P2219 Patent- und Rechtsanwälte Bock Bieber Donath, Hans-Knöll-Str. 1 , 07745 Jena

Verfahren zur Spaltung von Cervimycin-Halbestern

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Spaltung von Cervimycin-Halbestern und dient im weitesten Sinne der Gesunderhaltung der Bevölkerung durch eine verbesserte Bekämpfung von Infektionskrankheiten durch die effektivere Herstellung eines Antibiotikums.

Die Häufigkeit und das Spektrum antimikrobieller Resistenzen haben in den letzten Jahren in Deutschland, aber vor allem in den europäischen

Nachbarländern und weltweit deutlich zugenommen. Bisher erfolgreich eingesetzte Antibiotika verlieren ihre Wirksamkeit gegenüber pathogenen mikrobiellen Keimen immer mehr. Deshalb werden intensiv neue Antibiotika gesucht, welche gegenüber resistenten pathogenen Mikroorganismen wirksam sind. Der gefürchtete interspezifische

Transfer der Vancomycin-Resistenz von Enterokokken auf

Staphylokokken trat erstmalig 2002 in den USA auf.

Cervimycine stellen eine Antibiotikagruppe dar, die von Streptomyces sp. (hinterlegt bei der DSZM, der Deutschen Sammlung für

Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig,

Mascheroder Weg 1 unter DSM 13059) bei Fermentation in einem

Submersmedium gebildet wird (Herold K, Xu Z, Gollmick FA, Gräfe U,

Hertweck C (2004); Biosynthesis of Cervimycin C, an aromatic polyketide antibiotic bearing an unusual dimethylmalonyl moiety. Org.

Biomol. Chem. 7, 2411-2414 und Herold K (2005) Untersuchungen zur

Struktur, Wirkungsweisen und Biosynthese der Cervimycine als

Verbindungen einer besonderen Klasse aromatischer Polyketide.

Promotionsarbeit an der Biol.-Pharm. Fakultät der Friedrich-Schiller- Universität Jena. Tag der Verteidigung: 17.01.2005).

Die Cervimycine gehören zu den Polyketid- Antibiotika; sie bestehen aus einem Polyketid-Aglykon, an das häufig ein oder zwei mehrgliedrige Saccharidketten gebunden sind. Dabei wurde gefunden, dass eine Minorkomponente der Cervimycine, das Cervimycin K, auch als HKI 10311129 bezeichnet, eine besonders

starke antibiotische Wirkung gegenüber multiresistenten Staphylokokken sowie den Vancomycin-resistenten Enterococcus faecalis aufweist.

Cervimycin K ist somit ein erfolgversprechender Kandidat für ein wirksames Antibiotikum zur Bekämpfung resistenter pathogener Keime. Es ist eine gelb-orange amorphe Substanz mit der Summenformel C ₅₆ H ₇₅ NaNO ₂₂ und einer Molmasse von 1.136,4678 g/mol. Das Cervimycin K besteht aus dem Polyketid-Aglykon, an das als Zuckerkomponenten eine Disaccharid-Gruppe und eine nichtveresterte Tetrasaccharid-Gruppe mit endständiger OH-Gruppe gebunden vorliegen. Es enthält im Unterschied zur Mehrheit der Cervimycine keine methylierte Malonsäure-Estergrappe. Aus 180 1 Kulturfiltrat wurden 13 mg gewonnen.

Zur Gewinnung kann der Fermentationsansatz durch Extraktion mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt von der flüssigen Phase getrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschließend zur Trockene eingeengt werden. Der ölige Rückstand wird in wenig Chloroform aufgenommen, die Lösung filtriert und durch Zugabe von dem 20-fachen Volumen Hexan ein rohes Produkt ausgefällt.

Die weitere Aufarbeitung erfolgt durch Gelpermeationschromatographie an Sephadex LH-20 unter Verwendung von Methanol als Eluent. Die mittlere, antibiotisch wirkende Fraktion wird im Vakuum zur Trockene eingeengt. Die Feinreinigung erfolgt durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Gradienten. Die aus Cervimycin K bestehende gelbe Fraktion wird zur Trockene eingeengt.

Neben der Minorkompente Cervimycin K befinden sich in den Kulturlösungen mit etwa 1,0 g/l bis wesentlich höhere Konzentrationen anderer, aber weniger wirksamerer Cervimycine. Dazu gehören die Cervimycine A und C, die bereits unter der Bezeichnung Altamirarnycin 2 und Altamiramycin 1 (Groth I, Schlegel B, Kleinwächter P, Gräfe U, Härtl A, Perner A, Hilliger M, Möllmann U. New antibiotic altamiramycin, showing strong activity against Gram

positive bacteria, obtained by culturing Streptomyces sp. HKI 0179 (DSM 13059). DEl 0065606 (2002-06-27)) als neue Antibiotika geschützt wurden. Das zu den Hauptkomponenten gehörende Altamiramycin 1 (Cervimycin C) weist am Aglykon eine Säureamid-Funktion auf, die auch beim Cervimycin D als auch beim Cervimycin K ^■ vorhanden ist. Das Cervimycin C ist außerdem an der OH-Gruppe des Tetrasaccharids mit der Dicarbonsäure Dimethylmalonsäure und das Cervimycin D mit Methylmalonsäure verestert. Es stellt einen Halbester der dimethylierten Malonsäure dar. Die Komponente Cervimycin C-Methylester ist ein Diester der dimethylierten Malonsäure; die zweite Säurefunktion ist mit Methanol verestert. Aus 180 1 Kulturfiltrat wurden 1,6 g Cervimycin C und I ₅ O g Cervimycin D isoliert (Herold K (2005)).

Die in relativ großer Menge gebildeten Cervimycine C, D, und der Cervimycin C-Methylester sollten wegen ihrer strukturellen Verwandtschaft Ausgangssubstanzen für eine wirtschaftliche Herstellung von Cervymycin K durch Spaltung der Esterbindung zwischen der Tetrasacchärid-Seitengruppe und der Malonyl-Gruppe darstellen. Sie alle enthalten am Aglykon eine Säureamidgruppe und unterscheiden sich von Cervimycin K nur durch die Anwesenheit der methylierten Malonylgruppe an der OH-Gruppe der Tetrasacchärid-Seitengruppe.

Es ist seit langem bekannt, dass bei der chemischen Hydrolyse von Diestern von Dicarbonsäuren, insbesondere auch von substituierten

Malonsäure-Estern, generell eine Estergruppe relativ leicht unter

Bildung des Halbesters entfernt wird, während die zweite Estergruppe wesentlich stabiler ist.

Die erschwerte Bildung der Vollester der Malonsäuren hängt möglicherweise mit der hohen negativen Ladung der entstandenen freien

Carboxylgruppe des Halbesters zusammen. Die Abspaltung einer

Alkoholkomponente bei Dicarbonsäuren, unter Bildung ihrer Halbester wird meistens unter alkalischen Bedingungen durchgeführt. (H.G.O.

Becker et al.: Organisch chemisches Grundpraktikum. 7.1.4.3 Hydrolyse von Carbonsäurederivaten, Johann Ambrosius Barth Verlag Heidelberg,

Leipzig, 20. Auflage 1996).

Letzteres gilt auch, wenn man die Esterspaltung mit esterolytisch wirkenden Enzymen, wie Esterasen, Proteasen und Lipasen, durchführt. Auch hierbei erfolgt die Spaltung des Diesters zum Monoester relativ leicht, während die zweite Estergrappe häufig nicht entfernt werden kann, so dass bevorzugt die Halbester entstehen.

Da die Reaktion stereospezifisch ist, entstehen aus substituierten prochiralen Monalkylmalonsäure-Diestern bevorzugt enantiomere Halbester. Die Spaltung der Diester erfolgt nach Literaturdaten beispielsweise bei pH 7 über eine Zeit von 24 h mit teilweise sehr guten Ausbeuten. Als Enzym wird beispielsweise Schweineleberesterase (EC 3.1.1.1)vorgeschlagen (Iriuchijima K, Hasegawa K, Tsuchihashi G (1982). Agric. Biol. Chem. 46, 1907; JP 04082863 A2; Heidel H, Huttner G, Vogel R, Heimchen G (1994) A novel chiral building block with neopentane framework for synthesis - chemoenzymatic preparation of R-CH ₃ C(CH ₂ OSO ₂ CF ₃ )(CH ₂ Cl)(CH ₂ Br) Chem. Ber. 127, 271 - 274).

Das Ausmaß der Spaltung von gemischten Aryl- und Alkylmalonaten mit Schweineleber-Esterase wurde durch Zugabe von 50 % bzw. 25 % Dimethylsulfoxid zu der wässrigen Phase erhöht. Bei Einsatz von V- Chymotrypsin an Stelle der Schweineleberesterase traten sehr langsame bzw. keine Reaktionen auf (Björkling F, Boutelje J, Gatenbeck K, HuIt K, Norin T (1982) Tetrahedron Lett. 26, 4957 und Björkling F, Boutelje J, Gatenbeck K, HuIt K, Norin T, Szmulik P (1985) Tetrahedron Lett, 41, 1347; Gutman AC, Shapiro M, Boltanski A (1992) Enzyme- catalyzed formation of chiral monosubstituted mixed diesters and half esters of malonic acid in organic solvents. J. Org. Chem. 57, 1063 - 1065).

Die Reaktionen können auch in phosphatgepufferten wässrigen Milieu bei pH 8 durchgeführt werden (Schneider M, Engel N, Boensmann H

(1984) Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 23, 66). Die Zugabe von Methanol

(10 % v/v) erhöhte die Ausbeute, aber die Stereoselektivität der Reaktion wurde schlechter. Bei Anwesenheit von Dimethylsulfoxid war die

Reaktionsgeschwindigkeit langsamer (Luyten M, Müller S. Herzog B, Keese R (1987) HeIv. Chim.Acta 70, 1250).

Versuche, die Malonsäuregrappen von Cervimycin C ₅ dem Cervimycin C Methylester oder Cervimycin D durch chemische Hydrolyse im neutralen sowie alkalischen oder sauren pH-Bereich zu spalten, um das Cervimycin K zu gewinnen, waren bisher erfolglos. Bei extremen pH- Bedingungen bildeten sich wesentlich kleinere Spaltprodukte der Cervimycine. Wahrscheinlich wird bei der Hydrolyse bei alkalischen oder sauren pH- Werten die Grundstruktur der Cervimycinmoleküle zerstört.

Die in der Literatur aufgeführten enzymatischen Transformationen an substituierten Malonsäureestern wurden bisher alle mit strukturell sehr einfachen Malonsäureestern durchgeführt. Es bildeten sich ausnahmslos dabei immer die Halbester der eingesetzten Malonylsäurederivate. Die Herstellung der substituierten Malonsäuren durch Spaltung beider Esterbindungen als auch die Gewinnung der Alkoholkomponenten wurde bisher nicht beschrieben, weil die substituierten Malonsäuren als auch die Alkoholkomponenten in der Regel direkt synthetisiert werden. Die Gewinnung komplexer Alkoholkomponenten aus Naturstoffen durch Spaltung ihrer Malonyl-Halbester ist bisher wie auch eine durch esterolytische Enzyme katalysierte Transformation von Cervimycin C (identisch mit Altamiramycin 1), Cervimycin D sowie des Cervimycin C-Methylesters in das Cervimycin K nicht beschrieben worden. Wie bei allen Esterspaltungen stellt sich in den Reaktionsflüssigkeiten ein thermodynamisches Gleichgewicht ein, dessen Einstellung möglicherweise extrem langsam erfolgen kann. Durch Zugabe der für die jeweilige Esterbindung katalytisch wirkender Enzyme kann die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung in günstigen Fällen beschleunigt werden. Als Regel gilt, dass Ester, die sich schnell bilden, auch schnell gespalten werden. So hochkomplexe Ester wie es die Cervimycinester darstellen, sollten aber nach dieser Regel kinetisch sehr stabil bzw. nicht oder nur sehr langsam enzymatisch spaltbar sein. Für die zweite Esterbindung an den methylierten Malonsäuren gilt dies in noch stärkerem Maße.

Aufgabe der Erfindung ist es, auf einfachem Weg die weniger aktiven, aber in größerer Menge gebildeten Cervimycinester in das hochaktive,

bei der feπnentativen Herstellung als Minorkomponente auftretende Cervimycin K umzuwandeln.

Diese Aufgabe wird erfmdungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen werden in den nachgeordneten Ansprüchen angegeben.

Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass strukturell geeignete Hauptkomponenten, wie bspw. die Cervimycin-Dimethylmalonsäure- und Methylmalonsäure-Monoester und der

Cervimycindimethylmalonsäure-Diester, als Edukte im Verlaufe einer Reaktion mit Enzymen esterolytischer Aktivität für eine Dauer von 0,1 h bis zu mehreren Wochen bei Temperaturen von 20 ⁰ C bis 75 ⁰ C, bevorzugt 30 bis 6O ⁰ C, bei einem pH- Wert von pH 5,0 bis 10,0, bevorzugt pH 6,5 bis 9,0, in einen Reaktor behandelt werden.

Es wurde überraschender Weise gefunden, dass die Reaktion unabhängig davon stattfindet, ob am Aglycon eine Säureamidgruppe wie bei Cervimycin C (Altamiramycin I), Cervimycin D, Cervimycin J oder dem Cervimycin C-Methylester vorhanden oder ob die Aminogruppe der Säureamidgruppe durch eine Methylgruppe wie bei Cervimycin A (Altamiramycin 2), Cervimycin B, Cervimycin L oder dem Cervimycin A-Methylester substituiert ist.

Darüberhinaus wurde überraschend gefunden, sich die Bildung von Cervimycin K aus den Cervimycin-Halbestern entscheidend erhöht bzw. überhaupt erst eine Spaltungsreaktion nachweisbar wird, wenn ein nicht- enzymatisch aktives Protein, wie Serumalbumin in Konzentrationen im Bereich zwischen 0,1 % bis 5%, bevorzugt zwischen 0,5 % und 2 % im Reaktionsansatz anwesend ist.

Als esterolytische Enzyme kommen Esterasen im engeren Sinn, aber auch Proteasen und Lipasen zum Einsatz. So werden zur Katalyse der Reaktionen Lipasen aus Pilzen der Gattung Mucor, Rhizömucor, Rhizopus, Candida, Aspergillus, aus Humicola lanuginosa oder aus Pseudomonas ßuoreszenz mit Erfolg eingesetzt. Die Verwendung von

Schweineleber-Esterase oder Proteasen mikrobiellen Ursprungs wie Pronase aus Streptomyces griseus, die Cobalt-Metalloprotease MO2 aus Streptomyces hygroscopicus (DD 263301), Subtilisin oder Alcalase sowie Esterasen, die aus dem Cervimycinbildner Streptomyces sp. (DSM 13059) sowie der Art Streptomyces tendae gebildet werden als auch Proteasen, die wie Papain aus Pflanzen gewonnen werden, ist erfindungsgemäß .

überraschend wurde auch gefunden, dass der Zusatz von Tensiden eine Steigerung des Umsatzes der Edukte bewirkt. So steigt bei Zugabe von Triton X100 bei einem Versuch, bei dem eine Lipase aus Rhizopus niveus eingesetzt wurde, der Umsatz von 10 % bei einem nicht- supplementierten Ansatz auf 20%.

Die erfmdungsgemäße Reaktion findet in homogener als auch heterogener Phase statt, wobei eine Phase eine Flüssigphase darstellt. Die flüssige Umgebung besteht in einer Form der Ausführung aus einer wässrigen, gepufferten Reaktionslösung mit einer Leitfähigkeit kleiner als 10 mS. Die Lösung kann zusätzlich wasserlösliche Lösemittel wie Methanol oder andere niedere Alkohole oder auch Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid enthalten. Durch den Zusatz der Lösemittel wird die Löslichkeit der Cervimycin-Edukte erhöht, so dass sie mit höheren Konzentrationen in der Reaktion eingesetzt werden können.

Es erwies sich weiterhin als umsatzsteigernd, als eine zweite Flüssigphase ein mit Wasser nicht mischbares Lösemittel einzusetzen. Die zweite, nichtwässrige Phase kann beispielsweise Hexan oder Octan sein.

Erfindungsgemäß ist auch die Reaktion in Anwesenheit einer Festphase. In einer Ausführung handelt es sich dabei um Ionenaustauscher bevorzugt Q-Sepharose oder DEAE-Cellulose. Vorteilhaft dabei ist, dass auf diesem Weg intensive pH- Verschiebungen vermieden werden. Es ist zu vermuten, dass die bei der Reaktion freigesetzten methylierten Malonsäuren an den Austauscher verbleiben und so aus dem Gleichgewicht entfernt werden. Durch einen alkalisch eingestellten

Anionenaustauscher können weiterhin auch die freigesetzten Protonen neutralisiert werden, so dass pH-Bewegungen vermieden werden.

Bei einer weiteren Vohrgehensweise werden die Methylmalonsäureester- oder die Dimethylmalonsäure-Halbester der Cervimycine kovalent über einen 3 bis 16 Kohlenstoffatome in der Kette enthaltenden Spacer an eine Festphase gebunden in die Reaktion eingesetzt. Bevorzugt werden

Festphasen verwendet, an deren Hydroxylgruppen tragende Oberflächen mit Aminopropyltriethyloxisilan beschichtet sind und an die über die Aminofunktion die Cervimycin-Halbester nach der Carbodiimid-

Methode kovalent gebunden vorliegen.

Die mit einer Molmasse von 119,1 monomethylierte bzw. 134,1 g/mol dimethylierte, relativ kleinen Malonsäuren werden in einer weiteren Ausführung während der Reaktion aus dem Reaktorvolumen durch eine Ultrafiltration durch Membranen oder andere Penetrationsbarrieren mit einer Ausschlußgrenze (cut-off) gleich oder kleiner als 1 kD ständig entfernt, während das esterolytische Enzym diese nicht passagieren kann. Die Molmassen der Enzyme liegen in der Regel zwischen 30 und 60 kD. Das Verfahren wird in einer an sich bekannten Ultrafilteranlage durchgeführt. Als Penetrationsbarrieren werden Membranen- oder Hollow-Fiber-Module eingesetzt. Durch Umpumpen und Beauflagen mit einem Druck bis zu 2 atm entsteht ein Permeatstrom durch die Penetrationsbarriere, der vor allem die kleineren Reaktionsprodukte mit sich führt bzw. ausverdünnt. Der Druck wird so gewählt, dass die Cervimycin-Edukte in nur geringem Ausmaß permeieren.

Eine andere Vorgehensweise nutzt Penetrationsbarrieren, bevorzugt angeordnet als Membran-Module oder Hollow-Fiber zur quasi- Immobilisierung des Enzyms. Der cut-off der Barriere liegt bei dieser Vorgehensweise in Abhängigkeit von dem Selektionsverhalten im Bereich zwischen 1 kD und 30 kD. Die Edukte als auch die Reaktionsprodukte permeieren bei dieser Art der Ausführung relativ schnell durch die Penetrationsbarriere zum Enzym hin und auch zurück. In einer anderen Ausführung werden die Ester des Cervimycin C und D vorher oder auch während des Zusammengebens der Reaktanten an

Anionenaustauscher gebunden und die Esterasen wirken in gelöstem Zustand auf die am Ionenaustauscher über das an die Malonsäure- Carboxylgruppe gebundenen Cervimycine C und D ein. Bevorzugt wird auch hier Q-Sepharose oder DEAE-Sepharose als Anionenaustauscher eingesetzt. Durch das Zusammengeben des Anionenaustauschers mit den Halbestern Cervimycin C und Cervimycin D entstehen Ionenaustauscher/Cervimycin-Komplexe, in denen die Cervimycinester sehr wahrscheinlich in einer für den Angriff der esterolytischen Enzyme günstigen sterischen Lage mit einer höheren Rate gespalten werden. Nach der Spaltung verbleibt die entstandene methylierte Malonsäure am Austauscher.

Die Bildung der Komplexe kann in einer Ausführung vor der Esterspaltung in einem separaten Schritt erfolgen. Nachteilig ist hierbei jedoch, dass der Methylester des Cervimycin C hierbei nicht gebunden wird und somit nicht an der Reaktion teilnimmt.

In einer anderen Ausführung werden Anionenaustauscher und Cervimycinester bereits im Reaktor zusammengegeben und anschließend das Enzym zugesetzt. Da der Methylester des Cervimycins als Halbester schnell und quantitativ auch ohne Bindung an Ionenaustauscher zu Cervimycin C gespalten wird, treten hierbei keine Verluste auf.

Es wurde weiterhin gefunden, dass der Einsatz der Ionenaustauscher auch in kleineren Mengen, als sie zur Bildung eines l : l-Komplexes mit den Cervimycin-Estern benötigt werden, nach Zugabe des esterolytischem Enzym zu der gewünschten Esterspaltung führt. Das gebildete Cervimycin K geht in allen Ausführungen der Erfindungen in die flüssige Phase über, während die gebildete Methyl- und Dimethylmalonsäure am Austauscher verbleiben.

überraschend wurde auch gefunden, dass eine Bindung des esterolytischen Enzyms an Festphasen das Reaktionsgleichgewicht zu Gunsten der Reaktionsprodukte verschiebt. Bei dieser Art der Ausführung werden die Edukte und die Reaktanten an dem immobilisierten Enzym vorbeigeführt, wobei die entstandenen

Malonsäuren durch Bindung an Anionenaustauscher bei geeigneten, in der Regel niedrigen Ionenstärken aus dem Reaktionssystem entfernt werden. Als feste Träger werden Adsorbenzien wie poröses Glas aber auch supramolekulare Verbindungen wie Zeolithe und oder Dextrane eingesetzt.

Die supramolekularen Verbindungen beeinflussen außerdem sehr wahrscheinlich die Gleichgewichtslage dadurch günstig, indem sie die entstehenden methylierten Malonsäuren mit ihren nanoskalierten Poren abfangen oder dass sie die Reaktion sterisch günstig beeinflussen.

Auch der Einsatz chemisch vernetzter oder immobilisierter esterolytischer Enzyme beeinflußt nicht nur die Gleichgewichtslage oder die Geschwindigkeit der Reaktion günstig, sondern es besteht der große Vorteil, dass zurückgewonnen bzw. mehrfach eingesetzt werden können.. Erfmdungsgemäß ist auch, dass durch Zugabe zwei- und dreiwertiger

Kationen wie beispielsweise Mg ^+"1" , Mn ^+"1" , Zn ⁴⁺ , Fe ⁺ ^ oder Al ^+"1"1"' in Konzentrationen größer als 10 mM das Reaktionsgleichgewicht oder die Reaktionsgeschwindigkeit zu Gunsten der Reaktanten verschoben werden kann und dass dadurch die Cervimycin K-Bildung gefördert wird. Sehr wahrscheinlich entstehen hierbei schwerlösliche Salze der freigesetzten Malonsäuren, die auf diesem Weg aus dem Gleichgewichtssystem entfernt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren erstreckt sich auch auf die Durchführung der Fermentation mit Streptomyces sp. (DSM 13059) bzw. einem die Cervimycine bildenden Mikroorganismus der Art

Streptomyces tendae. Durch die Zugabe von esterolytischen Enzymen, bevorzugt in einer späten Phase der Fermentation, wird so eine

Umwandlung der Cervimycin-Ester in Cervimycin K bereits während des Fermentationsprozesses erreicht.

In einer anderen Ausführung wird das zellfreie Kulturfiltrat der

Fermentation mit esterolytischen Enzymen behandelt. Um den negativen

Einfluß lebender Mikroorganismen auf die Reaktion auszuschließen und um dadurch auch einen langzeitstabilen bewuchsfreien Reaktionsansatz

zu erreichen, werden die Reaktionslösungen durch Filtration durch Sterilfilter sterilisiert.

Ausführungsbeispiel 1

1 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers von pH 8,5 werden mit 40 μl einer methanolischen Lösung Cervimycin C-Lösung versetzt, die 2 mg Cervimycin C in 0,5 ml Methanol enthält. Davon werden 40 μl in 1 ml Phosphat-Puffer von pH 8,5 gegeben. Das Gemisch wird mit 40 μl einer Lipaselösung versetzt, die 2 mg der nachfolgend aufgeführten Lipasen mit einer spezifischen Aktivität von 2,6 U/g (Fluka) in 0,5 ml Wasser enthält. Unter pH-Kontrolle und pH-Konstanthaltung durch Zugabe von 0.1 M NaOH wird über eine Dauer von 50 h bei 40 ⁰ C inkubiert. Mit Hilfe der HPLC-Methode wird ein Anstieg des Cervimycin K-Gehaltes in dem Ansatz von 0 mg/1 auf 6,9 mg/1 nachgewiesen während die Cervimycin C -Konzentration von 40 mg/1 auf etwa 34 mg/1 sank. Die Konzentration des Cervimycine wird in der wässrigen Phase durch eine standardisierte HPLC-Methode bestimmt.

HPLC-Parameter zur Bestimmung der Cervimycine

HPLC: Niederdruckgradientenanlage der Fa. Jasco

Detektor: Diodenarray

Säule: ProntoSIL 120-5-C18-ace-EPS 5 μm, 250 x 4 mm

Vorsäulenkartusche: ProntoSIL 120-5-C18-ace-EPS 5 μm 20 x 4mm

Säulentemperatur: 25 ⁰ C

Mobile Phase: ACN : TFA (0,1 %) Gradient

0 min - 50 % ACN : 50 % TFA 20 min - 100 % ACN

30 min - 100 %ACN

30,5 min - 50 % ACN : 50 % TFA

35 min - 50 % ACN : 50 % TFA

Flussrate: 1 ml/min

Inj ektionsvolumen: 20 μl

Ausmhrangsbeispiel 2

Zu 5 ml 0,01 M Phosphatpuffer von pH 7,03, der in einer weiteren Versuchsausführung 0,5 % Rinderserumalbumin-enthielt, wurden 250 μl methanolische Cervimycin C-Lösung, die 20 mg Cervimycin C in ImI

5 Methanol enthielt zugesetzt. Anschließend wurden dazu unter Mischen 0,5 ml einer 0,01 M phosphatgepufferten Esteraselösung (Esterase aus horse liver) pH 7,03 gegeben, die 10 mg Esterase pro ml 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,03 enthielt. Das Gemisch wurde bei 37 ⁰ C 24h inkubiert.

10 Zum Nachweis des Cervimycin K wurden dem Gemisch 0,1 ml entnommen und in der HPLC (Shimadzu) mit einem Acetonitril - 0,1 % Trifluoressigsäuregradienten auf einer Protosil ace-EPS 120-5-C _1S -SaUIe ( 250 x 4 mm) aufgetrennt. Der Cervimycin K-Peak wurde mit Massespektroskopie (Bentrop Massespektrometer Finnigan LCQ,

15 Finnigan, Bremen) in Verbindung mit einer Elektronenspray-Ionenquelle und einem ion-trap Analysator untersucht. Es wurde ein charakteristischer Massepeak für Cervimycin K bei M 1113 nachgewiesen. Die quantitative Auswertung ergab in der Probe einen Cervimycin K- Gehhalt von 114 mg/1. Diese Menge entspricht einer

20 Ausbeute von 18 %. (siehe dazu Tabelle 1)

Ausführungsbeispiel 3

Spaltung von Cervimycin C mit unterschiedlichen Esterasen und

25 _. Lipasen:

Es wurden 2mg lyophil getrocknetes Enzym in 0,02 M Phosphatpuffer von pH 8,5 gelöst (Enzymlösung). In den Ansatz wurden zu 1 ml Phosphatpuffer 40 μl methanolische Cervimycinlösung und 20 μl der Enzymlösung gegeben. Aus 40 mg/L Cervimycin bildet sich die in der

30 rechten Spalte angegebene Cervimycin K-Konzentration. (siehe dazu Tabelle 2)

Ausführungsbeispiel 4

10 ml eines 0,005 M Phosphatpuffers von pH 8,5 werden mit 1,0 ml 35 einer methanolischen Lösung versetzt, die 640 μg/ml Cervimycin C und

1 g mit 0,005 M Phosphatpuffer äquilibrierter Q-Sepharose versetzt. Nach der Bindung des Cervimycin C an den Ionenaustauscher wird der klare überstand durch Zentrifugieren entfernt und der Ionenaustauscher mit 5 ml einer Lipaselösung versetzt, die 2 mg Lipase aus Rhizomucor mihei mit einer spezifischen Aktivität von 0,51 U/mg (Fluka) enthält. Die Suspension wird unter Schütteln über eine Dauer von 50h bei 40 ⁰ C inkubiert. Es werden etwa 15% Cervimycin C zu Cervimycin K umgesetzt. Das gebildete Cervimcin K befindet sich im wässrigen überstand. Zur Gewinnung wird der Ansatz in an sich bekannter Weise durch Extraktion mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt von der wässrigen Phase getrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschließend zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wird in wenig Chloroform aufgenommen, die Lösung filtriert und durch Zugabe von dem 20-fachen Volumen Hexan ein rohes Produkt ausgefällt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt durch Gelpermeationschromatographie an Sephadex LH-20 unter Verwendung von Methanol als Eluent. Die mittlere, antibiotisch wirkende Fraktion wird im Vakuum zur Trockene eingeengt. Die Feinreinigung erfolgt durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Gradienten. Die aus Cervimycin K bestehende gelbe Fraktion wird zur Trockene eingeengt.