以下、実施例を用いて、以上に説明した� ��施態様を具体的に説明するが、これは例示� ��あって、本発明をこの実施例に限定するも� ��ではない。

 <実施例1:CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞の選別>

 (1)細胞集団の調製
 材料は、呼吸器外科の手術時に余剰になっ� ��ヒト肋骨片を使用した。また、材料が不足� ��た場合には、Cambrex社より購入した骨髄(カ� �ログ番号:2M-125C,2M-125D)も使用した。

 まず、肋骨片(1cm×1cm)を、PBSで洗浄し、外科 用ハサミを用いて細かくきざんだ後、HBSS ⁺ (calcium- and magnesium-free Hanks-balanced salt soluti on supplemented with 2% FCS, 10 mM HEPES, and 1% p enicillin/streptomycin)に懸濁し、液体部分を吸引� ��て除去した。

 次に、残った骨片をハサミでさらに細かく� ��んだ後、その骨片を0.2%コラゲナーゼ溶液(Wa ko 032-10534 10mM HEPESと1% P/S)に入れ、振盪機� �、37℃で1時間インキュベートした。なお、� �ントロールとして、0.2%コラゲナーゼ溶液を� ��れないで残った骨片を処理し、同様の実験� ��行った。

 最後に、コラゲナーゼ処理したサンプルを� ��セルストレーナー(ファルコン2350)で濾過し� ��骨の破片を除去した後、得られた細胞懸濁� ��を4℃で7分間遠心分離(×1200rpm)した。遠心分 離後、細胞集団に混入している赤血球を除去 するため、ペレットに1mlの水(SigmaW3500)を入れ て5~10秒間攪拌した後、レスキュー溶液(4%FBS� �2×PBS Sigma D1408)に再懸濁した。このサンプ� �を再度セルストレーナーで濾過し、赤血球� �破片を除去し、ヒト骨髄細胞懸濁液を得た� �

 なお、Cambrex社より購入した骨髄は、液体窒 素にて凍結された状態で保存し、実験ごとに 解凍して使用した。はじめに、HBSS ⁺ 溶液にDNaseIを加えた溶液(以下、DNaseI HBSS ⁺ 溶液とする)を37℃の恒温槽にて温めた。凍結 骨髄(2M-125C、2M-125D)が入ったバイアルを37℃の 恒温槽につけ、最後のひとかけらが残るくら いまで(約1、2分間)すばやく解凍した。骨髄� �胞をDNaseI HBSS ⁺ 溶液にて懸濁し15ml遠沈管に移した。さらに� �ータルボリュームが10mlになるまでDNaseI HBSS ⁺ 溶液加え、室温で7分間遠心分離(×1200rpm)した 。遠心分離後、細胞ペレットを崩さないよう にピペットで上清を除去し、新たなDNaseI HBSS ⁺ 溶液1mlで再懸濁し、ヒト骨髄細胞懸濁液を得 た。

 (2)抗体反応

 上記方法によって得られたヒト骨髄細胞懸� ��液を、2.5~5×10 ⁷ cells/mlの濃度になるようにHBSS ⁺ に懸濁した。

 次に、ヒト骨髄細胞2.5~5×10 ⁷ cellsに対して、1倍希釈FITC標識抗ヒトCD45抗体( DAKO)を50μl、1倍希釈FITC標識抗ヒトCD235a(Glycopho tinA)抗体(DAKO)を50μl、1倍希釈PE標識抗ヒトCD271 (low-affinity nerve growth factor receptor)抗体(Milten yi Biotec)を50μl、及び1倍希釈APC標識抗CD90(Thy-1 )抗体(BD Biosciences Pharmingen)を50μl加え、氷上� ��て30分間反応させた。

 反応後、上記細胞懸濁液に10ml HBSS+を加え� �その懸濁液を4℃で7分間遠心分離(×1200rpm)し� ��。上清を捨てて得られたペレットに2μg/ml p ropidium iodide (PI)(Sigma Chemical Co.)含有HBSS+を� �れ、1×10 ⁷ cell/mlの濃度になるように懸濁した。この懸� �溶液に対し、滅菌した60mm以下のナイロンメ� ��シュフィルター(Miltenyi Biotec)を用いて、懸� ��液中の細胞塊をとり除き、得られた細胞浮� ��液を以下のフローサイトメトリーによる解� ��(FACS解析)に使用した。

 なお、上記抗体の細胞への非特異的な結合� ��検定するためのコントロールには、FITC標識 抗MouseIgG1,kappa抗体(eBioscience)、PE標識抗 Mouse  IgG1 抗体(eBioscience)、APC標識抗 MouseIgG1,kappa抗 体(eBioscience)を用いた。

 (3)ヒト間葉系幹細胞の分画

 抗体と反応させた骨髄細胞を、各抗体の反� ��性によりFACSを用いて分画した。FACSには、48 8nmアルゴンレーザー、600~650nm REDレーザーが� ��載されているMoFlo及びFACS Vantageを使用した� ��

 まず、1×10 ⁵ イベント分のデータを取り込み、PI陽性細胞� ��ゲートアウト(図1(a))した。次にCD45 ^- CD235a ^- 分画にゲート(図1(b))を設定した。最後に、横 軸をCD90 (Thy-1)と、縦軸をCD271 (LNGFR)とし、共 陽性分画にゲートを設定した。その後、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ^- 細胞、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ^- CD90 ⁺ 細胞、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ^- CD90 ^- 細胞、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ 細胞、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ^- 細胞、CD45 ^- CD235a ^- CD90 ⁺ 細胞、CD45 ^- CD235a ^- CD90 ^- 細胞に分画し、これらの細胞を回収した。な お、非血球細胞数に対して、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞は0.04%、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ^- 細胞は1.73%、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ^- CD90 ⁺ 細胞は0.1%、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ^- CD90 ^- 細胞は98%であった(図1(c)を参照のこと)。

 <実施例2:CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞の機能解析>

 (1)コラゲナーゼ処理の効果

 まず、コラゲナーゼ処理を行った細胞懸濁� ��及びコラゲナーゼ処理を行わない細胞懸濁� ��を用い、ソーティングによって得られたCD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞分画の細胞を増殖培養液(DMEM: GIBCO11885 +  20%FBS:Hyclone +b FGF+10mM HEPES +1%P/S)に懸濁し� �。そのうち、96穴培養皿のウエルあたり、5× 10 ³ 、1×10 ⁴ 、1×10 ⁵ 個の細胞を播種し、37℃ 5%CO ₂ インキュベーターにて培養した。4日後に培� �上清を除去し、新しい増殖培養液を入れた� �培地交換は3~4日ごとに行なった。10日後、細 胞がコンフルエントになったウエルを数え、 その割合を図2に表した。

 その結果、いずれの細胞密度においても、� ��髄をコラゲナーゼ処理することにより、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞は、高い回収率で回収された。

(2)CD271 ⁺ CD90 ⁺ 選別の効果
 実施例1に示す各分画に対して、増殖培養液 (DMEM: GIBCO11885 + 20%FBS:Hyclone +b FGF+10mM HEPES  +1%P/S)に懸濁した細胞100~8000個を35mm培養皿に� �種し、37℃ 5%CO ₂ インキュベーターにて培養した。4日後に培� �上清を除去し、新しい増殖培養液を入れた� �培地交換は3~4日ごとに行なった。10日後、位 相差顕微鏡にて培養皿を観察し、50個以上の� ��胞からなるコロニーをカウントした。この� ��うにして、播種した細胞の個数のうち、い� ��つの細胞がコロニーを形成したかを測るこ� ��により、CFU-F(線維芽細胞コロニー形成単位) 活性を有する細胞の頻度を比較した。なお、 WBM(whole bone marrow)とは全骨髄細胞を示す。

<表1>

 その結果、表1に示す通り、CD90 ⁺ 細胞のみ、あるいはCD271 ⁺ 細胞のみによる選別に比べ、CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞による選別によって、CFU-F(線維芽細胞コ ロニー形成単位)活性を有する細胞は、それ� �れ約50倍及び約27倍濃縮できることが分かっ� ��。一方、WBM、CD90 ^- 細胞のみ、CD271 ^- 細胞のみによる選別では、CFU-F活性を有する� ��胞は認められなかった。また、WBM100000個を1 00mm培養皿に、CD90 ^- 細胞300000個をT75培養フラスコに、CD271 ^- 細胞240000個をT75培養フラスコに播種して、上 記と同様の実験を行ったが、CFU-F活性を有す� ��細胞は認められなかった。

 さらに、文献(Aslan H, Zilberman Y, Kandel L, e t al. Osteogenic differentiation of noncultured immuno isolated bone marrow-derived CD105 ⁺  cells. Stem Cells. 2006;24:1728-1737.、及びQuirici  N, Soligo D, Bossolasco P, et al. Isolation of bone  marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth  factor receptor antibodies. Exp Hematol. 2002;30:783-79 1.)に記載の数値と比較しても、CD105 ⁺ 細胞のみ(Aslan H, Zilberman Y, Kandel L, et al.  Osteogenic differentiation of noncultured immunoisolated  bone marrow-derived CD105 ⁺  cells. Stem Cells. 2006;24:1728-1737.)、あるいはCD 271 ⁺ 細胞のみ(Quirici N, Soligo D, Bossolasco P, et al . Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by  anti-nerve growth factor receptor antibodies. Exp He matol. 2002;30:783-791.)による選別に比べ、CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞による選別によって、CFU-F活性を有する� ��胞の濃縮率は、はるかに高かった。なお、� ��105抗体は内皮細胞、初期のBリンパ球、単球 を認識する抗体である。

<表2>

 (2)分化アッセイ

 (i)骨芽細胞への分化

 (a)分化誘導

 CFU-Fアッセイを行った後のCD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞を継代し、コンフルエントになった状態 で、培地を増殖培養液から骨芽細胞誘導培地 (CAMBREX PT-4120)に交換し、37℃ 5%CO ₂ インキュベーターにて培養した。3~4日ごとに 新しい骨分化誘導培地に交換し、2週間分化� �導を行った。

 (b)染色

 分化誘導した細胞を4%PFAにて室温で10分間固 定し、その後、PBSで5分間の洗浄を3回行った� ��アルカリフォスファターゼ(ALP)基質キット� �あるヒストファイン(株式会社ニチレイバイ� ��サイエンス Code,415161)を用いて、骨芽細胞� �染色を行なった。 

 その結果、図3に示すように、桃色~赤色に� �まった骨芽細胞が認められ(図3では、灰色~� �色に相当)、骨芽細胞へ分化することが示さ� ��た。

 (ii)脂肪細胞分化アッセイ

 (a)分化誘導

 CFU-Fアッセイを行った後のCD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞を継代し、コンフルエントになった状態 で、培地を増殖培養液から脂肪細胞誘導培地 (CAMBREX PT-4135)に交換し、37℃ 5%CO ₂ インキュベーターにて培養した。3日後に脂� �細胞維持培地(CAMBREX PT-4122)に交換し、その� �3~4日ごとに脂肪細胞誘導培地と脂肪細胞維� �培地とを交互に交換し、2週間分化誘導を行� ��た。

 (b)染色

 分化誘導した細胞を4%PFAにて室温で10分間固 定し、その後、PBSで5分間の洗浄を3回行った� ��オイルレッドO染色溶液(武藤化学株式会社,� �Lot No,060822)を用いて、脂肪細胞の染色を行� �た。 

 その結果、図3に示すように、赤色に染まっ た脂肪細胞の油滴が認められ(図3では、灰色~ 黒色に相当)、脂肪細胞へ分化することが示� �れた。

 (iii)軟骨分化アッセイ

 (a)分化誘導

 CFU-Fアッセイを行った後のCD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞を継代し、細胞数が2×10 ⁵ cellsになったところで、これらの細胞を軟骨� ��胞誘導培地(CAMBREX PT-4121)に懸濁し、15ml遠沈 管に移した後、5分×150gで遠心した。上清を� �去し、軟骨細胞誘導培地+TGF-β3(CAMBREX PT-4124) +BMP-6(R&D Systems 507-BP/CF)に懸濁した。5分×1 50g遠心した後、ペレット状の細胞をそのまま 37℃・5%CO ₂ インキュベーターにて培養した。3~4日ごとに 新しい軟骨分化誘導培地と交換し、3週間分� �誘導を行った。

 (b)染色

 分化誘導した細胞塊を4%PFAにて室温で1時間� ��定し、その後、PBSで5分間の洗浄を3回行っ� �。次いで、細胞塊をパラフィン包埋し、6μm� ��スライスした。0.05%トルイジンブルー溶液(p H4.1 Wako 209-14545)を用いて、切片を染色した� � 

 その結果、図3に示すように、紫色に染まっ た軟骨に特有な多糖類が認められ(図3では、� ��色~黒色に相当)、軟骨への分化が明らかに� �った。

 このように、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞は、間葉系細胞である骨芽細胞、軟骨細 胞、脂肪細胞への分化能を有する。そして、 ヒト骨髄に含まれる細胞集団から、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞を選別すれば、ヒト間葉系幹細胞を高度 に濃縮することができる。

 <実施例3:間葉系幹細胞が存在する組織の� ��討>

 本実施例では、間葉系幹細胞は、骨髄、末� ��血、及びG-CSF投与後の末梢血には存在する� �、臍帯血には存在しないことを示す。 

 ヒト臍帯血、末梢血、及びG-CSF投与後の末� �血は、廃棄される患者検体を使用した。ま� �、実施例1に記載の方法を用いて、ヒト臍帯� ��、末梢血、及びG-CSF投与後の末梢血から細� �集団を調製し、FACS解析を行った。 

 その結果、図4に示すように、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞は、CD45陰性CD235a陰性分画にゲートを設� �した場合、骨髄中では0.01~0.04%、G-CSF投与後� �末梢血では0~0.015%、末梢血では0~0.008%含まれ� ��いた。一方、CD45 ^- CD235a ^- CD271 ⁺ CD90 ⁺ 細胞は、臍帯血には含まれていなかった。