido en compuestos problemáticos en la pasta y las lejías negras, se procedió a la evaluación papelera de las bio-pastas. En general, las pastas obtenidas tras pretratamiento de la madera con los cuatro hongos ensayados presentaron propiedades bastante similares a las de las pastas control (Tablas 2 y 3). Los números kappa de las pastas crudas, obtenidas tras tratamiento de la madera

con los hongos, fueron similares a los de la pasta control y, aunque el pretratamiento puede dar lugar a cierta pérdida de viscosidad de la celulosa (siempre moderada) y a un incremento en el contenido de finos, la blancura inicial es superior. Por otro lado, el tratamiento de la madera con los hongos hace posible un ahorro en la energía a aplicar para obtener el mismo grado de refino, aumenta la densidad y la impermeabilidad al aire del papel y mejora alguna de sus propiedades mecánicas (por ejemplo, el índice de tracción).

En resumen, el pretratamiento de la madera bajo condiciones de fermentación en estado sólido utilizando los cuatro hongos citados anteriormente, u otros basidiomicetos que crezcan en forma similar sobre la madera, permite obtener pasta Kraft de frondosas de tipo TCF con propiedades papeleras similares (o mejoradas para ciertos tipos de aplicaciones) y un bajo contenido en los compuestos lipofilicos responsables de la formación de depósitos de"pitch", así como reducir muy sustancialmente la concentración de estos compuestos en las lejías negras y posteriores aguas de lavado con la ventaja que esto supone con vistas a reducir los vertidos líquidos en las fábricas de pasta a través del progresivo cierre de los circuitos para alcanzar condiciones ZLE.

5. Tablas y descripción detallada de las figuras (páginas siguientes) Tabla 1. Eliminación de los principales compuestos lipofílicos (esteroles libres y esterificados) en madera de eucalipto, pastas y lejías negras (tras cocción Kraft de laboratorio) mediante pretratamiento de astillas industriales con cuatro hongos de tild, basidiomiceto (en la primera columna se indica la cantidad presente en los controles no tratados) Eliminación por los hongos (% respecto al control) <BR> <BR> Control* Bjerkandera Phlebia Pleurotus Poria<BR> <BR> <BR> adusta radiata pulmonarius subvermispora<BR> <BR> <BR> Matera : Esteroles libres 218 56 77 46 68 Esteres de esteroles 206 62 57 32 51 Pasta.

Esteroles libres 324 55 57 48 44 Esteres de esteroles 61 71 61 61 40 Lejía negra.

Esteroles libres 8.7 55 76 69 44 * mg/kg de madera o pasta, y mg/L lejía negra Tabla 2. Propiedades de las pastas no blanqueadas, y longitud de fibra y contenido en finos de las pastas finales (TCF), obtenidas tras cocción Kraft de madera eucalipto (astillas industriales) pretratada con cuatro hongos de tipo basidiomiceto (comparadas con las pastas control) Tratamiento con los hongos <BR> <BR> <BR> Bjerkandera Phlebia Pleurotus Poria<BR> <BR> <BR> aa'usta radiata pulmonarius subvermispora Rendimiento (%) 53.5 53.1 52.7 53.2 51.3 Número Kappa 15.9 15.9 15.8 15.9 15.3 Viscosidad (mL/g) 1464 1350 1355 1381 1287 Blancura (% ISO) 43.5 45.5 43.5 44.6 44.2 Longitud de fibra (mm) 0.63 0.60 0.62 0.61 0.61 Finos (%) 17.7 21.8 19.6 21.1 20.6

Tabla 3. Propiedades papeleras (y de refino) de las pastas blanqueadas (TCF) obtenidas tras cocción Kraft de madera de eucalipto (astillas industriales) pretratada con cuatro hongos de tipo basidiomiceto (comparadas con las pastas control) Tratamiento con los hongos Control B>erkaszdera Phlebia Pleurotus Poria adusta radiata pulmonarius subvermispora Grado de refino (°SR) 33 37 36 36 37 Densidad aparente (g/cm3) 0.75 0.77 0.77 0.76 0.77 Indice de tracción (N. m/g) 95.7 94.0 98. 3 98.7 92.0 Indice de estallido 7.00 7.45 7.14 6.89 7.05 (kPa.m2/g) Indice de rasgado 9.02 7.40 7.70 7.90 8.00 (mN.m2/g) Permeabilidad Gurley (s) 26 44 44 34 39 <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Permeabilidad Bendsten 800 400 480 600 480<BR> <BR> <BR> (mL/min) Coeficiente de dispersión 23.9 24.1 24.0 24.1 23.3 (m²/kg) Opacidad (%) 68.2 68.0 68.1 68.1 67.0 * Todos los datos corresponden a la misma energía de refino (un total de 4 200 revoluciones en un molino PFI) Leyendas de las figuras : Figura 1. Cromatografía de gases-espectrometría de masas de la fracción lipofílica de los extraíbles de la madera de Eucalyptus globulus (A) y de los depósitos de"pitch" detectados durante la fabricación de pasta Kraft de eucalipto totalmente libre de cloro (TCF) (B).

Para detalles ver el texto (Ejemplo 1)

Figura 2. Eliminación de los compuestos lipofílicos tras 14 días de tratamiento de la madera de eucalipto (pequeñas astillas) con los basidiomicetos Bjerkandera adusta, Poria subverraispora, Phlebia radiata y Pleurotus pulmonarius (análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas de los compuestos presentes en las maderas pretratadas comparadas con la madera control).

Para detalles ver el texto (Ejemplo 2) Figura 3. Evolución temporal de los principales grupos de compuestos lipofílicos durante el tratamiento de la madera de eucalipto con los basidiomicetos Poria subvermispora, Bjerkandera adusta, Phlebia radiata y Pleurotus pulmonarius. A : Triglicéridos; B : Esteres de esteroles ; C : Cetonas esteroidales; D : Esteroles libres; E : Hidrocarburos esteroidales; F : Escualeno; y G : Acidos grasos (de arriba a abajo en las diferentes barras).

Para detalles ver el texto (Ejemplo 2) Figura 4. Eliminación de esteroides totales frente a pérdida de peso de la madera de eucalipto en el curso de un tratamiento de 7 semanas con los basidiomicetos Bjerkandera adusta (Q), Poria subvermispora (O), Phlebia radiata () y Pleurotus pulmonarius (0) (lw a 7w : muestras tomadas tras 1 a 7 semanas de tratamiento con los hongos). Las desviaciones standard se mantuvieron en todos los casos inferiores al 10% de las correspondientes medias.

Para detalles ver el texto (Ej emplo 2) Figura 5. Análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas de la fracción lipofílica de los extraíbles de la madera de eucalipto durante cocción Kraft de laboratorio de astillas industriales pretratadas con el basidiomiceto Phlebia radiata (abajo) y astillas control no inoculadas (arriba) : Comparación de los compuestos presentes en la madera (A y D), y en la pasta no blanqueada (B y E) y la lejía negra (C y F) procedentes de la cocción (para el análisis cromatográfico se extrajo la misma cantidad de material para cada uno de los tipos de muestra).

Para detalles ver el texto (Ejemplo 3)

6. Ejemplos de realización de la invención Ejemplo 1 "SCREENING"DE HONGOS PARA EL CONTROL DE LOS DEPOSITOS DE "PITCH"EN LA FABRICACION DE PASTAS KRAFT A PARTIR DE MADERA DE EUCALIPTO Descripción de los métodos utilizados Hongos estudiados. Para llevar a cabo este estudio se aislaron e identificaron diferentes hongos que crecían en plantaciones españolas de Eucalyptus globulus y Eucalyptus camaldulensis. Los hongos se obtuvieron de astillas de maderas de Eucalyptus globulus de la fábrica de ENCE en Pontevedra, y de madera muerta, cortezas y residuos encontrados en plantaciones de Eucalyptus globulus y Eucalyptus camaldulensis en Cáceres y Pontevedra. Muestras de los cuerpos fructíferos y maderas se colocaron en placas de agar malta (2%) o agar extracto de levadura (0.5%)-malta (2%) con estreptomicina (50 mg/L) y clorhidrato de oxitetraciclina (50 mg/L) y se incubaron de 15 a 20 días a 20°C. Otros cultivos fueron obtenidos después de esterilizar la superficie de las maderas por inmersión en etanol 70% (1 min), hipoclorito sódico al 3% (3 min) y etanol al 70% (1 min) y sembrar en las condiciones descritas. Para aislar los basidiomicetos, se añadió a las placas 3 mg/L de benomilo.

Además de los hongos aislados de plantaciones de eucalipto y de madera de eucalipto utilizada para la fabricación de pasta de papel, se utilizaron otros hongos obtenidos de las colecciones de cultivos del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC en Madrid y del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) en Baarn (Países Bajos).

Degradación de los extraíbles de madera de eucalipto. El"screening"para la degradación de los extraíbles de madera de eucalipto se llevó a cabo en pequeña escala (por duplicado) utilizando condiciones de fermentación en estado sólido. Erlenmeyer de 100 mL con 2 g de pequeñas astillas (1-2 x 10-20 mm) de madera de Eucalyptus globulus y 6 mL de agua, esterilizados 20 min a 110°C, se inocularon con dos porciones de micelio obtenidas de placas de agar malta y se incubaron a 26°C durante 40 días. La madera procedía de árboles de Eucalyptus globulus de 14 años de edad. El experimento

se realizó por duplicado con los correspondientes controles sin inocular, incubados en las mismas condiciones.

Después de 40 días, la madera se secó en estufa de aireación a 60°C durante 12 h y se pesó. La fracción extraíble de la madera se obtuvo tras extraer en un Soxhlet con acetona durante 6 h y se secó en las mismas condiciones que la madera. La lignina Klason se determinó tras extracción con agua caliente del serrín libre de extraíbles siguiendo el protocolo descrito en la norma Tappi 222 om-88 (41).

Analysis de la fracción lipofílica de los extraibles de la madera. Los compuestos solubles en cloroformo, se analizaron por cromatografía de gases en un cromatógrafo Hewlett Packard HP 5890 equipado con detector de llama y una columna capilar de sílice de 5 m x 0.25 mm y 0.1 ptm de espesor de película (DB5-HT de J&W Scientific), utilizando helio como gas portador. La temperatura del inyector y del detector fue 300°C y 350°C respectivamente. El horno se programó de 100°C (1 min) a 350°C (3 min) a 15°C/min. Los esteroles libres y esterificados se cuantificaron utilizando una curva de calibración realizada con mezclas de sitosterol y colesteril oleato (los coeficientes de correlación fueron mayores del 99%).

Para la identificación de los compuestos se utilizó cromatografía de gases- espectrometría de masas en un cromatógrafo Varian Star 3400 con detector de trampa de iones (ITD, Varian Saturn 2000) utilizando la misma columna (15 m de longitud) y helio como gas portador. La temperatura del inyector durante la inyección fue de 120°C y después de 0.1 min se programó para alcanzar 380°C (200°C/min) y se mantuvo a esta temperatura 10 min. El horno se programó de 120°C (1 min) a 380°C (5 min) a 10°C/min, y la temperatura del detector y de la línea de transferencia a 200°C y 300°C respectivamente. Los compuestos se identificaron por comparación con patrones y con espectros de masas de las librerías Wiley y Nist.

Descripción de los resultados obtenidos Honzgos estudiados. Con el fin de evaluar posteriormente su capacidad para degradar los extraíbles de la madera de eucalipto, se aislaron e identificaron inicialmente un total de 90 especies de hongos a partir de astillas de Eucalyptus globulus (ENCE) y de plantaciones de Eucalyptus globulus y Eucalyptus camaldulensis. Desde el punto de vista taxonómico y ecológico muchas de las especies identificadas no son específicas

del eucalipto ya que también se han encontrado en coníferas y otras frondosas. Sin embargo, al menos cinco de los taxones identificados se han descrito asociados a eucaliptos como hongos micorrizógenos o saprófitos y probablemente fueron introducidos en España al mismo tiempo que los árboles. Entre estos hongos, Laccaria fraterna es uno de los productores de ectomicorrizas más frecuentes entre las especies de eucalipto de Australia y se ha distribuido por todo el mundo con las plantaciones de eucalipto (42), habiéndose citado en España como Laccaria lateritia (34). La segunda especie productora de ectomicorrizas, Descolea rheophylla, sólo se ha citado en Europa incluyendo España (17). Los otros tres hongos saprófitos asociados a eucalipto son los basidiomicetos Melanotus hepatochrous y Hypoderma eucalypti y el hongo conidial Kirramyces eucalypti. La primera especie está ampliamente distribuida en Australia asociada a eucalipto y algunos helechos arbóreos y Podocarpaceas y también se ha encontrado en España (16). Melanotus hepatochrous es una de las especies que se han encontrado más frecuentemente en las pilas de madera de madera de eucalipto muestreadas. Hypoderma eucalypti es una especie descrita inicialmente en España (14) y que luego se ha encontrado en Australia. Por último, Kirramyces eucalypti es una especie fitopatógena de Eucalyptus globulus y especies relacionadas citada en Italia (38), que es la primera vez que se encuentra en España.

Tratamiento de la madera de eucalipto con los diferentes hongos. De las 73 cepas ensayadas para estudiar la degradación de los extraíbles de las maderas de Eucalyptus globulus, 34 fueron aisladas de madera de eucalipto en España incluyendo basidiomicetos (Bjerkandera adusta, Byssomerulius corium, Coniophora puteana, Crepidotus variabilis, Cyathus olla, Dacryayces capitata, Hyphoderma medioburiense, Hypochnicium caucasicum, Melanotus hepatochrous, Omphalotus olearius, Peniophora cinerea, Peniophora incarnata, Peniophora limitata, Peniophora meridionalis, Peniophora nuda, Phanerochaete avellanea, Polyporus arcularius, Pulcherricium caeruleum, Schizophyllum commune, Stereum hirsutum, Trametes versicolor y Tremella mesenterica) ascomicetos (Mollisia discolor, Mollisia melaleuca, Mollísia sp. y Orbilia coccinela) y hongos conidiales (Alternaria sp., Arthrinium phaeospermum, Colletotrichum sp., Epicoccum nigruni, Fusarium oxysporum, Paeciloniyces sp. y Periconia igniaria). Otras cepas aisladas de madera de eucalipto (Bjerkandera adusta, <BR> <BR> <BR> Chaetospermum chaetosporum, Exophiala jeanselmei, Monocilliuna tenue,

Mycosphaerella parkii, Penicillium megasporum, Pestalotiopsis crassiuscula y Phialophora mustea) y de diferentes plantas leñosas y herbáceas (Ceratocystis <BR> <BR> <BR> <BR> allantospora, Ceratocystis crassivaginata, Ceratocystis deltoideospora, Ceratocystis tenella, Dichomitus squalens, Funalia trogEi, Ganoderma australe, Geotrichum candidum, <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Ophiostoma ainoae, Ophiostoma huntii, Ophiostoma nzegalobrunneum, Ophiostoma microsporum, Ophiostoma olivaceum, Ophiostoma piceae, Ophiostoma piliferum, <BR> <BR> <BR> <BR> Ophiostoma rostrocoronatum, Ophiostoma valdivianum, Phanerochaete chrysosporium, Phellinus torulosus, Phlebia chrysocrea, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius y Poria subvermispora) se obtuvieron de colecciones de cultivo. También se estudiaron cepas con alta actividad lipasa de Fusarium decemcellulare y Fusarium oxysporum, y las cepas de Ophiostoma piliferum comercializadas por Clariant como CartapipTM 58 y 97.

Varios de los hongos ensayados reducen significativamente el contenido total de la fracción extraíble en acetona entre un 50 y un 70%. Las mayores reducciones se obtuvieron con los basidiomicetos Funalia trogii, Melanotus hepatochrous y especies del género Pleurotus, los ascomicetos Mollisia melaleuca y varias especies de Ophiostoma, y el hongo conidial Paecilomyces sp. En este sentido, se ha descrito que el pretratamiento de madera de Pinus sylvestris con algunos basidiomicetos puede dar lugar a la degradación de los extraíbles de este tipo de madera y a la disminución de la toxicidad de los mismos (13). Sin embargo otros, entre los que podemos mencionar los basidiomicetos Coniophora puteana y Phlebia subvermispora y el ascomiceto Nectria coccinea, incrementan esta fracción. Este incremento podría deberse a la síntesis de compuestos lipídicos (44) aunque también podría deberse a productos derivados de la lignina, tal como se comenta más adelante. Hay que mencionar que los basidiomicetos causan mayor degradación de la madera de eucalipto que los ascomicetos por su capacidad para degradar los materiales lignificados. Sin embargo, las diferentes especies ensayadas (con la excepción de Melanotus hepatochrous) produjeron pérdidas de peso moderadas (alrededor de un 5% tras 40 días de tratamiento), un requisito imprescindible para que estos hongos puedan utilizarse en la industria papelera. En el caso de los ascomicetos y hongos conidiales su crecimiento sobre madera se limita a la utilización de compuestos fácilmente degradables, como los de las fracciones hidrosoluble y extraíble, por lo que no suelen producir grandes pérdidas de peso. Entre

estos hongos, se ha descrito que el pretratamiento de madera de pino con Ophiostoma piliferum (18) puede reducir el contenido en extraíbles y controlar el crecimiento de organismos no deseados incrementado la eficacia del proceso de fabricación de pasta química (4,6).

Análisis de la fracción lipofilica tras tratamiento de la madera con los Atongos. Los compuestos lipofílicos de la madera participan en la formación de los depósitos de "pitch"que se detectan durante el proceso de fabricación de pasta de papel (31). Entre los diferentes constituyentes de esta fracción lipofílica el sitosterol libre y esterificado es uno de los principales compuestos en los depósitos durante la fabricación de pasta Kraft de tipo TCF a partir de madera de eucalipto (11). En el presente"screening"se estimaron las variaciones de los extraíbles totales y del contenido en sitosterol y ésteres de esteroles en la madera de eucalipto tras el tratamiento con los hongos en condiciones de fermentación en estado sólido. El análisis cromatográfico mostró que más de la mitad de las cepas reducían el contenido de sitosterol y/o ésteres de sitosterol al crecer en las condiciones descritas. Descensos significativos en el contenido en esteroles libres y esterificados se produjeron incluso tras tratamientos con algunos de los hongos que, como Poria subvermispora, incrementaban el extracto total en acetona. El incremento de esta fracción puede explicarse por la liberación de compuestos de bajo peso molecular procedentes de la degradación de la lignina (estimada por el método Klason) por una parte de los hongos de tipo basidiomiceto. Esta interpretación resultó reforzada por los resultados de la termoquimiolisis de la fracción extraíble, que reveló un incremento de productos relacionados con la lignina tras el tratamiento con este tipo de hongos (26).

El análisis cromatográfico de la fracción lipofílica puse de manifiesto que tanto los ascomicetos como los basidiomicetos degradan los ésteres de esteroles presentes en la madera de eucalipto, aunque la mayor degradación corresponde a los basidiomicetos.

Sin embargo, la degradación de sitosterol libre sólo tiene lugar con los basidiomicetos, mientras los ascomicetos (por ejemplo las cepas de Ophiostoma piliferum y Ophiostoma valdivianum) incrementan el contenido de sitosterol libre. Debido a esta característica, los ascomicetos no pueden utilizarse en el control del"pitch"en las pastas de eucalipto.

El incremento en los esteroles libres producidos por los hongos del género Ophiostoma podría estar relacionado con la actividad esterol esterasa descrita recientemente en

Ophiostoma piceae (24), que sería responsable de la liberación de sitosterol a partir de los sitosterol ésteres. Los resultados anteriores fueron confirmados en experimentos por cuadruplicado utilizando ocho basidiomicetos (Bjerkandera adusta, Crepidotus variabilis, Funalia troges, Phanerochaete chrysosporium, PAlebia radiata, Pleurotus eryngii, Pleurotus pulmonarius y Poria subvermispora), cuatro ascomicetos (Mollisia sp, Ophiostoma piliferum y Ophiostoma valdivianum) y un hongo conidial (Paecilomyces sp.) representativos de los diferentes patrones de degradación de los constituyentes de la fracción lipofílica de los extraíbles del eucalipto. Los resultados obtenidos indican que Poria subvermispora, Phlebia radiata, Funalia trogii y Bjerkandera adusta, Crepidotus variabilis y diferentes especies de Pleurotus podrían utilizarse en el control biológico del"pitch"en Eucalyptus globulus, ya que pueden degradar el sitosterol libre y esterificado. El tratamiento de la madera con estos hongos podría suponer una ventaja adicional ya que degradan la lignina de eucalipto, lo que podría permitir un menor consumo de álcali durante la preparación de pastas Kraft y/o la obtención de pastas con menor contenido en lignina.

Ejemplo 2 EVOLUCION DE LOS COMPUESTOS LIPOFILICOS DURANTE EL TRATAMIENTO DE LA MADERA DE EUCALIPTO CON BASIDIOMICETOS Descripción de los métodos utilizados Para tratar la madera de eucalipto se utilizaron cepas de basidiomicetos seleccionadas en un"screening"anterior que se encuentran conservadas en las colecciones de cultivos del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC (IJFM) en Madrid y del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) en Baarn (Países Bajos) : Bjerkandera adusta IJFM A660 (CBS 230.93), Phlebia radiata IJFM A588 (CBS 184.83), Pleurotus pulmonarius IJFM A578 (CBS 507.85), y Poria subvermispora IJFM A661 (CBS 347.63). El tratamiento de la madera de Eucalyptus globulus bajo condiciones de fermentación en estado sólido, y la extracción y análisis cromatográfico de la fracción lipofílica de los extraíbles se llevaron a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1. Con objeto de seguir la evolución de los diferentes compuestos lipofílicos a lo largo del tratamiento de la madera, se

analizaron tres cultivos completos tras 0, 1,2,4 y 7 semanas de tratamiento con cada uno de los cuatro hongos.

Descripción de los resultados obtenidos Tal como se muestra en la Fig. 2 (arriba), los principales picos encontrados tras análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas de la fracción lipofílica de los extraíbles de la madera de Eucalyptus globulus no-inoculada (control) corresponden a : esteroles esterificados (39% de los compuestos cromatografiables) y libres (29%), hidrocarburos esteroidales (12%), ácidos grasos (12%), cetonas esteroidales (3%), escualeno (3%) y triglicéridos (1%) (las abundancias relativas fueron calculadas utilizando factores de respuesta para los principales tipos de compuestos). La abundancia de estos compuestos no cambió significativamente en el curso de las 7 semanas de incubación a las que fue sometida la madera control esterilizada. El sitosterol fue el principal esterol encontrado en forma libre o esterificada, y los ácidos palmítico, linoleico y oleico fueron los principales ácidos grasos más abundantes en la madera analizada. El análisis cromatográfico de la fracción lipofílica de las maderas tratadas reveló que los cuatro hongos ensayados eran capaces de degradar los compuestos anteriores, aunque en grados diferentes. Los perfiles cromatográficos de la Fig. 2 correspondientes al análisis de compuestos lipofílicos en las maderas tras 14 días de tratamiento con los hongos muestran los siguientes cambios con respecto a la madera control : i) descenso de los picos de ésteres de esteroles e hidrocarburos esteroidales por los cuatro hongos ensayados; ii) un descenso moderado del pico del sitosterol por Pleurotus pulmonarius pero fuerte degradación de este compuesto por los demás hongos : iii) una degradación más parcial de otros compuestos como cetonas esteroidales y escualeno; y iv) un incremento en la presencia de triglicéridos por algunos de los hongos, a pesar de que estos compuestos sólo eran un pico minoritario en la fracción lipofílica de los extraíbles de la madera control.

En la Fig. 3 se muestra la composición cuantitativa de la fracción lipofílica de los extraíbles en las muestras recogidas tras 0, 1, 2,4 y 7 semanas de tratamiento de la madera con los cuatro hongos ensayados. La evolución temporal de los compuestos lipofílicos reveló que : i) el descenso más importante se produjo durante la primera semana de tratamiento; ii) este descenso inicial fue debido a un rápido descenso de los

ésteres de esteroles y, en menor medida, de los esteroles libres (excepto en el caso de Pleurotus pulmonarius que degradó lentamente los esteroles) ; iii) a continuación la degradación continuó con eficiencias diferentes por parte de los distintos hongos, siendo la más llamativa la producida por Phlebia radiata ; iv) el contenido en cetonas esteroidales se incrementó inicialmente (pero el tratamiento con los hongos lo devolvió a sus niveles iniciales) en contraste con el de hidrocarburos esteroidales y escualeno que descendieron progresivamente durante el tratamiento con los hongos (aunque con ritmos inferiores a los observados para la degradación de esteroles libres y esterificados) ; y v) los hongos, con la única excepción de Pleurotus pulmonarius incrementaron el contenido de ácidos grasos libres y triglicéridos durante el tratamiento de la madera.

El fuerte descenso del contenido en ésteres de esteroles tras el tratamiento con los diferentes hongos (hasta 84-98% del contenido inicial) podría incluir su hidrólisis enzimática por esterol esterasas. Estas enzimas han sido citadas en varios hongos investigados para el control del"pitch" (5,7,24,33). En el presente estudio, tanto los esteroles libres preexistentes como aquéllos liberados por hidrólisis enzimática de ésteres fueron eficazmente degradados (63-98%). La abundancia de algunas cetonas esteroidales se incrementó en las fases intermedias del tratamiento de la madera, siendo finalmente reducida en 36-50% del contenido inicial por Phlebia radiata y Poria subvermispora. Estas cetonas podrían ser metabolitos intermediarios de la bio- transformación de los esteroides, incluyendo la acción de esterol oxidasas. Se han publicado varios estudios sobre la biodegradación del sitosterol y otros esteroles por bacterias y hongos (15,39). Sin embargo, la participación de los basidiomicetos no había sido considerada previamente. El incremento del contenido en triglicéridos (hasta 290% del contenido inicial en la madera tratada con Phlebia radiata) puede ser explicado por la capacidad de los hongos para sintetizar estos compuestos lipídicos (44).

La pérdida de peso durante el tratamiento biológico constituye el principal inconveniente para el uso de los hongos para la eliminación de los compuestos lipofílicos de la madera de eucalipto, a causa del descenso potencial del rendimiento de la pasta. Pérdidas de peso de 12-14% se encontraron al final de las siete semanas de tratamiento de la madera de eucalipto con los hongos ensayados, a excepción de Pleurotus pulmonarius que sólo alcanzó un 4% de pérdida de peso. Por consiguiente, la

duración óptima del tratamiento biológico debe ser fijada como un compromiso entre una degradación eficiente de los compuestos lipofílicos problemáticos y una pérdida de peso moderada, tal como se muestra en la Fig. 4. Esta muestra la eliminación de esteroides totales frente a la correspondiente pérdida de peso causada por los cuatro hongos a lo largo del tratamiento. Los resultados indican que prolongar el tratamiento con los hongos para alcanzar la máxima degradación de esteroides (hasta 90% utiliando Phlebia radiata y Poria subvermispora) no resulta ventajoso a causa de la excesiva pérdida de peso producida. Sin embargo, con los cuatro hongos ensayados es posible obtener una eliminación de 50-70% de los esteroides de la madera de eucalipto (círculo en la Fig. 4) con pérdidas de peso moderadas de 1-4%. Finalmente, la duración del tratamiento fue tenida en cuenta para evaluar la viabilidad industrial de la eliminación biológica de los extraíbles de eucalipto ya que, por razones prácticas, debe ser tan corta como sea posible. Se concluyó que, bajo las presentes condiciones, una semana de tratamiento con Phlebia radiata (4% de pérdida de peso) o dos semanas de tratamiento con Poria subvermispora (2.5% de pérdida de peso) constituyen los pretratamientos biológicos más ventajosos para eliminar los extraíbles más problemáticos de la madera de eucalipto (hasta un 70% del contenido inicial). Conviene recalcar que la eliminación de los compuestos lipofílicos de la madera de eucalipto por los hongos es muy superior a la obtenida durante el"seasoning"de la madera (28), utilizado a menudo para el control de los problemas de"pitch".

Ejemplo 3 FABRICACION DE PASTA KRAFT LIBRE DE CLORO CON BAJO CONTENIDO EN COMPUESTOS LIPOFILICOS A PARTIR DE ASTILLAS DE EUCALIPTO TRATADAS CON Bjerkandera adusta, Phlebia radiata, Pleurotus pulmonarius Y Poria subvermispora Descripción de los métodos utilizados Pretratamiento de las astillas de eucalipto. Las astillas de Eucalyptus globulus de dimensiones industriales (2-4 x 20-40 mm) utilizadas, que procedían de árboles de 14 años de edad, se obtuvieron de la fábrica de pasta de papel de ENCE en Pontevedra (España). Las cuatro cepas de hongos utilizadas, seleccionadas tras un"screening"

previo, fueron las mismas del Ejemplo 2. Los hongos fueron cultivados en frascos de 1 L con 200 mL de medio glucosa-amonio-extracto de levadura (25) durante 5 días, y los "pellets"producidos fueron lavados y utilizados para inocular las astillas de eucalipto.

Éstas se incubaron bajo condiciones de fermentación en estado sólido (capacidad de retención de agua) en un fermentador rotatorio con seis botellas de 2 L cada una conteniendo 350 g de astillas, esterilizadas a 120°C durante 20 min (43). Las botellas fueron insufladas con aire húmedo (165 mL/min), rotadas 1 h/día a 1 rpm, y mantenidas a 26°C. Tras 21 días, las astillas tratadas fueron secadas en un horno aireadas a 60°C, reducidas a serrín usando un molino de cuchillas, extraídas con acetona y los compuestos lipofílicos analizados por cromatografía de gases-espectrometría de masas tal como se describe más abajo. El contenido en lignina Klason fue estimado tal como se describe en el Ejemplo 1.

Cocción, blanqueo y evaluación de las popiedades de la pasta. La cocción Kraft fue llevada a cabo en un digestor de laboratorio Lorentzen & Wettre a 165°C (50 min), con una relación lejía/madera de 3.5, y una sulfidez del 25% (5-7 réplicas). El digestor consistía en seis autoclaves de 2.5 L (cargadas con 200 g de madera) que rotaban a 2.8 rpm en un baño de polietilenglicol (90 min para alcanzar los 165°C). Utilizando un 15% de álcali activo se obtuvo el mismo índice kappa para el control y la madera tratada con Pleurotus pulnr2oyzarius y Bjerkandera adusta, y un pequeño incremento en el álcali total fue necesario con la madera tratada con Poria subvermispora y Phlebia radiata. Tras la cocción, las pastas crudas fueron desintegradas, lavadas y filtradas. Se midió el rendimiento (%), el álcali residual (g/L), el número kappa (ISO 302), la viscosidad (mL/g) (ISO 5351/1), y la blancura (%) (ISO 2470) (32). Muestras de las pastas crudas fueron secadas en un horno aireado a 60°C y extraídas para el análisis cromatográfico de los compuestos lipofílicos.

La secuencia de blanqueo TCF utilizada fue OQPoP, donde O es una fase de preblanqueo con oxígeno, Q representa la fase de quelato y Po y P son dos fases de blanqueo con peróxido de hidrógeno (la primera bajo oxígeno presurizado). Los experimentos de blanqueo fueron llevados a cabo en reactores de acero inoxidable equipados con un agitador interno, un sistema de inyección de oxígeno, y controles automáticos de presión y temperatura. En las diferentes fases de blanqueos se estimaron el número kappa, la viscosidad y la blancura. Además, en la pasta final blanqueada se

midió la longitud media de la fibra (mm) y el contenido en finos de menos de 0.45 mm (%) (Kajaani FS-200).

A fin de evaluar sus propiedades papeleras, utilizando métodos ISO (32), las pastas blanqueadas fueron refinadas usando un molino PFI (ISO 5264/2) aplicando diferentes energías (expresadas como revoluciones totales). A continuación se estimó el grado de refino Schopper-Riegler (°SR) (ISO 5702) y se prepararon formetas con un gramaje de 65 g/m2 (ISO 536). En las formetas se midió la densidad aparente (g/cm3) (ISO 5270), los índices de tracción (N. m/g) (ISO 1924), estallido (kPa. m2/g) (ISO 2758) y rasgado (mN. m2/g) (ISO 1974), el coeficiente de dispersión (m2/kg) (ISO 9416), la opacidad (%) (ISO 2469), y la permeabilidad al aire mediante los índices Gurley (s) (ISO 5636/5) y Bendtsen (mL/min) (ISO 5636/3).

Análisis de los compuestos lipofílicos. Para el análisis químico de los extraíbles, el serrín de madera y la pasta seca fueron extraídos en Soxhlet con acetona durante 6 h (41). En el caso de las lejías negras procedentes de la cocción, se llevó a cabo una extracción líquido/líquido (x 3) con acetona-hexano (2 : 1) a pH 12 (35). Estas últimas condiciones de extracción habían sido optimizadas para la recuperación de esteroles, al tratarse de los compuestos más problemáticos durante el pulpeo Kraft de la madera de eucalipto. Los extractos fueron evaporados a sequedad y redisueltos en cloroformo para el análisis cromatográfico de las fracción lipofílica.

Los compuestos solubles en cloroformo se analizaron por cromatografía de gases- espectrometría de masas usando un cromatógrafo Varian Star 3400 con detector de trampa de iones (ITD, Varian Saturn 2000), una columna capilar de 15 m x 0.25 mm y 0.1 jum de espesor de película (DB-5HT de J &W Scientific) y helio como gas portador.

La temperatura del inyector durante la inyección fue de 120°C y después de 0.1 min se programó para alcanzar 380°C (200°C/min) y se mantuvo a esta temperatura 10 min. El horno se programó de 120°C (1 min) a 380°C (5 min) a 10°C/min, siendo la temperatura del detector y de la línea de transferencia de 200°C y 300°C respectivamente. Los compuestos se identificaron por comparación con compuestos patrón y con los espectros de masas de las librerías Wiley y Nist. Los picos se cuantificaron por sus áreas, y se utilizó una mezcla de compuestos patrón (ácido palmítico, sitosterol, colesteril oleato y triheptadecanoína) para elaborar curvas de calibración para la cuantificación de los constituyentes de la fracción lipofílica de los extraíbles en

concentraciones entre 0.1 y 1 mg/mL (todos los coeficientes de regresión fueron superiores a 0.99).

Descripción de los resultados obtenidos Las astillas de Eucalyptus globulus tras 3 semanas de tratamiento con los hongos Bjerkandera adusta, Phlebia radiata, Pleurotus pulmonarius y Poria subvermispora, fueron utilizadas como materia prima para fabricar pasta mediante cocción Kraft de laboratorio, seguida de blanqueo TCF y evaluación papelera. Con la única excepción de Bjerkandera adusta (que degradó hasta un 12% de la madera), las perdidas de peso causadas por los hongos fueron moderadas (hasta 6-7%) si se tiene en cuenta la duración del tratamiento. Además de la eliminación de los compuestos lipofílicos, el tratamiento de la madera con estos hongos también disminuyó el contenido en lignina Klason, hasta un 24% en el caso de Phlebia radiata, seguido de Bjerkandera adusta (9%), Poria subvermispora (7%) y Pleurotus pulmonarius (3%).

Muestras de las pastas y lejías negras procedentes de las cocciones Kraft de laboratorio, así como la madera pretratada, fueron extraídas y la composición de la fracción lipofílica del extraíble analizada por cromatografía de gases-espectrometría de masas. Tal como se muestra en la Fig. 5A, los esteroles esterificados (hasta 39% del total de compuestos cromatografiables) y libres (29%), hidrocarburos esteroidales (12%), ácidos grasos libres (12%) y cetonas esteroidales (3%) fueron los principales compuestos identificados en las muestras de madera. Tras la cocción Kraft se observaron cambios en los perfiles cromatográficos de los compuestos lipofílicos incluyendo menores niveles de hidrocarburos esteroidales y ésteres de esteroles en la pasta, tal cómo se muestra en la Fig. 5B. Cómo se muestra en la Fig. 5C, la lejía negra se caracterizó por la ausencia de ésteres de esteroles y la presencia de un lignano, probablemente formado por despolimerización de la lignina durante la cocción.

Los anteriores perfiles cromatográficos fueron drásticamente modificados como consecuencia del pretratamiento de la madera con los hongos antes de la cocción. Esto se ilustra en la Fig. 5D-F que muestra los principales compuestos lipofílicos presentes en la madera tratada con Phlebia radiata y en la pasta y lejía negra obtenidas tras su cocción Kraft. Como resultado del pretratamiento con los hongos, los picos correspondientes al sitosterol y a ésteres de esteroles (los últimos incluyendo sitosterol y

pequeñas cantidades de estigmastanol y citrostadienol esterificados principalmente con ácidos linoleico y oleico) disminuyeron en todas las muestras. Ya que los esteroles libres y esterificados eran los principales compuestos lipofílicos en los depósitos de "pitch"analizados, se cuantificaron en las diferentes muestras analizadas. La Tabla 1 muestra el contenido en esteroles y ésteres de esteroles en la madera control y en la pasta y lejía negra obtenidas, y el efecto del pretratamiento con los hongos sobre la abundancia de estos compuestos en las diferentes muestras. Teniendo en cuenta la relación madera/lejía en la cocción y el rendimiento final en pasta (ver Tabla 2) es posible deducir que una parte de los ésteres de esteroles de la madera se saponifican durante la cocción (no detectándose en las lejías negras) y que también se produce cierto descenso en los esteroles libres. Aunque se observaron algunas diferencias entre los cuatro hongos investigados, todos ellos dieron lugar a descensos significativos en los contenidos de ésteres de esteroles y/o esteroles libres en las muestras de madera (32- 77%), pasta (40-71%) y lejía negra (44-76%). Ya que el sitosterol es el principal compuesto lipofílico en las pastas analizadas, el pretratamiento de la madera con Phlebia radiata y Bjerkandera adusta aparece como el más ventajoso desde el punto de vista de la eliminación de los compuestos responsables de la formación de depósitos de "pitch". La eficacia de los basidiomicetos eliminando ésteres de esteroles de la madera de frondosas es muy superior a la descrita para los inóculos comerciales de Ophiostoma piliferum (CartapipTM), que, por otra parte, no son capaces de degradar los esteroles libre (29,37). La capacidad de cultivos líquidos del basidiomiceto Phanerochaete chrysosporium de degradar ésteres de esteroles extraídos de madera de chopo y responsables de problemas de"pitch" (9), había sido ya descrita (33).

A continuación se llevó a cabo un análisis de las propiedades de cocción, refinado y papeleras de las maderas pretratadas a fin de evaluar el potencial de las cepas de hongos para el control de los problemas de"pitch"durante la fabricación de pastas TCF de madera de eucalipto. Varias características de las pastas obtenidas aparecen resumidas en la Tabla 2, comparadas con la pasta control preparada a partir de madera no tratada.

El rendimiento en pasta tras tratamiento de la madera con Bjerkandera adusta, Pleurotus pulmonarius, y Phlebia radiata (alrededor de un 53%) fue semejante al obtenido con las astillas no tratadas, mientras que, un rendimiento algo inferior fue obtenido tras el pretratamiento de la madera con Poria subvermispora. Cierta reducción

de la viscosidad (5-12%) de la pasta no blanqueada fue observada tras todos los pretratamientos con los hongos pero, como se menciona más abajo, las diferencias de viscosidad se redujeron en la pasta final. Como resultado del pretratamiento de la madera con Bjerkandera adusta, Pleurotus pulnionarius y Poria subvermispora, se produjo un incremento de la blancura de la pasta cruda (2% ISO).

Tras el blanqueo TCF se obtuvieron blancuras finales (89-91% ISO) semejantes en las pastas obtenidas a partir de madera pretratada y control, y las diferencias en viscosidad se redujeron al alcanzar grados de blancura superiores. Los mejores resultados se obtuvieron con Phlebia radiata que dio lugar a pastas con blancura final y viscosidad muy semejantes a las del control. Como consecuencia del pretratamiento con los hongos se observó cierto descenso en el tamaño medio de las fibras y un incremento de la fracción fina (hasta 3-4%) (Tabla 2). Las pastas blanqueadas fueron refinadas aplicando diferentes energías que dieron lugar a grados de refino diferentes en cada caso. A efectos comparativos, la Tabla 3 muestra los valores de resistencia, porosidad y propiedades ópticas tras aplicar una energía de refino intermedia (4200 rpm) que produjo pastas con grados de refino (33-37°SR) semejantes a los utilizado para la fabricación de papel. En general, las pastas obtenidas con las maderas pretratadas con los hongos fueron más fáciles de refinar (es decir, se obtuvieron grados de refino mayores aplicando la misma energía) y los mejores resultados se obtuvieron con Poria subvermispora. El tratamiento de la madera con los hongos también dio lugar a un incremento de la densidad aparente del papel para todos los grados de refino ensayados.

Las propiedades mecánicas de las pastas sólo difirieron ligeramente de las del control pero el tratamiento de la madera con Phlebia radiata y Pleurotus pulmonarius mejoró el índice de tracción para todas las energías de refino ensayadas. Bjerkandera adusta, Phlebia radiata y Poria subvermispora incrementaron ligeramente la resistencia la estallido aunque la resistencia al rasgado disminuyó un poco en todos los casos. Las propiedades ópticas no se modificaron así como tampoco el coeficiente de dispersión y la opacidad. La diferencia más notable se apreció en la porosidad del papel medida por dos test de permeabilidad al aire. De esta forma se observó que la porosidad del las pastas descendía al aumentar la energía de refino, especialmente en las pastas obtenidas tras el tratamiento de la madera con Poria subvermispoi-a.

Es posible concluir que el pretratamiento con los hongos reduce fuertemente la cantidad de compuestos lipofílicos problemáticos (sitosterol libre y ésteres de esteroles) durante la fabricación de pasta de eucalipto mediante cocción Kraft y blanqueo TCF, manteniendo la mayor parte de las propiedades de la pasta. Bajo las presentes condiciones los mejores resultados se obtuvieron con Phlebia radiata. Además algunos de los cambios en las propiedades de la madera pretratada, como la reducción en la energía de refino y la mejora de algunas propiedades mecánicas, resultan positivos para la fabricación de pasta y papel. El rendimiento total de las pastas obtenidas (considerando la pérdida de peso durante el pretratamiento biológico y el rendimiento de la cocción Kraft) varía entre 53% para la madera control y 47-50% par la madera tratada con hongos aunque podría ser optimizado ajustando la duración del pretratamiento biológico. Respecto a las otras propiedades de la pasta, algunos de los cambios más significativos (p. e. el mayor contenido en finos de la pasta no refinada, la mayor densidad aparente del papel y el fuerte descenso de la porosidad) parecen relacionados con una modificación en la distribución de tamaños de las fibras durante el tratamiento con los hongos. La selección final del tratamiento biológico más prometedor para el control industrial de los depósitos de"pitch"en diferentes pastas de frondosas deberá ser un compromiso entre el óptimo en términos de eliminación de compuestos lipofílicos problemáticos, un mínimo descenso del rendimiento de la pasta, y la conservación o mejora de aquellas propiedades de interés para los diferentes tipos de papel a producir.