Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einem Flüssigkeitsvolumen und zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe.

Die Detektion von Zielsubstanzen, insbesondere von biologischen Zielsubstanzen, spielt in der Flüssigkeits-Analytik eine wichtige Rolle. Zu detektierende bzw. zu überwachende Zielsubstanzen können Biomoleküle, wie beispielsweise eukaryotische Zellen, prokaryotische Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren, Toxine, Antikörper oder auch Nukleinsäuren oder Proteine sein. Zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Zielsubstanzen in aus einer zu untersuchenden Flüssigkeit entnommenen Proben werden Analyseverfahren angewendet. Hierzu stehen manuell oder automatisiert bzw. zumindest teilautomatisiert durchführbare Laborverfahren oder vollständig automatisiert arbeitende Analysegeräte zur Verfügung. Zu den automatisiert arbeitenden Analysegeräten gehören auch Online-Analysegeräte, die kontinuierlich oder diskontinuierlich Proben aus der zu überwachenden Flüssigkeit entnehmen und eine qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz durchführen.

Bei geringen Konzentrationen der Zielsubstanz in der zu analysierenden Flüssigkeit stellt sich das Problem, bei der Probennahme eine für die anschließende Analyse ausreichende Menge der Zielsubstanz zur Verfügung zu stellen. In manchen Anwendungen liegt die Zielsubstanz in einer unbehandelten Flüssigkeitsprobe in einer Konzentration vor, die zu gering für die nachfolgende Bearbeitung oder Analyse ist. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit einer Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der Probe. Als Beispiel hierfür sei der Nachweis von Biomolekülen in Wasser oder Abwasser, z.B. der Nachweis von SARS-CoV-2 in Wasser mittels molekulargenetischer Techniken wie PCR oder Real Time PCR, genannt. Die Konzentrationen der nachzuweisenden Viruspartikel oder von viralen Fragmenten im Abwasser ist häufig zu gering, als dass man sie mittels der dem Fachmann bekannten Methoden nachweisen kann. Reicht bei der Untersuchung von Blutproben auf das Vorliegen einer Virusinfektion ein Volumen von 200 pl aus, so ist das erforderliche Probenvolumen bei der Untersuchung von Wasser/Abwasser deutlich größer. In der Literatur werden Ausgangsmengen von bis zu mehreren Litern beschrieben.

Die Aufkonzentrierung von Zielmolekülen in einem Flüssigkeitsvolumen spielt nicht nur für die Vorbereitung von Proben für molekulargenetische Analyse-Techniken eine wichtige Rolle, sondern gleichermaßen auch für alle immunologischen Technologien und spektroskopischen Technologien, wie beispielsweise Molekülspektroskopie oder Massenspektroskopie.

Die Aufkonzentrierung von Zielsubstanzen, insbesondere Biomolekülen, in einem Flüssigkeitsvolumen spielt außerdem eine Rolle bei der Erzeugung von die Zielsubstanzen bzw. Biomoleküle umfassenden Rohprodukten oder Produkten, die für die weitere Verwendung für Forschungszwecken, zu industriellen Zwecken oder für therapeutische Zwecke dienen.

Im Stand der Technik sind für die Anreicherung von Viren oder subzellulären Partikeln aus einer biologischen Probe verschiedene Techniken bekannt, z.B. Ultrazentrifugationstechniken oder die Technik der Ultrafiltration. Diese Methoden sind zeitaufwändig und verhältnismäßig teuer. Alternative Verfahren bestehen in der Präzipitation von Viruspartikeln mittels Polyethylenglycol/Natriumchlorid und einer nachfolgenden Zentrifugation (Yamamoto et al., Virology 40 (1970) 734; Morandi et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 1543-1538). Dabei nutzt man verschiedene Mischungen von PEG und Natriumchlorid und mischt diese Reagenzien mit der biologischen Probe. Nachfolgend wird der Ansatz bei Kälte längere Zeit inkubiert und nachfolgend werden die Virus- (Protein)-NaCIZPEG- Präzipitate durch Zentrifugation gewonnen. Auch diese Verfahren sind aufwändig und benötigen viel Zeit. Problematisch ist darüber hinaus die Weiterbearbeitung der Präzipitate für die Isolierung der viralen Nukleinsäuren. Oftmals lassen sich die Präzipitate nur sehr schwer wieder in Lösung bringen. Dies beeinflusst die Effizienz und die Qualität der Nukleinsäureisolierung erheblich.

Aus US 2015/0224502 A1 ist ein Probensammel-Gerät für die Durchfluss-Probennahme in Gewässern bekannt. Hier wird zur Aufkonzentrierung von in Gewässern in geringer Konzentration vorliegenden Zielsubstanzen der Weg gegangen, die Zielsubstanzen in einem Filter oder Adsorptionsmedium zurückzuhalten und die am Filter adsorbierten Substanzen für eine nachfolgende Analyse durch Elution oder als Lysat freizusetzen und einem Analysemodul zur Verfügung zu stellen. Auch dieses Verfahren ist apparativ aufwändig und nicht universell einsetzbar.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches, schnelles und universell einsetzbares Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem Volumen einer Probeflüssigkeit, die die mindestens eine Zielsubstanz enthält, für die nachfolgende Analyse oder als Rohprodukt oder Produkt für die nachfolgende Verwendung für Forschungszwecke, für therapeutische Zwecke oder für industrielle Zwecke, z.B. zur Produktherstellung, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird in überraschend einfacher und universell anwendbarer Weise mittels des in Anspruch 1 definierten Verfahrens gelöst. Gleichermaßen wird die Aufgabe mittels des in Anspruch 2 definierten Verfahrens gelöst. Die Aufgabe wird auch durch die in Anspruch 18 angegebene Verwendung und das in Anspruch 20 angegebene Kit gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit durch Aufkonzentrierung der mindestens einen Zielsubstanz in dem ersten Flüssigkeitsvolumen, umfasst: - Zugeben eines Superabsorbers zu dem ersten Flüssigkeitsvolumen oder Zugeben des ersten Flüssigkeitsvolumens zu dem Superabsorber,

- Inkubieren des aus dem Superabsorber und dem Flüssigkeitsvolumen gebildeten ersten Gemisches, und

- Entnehmen einer Probe des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils des ersten Gemisches.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit umfasst:

- Zugeben eines Superabsorbers zu dem ersten Flüssigkeitsvolumen oder Zugeben des ersten Flüssigkeitsvolumens zu dem Superabsorber,

- Inkubieren des aus dem Superabsorber und dem ersten Flüssigkeitsvolumen gebildeten ersten Gemisches, insbesondere bis zum im Wesentlichen vollständigen Verschwinden des flüssigen Anteils des ersten Gemisches,

- danach Zugeben eines zweiten Flüssigkeitsvolumens einer wässrigen Lösung zum verbliebenen Superabsorber oder Zugeben des verbliebenen Superabsorbers zu dem zweiten Flüssigkeitsvolumen und somit Erzeugen eines zweiten Gemisches aus dem Superabsorber und dem zweiten Flüssigkeitsvolumen, und

- Entnehmen einer Probe des flüssigen Anteils des zweiten Gemisches.

Das aus dem Superabsorber und dem zweiten Flüssigkeitsvolumen gebildete zweite Gemisch kann vor dem Entnehmen der Probe des flüssigen Anteils des zweiten Gemisches inkubiert werden, beispielsweise um einen bestimmten Konzentrationsbereich der Zielsubstanz oder ein bestimmtes Volumen des flüssigen Anteils einzustellen.

Die bei diesem Verfahren nach dem Inkubieren des ersten Gemisches zugegebene wässrige Flüssigkeit kann beispielsweise einen Lysepuffer umfassen.

Das Inkubieren des aus dem Superabsorber und dem ersten Flüssigkeitsvolumen gebildeten ersten Gemisches kann bis zu einer starken Reduzierung des flüssigen Anteils des ersten Gemisches durchgeführt werden. Dabei kann der flüssige Anteil auch vollständig verschwinden oder zumindest so weit reduziert werden, dass mittels einer Pipette oder eines Tupfers keine Flüssigkeit mehr aus dem Gemisch aufnehmbar ist.

Bei beiden erfindungsgemäßen Verfahren wird eine mindestens eine Zielsubstanz enthaltene Probe erzeugt, die nachfolgend analysiert und/oder als Rohprodukt oder Produkt in einem Prozess oder Verfahren weiterverwendet werden kann. Hier und im Folgenden ist mit dem Begriff Probe daher ein, beispielsweise flüssiges, Stoffvolumen bezeichnet, das die Zielsubstanz in einer bei der erfindungsgemäßen Erzeugung der Probe beeinflussbaren oder einstellbaren Konzentration enthält. Die Probe kann somit nicht nur für eine anschließende Analyse zur Verfügung stehen, sondern sie kann auch als Rohprodukt oder Produkt für weitere Forschungszwecke oder auch zur, beispielsweise industriellen, Produktherstellung oder für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Solche als Rohprodukt oder Produkt dienende Proben können beispielsweise aufkonzentrierte Viren, Nukleinsäuren, Antikörper oder Proteine umfassen.

Superabsorber (auch: Superabsorbent Polymers, SAP) werden Kunststoffe genannt, die in der Lage sind, ein Vielfaches ihres Eigengewichts an polaren Flüssigkeiten aufzusaugen. Als zur Aufnahme durch den Superabsorber geeignete Flüssigkeiten kommen polare Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser bzw. wässrige Lösungen in Frage. Bei Aufnahme der Flüssigkeit quillt der Superabsorber auf und bildet ein Hydrogel. Hydrogele können alle vernetzten Polymere bilden, die polar sind, z.B. Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Amylopektin, Gelatine, Cellulose. Für die vorliegende Erfindung sind indes Kunststoffe, insbesondere die hier und im Folgenden genannten Kunststoffe, gegenüber biologischen Polymeren bevorzugt.

Geeignet für die Erfindung ist z.B. ein Copolymer aus Acrylsäure (Propensäure, H2C=CH-COOH) oder Natriumacrylat (Natriumsalz der Acrylsäure, H2C=CH-COONa) einerseits und Acrylamid andererseits, wobei das Verhältnis der beiden Monomere zueinander variieren kann. In Frage kommen auch weitere Polyacrylate oder andere auf Acrylsäure oder Acrylat als Monomer basierende Polymere oder Copolymere. Zusätzlich kann bei der Herstellung des Copolymers ein so genannter Kernvernetzer (Core-Cross-Linker, CXL) der Monomerlösung zugesetzt werden, der die gebildeten langkettigen Polymermoleküle stellenweise untereinander durch chemische Brücken verbindet (vernetzt). Durch diese Brücken wird das Polymer wasserunlöslich. Dieses sogenannte Basispolymer wird optional einer sogenannten Oberflächen-Nachvernetzung, (Surface-Cross-Linking, SXL) genannt, unterzogen. Dabei wird eine weitere Chemikalie auf die Oberfläche der Partikel aufgebracht, die durch Erwärmung ein zweites Netzwerk nur auf der äußeren Schicht des Korns knüpft. Diese Hülle stützt das aufgequollene Gel, um auch bei äußerer Belastung (Bewegung, Druck) zusammen zu halten.

Superabsorber in Form von Granulat kommt beispielsweise herkömmlich in Babywindeln, Monatshygiene-Produkten, bei der Inkontinenzversorgung und in Verbandmaterial zum Einsatz. Auch die Verwendung in Kabelummantelungen für Tiefseeleitungen ist bekannt. Weiter werden Superabsorber ais gelbildende Löschmittel in der Brandbekämpfung, als mechanische Stabilisatoren für Schnittblumen in einer Vase oder als Zusatz für Pflanzenerde für eine dauerhafte Wasserspeicherung verwendet. Hierbei kommt wegen der besseren Umweltverträglichkeit kalilaugeneutralisierte Acrylsäure zum Einsatz. In Form von kugelförmigen Partikeln ist die Verwendung von Superabsorbern unter Bezeichnungen wie „Wasserperlen“, „Aqua Beads“ oder „Water beads“ als Spielzeug bekannt. Hierbei handelt es sich um Superabsorber, welche in Form von Kügelchen von variablen Größen von Submillimetern bis Zentimetern kommerziell angeboten werden. Wie weiter unten noch ausführlicher beschrieben wird, hat sich überraschend gezeigt, dass während der Inkubation eines Gemisches aus einem derartigen Superabsorber und einer mindestens eine, insbesondere biologische, Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit zwar ein hoher Anteil der Flüssigkeit von dem Superabsorber aufgenommen wird, die Zielsubstanz aber im nicht vom Superabsorber aufgenommenen flüssigen Anteil verbleibt oder, bei im Wesentlichen vollständigem Verschwinden des flüssigen Anteils, an der Oberfläche des Superabsorbers verbleibt. Da die Zielsubstanzen, insbesondere biologische Zielsubstanzen, vom Superabsorber also nicht aufgenommen werden, ist die Konzentration der mindestens einen Zielsubstanz in einem nach Inkubation verbliebenen flüssigen Anteil des ersten Gemisches oder die Konzentration der Zielsubstanz in einer Lösung, die durch Zugeben einer wässrigen Lösung zum nach dem Inkubieren des ersten Gemisches verbliebenen Superabsorber gebildet wird, im Wesentlichen proportional zur Konzentration der Zielsubstanz in der ursprünglichen Probeflüssigkeit. Dies erlaubt eine quantitative Ermittlung der Konzentration der Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit anhand der nach den erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Probe. Dieser Effekt kann auch zu einer gezielten Einstellung einer gewünschten Konzentration der Zielsubstanz in einer Probe genutzt werden, die als Rohprodukt oder Produkt für weitere Forschungszwecke, Therapiezwecke oder eine Produktherstellung dient.

Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann das erste Flüssigkeitsvolumen eine polare Flüssigkeit, insbesondere als Hauptbestandteil, enthalten. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren kann das erste Flüssigkeitsvolumen ein polares Lösungsmittel, insbesondere als Hauptbestandteil, enthalten. Beispielsweise kann das erste Flüssigkeitsvolumen zu einem Massenanteil von mindestens 50 % aus einem polaren Lösungsmittel bestehen. Die polare Flüssigkeit bzw. das polare Lösungsmittel kann beispielsweise Wasser sein.

Die Zielsubstanz kann ein Biomolekül sein. Sie kann ausgewählt sein aus den folgenden Substanzen: eukaryotische Zellen, Bestandteile von eukaryotischen Zellen, prokaryotische Zellen, Bestandteile von prokaryotischen Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteile, Toxine, Antikörper, Nukleinsäuren und Proteine.

Wie erwähnt, kann der Superabsorber in einer vorteilhaften Ausgestaltung ein Kunststoff sein oder einen Kunststoff umfassen, der einen Anteil des Flüssigkeitsvolumens, z.B. ein in dem Flüssigkeitsvolumen enthaltenes polares Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser, unter Bildung eines Gels bzw. Hydrogels aufnimmt. Vorteilhaft ist der Kunststoff so ausgewählt, dass er im Wesentlichen keine Biomoleküle bzw. die weiter oben angegebenen Substanzen wie eukaryotische Zellen, Bestandteile von eukaryotischen Zellen, prokaryotische Zellen, Bestandteile von prokaryotischen Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteile, Toxine, Antikörper, Nukleinsäuren und Proteine aufnimmt. Der Superabsorber soll also die Zielsubstanz, z.B. Biomoleküle, nicht oder nur zu einem für den Zweck der Anreicherung der Zielsubstanz in der zu erzeugenden Probe vernachlässigbaren Anteil aufnehmen. Dies ist beispielsweise bei den erwähnten Superabsorbern aus den genannten Polymer- bzw. Copolymermaterialien, z.B. bei den kommerziell erhältlichen Wasserperlen, Waterbeads etc. der Fall.

Der Superabsorber kann in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln (kugelförmige Partikel), eingesetzt werden. Er kann dem Flüssigkeitsvolumen somit in Form solcher Partikel zugegeben werden oder das Flüssigkeitsvolumen kann dem Superabsorber in dieser Form zugegeben werden. Die Partikel oder Kugeln können einen Durchmesser zwischen 100 bis 5000 pm aufweisen.

Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Superabsorber um kommerziell erhältliche Superabsorber- Kugeln, beispielsweise um unter den Bezeichnungen „Aquabeads“, „Water Beads“, „Wasserperlen“, „Aquaperlen“, „Hydrokugeln“, „Gelkugeln“ erhältliche Superabsorber-Kugeln.

In einer vorteilhaften Verfahrensausgestaltung kann das Volumen des nach dem Schritt des Inkubierens verbleibenden flüssigen Anteils des oben erwähnten ersten und/oder zweiten Gemisches, und damit die Konzentration der Zielsubstanz im verbleibenden flüssigen Anteil, durch die zeitliche Dauer des Inkubierens, durch die Größe und Anzahl der dem Flüssigkeitsvolumen zugesetzten Superabsorber-Partikel oder Superabsorber-Kugeln aus dem Superabsorber, und/oder durch die während des Inkubierens herrschenden Temperatur gesteuert werden.

Die Erfindung umfasst außerdem eine Verwendung eines Superabsorbers zur Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere eines Biomoleküls, in einem Flüssigkeitsvolumen. Das Flüssigkeitsvolumen kann eine polare Flüssigkeit, insbesondere Wasser, enthalten, wobei der Superabsorber dazu eingerichtet ist, die polare Flüssigkeit, z.B. Wasser, bzw. mindestens einen Teil der polaren Flüssigkeit, unter Bildung eines Hydrogels aufzunehmen. Der Superabsorber kann aus den oben beschriebenen Materialien gebildet sein und in den zuvor beschriebenen Ausgestaltungen als Granulat oder, besonders bevorzugt, in Form von Kugeln, insbesondere kommerziell erhältlichen Wasserperlen, Water Beads oder Aqua Beads, verwendet werden. Die Verwendung kann das Zugeben des Superabsorbers zu dem Flüssigkeitsvolumen oder das Zugeben des Flüssigkeitsvolumens zu dem Flüssigkeitsvolumens und Inkubieren des so gebildeten Gemisches, wie weiter oben anhand der beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erläutert, umfassen. Die Verwendung kann außerdem die Steuerung einer Temperatur und/oder einer Inkubationszeit sein, um gezielt eine Konzentration oder einen Konzentrationsbereich der Zielsubstanz im flüssigen Anteil des Gemisches einzustellen.

Ganz allgemein beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Aufkonzentrierung eines Superabsorbers zur Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere eines Biomoleküls, in einem Flüssigkeitsvolumen durch Zugabe eines Superabsorbers zu dem Flüssigkeitsvolumen oder durch zugeben des Flüssigkeitsvolumens zu dem Superabsorber und Inkubieren. Eine nach dem Inkubieren aus dem verbliebenen flüssigen Anteil des Gemisches aus der Flüssigkeit und dem Superabsorber entnommene Probe kann zur weiteren Analyse oder zur weiteren Verwendung, z.B. in einem Produktionsprozess oder für therapeutische Zwecke oder zu Forschungszwecken dienen. Das Volumen der entnommenen Probe kann im wesentlichen dem Volumen des verbliebenen flüssigen Anteils entsprechen oder deutlich geringer als das Volumen des verbliebenen flüssigen Anteils sein.

Die Erfindung umfasst außerdem ein Kit zur Durchführung der voranstehend beschriebenen Verfahren und/oder Verfahrensvarianten. Das Kit kann den Superabsorber und weitere Substanzen und/oder Mittel zur Durchführung des Verfahrens umfassen. Das Kit kann beispielsweise mindestens ein Behältnis mit vorgelegtem Superabsorber umfassen, in das ein initiales Flüssigkeitsvolumen zur Aufkonzentrierung zugegeben werden kann.

Die gemäß den beschriebenen Verfahren bzw. gemäß der beschriebenen Verwendung erhaltene Probe kann manuell oder automatisiert einem Laborgerät für die weitere Behandlung oder Analyse zugeführt werden. Die weitere Analyse kann mittels molekulargenetischen Analyse-Techniken, immunologischen Technologien und spektroskopischen Technologien, z.B. Molekülspektroskopie oder Massenspektroskopie, sensorbasiert, z.B. mittels optischer oder elektrochemischer Sensoren, durch Kultivierung, Sequenzierung oder Durchflusszytometrie durchgeführt werden.

Die Erfindung beinhaltet entsprechend auch ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, umfassend: das Erzeugen einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit nach einem der voranstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren in einer der voranstehend beschriebenen Ausgestaltungen, und den qualitativen oder quantitativen Nachweis der mindestens einen Zielsubstanz in der Probe mittels mindestens einer der folgenden Methoden: Nukleinsäure-basierte Nachweisverfahren, Sequenzierungen, immunologische Nachweisverfahren, mikrobiologische Analysen, mikroskopische Verfahren, Massenspektrometrie, Sensor-basierte Nachweise und Durchflusszytometrische Techniken.

Wie in den voranstehend beschriebenen Verfahren und Verfahrensausgestaltungen kann die Zielsubstanz eine der weiter oben genannten biologischen Substanzen sein.

Nukleinsäure-basierte Nachweisverfahren können z.B. PCR-, Realtime PCR-, digitale PCR-basierte Verfahren oder Sequenzierung umfassen. Immunologische Nachweisverfahren können immunologische Assays wie ELISA oder Lateral Flowtests sein. Mikrobiologische Analysen können die Kultivierung lebender Zellen in der Probe umfassen. Sensor-basierte Nachweise können Nachweisverfahren mittels optischer, spektroskopischer oder elektrochemischer Sensoren umfassen.

In einer möglichen Ausgestaltung des Verfahrens oder der Verwendung kann die erzeugte Probe oder die weiter behandelte Probe in eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, eines automatischen Analysegeräts zur automatisierten Durchführung eines Nachweises der Zielsubstanz mittels molekulargenetischer Techniken wie PCR oder Real Time PCR gegeben werden. Dies kann manuell oder automatisiert erfolgen.

Die Erfindung beinhaltet auch einen Kit zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens einer Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit. Dieses Kit kann mindestens den Superabsorber in einer für das Verfahren geeigneten Darreichungsform sowie ggfs. weitere Chemikalien, wie z.B. Pufferlösungen oder Lyse-Puffer, beinhalten.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren und einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert. Diese Beispiele stellen keine Limitierung der erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren dar.

Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Flüssigkeit vor (a) und nach Zusetzen eines Superabsorbers in Form von Kugeln und Inkubieren (b);

Fig. 2 Amplifikationskurven verschiedener Proben aus Oberflächenwasser ohne Aufkonzentrierung und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 3 Amplifikationskurven verschiedener Proben aus Salmonellen enthaltendem Wasser ohne Aufkonzentrierung, nach Aufkonzentrierung mittels eines Filtrationsverfahrens und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 4 Amplifikationskurven verschiedener Proben aus MS2-Phagen RNA enthaltendem Wasser ohne Aufkonzentrierung, nach Aufkonzentrierung mittels eines Filtrationsverfahrens und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 5 eine gelelektrophoretische Darstellung genomischer DNA aus einer Wasserprobe ohne Aufkonzentrierung und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 6 eine gelelektrophoretische Darstellung der DNA eukaryotischer Zellen aus einer Wasserprobe ohne Aufkonzentrierung und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens; und Fig. 7 Amplifikationskurven verschiedener Proben von Wasser, das DNA in sehr geringer Konzentration enthält, ohne Aufkonzentrierung und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von Superabsorber-Kugeln unterschiedlicher Größen.

Der hier beschriebenen Erfindung lag folgende unerwartete Beobachtung zu Grunde. Kommerziell verfügbare sog. Wasserperlen (kommerziell unter anderem unter den Bezeichnungen Aqua Beads, Water Beads, Wasserbeads, oder Gelperlen erhältlich) wurden einem Flüssigkeitsvolumen von 1 Liter zugegeben. Diese Wasserperlen sind aus einem Superabsorber-Material gebildet. Bei der Flüssigkeit handelte es sich um Oberflächenwasser, das einem Löschwasserteich mit Schwebstoffen entnommen worden war. Nach einer Inkubationszeit quollen die Kügelchen zu einem Vielfachen ihres ursprünglichen Volumens auf. Das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Wasserperlen reduzierte sich. Überraschenderweise zeigte sich, dass die Schwebstoffe der Flüssigkeit von den aufquellenden Kügelchen nicht aufgenommen wurden. Der flüssige Anteil des Gemisches einschließlich der Schwebstoffe (Volumen 400 ml) wurde in ein neues Gefäß überführt. Diesem flüssigen Anteil wurde eine Probe mit einem Volumen von 50 ml entnommen.

Eine Vergleichsprobe mit einem Volumen von 50 ml wurde direkt aus der Flüssigkeit, d.h. dem erwähnten Oberflächenwasser, entnommen, ohne die Flüssigkeit zuvor nach dem beschriebenen Verfahren einzuengen. Beide Proben wurden bei 5000 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Sediment für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt. Die Nukleinsäureextraktion erfolgte mittels eines kommerziellen Kits (innuprep Stool DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). Die DNA von beiden Proben wurde dann mittels Real Time PCR auf die Menge an bakterielle Gesamtkeimzahl untersucht.

Hierbei zeigte sich, dass in der unbehandelten Vergleichsprobe weniger Bakterien nachgewiesen wurden als in der mit dem Superabsorber eingeengten Probe. Dies bedeutet, dass die in der Flüssigkeit enthaltenen Bakterien nicht in die Wasserperlen aufgenommen wurde. Sie wurden aufkonzentriert und waren Bestandteil des verbliebenen flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Superabsorber-Kugeln. Diese Beobachtungen konnten nachfolgend auch für andere Biomoleküle (Viren oder eukaryotische Zellen) bestätigt werden: Nach Zugabe des Superabsorbers zu einem diese Biomoleküle enthaltenen Flüssigkeitsvolumen wurde das Volumen eingeengt und die Biomoleküle wurden in der verbleibenden Restflüssigkeit aufkonzentriert. Noch überraschender war, dass man mit dem beschriebenen Verfahren auch Proteine sowie freie genomische DNA, die sich in geringen Konzentrationen in einer wässrigen Lösung befinden, aufkonzentrieren kann.

Die Verwendung von Superabsorbern zur Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere von Biomolekülen, in einer polaren Flüssigkeit als Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, zur Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der Flüssigkeit ist sehr einfach und universell einsetzbar. Ein geeignetes Verfahren ist anhand von Fig. 1 wie folgt kurz beschrieben:

1 . Zugabe eines Superabsorbers 2 zu einem Volumen einer, insbesondere wässrigen, Flüssigkeit 1 , oder alternativ: Zugabe der Flüssigkeit zu einem vorgelegten Superabsorber 2;

2. Inkubation des Gemisches aus der Flüssigkeit 1 und dem Superabsorber 2 zur Einengung (Volumenreduzierung) des flüssigen Anteils 3 des Gemisches; und anschließend

3. Überführung mindestens eines Teils des flüssigen Anteils 3 des Gemisches in ein neues Gefäß als Probe zur weiteren Bearbeitung. Die weitere Bearbeitung kann z.B. eine Nukleinsäurextraktion sein, eine Messung oder auch eine direkte Analyse mit unterschiedlichsten Technologien, wie NGS Anwendungen, immunologischen Technologien, spektroskopischen Technologien, molekülspektroskopischen- oder massenspektrometrischen Technologien etc.

Alternativ kann der überführte Teil des flüssigen Anteils auch als Produkt für weitere Forschungszwecke, für therapeutische Zwecke oder als Rohprodukt in einem Produktionsprozess verwendet werden.

Der Grad der Aufkonzentrierung und die Geschwindigkeit dieses Prozesses können sehr genau mittels der Art des eingesetzten Superabsorbers, mittels seiner eingesetzten Menge, oder mittels der Inkubationszeit und/oder der Inkubationstemperatur gesteuert werden.

Mit dem Verfahren kann damit das Problem der Bearbeitung von niedrigkonzentrierten Proben für eine weitere Bearbeitung der interessierenden Zielsubstanzen, insbesondere Biomolekülen, oder deren Nachweis einfach gelöst werden. Das Verfahren kommt ohne teure Geräte wie z.B. Ultrazentrifugen, teure Ultrafiltrationsmembranen, aufwändige Verfahren wie PEG-Fällungen oder generell Fällungsreaktionen zur Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren etc. aus. Darüber hinaus ist das Verfahren in Bezug auf die Zielsubstanzen, insbesondere für Biomoleküle, universell einsetzbar. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Superabsorber ungiftig und ungefährlich und oftmals auch biologisch abbaubar sind. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann damit die Untersuchung von niedrigkonzentrierten Biomolekülen stark vereinfacht werden.

Weitere Versuche zur Aufkonzentrierung von in einer Probeflüssigkeit enthaltenen genomischen DNA offenbarten aber noch einen weiteren Effekt. In diesen Versuchen wurde eine wässrige DNA-Lösung mit einem Volumen von 500 pl unter Zugabe einer Kugel aus einem Superabsorber-Material (kommerziell verfügbare Wasserperlen; Durchmesser ca. 1 mm) inkubiert. Mit zunehmender Inkubationsdauer reduzierte sich das Volumen der Probe und erhöhte sich die Konzentration der DNA. Der Prozess wurde war abgeschlossen, als das Volumen der Flüssigkeit de facto Null war. Dieses Ergebnis implizierte die Vorstellung des Verlustes der DNA. Umso überraschender war die Beobachtung, dass in einer durch Zugabe von 250 pl Wasser zur Kugel aus Superabsorber-Material und einem kurzen Schütteln des Gefäßes erzeugte Probe, DNA messbar war und zwar in ungefähr der doppelten Konzentration im Verhältnis zur Ausgangsprobe von 500 pl. Damit wurde gezeigt, dass die DNA nicht vom Superabsorber-Material aufgenommen wird, sondern sich an der Außenfläche der Kugel aus Superabsorber-Material angelagert hatte und nach Zugabe eines flüssigen Mediums wieder gewonnen werden kann. Damit ist es möglich, nicht nur Biomoleküle in einer Probeflüssigkeit mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aufzukonzentrieren, sondern nach kompletter Flüssigkeitsaufnahme durch den eingesetzten Absorber die Biomoleküle, in diesem Falle die DNA, durch Zugabe einer wässrigen Lösung, gezielt auf eine gewünschte Konzentration einzustellen.

Auf der Basis dieser Beobachtung zeigen sich noch weitere Möglichkeiten zur Nutzung von Superabsorbern zur Aufkonzentrierung von Biomolekülen. Zur Erzeugung einer für eine qualitative oder quantitative Analyse einsetzbaren Probe einer Probeflüssigkeit, die als qualitativ oder quantitativ zu bestimmende Zielsubstanz Biomoleküle wie eukaryotische Zellen, prokaryotische Zellen, Viren, Phagen oder subzelluläre Kompartimente enthält, kann das folgende Verfahren angewendet werden: Zunächst kann ein erstes Volumen der Probeflüssigkeit mit einem Superabsorber behandelt werden, derart, dass die gesamte Flüssigkeit vom Superabsorber aufgenommen wird. Vorzugsweise werden als Superabsorber die bereits beschriebenen sog. Wasserperlen eingesetzt. Nach Inkubation und kompletter Flüssigkeitsabsorbierung wird ein Lysepuffer zum Superabsorber gegeben und das so erzeugte Gemisch inkubiert. Die Art des Lysepuffers und/oder die Inkubationszeit können beliebig gewählt werden. Nachfolgend wird der Lysepuffer vom Superabsorber getrennt. Die so erhaltene flüssige Probe enthält die Zielsubstanz. Die als Zielsubstanz in der Probe enthaltenen Biomoleküle können ggfs. weiter lysiert werden. Nach der Lyse kann die Probe für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt werden. Unter der Voraussetzung, dass die Lyse bereits erfolgreich umgesetzt wurde, wird das Lysat ohne weitere Inkubation für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt.

Im Folgenden werden einige Ausführungsbeispiele der Erfindung genauer beschrieben.

Ausführungsbeispiel 1 : Einengen einer Schmutzwasserprobe mit einem Volumen von 1 Liter

Als Probeflüssigkeit wurde Schmutzwasser aus einem Feuerlöschteich eingesetzt. Es wurden zwei Volumen-Einheiten von jeweils 1 Liter der Flüssigkeit jeweils in eine Probenflasche überführt.

Für die Einengung wurden 50 g kommerziell unter der Bezeichnung „Water Beads“ erhältlicher Superabsorber-Kugeln mit einer Masse von ca. 0,006 g pro Kugel und einem Durchmesser von ca.

1 mm in eine der Probenflaschen zugegeben. Nach Inkubation wurde der verbliebene flüssige Anteil von ca. 650 ml in ein neues Gefäß überführt. Damit erfolgte eine Einengung des ursprünglich eingesetzten Volumens Probeflüssigkeit von 1000 ml auf 650 ml. Für den Nachweis, dass die Konzentration von Bakterien in der eingeengten Probeflüssigkeit erhöht werden konnte, wurden jeweils zwei Proben (Proben 1 und 2) mit einem Volumen von 10 ml der eingeengten Probeflüssigkeit und zum Vergleich zwei Proben der in der zweiten Probenflasche enthaltenen, nicht eingeengten Probeflüssigkeit (Proben 3 und 4) in einem 15 ml Reaktionsgefäß bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das resultierende Sediment-Pellet wurde nachfolgend zur DNA-Extraktion eingesetzt. Die DNA- Extraktion wurde mit einem kommerziellen Kit (innuPREP Stool DNA Kit; IST Innuscreen GmbH) durchgeführt. Die extrahierte DNA wurde mittels Real Time PCR zur Bestimmung der bakteriellen Gesamtkeimzahl eingesetzt. Als Nachweis-System wurde ein kommerzieller Kit verwendet (innuDETECT Bacteria Quantification Assay; IST Innuscreen GmbH).

Zur Bestimmung der Anzahl der Bakterien-Kopien in der Probe wurde die Standard-DNA aus dem Assay verwendet.

In Fig. 2 sind die Amplifikationskurven der Proben dargestellt. Die Kurven A (durchgezogene Linie) sind die Amplifikationskurven der drei Standards. Die Kurven B (lange und kurze Striche) sind die Amplifikationskurve der aus der eingeengten Probeflüssigkeit entnommenen Proben 1 und 2 dargestellt, und die Kurven C (gleich lange Striche) sind die Amplifikationskurve der aus der unbehandelten Probeflüssigkeit entnommenen Proben 3 und 4.

Die Tabelle 1 gibt die Ct-Werte und Kopienzahlen für die einzelnen Standards und Proben an.

Die Ergebnisse der Realtime PCR demonstrieren, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren eine ca. 3-fache Konzentrierung der Gesamtkeimzahl in der Probe nachzuweisen ist.

Tabelle 1 :

Ausführungsbeispiel 2: Nachweis von Salmonellen in Wasserproben

Als Probeflüssigkeit wurde Leitungswasser mit zugesetzten Salmonellen eingesetzt, wobei jeweils einem Volumen von 10 ml des Leitungswassers 1 x 10 ⁶ Salmonellen als Spike zugegeben wurde.

Aus einem solchen nicht eingeengten Probeflüssigkeitsvolumen wurden jeweils als Vergleichsproben zwei Proben (Probe 1 und 2) von je 200 pl entnommen. Zwei weitere Probeflüssigkeitsvolumina von 10 ml wurden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeengt. Für die Einengung wurden kommerziell unter der Bezeichnung „Water Beads“ erhältliche Superabsorber-Kugeln verwendet, die pro Kugel eine Masse von ca. 0,006 g und einen Durchmesser von ca. 1 mm aufweisen. Es wurden 40 Stück der „Water Beads“ in jedes der beiden Probeflüssigkeitsvolumina gegeben. Durch Inkubieren des so erhaltenen Gemisches wurde dessen flüssiger Anteil auf ein Volumen von ca. 500 pl eingeengt.

Von diesem flüssigen Anteil wurden 2 xje 200 pl für die nachfolgende DNA- Extraktion eingesetzt (Proben 3 bis 6).

Parallel dazu wurde ein weiteres Probeflüssigkeitsvolumen von 10 ml mit einem Standardverfahren unter Verwendung einer Filtrationsmembran bearbeitet. Dazu wurden das Probeflüssigkeitsvolumen über eine Filtermembran (0,45 pm MCE Membran; Millipore) unter Verwendung einer Vakuumpumpe filtriert. Der Filter wurde zerschnitten und mit 600 pl 1 x PBS-Lösung versetzt und in einem Lysis Tube unter Verwendung eines Homogenisators (SpeedMill, Analytik Jena GmbH) homogenisiert. Von der nach Homogenisierung erhaltenen Flüssigkeit von ca. 500 pl wurden ebenfalls zwei Proben mit einem Volumen von jeweils 200 pl für die DNA- Extraktion eingesetzt (Proben 7, 8).

Die DNA- Extraktion erfolgte mittels eines automatisierten Verfahrens auf dem Automaten KingFisher Flex (Thermo Fisher) und einem kommerziell verfügbaren Kit (deltaPREP AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH). Die extrahierte DNA wurde mittels Real Time PCR zum Nachweis der Salmonellen eingesetzt. Als Nachweis-System wurde ein kommerzieller Kit verwendet (innuDETECT Salmonella enterica Assay; IST Innuscreen GmbH).

In Fig. 3 sind die Amplifikationskurven der Proben dargestellt. Die Kurven A (lange und kurze Striche) zeigen die Verläufe der Amplifikationskurven der Proben 1 und 2 der nicht eingeengten Probeflüssigkeit. Die Kurven B (gleich lange Striche) sind die Amplifikationskurven der Proben 3 bis 6 der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeengten Probeflüssigkeit. Die Kurven C (durchgezogene Linie) sind die Amplifikationskurven der Proben 7 und 8, die durch filterbasierte Anreicherung gewonnen wurden.

Die Tabelle 2 gibt die Ct-Werte für die einzelnen Proben an.

Tabelle 2: Die Unterschiede der Ct -Werte zeigen rechnerisch eine 32-fache Konzentrierung der Ausgangsprobe hinsichtlich der Salmonellenzahl. Die Anreicherung der Bakterien auf einem Filter zeigt eine schlechtere Effizienz im Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Ausführungsbeispiel 3: Nachweis von MS2-Phagen RNA in Wasserproben

Als Probeflüssigkeit wurde Leitungswasser mit zugesetzten MS2-Bakteriophagen eingesetzt, wobei jeweils einem Volumen von 10 ml des Leitungswassers 5 pl einer MS2-Bakteriophagen Lösung (Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767) als Spike zugegeben wurde.

Aus einem solchen Probeflüssigkeitsvolumen wurden als Vergleichsproben zwei Proben (Probe 1 und 2) von je 200 pl entnommen. Zwei weitere Probeflüssigkeitsvolumina von jeweils 10 ml der Probeflüssigkeit wurden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeengt. Für die Einengung wurden kommerziell unter der Bezeichnung „Water Beads“ erhältliche Superabsorber-Kugeln verwendet, die pro Kugel eine Masse von ca. 0,006 g und einen Durchmesser von ca. 1 mm aufweisen. Es wurden 40 Stück der „Water Beads“ in jedes der beiden Probeflüssigkeitsvolumina gegeben. Durch Inkubieren des so erhaltenen Gemisches wurde dessen flüssiger Anteil auf ein Volumen von ca. 500 pl eingeengt. Von diesem flüssigen Anteil wurden 2 xje 200 pl für die nachfolgende Phagen-RNA- Extraktion eingesetzt (Proben 3 bis 6).

Parallel dazu wurde ein weiteres Probeflüssigkeitsvolumen von 10 ml mit einem Standardverfahren unter Verwendung einer Filtrationsmembran bearbeitet. Dazu wurde das Probeflüssigkeitsvolumen über eine Filtermembran (0,45 pm MCE Membran; Millipore) unter Verwendung einer Vakuumpumpe filtriert. Der Filter wurde zerschnitten und mit 600 pl 1 x PBS-Lösung versetzt und in einem Lysis Tube unter Verwendung eines Homogenisators (SpeedMill, Analytik Jena GmbH) homogenisiert. Von der nach Homogenisierung erhaltenen Flüssigkeit von ca. 500 pl wurden zwei Proben mit einem Volumen von jeweils 200 pl für die Phagen-RNA-Extraktion eingesetzt (Proben 7, 8).

Die Phagen-RNA-Extraktion erfolgte mittels eines automatisierten Verfahrens auf dem Automaten KingFisher Flex (Thermo Fisher) und einem kommerziell verfügbaren Kit (deltaprep AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH). Die extrahierte Phagen-RNA wurde mittels Real Time PCR zum Nachweis der MS2-Phagen-RNA eingesetzt. Als Nachweis-System wurde ein kommerzieller Kit verwendet (innuDETECT Internal Control DNA/RNA Assay; IST Innuscreen GmbH). Für die Reverse Transkription und Amplifikation der MS2-Phagen-RNA wurde ein kommerzieller OneStep- RT- Mastermix verwendet (innuDRY qRT-PCR MasterMix Probe; IST Innuscreen GmbH).

In Fig. 4 sind die Amplifikationskurven der Proben dargestellt. Die Kurven A (lange und kurze Striche) geben die Verläufe der Amplifikationskurven der Proben 1 und 2 der nicht eingeengten Probeflüssigkeit an. Die Kurven B (gleich lange Striche) sind die Amplifikationskurven der Proben 3 bis 6 der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeengten Probeflüssigkeit. Die Kurven C (durchgezogene Linie) sind die Amplifikationskurven der Proben 7 und 8, die durch filterbasierte Anreicherung gewonnen wurden.

Die Tabelle 3 gibt die Ct-Werte für die einzelnen Proben an:

Tabelle 3:

Die Unterschiede der Ct -Werte zeigen rechnerisch eine 50-fache Konzentrierung der Ausgangsprobe. Die filterbasierte Anreicherung scheint für die Anreicherung der Phagen nur sehr schlecht geeignet zu sein.

Ausführungsbeispiel 4: Aufkonzentrierung genomischer DNA in einer Wasserprobe und spektrophotometrische Messung

Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung genomischer DNA in einer Probeflüssigkeit eignet, wurde genomische DNA aus einer Blutprobe isoliert. Die DNA wurde in Wasser gelöst und die Konzentration der DNA auf 10 ng/pl eingestellt. Das Ausgangsvolumen der so hergestellten Probeflüssigkeit betrug 2 ml. Die Einengung erfolgte durch Zugabe von 10 Stück kommerziell verfügbaren „Water Beads“ (Masse pro Stück ca. 0,006 g; Durchmesser: ca. 1 mm). Das Volumen der Probeflüssigkeit wurde nach einer kurzen Inkubationszeit auf ein Restvolumen von 500 pl eingeengt und eine erste spektrophotometrische Messung zur Konzentrationsbestimmung der DNA in dem flüssigen Anteil des Gemisches durchgeführt. Nach Verlängerung der Inkubationszeit wurde der flüssige Anteil des Gemisches weiter bis auf 250 pl eingeengt und eine zweite spektrophotometrische Messung zur Konzentrationsbestimmung der DNA in dem flüssigen Anteil des Gemisches durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4:

Die Daten zeigen, dass nach der Aufkonzentrierung die gemessenen Werte bei nur geringer Abweichung den theoretischen Werten entsprechen.

Ausführungsbeispiel 5: Aufkonzentrierung genomischer DNA aus einer 2 ml Probe und Nachweis der Erhöhung der Konzentration auf einem Agarosegel

Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung genomischer DNA einer Probeflüssigkeit eignet, wurde genomische DNA aus einer Blutprobe isoliert. Die DNA wurde in Wasser gelöst und die Konzentration der DNA auf 10 ng/pl eingestellt. Das Ausgangsvolumen der so hergestellten Probeflüssigkeit betrug 2 ml. Aus diesem Ausgangsvolumen wurde eine erste Probe als Vergleichsprobe für die Gelelektrophorese entnommen. Die Einengung des Ausgangsvolumens erfolgte durch Zugabe von 10 Stück kommerziell verfügbaren „Water

Beads“ (Masse ca. 0,006 g; Durchmesser: ca. 1 mm). Der flüssige Anteil des so erzeugten Gemisches wurde nach einer kurzen Inkubationszeit auf ein Restvolumen von 250 pl eingeengt. Eine aus diesem Restvolumen entnommene zweite Probe wurde nachfolgend im Vergleich zur Ausgangsprobe auf einem Agarosegel dargestellt.

Fig. 5 zeigt die gelelektrophoretische Darstellung der DNA, wobei sich in der ersten Spur (1) die DNA- Leiter, in der zweiten Spur (2) die Vergleichsprobe und in der dritten Spur (3) die zweite Probe aus dem eingeengten Restvolumen befindet. Das Gelbild zeigt deutlich die stark erhöhte Menge an DNA nach der Einengung im Vergleich zur nicht eingeengten Probeflüssigkeit.

Ausführungsbeispiel 6: Anreicherung von eukaryotischen Zellen in einer Probeflüssigkeit und nachfolgende Extraktion der DNA aus diesen Zellen

Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung von in einer Probeflüssigkeit vorliegenden eukaryotischen Zellen eignet, wurden kernhaltige Zellen aus einer Blutprobe isoliert. Die Zellen wurden danach vollständig in einem Ausgangsvolumen von 2 ml Wasser resuspendiert. Vor der Aufkonzentration der Probeflüssigkeit wurden 200 pl der Ausgangs- Zellsuspension als Vergleichsprobe abgenommen und für eine DNA-Extraktion eingesetzt. Die Einengung der Probeflüssigkeit erfolgte durch Zugabe von 8 Superabsorber-Kugeln, die unter dem Namen „Water Beads“ kommerziell erhältlich sind und die eine Masse ca. 0,009 g und einen Durchmesser von ca. 2 mm aufweisen. Das Ausgangsvolumen der Probeflüssigkeit wurde nach einer kurzen Inkubationszeit auf ein Restvolumen von ca. 400 pl eingeengt. Von diesen ca. 400 pl wurden 200 pl als Probe entnommen und für die DNA-Extraktion eingesetzt.

Die DNA- Extraktion erfolgte mittels eines kommerziellen Kits (innuPREP DNA Mini Kit 2.0; IST Innuscreen GmbH). Die DNA wurde spektrophotometrisch gemessen und auf einem Agarosegel analysiert.

Die Ergebnisse der spektrophotometrischen Messungen und die ermittelte DNA-Menge in den jeweiligen Proben sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

Tabelle 5:

Fig. 6 zeigt die gelelektrophoretische Darstellung der DNA, wobei sich in der ersten Spur (1) die DNA- Leiter, in der zweiten Spur (2) die Vergleichsprobe und in der dritten Spur (3) die zweite Probe aus dem eingeengten Restvolumen befindet.

Die Daten zeigen, dass eukaryotische Zellen aus einer Probe mittels der erfindungsgemäßen Verfahren angereichert werden können. Die DNA ist von hoher Qualität.

Ausführungsbeispiel 7: Aufkonzentrierung einer Proteinlösung

Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung von Proteinen in einer Probeflüssigkeit eignet, wurde eine wässrige Albumin-Lösung hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde in der unbehandelten Ausgangslösung spektrophotometrisch bei 280 nm auf 11 ,8 mg/ml bestimmt. Es wurden unterschiedliche Aufkonzentrierungen vorgenommen. Dazu wurde jeweils ein Ausgangsvolumen von 100 pl der Proteinlösung in ein Reaktionsgefäß überführt und die Lösung jeweils mit einer Kugel kommerziell verfügbarer „Water Beads“ (Masse ca. 0,006 g; Durchmesser: ca. 1 mm) über unterschiedliche Zeiträume inkubiert. Dies führte zur Einengung der Ausgangslösung von 100 pl auf ca. 60 pl, ca. 40 pl sowie ca. 20 pl. Die so eingeengten Restvolumina wurden als einzelne Proben nachfolgend bei 280 nm gemessen und die Proteinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6:

Es zeigt sich, dass mittels des Verfahrens auch Proteine aufkonzentriert werden können und die Konzentrationen in Abhängigkeit von der Einengung kontinuierlich zunehmen.

Ausführungsbeispiel 8: Sensitivitätssteigerung der Real Time PCR nach Aufkonzentrierung einer Probe mit humaner DNA sehr geringer Konzentration

Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung von Lösungen mit sehr geringen Konzentrationen an DNA eignet, wurde eine Probeflüssigkeit mit humaner genomischer DNA in sehr geringer Konzentration hergestellt. Die DNA-Konzentration der Probe betrug 8 ng/pl, was ca. der Menge an genomischer DNA einer diploiden eukaryotischen Zelle entspricht. Für die Einengung wurden als Ausgangsvolumina jeweils 100 pl der Probeflüssigkeit eingesetzt. Zu einem ersten Ausgangsvolumen der Probeflüssigkeit wurde 1 Stück kommerziell verfügbarer „Water Beads“ (Masse ca. 0,006 g; Durchmesser: ca. 1 mm) und zu einem zweiten Ausgangsvolumen der Probeflüssigkeit wurde 1 Stück kommerziell verfügbarer „Water Beads“ (Masse ca. 0,009 g; Durchmesser: ca. 2 mm) gegeben. Nach kurzer Inkubation wurden die flüssigen Anteile der beiden Gemische auf ca. 10 pl eingeengt. Eine aus der nicht eingeengten Probeflüssigkeit entnommene Vergleichsprobe (Probe 1) und aus den aufkonzentrierten flüssigen Anteilen der beiden Gemische entnommene Proben (Probe 2-5) wurden in der Real Time PCR zum Nachweis einer humanspezifischen Targetsequenz (Single Copy Gen Östrogenrezeptor 1 , Inhouse-Methode) eingesetzt.

Die Amplifikationskurven der einzelnen Proben sind in Fig. 7 dargestellt. Die Kurven A (durchgezogene Linie) Farbe sind die Amplifikationskurven der Vergleichsprobe (Doppelbestimmung), die Kurven B (lange und kurze Striche) sind die Amplifikationskurven der Proben 2 bis 5.

Die Tabelle 7 gibt die Ct-Werte für die einzelnen Proben an. Tabelle 7:

Eine Probenentnahme aus der Ausgangslösung hat kein Amplifikationsergebnis gebracht, da die Konzentration der DNA zu gering war. Die DNA aus den eingeengten Proben konnte das Single Copy Gene detektieren, was den Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.

Ausführungsbeispiel 9: Erzeugung einer Probe durch Inkubation einer DNA-Lösung mit einem Superabsorber bis zur kompletten Flüssigkeitsaufnahme und nachfolgender Einstellung der Probenkonzentration durch Zugabe einer wässrigen Lösung

Als Probeflüssigkeit wurde eine DNA-Lösung mit einer Konzentration von 100 ng/pl hergestellt (lambda DNA). Zu 500 pl dieser DNA-Lösung wurden zwei kommerziell verfügbare „Water Beads“ (0,006 g; Durchmesser ca. 1 mm) zugegeben und das so erhaltene erste Gemisch inkubiert, bis der flüssige Anteil des Gemisches komplett verschwunden war. Danach erfolgte die Zugabe von 250 pl eines Puffers (10 mM Tris HCl, pH 8,5) zu den verbliebenen „Water Beads“. Das so erzeugte zweite Gemisch wurde mittels eines Vortex-Mischers durchmischt und anschließend der flüssige Anteil des zweiten Gemisches als zu analysierende Probe von den „Water Beads“ getrennt und spektrofotometrisch analysiert.

Die Tabelle 8 gibt die ursprüngliche DNA-Konzentration in der als Probeflüssigkeit dienenden, ursprünglichen DNA-Lösung und die spektrofotometrisch ermittelte Konzentation in der Probe an.

Tabelle 8:

Die Daten zeigen, dass die in der Probe nach Aufkonzentrierung und erneuter Resuspendierung ermittelte Konzentration mit nur geringer Abweichung den theoretischen Werten entsprechen. Ausführungsbeispiel 10: Aufkonzentrierung einer Probeflüssigkeit zum Nachweis eines Proteins (CRP) mittels eines immunologischen Nachweisverfahrens

Als Probeflüssigkeit wurde eine Verdünnung des C-reaktiven Proteins (CRP) in einer PBS-Pufferlösung verwendet. Der immunologische Nachweis des C-reaktiven Proteins in verschiedenen, aus der Probeflüssigkeit erzeugten Proben erfolgte mittels eines CRP-ELISA Kits von Bio-Techne GmbH (h C- Reactive Protein DuoSet, DY1707). Als Ausgangsprobe diente die Positive Standardkontrolle (humanes CRP) des Kits. Die Messungen wurde in einem ELISA Reader (Thermofisher) bei 405 nm durch geführt.

Aus der Ausgangsprobe wurden drei Lösungen (Proben 1 , 2 und 3) unterschiedlicher Konzentrationen an CRP erzeugt. Aus diesen Proben wurde jeweils ein erster Anteil von ca. 80 pl entnommen, mit 120 pl des Dilution Buffers des Kits verdünnt und auf die ELISA-Platte gegeben. Aus den Proben 1 , 2 und 3 wurde ein weiterer Anteil von jeweils 500 pl entnommen, mit jeweils 6 „Water Beads (0,006 g, Durchmesser 1 mm) versetzt und inkubiert, bis die so erhaltenen Proben 1A, 2A und 3A auf ein Volumen von ca. 70-80 pl eingeengt waren. Diese eingeengten Proben 1A, 2A und 3A wurden ebenfalls mit 120 pl des Dilution Buffers des Kits verdünnt und auf die ELISA-Platte gegeben. Die auf die ELISA-Platte aufgebrachten Lösungen aus Proben 1 , 2, 3, 1A, 2A und 3A wurden neben einer Standardreihe [S1-S4, je 200 pl] nach den Vorschriften des Herstellers semiquantitativ vermessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst.

Tabelle 9: Aufgrund der unzureichenden Bindungskapazität, Spannweite und Linearität der ELISA-Methode konnten die theoretisch erwarteten Proteinmengen nicht exakt gemessen werden. Die theoretisch berechnete Anreicherung betrug den Faktor 6,5. Die mittels ELISA gemessene Anreicherungsrate liegt zwischen 2,1 und 5,4.

Die Konzentration der nicht messbaren Probe 3 konnte in der aus Probe 3 durch Anreicherung erzeugten Probe 3A bestimmt werden. Damit zeigt sich, dass es mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich ist, ein spezifisches Zielprotein in einer Probeflüssigkeit aufzukonzentrieren und mittels ELISA nachzuweisen. Über die Aufkonzentrierung ist somit ein Sensitivitätsvorteil erzielbar.