【발명의 명칭】

대뇌 측뇌실 투여에 의해 헌터증후군을 치료하기 위한방법 및 조성물 【기술분야】

본 발명은 헌터증후군을 치료하기 위한 방법 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

헌터증후군 또는 제 2형 점액다당질증 (Mucosacchar idosi s type I I )은 이듀 로네이트- 2 -설파타제 ( iduronate-2-sul fatase, IDS또는 I2S)의 결핍으로 인해 글 리코스아미노글리칸 (Glycosaminoglycan, GAG)과 같은 뮤코다당체가 체내에서 분 해되지 못하여 리소좀 내에 축적되는 리소좀 축적질환 (Lysosomal storage di seases , LSD) 중 하나이다. GAG는 신체의 모든 세포 내에 축적되어 여러 가지 증상을 유발하며， 그 증상에는 두드러진 얼굴 모습， 큰 머리， 간이나 비장의 비 대로 인한 복부 팽만등이 포함되며， 청력 상실， 심장판막질환， 폐쇄성 호흡기질 환， 수면무호흡 등도 동반한다. 또한, 관절운동에도 제한이 올 수 있으며 중추신 경계의 침범으로 신경계 증상과 발달 지연이 유발될 수 있다. 헌터 증후군은 162,000명당 1명꼴로 발생하는 것으로 알려져 있으며， X 염색체와 연관된 열성 (X-l inked recessive) 양식으로유전된다.

헌터 증후군의 치료 방법 중 하나인 효소 대체 요법은 외부에서 생산된 IDS를 체내에 투여하는 방법이며， 투여가 간단한 장점이 있지만지속적으로 효소 를 투여해야 하므로 치료 비용이 높다는 단점이 있으며， 현재 재조합 기술에 의 해 생산되어 미국 FDA의 허가를 받은 엘라프라제 (Elaprase® ; Shi re Pharmaceut ical s Group)가 시판중에 있으나, 단가가 매우 비싸고, 효과 및 안전 성이 낮은 단점이 있다.

효소 대체 요법 (Enzyme replacement therapy, ERT)은 대상체에게 천연 또 는 재조합-유래 단백질 및/또는 효소를 전신적으로 투여하여 달성된다. 허가된 효소 대체 요법들은 전형적으로 정맥 내 투여되며 질병 또는 질환의 원인이 되는 효소 결핍으로 인한 신체적 증상들의 치료에 일반적으로 효과적이다. 그러나 정 맥 투여된 단백질 및/또는 효소가 중추신경계 (central nervous system； CNS)의 세포 및 조직에 제한적으로 분배되어 문제가 된다. 특히 CNS 병인학 (et iology)을 갖는 질환치료의 경우 정맥 내 투여된 단백질 및/또는 효소가 혈액-뇌 장벽 (blood-brain barr ier , BBB)을통과하지 못하기 때문에 문제가 되어왔다.

이러한 혈액-뇌 장벽으로 인한 문제점을 극복하기 위해， 경막 내

( intrathecal； IT) 주사법으로 단백질 및/또는 효소를 대상체의 뇌척수액 내로 직접 투여하는 치료 방법에 대한 시도가 이루어져 왔으나, 안정성과 유효성 측면 에서 성공하지 못하고 있는실정이다.

이에 중추신경장애를 수반하는 헌터증후군 환자를 효과적으로 치료하고， 종국적으로 이들 환자에게서 뇌기능 개선을 가져올 수 있는 치료 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자는 대상체의 대뇌 측뇌실 내로 이듀로네이트- 2 -설파타제 베타를 장기적으로 반복 투여할 경우, 헌터증후군 환자에서 나타나는 뇌기능 저하를 억 제하고 이를 개선할수 있다는놀라운 효과를 확인하고본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 헌터증후군으로 인한 중추 신경계 퇴행, 특히， 뇌기능 저하를 실질적으로 치료 또는 개선하는 치료 방법 및 약제학적 조성물을 제공하 는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 이듀로네이트- 2 -설파타제 베타 를 포함하고, 대뇌 측뇌실 내로 4주마다 1회 투여되어, 대상체에서 헌터증후군을 치료하는 약제학적 조성물 및 이를 이용한헌터증후군 치료 방법을 제공한다.

【발명의 효과】

본 발명의 일측면에 따른 약제학적 조성물은， 헌터 증후군을 앓는 대상체 에서 실제로 뇌기능을 개선하는 등의 효과를 나타낸다. 본 발명에서는 이러한조 성물의 투여가 임상에서도 충분히 뇌기능 손실을 억제할 수 있다는 가능성을 확 인하였다.

또한 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 장기간에 걸친 반복적인 투여로 인해， 같은 용량의 유효 성분을 단회 투여하는 것에 비하여 헌터증후군을 치료하 는 효과가 더 우수하고, 단회 투여 결과로부터는 예측할 수 없는 효과로서 손상 된 뇌 구조를 치료 또는 회복시키고 뇌기능을 실질적으로 치료 또는 개선하고， 특히 기억과학습 기능을 향상시키는효과를나타낸다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 시험예 1에서 본 발명의 일측면에 따른 제형물이 투여되는 위치를 나타낸 그림이며, 표시된 위치는마우스의 대뇌 측뇌실을 의미한다.

도 2는 시험예 2에서 마우스 뇌로부터 뇌척수액을 주줄하는 사진을 나타 낸 것이며, 가장오른쪽사진은마이크로피펫에 수거된 뇌척수액을 나타낸다. 도 3은 시험예 2의 결과로서 마우스의 뇌와 뇌척수액 내에 축적된 헤파란 황산 (heparan sul fate； HS)의 양을 나타낸 그래프이다.

도 4는 시험예 2의 결과로서 단회 투여로부터 28일 후 시점과 실시예에 따라 6회 반복 투여로부터 28일 후 시점에서, 마우스의 뇌와 뇌척수액 내에 축적 된 HS의 양을 비교한그래프이다.

도 5a는 시험예 3의 결과로서 마우스의 뇌 자기공명영상결과이고, 도 5b 는마우스의 전체 뇌 부피에 대한뇌 실질 부피 비율을나타낸 그래프이다.

도 6은 시험예 4의 결과로서 마우스의 뇌 조직에 대한 헤마톡실린 및 에 오신 조직 염색 결과를 나타낸사진이다.

도 7은 시험예 5의 결과로서 마우스 뇌 조직에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸사진이다.

도 8은 시험예 6의 결과로서 마우스의 학습 기억능력을 평가하기 위한 공 포조건화시험의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 시험예 7의 결과로서 마우스의 과행동 특성을 평가하기 위한 개방 영역 시험의 결과를 나타낸 그래프이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

정의 2019/231260 1»（：1^1{2019/006515 본 발명을 더욱 잘 이해하기 위하여, 소정의 용어들은 아래와 같이 정의 된다. 아래 용어들 및 기타 다른 용어에 대한추가적인 설명은 본 명세서 전체에 걸쳐 설명된다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "약”은 하나 이상의 수치들에 적용되는 바 와 같이 기재된 기준 수치와 유사한 수치를 의미한다. 본 발명의 일측면에 있어 서， 용어 "약"은 달리 기재되지 않거나 다른 내용으로부터 분명하지 않는 한（이 러한 숫자가 가능한 수치의 100%를초과하는 경우를 제외한다） 기재된 수치를 중 심으로（이상 또는 이하） 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들 의 범위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "치료”는 부분적으로 또는 완벽하게 특정 한 질환, 장애, 및/또는 병폐（예를 들어， 헌터 증후군）의 하나 이상의 증상들 또 는 특징들을 완화시키고, 개선시키고, 안정시키고， 억제하고， 발병을 지연시키 고, 중증도를 감소시키고 및/또는 이의 빈도를 감소시키는 치료적 단백질（예를 들어, 리소좀 효소）의 투여라면 모두를 말한다. 이러한 치료는 적절한 질환， 장 애 및/또는 병폐의 징후들을 발현하지 않는 개체 및/또는 단지 질환, 장애 및/또 는 병폐의초기 징후들만을 나타내는 개체에게 할수 있다. 임의적으로 또는 추가 적으로, 이러한 치료는 적절한 질환， 장애 및/또는 병폐의 하나 이상의 확립된 징후들을 발현하는 개체에게 할수 있다.

이하에서는본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 일측면에 있어서， 이듀로네이트- 2 -설파타제 베타（’ ^| |3’’）를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에서 헌터증 후군을 치료하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서， 상기 약제학적 조성물은 헌터증후군을 앓는 대상체에서 뇌실질비대증을 치료또는 억제하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 헌터증후군을 앓는 대상체에서 뇌기능을 개선하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서， 상기 1 _욘는 서열번호 1의 아미노산 서열 을 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 서열번호 1은 재조합 인간이듀로네이:트- 2 - 2019/231260 1»（：1^1{2019/006515 설파타제 단백질이다. 본 발명의 일측면에 있어서, ^ |3는 서열번호 2의 아미 노산 서열을 가지는 단백질을 더 포함할 수 있다. 서열번호 2는 재조합 인간 이 듀로네이트- 2 -설파타제 단백질이며， 아미노산 59번째 위치의 시스테인이 포르밀- 글리신（1 ^? 0111 1당1 0116， 용1 ）으로 치환된 것이다.

본 발명의 일측면에 있어서 , 상기 욘는 약 20 내지 35 몰% 이하의 서 열번호 1의 아미노산서열을 가지는 단백질 및 약 65 내지 80몰% 이하의 서열번 호 2의 아미노산서열을 가지는 단백질을 함유할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일측면에 있어서， 상기 1將_|3는 약 35 몰% 이하의 서열번호 1의 아미노산 서열 을 가지는 단백질 및 약 65몰% 이하의 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단 백질을 함유할수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 1此-0는 서열번호 1과 적어도 60% , 65%, 70%, 75%, 80%， 85%, 90%, 95%또는 98%동일한 아미노산 서열을 가지는 단 백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 3-|3는 서열번호 2 와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질을포함할수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 1況-|3는 약 0. 1 1 /011 내지 약 60 농도， 약 1 11退/1111 내지 약 10미용세의 농도, 또는 약 6 0退/1111의 농도일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서 , 1회 투여시 1 _|3의 용량 애 은 약 1 용 내지 60 , 약 15 내지 약 60 il g, 약 20 내지 약 40 , 약 25 내지 약 35 , 약 29 내지 약 31 11 _§ , 또는 약 30 일 수 있으며， 이러 한 용량은 마우스 등의 포유 동물에 투여하는 경우의 투여 용량일 수 있으나 이 에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 일측면에 있어서， 1회 투여시 103- ^

수 있으며， 이러한 용량은 인간에게 투여하는 경우의 투여 용량일 수 있으나 이 에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 있어서， 상기 약제학적 조성물은 대상체의 대뇌 측뇌 실 내로 4주마다 1회 투여될 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서， 약제학적 조성물은 대상체의 대뇌 측뇌실 중 2019/231260 1»（：1^1{2019/006515 어느 한쪽또는둘 다에 직접 투여될 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 약제학적 조성물의 투여는 헌터증후군을 가 지는 대상체에서 뇌실질 비대증을 축소 또는 억제하거나; 대상체의 뇌기능을 개 선하거나; 대상체의 학습 기억능력을 개선하거나; 대상체의 과 행동 특성을 억제 하거나; 뇌 세포의 세포성 공포화를 감소시키거나; 또는 뇌 세포 내에서 ［ 溫 （리소좀-연관 막단백질 2）의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서， 약제학적 조성물의 투여는 대상체의 뇌（예를 들어 뇌 세포） 또는 뇌척수액 내에서 헤파란 황산어幻 축적을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 일측면에 있어서， 상기 此 축적은 대조군과 대비하여 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1배， 1.5배， 2배， 또는 3배 감소되는 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서， 상기 약제학적 조성물의 투여는 대상체에 3 회 이상 수행될 수 있다. 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여는 대상체에 3회 이상， 4회 이상， 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상, 8회 이상, 9회 이상， 또는 10회 이상수행될 수 있으며， 구체적으로 6회 수행될 수 있다. 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여기간은 12주 .이 상 48주 이하일 수 있다. 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여기간은 12주 이상， 16주 이상， 20주 이상， 24주 이상， 28주 이상， 32주 이 상, 36주 이상, 40주 이상, 44주 이상, 또는 48주 이상일 수 있으며 , 구체적으로 24주일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서， 상기 대상체는 인간 또는 포유동물일 수 있 다. 본 발명의 일측면에 있어서, 상기 포유동물은 마우스， 랫트, 설치류, 고양 이, 토끼, 개， 돼지, 말， 또는소 일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서， 상기 약제학적 조성물의 투여는 리저버 및 리저버에 연결된 카테터를 포함하는 뇌실내 카테터 시스템을 통해 수행될 수 있 다. 아래 시험예에서는 마우스에 투여하였으므로 별도의 입체정위 장치 및 입제 정위 좌표계 등이 필요하였으나， 임상에서 적용 시에는 간단한 뇌실내 카테터 시 스템을통하여 본 발명의 약제학적 조성물을투여할수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서， 상기 약제학적 조성물의 투여는 1） 상기 카 테터 시스템을 외과적으로 삽입하는 단계로서， 여기서 리저버는 대상체의 두피 아래에 존재하고, 카테터의 말단은 대상체의 대뇌 측실 내에 위치하여 대뇌 측실 2019/231260 1»（：1^1{2019/006515 의 내부 공간은 카테터의 내부 공간을 통해 리저버의 내부 공간과 연결되며， 뇌 척수액이 대뇌 측실로부터 리저버로 흘러들어가 리저버를 채우는 단계; 2) 리저 버로부터 약 0. 1 내지 5 의 뇌척수액을 0. 1 내지 60 /분의 속도로 빼내는 단 계; 3) 0. 1 내지 5 의 약제학적 조성물을 0. 1 내지 60 /분의 속도로 리저버 에 주입하는 단계; 및 4) 약제학적 조성물이 카테터를 통해 리저버로부터 대뇌 측실로 흘러가도록 하는 단계;를 포함하는 방법으로수행될 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여는 헌터증후군 을 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 효소 대체 요법과 병용하여 수행될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일측면에 있어서， 추가적인 효소 대체 요법은 10 0의 정맥 내 투여 및 피하 투여 중 하나 이상일 수 있다. 이러한 정맥 내 투여 와 피하 투여는 기존의 투여 방법을 의미할 수 있으며， 임상에 적용할 경우 본 발명의 대뇌 측뇌실 내 투여는 투여 스케줄에 있어서 한계를 설정할 필요가 없 다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 염화나트륨 및 폴리 소르베이트 20을 더 포함하고 가 약 5 내지 약 7일 수 있다. 본 발명의 일측면 에 있어서 , 약제학적 조성물은 가 약 6일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물에 포함된 염화나트륨 은 약 100 내지 약 200 의 농도일 수 있다. 여기서 염화나트륨의 농도는 위 범위 내에 존재하는 모든 정수 값의 범위에 해당할 수 있다. 구체적으로 염화나 트륨의 농도는 약 150 일 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물에 포함된 폴리소르베 이트 20은 약 0.01 1 /011 내지 0.5 1雄/미1의 농도일 수 있다. 여기서 폴리소르베 이트 20의 농도는 위 범위 내에 존재하는 모든 소수 값의 범위에 해당할 수 있 다. 구체적으로 폴리소르베이트 20의 농도는 약 0.05 1收/ 일 수 있다. 본 발명 의 일측면에 있어서， 상기 약제학적 조성물의 투여는 심각한 역효과를 유발하지 않는 것일 수 있다. 본 발명의 일측면에 있어서 , 심각한 역효과는, 이에 제한되 는 것은 아니지만 실질적인 면역 반응, 독성, 또는사망을 유도하는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어， ’ '실질적인 면역 반응"은 실질적인 적응성 I-세포 매개성 면역 반응과 같은 중증 또는 심각한 면역 반응들을 의미할 수 있 2019/231260 1»（：1^1{2019/006515 다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 바이알, 주사기, 또 는 프리필드시린지 등의 용기에 충전되어 제공될 수 있으며 , 단일 용량으로 투여 시 일회용 플라스틱 주사기에 충전되어 제공될 수 있다. 본 발명의 일측면에 있

약 7 ^의 부피, 약 4 1: 1 _^ 내지 약 6 나느의 부피， 또는 약 5 느 부피로 투여될 수 있으나， 이제 제한되지는 않는다. 또한 본 발명의 일측면에 있어서 , 상기 약

약 4此 내지 부피, 또는 약 5 부피로 투여될 수 있으나， 이제 제 한되지는 않는다.

본 발명은 일측면에 있어서, 약 150 의 염화나트륨， 약 0.05 1收/! ₁₁ 1의 폴리소르베이트 20， 및 약 5 1收細1의 이듀로네이트- 2 -설파타제 베타（犯 욘）를 포함하고， 가 약 6이며， 대뇌 측뇌실 내로 4주마다 1회 투여되고, 헌터증후군 을 앓는 대상체에서 뇌실질비대증을 치료 또는 억제하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 일측면에 있어서， 약 150 1 의 염화나트륨， 약 0.05 의 폴리소르베이트 20， 및 약 5 1收/ 의 이듀로네이트- 2 -설파타제 베타（1 - ）룰 포함하고， 가 약 6이며, 대뇌 측뇌실 내로 4주마다 1회 투여되고, 헌터증후군 을 앓는 대상체에서 뇌기능을 개선하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것일 수 있 다.

본 발명은 일측면에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에 처리하 는 단계를 포함하는 헌터증후군의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 헌터증후군을 치료하기 위한 본 발명의 약학 적 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 헌터증후군 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 실시예 및 시험예를 들어 본 명세서의 구성 및 효과를 보다 구체적 으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 명세서에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 명세서의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1] 투여를 위한 IDS-p 제형물의 제조

운반체 용액으로는 150 mM의 염화나트륨과 0.05 mg/ml의 트윈 20 용액 (Merck Mi 1 1 ipore , Darmstadt , Germany)을 사용하였다. (주)녹십자로부터 입수한 IDS-I3 용액 (50 mg/ml 또는 15 mg/ml )을 위 운반체 용액에 희석하여 6 mg/ml의 농도로 IDS-I3 제형물을 제조하였다. 이렇게 제조된 IDS-P 제형물을 아래 시험 예에서 사용하였다.

[시험예 1] 마우스에 대한 대뇌 측뇌실 내 투여

들를

본 명세서에 기재된 시험예에 사용된 마우스는 직접 제작한 마우스이며， 이듀로네이트 2 -설파타제 ( iduronate 2-sul fatase； IDS) 유전자의 일부를 결손시 키는 방식으로 제작하였다. 간단히， IDS 유전자를 엑손 2 내지 엑손 3로부터 결 손시켰다· IDS K0 마우스 ( IDS Knock-out mouse)를 C57BL/6.129S 배경 균주 (background strain)으로부터 번식시켰으며, 이는 IDS유전자에서 삭제 돌연변이 를 가졌다. 야생형 (WT) 대조군 마우스를 C57BL/B6.129S 균주로부터 번식시켰다. 모든 마우스의 유전자형을 꼬리 조각 (snip)으로부터 수득한 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 확인하였다. 본 명세서의 시험예는 실험동물윤리위원회

( Inst i tut ional Animal Care and Use Commi ttee)로부터 허가 받았으며 (허가 번 호. 20140925005) , 삼성생명과학연구소 (서울， 대한민국)의 동물복지정책에 따라 수행하였다.

번식된 마우스들을 아래 표 1과 같이 구별하여 할당하였다.

【표 11

대뇌 측뇌실 내 투여

정확한 대뇌 측뇌실 내 투여를 위해 마우스의 뇌 좌표가 필요하다. 이러 한 정보는 비특허문헌 1에 기재되어 있으며 도 1과 같다. 마우스 주령에 따른 대 뇌 측뇌실의 위치는 비특허문헌 1을 더 참고하였다.

위에 따라 번식된 6 주령의 마우스에 대해 대뇌 측뇌실 내 투여를 수행하 였다. 각 분류군에 대하여 운반체 용액과 제조예 1의 IDS-P 용액을 1회 투여 시 5 _W L의 부피로 투여하였다. 투여 당일, 마우스를 이소플루란 (하나 제약， 대한민 국)으로 호흡 마취하고 입체정위 장치 (Stereotact ic instrument ) (Stoel t ing, USA)에 고정시켰다. 그 후 마우스의 머리 표피를 최소로 벗겨낸 다음 노출된 두 개골을 깨끗이 하였다. 제조예 1에서 준비한 운반체 용액과 IDS-I3 용액을 일회 용 플라스틱 주사기에 넣고， 31-게이지 바늘을 가지는 주사기 펌프 (KD Scient i f ic , Swi tzer l and)를 이용하여 마우스의 대뇌 측뇌실에 10 u U분의 일정 한 속도로 주입하였다. 투여 시 주사기 바늘의 뇌 내 위치는 입체정위 좌표계 (stereotaxi c coordinates) (Stoel t ing, USA)를 이용하여 모니터링하였다. 투여 시작 시 바늘의 좌표는 다음과 같다: -0.58 ■ caudal to bregma , 1.25 mm lateral to sagi ttal suture , -1.77 mm in depth. 5 y L의 부피를 모두 투여한 후, 주사기 바늘을 ₃₀ 초당 0. 15 mm씩 들어올려 주사 부위로부터 제거하는 행위를 4~5회 반복하였다. 그런 뒤 -1.00 ■ in depth 위치에서 30초당 0.3 ■ 높이로 바늘을 들어올리는 방식을 수 회 반복하여 완전히 주사 바늘을 제거하였다. 이는 투여 용액의 역류 방지를 위해 도입된 것이고， 투여 전 과정에 소요되는 시간은 개체당 총 약 30분 정도이다. 투여 후 주사 부위를 포함하는 노출된 피부 부위는 의료용 스테이플러로 간단히 봉합하였다.

이러한 투여 후 마우스는 심각한 부작용을 나타내지 않았다. 투여 부위에 서의 실질적인 면역 반응 또는 신체 기능 이상 등으로 인한 개체 탈락은 관찰되 지 않았다. 최종 투여일로부터 28일 후 부검하여 아래 분석을 실시하였다.

[시험예 2] 마우스 뇌 또는 뇌척수액에 축적된 HS 분석

마우스 뇌 및 뇌척수액의 수거 표 1에 따른 각 분류군의 최종 투여일로부터 28일 후 부검시점에, 해당 마우스의 소뇌연수조 (ci sterna magna) 부위에서 붕규산유리 마이크로피팻 (Outer Di ameter : 10 mm, Inner Diameter : 0.75 mm)을 이용하여 뇌 척수액을 먼저 수거 하였다 (도 2 참조) . 수거된 뇌 척수액 (약 5~10 y L)은 HS분석을 위해 수거 직후 액체질소를 이용하여 급속 동결한 후초저온 넁동고에 분석시점까지 보관하였다. 뇌 내 헤파란 황산 분석을 위해 인산염완충식염수 (PBS)로 경심관류 (transcardial perfusion)를 수행하고, 뇌를 수거하고 급속 동결한후초저온 넁동고에 분석시점 까지 보관하였다.

HS분석 방법

수거된 마우스의 뇌척수액 및 뇌 조직 샘풀에서 HS 수준을 LC-

MS/MS(Liquid chromatography tandem-mass spectrometry)를 사용하여 즉정하였 다. PSB에서 균질화된 마우스 뇌척수액 또는 뇌 조직 2 y L 샘플을 사전 처리를 위해 분취하였다. 샘플들을 염산-메탄올에서 가열하여 메탄올 분해하였다. 메탄 올 분해물을 질소 기체 흐름 하에서 증발 ·건조시켰다. 내부 표준 ( internal standard)은 중수소 데르마탄 황산 (dermatan sul fate)과 헤파란 황산 (DS_d6 및 HS_d6)를 사용하였다. 그 결과 수득한 용액을 원심분리 필터에 옮겨 원심분리하 였고， 결과 여과물을 분석하였다. 초성능 액체 크로마토그래피 시스템 (Ul tra Performance Liquid Chromatography system； UPLC) (워터스 사)과삼중 사극자 질 량분석기 (tr iple quadrupole mass spectrometer) API 5000 (AB/MDS Sciex사)를 사 용하여 LC-MS/MS분석을 수행하였다. 분석기 버전 1.5.1을 사용하여 데이터를 처 리하였다. 분석 결과를 도 3과 도 4에 나타내었으며， 통계 분석은 홈-시닥 (Holm- Sidak)의 다중비교검정을 수행하였다 (도 3， 도 4에서 *： P<0.05, p< 0.001 ,

: P< 0.0001 이다) .

결과

각 분류군에서의 뇌와 뇌척수액 내 HS축적량을 비교하였다. 도 _. 3에 따르 면 마지막 투여일로부터 28일 후 시점에서 본 발명의 실시예의 경우， 비교예 1에 비하여 HS수준이 낮게 유지되고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 투여된 용량 이 한달 간꾸준히 효과를 지속하여 4주마다 1회의 투여 주기가 HS축적 억제 효 과를 나타낸다는 점을시사한다 (도 3 참조) .

도 4에 따르면 1회 투여시 동일한 용량을 투여한 비교예 2와 본 발명의 실시예 마우스의 HS 감소량을 비교했을 때, 단회 투여한 비교예 2에 비해 반복 투여한실시예에서 HS가 더 많이 감소되는 것을 확인하였다. 이것은 1회 투여 용 량을 동일하게 투여하고 같은 시간 (즉, 투여 후 28일)을 유지하더라도 지속적으 로 투여하는 것이 1회성 투여에 비해 훨씬 그 치료 효과가뛰어남을 확인하는 결 과이고， 임상적 치료 효과에 있어서도 시사하는 바가 크다. 이러한 결과에 따르 면 1회 투여 용량이 동일한 경우 반복 투여가환자의 치료 효과를 현저하게 증대 시킬 것이며， 이를 위해서는 환자와 보호자의 편의성이 반드시 뒷받침되어야 할 것이다.

[시험예 3] 뇌실질비대증 (ventr iculomegaly) 억제 효과평가

본 발명에 따른 대뇌 측뇌실 내 투여가 뇌와 뇌척수액의 생화학적 지표인

HS의 호전뿐 아니라， 뇌의 구조적 파괴나 손실에도 억제 효과가 있는지 여부를 확인하기 위해 마우스의 뇌 ffil 분석을수행하였다.

구체적으로， 6회 투여 완료 후 모든 마우스 이미지를 7.0 -테슬라 1 시 스템 (Bruker-Biospin, Fal landen, Swi tzer land)을사용하여 수득하였고, 이 시스 템은 100 ms의 상승 시간으로 400 /미까지 공급할 수 있는 20 cm 구배 세트를 구비한 것이다. 새장형 코일 (bi rdcage coi l ; inside diameter , 72 mm； Bruker Biospin)을 여기 (exci tat ion)를 위해 사용하였고, 신호 수신을 위해 활성적으로 디커플링된 위상 배열 코일 (act ively decoupled phased array coi l )을 사용하였 다.

실험 동안에 걸쳐 자발호흡을 위한 노즈 콘으로 전달되는 산소 및 질소 기체의 혼합물 (3 :7) 내의 이소플루란 (하나제약， 대한민국) (유도를 위해 5%, 동물 설정을 위해 2% 및 · I 실험 동안 1-1.5%)으로 마우스를 마취하였다. 마우스의 머리를 비트/이어 바 (bi te/ear bar)를사용하여 매우 조심스럽게 고정시켰다. 소 뇌를 포함하는 관상 이미지를 다음 특성을 가지도록 수득하였다: T2 -강조, 192 x 192 메트릭스 크기를 가지는 고속 스핀 에코 샷 시퀀스， 해상도 19.2 x 19.2 mm ² , TR/TE = 3 ,000/70 ms , NEX = 6， 어떤 절편사이간격도 없는 절편 두께 1.0 mm.

전체 뇌에 대한 뇌실의 퍼센트 부피비를 평가하기 위해, 각 마우스 당 9 개의 관상 를 수득하였다. 파라비전 2.0.2 소프트웨어 (Bruker , BioSpin, Kar l sruhe , Germany)를 사용하여 맹검 방법에서 연속적인 이미지들의 윤곽을 그 리는 것에 의해 수동적으로 퍼센트 부피비를 추정하였다. 각 이미지에서 전체 뇌 와 뇌실의 경계선들의 윤곽을 도시하였고, 이에 상응하는 면적을 위의 소프트웨 어를 이용하여 계산하였다. 뇌 실질 면적을（측뇌실 면적/전체 뇌 면적）으로 계산 하였다. 이러한 결과를 도 5 및 표 2에 나타내었다.

결과

헌터증후군 중 중추신경계 퇴행증을 동반하는 환자의 경우 뇌 실질비대증 을 동반한다. 동일하게 헌터증후군 마우스（1此 또0 마우스）에서도 뇌 ^1 촬영으 로 뇌 실질비대증을 확인할 수 있었다. 본 시험예에서 1 10 마우스 중 비치료 군의 뇌 실질비대증이 본 발명의 투여에 의해 완화되는지 여부를 검증하였고, 실 시예는 미치료군인 비교예 1에 비하여 뇌 실질이 크게 감소한 것을 확인할 수 있 었다.

【표 2]

[시험예 4] 세포성 공포화에 대한 억제 효과 평가

각 분류군 마우스를 부검할 당시， 마우스 뇌 조직 중 소뇌, 숨뇌 （medul la）, 시상, 및 피질의 일부를 조직염색 목적으로 수거하여 4 % 파라포름알 데하이드 용액（南 바이오세상）으로 하룻밤 동안 고정하고 파라핀에 가공한 후 포 매하였다. 4 y m 두께의 절편들을 헤마톡실린/에오신（H&E） 염색을 위해 준비하 였다.

헤마톡실린/에오신 염색

각 분류군 마우스로부터 수거한 뇌 조직 절편에 대해 헤마톡실린/에오신 염색을 수행하였다.

구체적으로 뇌 조직 절편이 고정된 슬라이드를 크실렌 용액에 담가 슬라 이드의 파라핀을 제거 한 후, 100% 에탄올로부터 낮은 농도의 에탄올에 순차적으 로 슬라이드를 담가 크실텐을 제거하였다. 그런 뒤 흐르는 물에 세척한 후 슬라 이드를 헤마톡실린 용액에 5분 내지 8분 동안 담가 염색하였다. 염색 후 흐르는 물로 슬라이드를 세척하고, 1% 염산에 잠시 담근 후， 흐르는 물로 다시 세척하 고, 1% 암모니아 용액에 담근후， 다시 흐르는 물로 세척하였다. 그런 뒤 에오신 용액에 2분 동안 담가 염색 후 에탄올 용액으로 탈수하고， 크실텐으로 봉입하였 다.

염색된 슬라이드를 ScanScope AKaper io , Lei ca, German)장치로 스캔한 후, ImageScope ( aper i o , Leica, German)장치로 분석하여 조직병리학적 형태 평가 를 수행하였으며， 스캔한슬라이드사진을도 6에 나타내었다.

결과

헤마톡실린/에오신 염색 결과 헌터증후군 마우스의 경우 뇌의 전반에서 글리코스아미노글；리칸 (glycosaminoglycans ; GAGs) 죽적에 따른 구조적인 파괴가 진행중 임을 확인하였다. 구체적으로 대조예 마우스와 비교하여, 헌터증후군을 가지는 비교예 1 마우스에서는 리소좀 축적병의 전형적인 표식인 세포성 공포화 가 마우스의 뇌 전체에서 발견되었다 (도 6 참조) . 이러한 세포성 공포화는 도 6 의 대조예 1에 대한 염색슬라이드 사진에 화살표로 표시하였다. 반면 본 발명에 따른 투여 후 헌터증후군을 가지는 실시예 마우스에서는 화살표로 표시된 부분에 서 세포성 공포화가광범위하게 감소함을 확인할수 있었다.

[시험예 5] LAMP2단백질 발현에 대한 억제 효과평가

면역조직화학 염색

시험예 4에서 준비한 각 분류군의 뇌 조직 절편을， 일차항체인 항- LAMP- 2 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 염색하였고， DAB 방법으로 발색하여 LAMP2 단백질의 발현을 가시화 하였다. LAMP2 단백질은 리소좀 연관 막 단백질로 서, 리소좀 활성의 지표로 활용된다. DAB 방법으로 발색한 뒤， 뇌 조직 절편을 헤마톡실린으로 LAMP2단백질 양성 세포와핵을 반대염색 하였다.

구체적으로 4 u m 두께의 조직 절편을 10% 정상 염소 혈청 (normal goat serum) (Dako, Carpinter ia, CA, USA)에 20분 동안 실온에서 방치하고, 이푸 항 lamp-2 항체와 1 : 100의 비율로 30분 동안 실온에서 방치하고, PBS로 수 차례 세 척하였다. 그런 뒤 HRP-표지되고 중합체 접합된 2차 항체에 30분 동안 실온에서 방치하였다. 3, 3 -디아미노벤지딘 기질-발색체 용액 (Dako , Carpinter i a, CA, USA) 에 5분 동안 방치하고, 물로 세척하였다. 그런 뒤 헤마톡실린으로 핵 염색을 수 행하였다.

염색된 슬라이드를 ScanScope AKaper io, Lei ca, German)장치로 스캔 한 후， ImageScope(aper io, Leica, German)장치로 분석하여 조직병리학적 형태 평가 를수행하였으며， 스캔한슬라이드사진을도 7에 나타내었다.

결과

도 7에 다르면 헌터증후군을 가지는 비교예 1 마우스의 경우 대조예 마우 스에 비해 뇌 세포와 혈관주위 세포들에서 리소좀 활성 및 질환상태 표지 인자 인 LAMP2 단백질의 발현이 현저히 높음을 확인할수 있었다. 반면， 본 발명에 따 른 투여 후， 헌터증후군을 가지는 실시예 마우스에서는 뇌 조직 전반에 걸쳐 LAMP2단백질 발현이 현저히 억제된 것을 확인할수 있었다.

[시험예 6-7] 뇌기능 개선 평가를 위한마우스 행동 평가

본 발명의 투여가 실제 뇌기능에 미치는 영향을 확인하기 위해 동물 행동 평가중 학습 기억 능력 ( learning memory) 평가용 테스트인 공포환경 시험 ( fear condi t ioning test )과 개방 영역 시험 (Open f ield test )를 수행하였다. 이 두 가 지 행동 평가 항목은 설치류와 같은 소동물의 탐색 능력이나 움직임， 충분히 예 상되는 환경적 변화에 대한 대처 정도를 평가함으로써 전반적인 뇌기능을 평가할 수 있다. 각시험의 수행 방법 및 결과는 아래와 같다.

[시험예 6] 공포조건화시험 (Fear condi t ioning test )

시험예 1의 대뇌 측뇌실 내 투여 이후 (1회차， 3회차， 6회차 투여 이후) 2 주 내지 3주째에， 각 분류군에 속하는 마우스의 공포 기억을 다음과 같은 공포 조건화 시스템 (Coulbourn instruments사)을 사용하여 평가하였다: 평가 1 일차 에, 공포 조건화 챔버에서 조건적 자극으로 30초 동안의 청각적 신호 (80 dB, 3600 Hz 음색 (tone) )와 비조건적 자극으로 2초 동안의 사지충격 (foot-shock; (0.6 mA 직류)을 이용하여 마우스를 자극하였다. 24시간 후인 평가 2 일차에, 마우스 를 동일한 점버에 다시 넣고 300초 동안 40 Hz 빈도수 (0.75초당 30 프레임)로 비 디오-녹화하여 연상적 기억을 평가하였다. 연상적 기억 평가로부터 1시간 이후 마우스의 단서 기억을 평가하기 위해, 마우스를 새롭고 모습이 다른 첨버에 넣고 청각적 신호 자극을주었다. 마우스의 움직임을 마찬가지로 300초 동안 40 Hz 빈 도수 (0.75초당 30프레임)로 비디오-녹화하였다. 녹화된 비디오를 움직임 지수 및 움직임의 상대적 부재를 자동적으로 계 산하는 프리즈 프레임 소트프웨어 버전 3.32를 이용하여 사후 분석하였다. 마우 스가 0.75초 또는 2초 발작 보다 길게 움직임의 상대적 부재를 나타내는 경우를 동결반응 기간 ( freezing durat ion)으로 계수하고, 이를 전체 관찰 기간 (300초)로 나누었다. 이를 백분율로 나타내어 연상적 조건화 (contextual condi t ioning)와 단서 의존 조건화 (cue-dependent condi t ioning) 항목에 대한 그래프를 도 8에 도 시하고 구체적인 결과값을 표 3에 기재하였다.

【표 3】

결과

도 8에 따르면 투여가 진행될수록 실시예 마우스는 비교예 1 마우스에 비 하여 학습 기억능력에서 현저하게 우월한 것을 확인할 수 있다. 실시예 마우스는 최종 6회 투여 후, 거의 정상 마우스에 가까운 학습 기억능력을 나타낼 정도로 뇌기능이 개선되었다. 시험이 진행되는 공간에서의 연상 기억 (시청각 기억 평가) 을 측정하는 ’연상적 조건화’ 항목과 반복된 공포 자극에 대한 공포 기억을 평가 하는 ’단서 의존 조건화’ 항목 모두 3회 투여 시점부터 뚜렷하게 나아짐을 알 수 있다（도 8 및 표 3 참조）.

[시험예 7] 개방 영역 시험

시험예 1의 대뇌 측뇌실 내 투여 이후（1회차， 3회차, 6회차 투여 이후）， 각 분류군 마우스의 탐색적 활동을 다음과 같은 개방 영역 시험을 통해 평가하였 다: 마우스를 불투명한 벽（높이 15.0 cm）으로 막힌 상부-개방 아레나（open-top arena； 44.5 cm x 44.5 cm）에서 탐색하게 하고， 이를 20분 동안비디오 녹화하였 다. 녹화된 비디오로부터 마우스의 탐험 거리, 움직임 속도， 휴식 시간, 중앙 영 역과 주변 영역에서의 머무름 시간， 각 지역에 진입한 횟수를 각각 분석하였다. 중앙 영역은 아레나 정중앙에 표시된 31.0 cm x 31.0 cm의 영역을 의미하며, 주 변 영역은 아레나에서 중앙 영역을 제외한 나머지를 의미한다. 각 분석 결과에 대한 그래프를 도 9에 도시하고 구체적인 결과값을 표 4에 기재하였다.

결과

헌터증후군 마우스는 보통 과행동（hyperact ivi ty） 특성을 보이는 것으로 알려져 있다. 이는 본 발명의 개방 영역 시험 결과에서도 확인되었다. 20 분간 관찰한 결과, 전체 구간을 움직인 거리의 총합（즉, 수평이동거리（Hor i zontal path di stance））이 비교예 1 마우스에서 꾸준히 증가하였다. 그러나 실시예 마우 스의 경우 움직인 거리의 총합이 감소하여 과행동 특성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 동일한 의미에서 움직이지 않는 휴식 시간 역시 비교예 1 마우스에서 는 감소하는 추세를 나타내었으나, 실시예 마우스는 높게 나타났다.

설치류는 특정 공간 내의 정중앙 보다 조류 등의 포식자로부터 보호가 쉬 운 측면을 선호하는 본능이 있다. 따라서 개방 영역 시험에서， 준비된 공간의 중 앙 영역 보다는 주변 영역을 탐색하는 것이 일반적인 행동 특성임에 반해， 비교 예 1 마우스의 경우 나이가 듦에 따라 중앙 영역에 진입하는 횟수와 시간이 증가 하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 실시예 마우스는 정상 마우스인 대조예와 유 사한 경향을 나타내었다.

【표 4]

2019/231260 1»（：1/10公019/006515