[0001] 本发明属于生物制药和绿色化学领域， 具体涉及一种 6-氰基- i3R,5R)-二羟基己酸叔 丁酯的生物刺备方法。

背景技术

[0002] 降胆固醇的他汀类药物是目前世界最畅销的药 物大类。 2010 年世界最畅销药物一一 辉瑞公司的立普妥 (商品名称 Lipito 年销售额 119 亿美元)有效活性成分为阿托伐他汀 {atorvastatm)(Nature 2012, 485:185-194), 而 6-氰基- （3R,5R) -二羟基己酸叔丁酯则是 ]¾于合 成此类降胆固醇他汀类药物的关键手性中间体 。 目前可以通过化学法或酶法制备 6-氰基

(3R,5R) -二羟基己酸叔丁酯 (Aiigew, Chem. int. Ed. 2005, 44:362 365 )。

[0003] 美国专利 US 2009/0216029 AI中公开了一种化学法工艺生产 6-氰基- （3R，5R) -二羟 基己酸叔丁酯， 具体是利用硼烷类化合物在 -70摄氏度以下的条件下将 6-氣基- ( 5R) 羟基- 3-氧代己酸叔丁酯还原。 该工艺需要极端反应条件， 易燃， 能耗严重并且产品的立体异构纯 度只能达到 98%。

【0004] 美国的科德克希思公司开发的合成路线则是利 用源于酿酒酵母 （ Saccharomyces cerevisiae) 的基因工程改造的酮还原酶 (ketone reductase, KRED)催化丛 6氰基- （5R) -羟基 3-氧代己酸叔丁酯到 6-氰基- （3:R、5R ) -二羟基己酸叔丁酯的还原反应， 同时利用一种葡萄 糖脱氢酶完成辅酶 （NADPH) 的再生反应。 通过该工艺路线可以获得立体异构纯的 6-氰基- (3R,5R) -二羟基己酸叔丁酯 (de值大于 99%) (W0 2008/042876 A2), 但是该工艺需要两 种酶联合作用才能完成辅酶循环， 从而造成生产成本升高。 同时反应中产生的葡萄糖酸会改 变反应体系的 pH值， 需要通过补加碱溶液加以调控， 增加了反应条件控制的难度， 另溶解 在反应体系中的副产物蔔萄糖酸也大大增加了 后处理工艺的难度。

[0005] 本专利公开了一种利用重组酮还原酶 (ketone reductase, KJIED)催化 6-氰基- （5R) - 羟基- 3-氧代己酸叔丁酯到 6-氰基- （3R，5R ) -二羟基己酸叔丁酯的还原反应。 只需要一种酶 即可同时完成底物还原和辅酶再生循环， 大大降低了生产成本。 且反应条件温和， 常温、 常 压、 水相条件下即可进行， 无需使 ]¾危险试剂。 反应中产生的副产物丙酮易挥发， 很容易.从 反应体系中除去， 大大简化了后处理工作。

发明内容

[0006] 本发明的目的在干提供一种改进的 6-氰基 -(311，5 -二羟基己酸叔丁酯的生物制备方 、 t

[0007] 为解决以上技术问题， 本发明采用如下技术方案： 一种 6-氰基- (3R，5R)-二羟基己酸 叔丁酯的生物制备方法， 其以 6-氰基- (5R)-羟基- 3-氧代己酸叔丁酯为底物， 该底物在生物催 化剂、 辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成 6-氰基- (3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯， 生物 催化剂为重组酮还原酶， 重组酮还原酶的制备方法为： 将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌 单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体 LB培养基中， 于 35〜4ί)Ό下摇床活化 8〜12小时， 将 活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性 的液体 LB培养基中， 于 35〜40Ό下摇床扩大 培养， 培养至 OD _{6i S} 值达到 0.6〜0.8 加入诱导剂， 于 25〜33 'Ό下继续培养 8〜12小时， 离 心， 收集沉淀物， 加入磷酸缓冲液得悬浮液， 将悬浮液置于冰水浴中超声破碎 8〜12 分钟， 再离心， 将上清液预冻至温度降至- 10〜- 25 °C , 然后再冻干 24〜48 小时， 即得冻干粉状的重 组酮还原酶， 重组酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮， 辅因子为 NAD/NADH 或 NADP/NADPH, 氢供体为异丙醇， 还原反应在 pH为 6,5〜7.5的水相缓冲液中进行。

[0008] 在一种具体的实施例中， 在反应起始时的反应体系中， 重组酮还原酶与 6-氰基- (5R)- 羟基- 3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为 】〜5%， 辅因子与 6-氰基- (5R)-羟基- 3-氧代己酸叔丁 酯的质量百分比为 0. 〜 0.5%, 异丙醇相对 6-氰基 5R>羟基 -3-氧代己酸叔丁酯的物质的量百 分比为 100〜- 150%。。

【0009】 诱导剂为异丙基- β -D-硫代半乳糖苷。

[0010] 优选地， 辅因子为 NA:DP/NADPH。

【00111 优选地， 水相缓冲液为磯酸盐缓 液。

[0012] 优选地， 还原反应在 ρΗ为 7.5的水相缓冲液中进行。

[0013] 具体地， 6-氰基- (3R，5R 二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法的实施过程 如下： 在反应 容器中依次加入底物 6-氰基- (5R)-羟基- 3-氧代己酸叔丁酯， 异丙醇， 水相缓 液， 搅拌均 匀， 继续加入重组酮还原酶和辅因子， 在 25〜35Γ Τ, 搅摔反应， 利用 LC- MS 检测反应迸 程， 待转化率达 90〜99%时， 加入乙酸乙酯进行多次萃取， 合并有机相并蒸发脱去溶剂， 即 得 6-氰基- (3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯产品。

[0014] 根据本发明， 除重组園还原酶外， 其余原料均可商购获得。

[0015] 本发明的有益效果在于：

本发明方法只需要一种重组酮还原酶即可同 时完成底物还原和辅酶再生循环， 大大降低了生 产成本， 且反应条件温和， 常温、 常压、 水相条件下即可进行， 无需使用危险试剂。 反应中 产生的副产物丙酮易挥发， 很容易从反应体系中除去， 大大简化了后处理工作。 [0016] 附图说明；

附图 1为转化率随反应时间变化图。

[0017] 具体实施方式；

本发明的反应式如下；

下面的实施例可以使本专业的技术人员更全 面地理解本发明， 但不以任何方式限制本发明。

[0018] 实施例一 ： 重组酮还原酶 （KRED) 酶粉摇瓶生产工艺

甘油管或转化平板阜菌落接种到 4ml 含氨苄青霉素抗性的液体 LB 培养基活化过夜 G7 V , 200rpm：)。 从过夜培养物以 1/100接种量转接〗00ml含氨苄青霉素抗性的液体 LB培养 基， 37Ό 200rpm振荡培养至 OD _6iW 值达到 0,6- 0,8, 加入 IPTG于 30Γ继续培养过夜。 离 心收集细胞， 用 10ml 磷酸缓冲液 （2mM pH7.0) 悬浮细胞。 细胞悬浮液置于冰浴中超声 波破碎 10分钟。 离心， 上清液预冻过夜。 冻千 24h-48h

ί001 ] 实施例二； 辅因子再生体系验证

取重组酮还原酶 （KRED) 酶粉 i mg， 加入 1 mL磷酸盐缓冲溶液 (pH 7.0, 50 mM), 异丙 醇 0.01 mL NAD 15 mg, 于 5 m:L离心管中, 30Ό水浴恒温磁力搅拌 1 min, 加入 1 mL乙 酸丁酯萃取， 气相色谱分析。 检测结果表明有丙酮生成， 异丙醇被转化， 根据峰面积计算转 化率为 10 5%

[0020] 实施例 Ξ: 反应监测方法

采用 LC- MS检测方法测定 6-氰基- (5R 羟基- 3-氧代己酸叔丁酯到 6-氰基- (3R,5R)-二羟基己 酸叔丁酯的转化。 样品处理： 取不同 间点反应液 50 M L, 加入甲醇 950 i L, 混匀后 0,45 u rn 微孔滤膜过滤， 然后进样检测 进样量 i L)。 色谱条件为： 色谱柱 SB-C18 2.1 X 50 3.5 μ m, 流动相 A水 ( 10 mM HCOON - 0.1% HCOOH) -B 乙腈， 流速 0.3 mL/min, 0-5 min 22%B。 质谱条件 千燥气流速 12 L/min, 鞘气压力 40 PSI, 干燥气温 度 35CTC , 毛细管电压 3500 V, 检测模式为正离子模式。 检测离子 172,1, 174.2, 228,1, 230.1, 245.3, 247.2,250.1,252.1, 239.1 , 6-氰基- (5R)-羟基- 3-氧代己酸叔丁酯保留时间 2.7min, 6-氰 基- (3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯保留 ^间 〗,8 rmn [0021] 实施例四； 转化含量测定

通过配备 ELSD 检测器的 HPLC 测定 6氰基- ( 5R) -羟基 氧代己酸叔丁酯和 6-氰基- (3R,5R) -二羟基己酸叔丁酯的含量。 对照品溶液制备： 称取 6-氰基- （5R) -羟基 -3-氧代己 酸叔丁酯对照品 125mg, 并称取 6-氰基- （3R,5R) -二羟基己酸叔丁酯对照品至 50 rinL容量 瓶, 用用甲醇溶解定容。 别从母液中取 3 mL， 4 mL, 5 mL， 6 mL, 7 mL加入 10 niL容量瓶， 定容至刻度， 过滤至液相小瓶， 进样 8 μ:【， 样品溶液制备： 称取 6-氰基- （5R) -羟基 -3-氧 代己酸叔丁酯与 6-氰基- （3R,5:R_) -二羟基己酸叔丁酯样品各 100 mg, 至 50 m:L容量瓶， W 甲醇溶解定容。 过滤至液相小瓶， 进样 8 μί。 按照夕卜标法计算含量。 色谱条件： 色谱柱 eclipse XDB-C18, 4.6 X 150 mm, 5 μ m; 流动相 A水 (0.1%HCOOH)， B 乙腈; 0-10min 25% B; ELSD条件： 温度 50 TJ , 气体流速 l,5 L/min, 增益值 】。

【0022] 实施例五： 克级制备工艺

向 50 mL三口瓶中添加 1000 mg 6-氰基- （5R) -羟基 -3-氧代己酸叔丁酯和 2000 μL异丙醇， 再向反应瓶中加入 8.5 mL事先己配好的 pH为 7.5 , 0.1 M PBS缓冲液。 反应体系置于 35 V , 600 rpni磁力搅拌水浴锅中搅摔。 待温度稳定后， 向反应瓶中加入 50 mg酮还原酶和 5 mg ADP粗粉， 幵始计时反应。 反应温度保持在 30 Ό。 反应到 4小^， 取反应液 50 μΐ 加入 1 mL无水甲醇终止反应。 混合均匀经 0,45 μηι有机滤膜过滤供 LC- MS分析。 继续反应 到 24小时， 加入无水甲醇终止反应。 底物转化率大于 99%, 产物光学纯度大于 99%。 反应 进程曲线见图 i。

[0023] 实施例六； 百克级制备工艺

向反应器中添加 100 g 6-氰基- (5R) -羟基 -3-氧代己酸叔丁酯和 200 niL异丙醇, 再向反应 瓶中加入 850 niL事先已配好的 pH为 7 5, 0,1 M PBS缓冲液。 反应体系置于 35 V , 机械 搅拌水浴锅中搅拌。 待温度稳定后， 向反应瓶中加入 5 g酮还原酶和 0.5 g NADP粗粉， 开 始计时反应。 反应温度保持在 30 t。 反应 24 小^后， 底物转化率大于 98%, 产物光学纯 度大于 99%。 反应结束后， 加入等体积乙酸乙酯萃取两次， 合并有机相并蒸发脱去溶剂， 得 到产物 96克左右。

[0024] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点 ， 其目的在于让熟悉此项技术的人士 能够了解本发明的内容并据以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。 凡根据本发明精神 实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。