Procédé de culture de micro-organismes en conditions réductrices obtenues par un flux gazeux La présente invention est relative à la culture de micro-organismes en conditions réductrices obtenues au moyen d'un flux gazeux.

Elle concerne plus particulièrement la production modifiée et/ou contrôlée de produits alimentaires par fermentation utilisant des levures en conditions réductrices telles que boissons alcoolisées, produits laitiers, etc.

L'invention concerne également la production de biomasses, notamment ferments ou levains, levures-aliments, ferments probiotiques, extraits de levures.

Elle concerne encore la production de substances actives utiles en particulier dans l'industrie pharmaceutique ou vétérinaire.

Elle est plus précisément relative à un procédé permettant de diminuer le potentiel d'oxydo-réduction lors de la culture de micro- organismes, notamment lors de fermentations utilisant des levures pour la préparation des produits précités, permettant de modifier et/ou de contrôler les flux métaboliques et donc la composition et/ou les propriétés desdits produits.

Les oxyde-réductions sont des étapes essentielles dans les réactions de l'anabolisme et du catabolisme cellulaire, pour lesquelles le sens des échanges est déterminé par le potentiel d'oxydo-réduction (Eh).

Celui-ci est un paramètre d'état des fermentations et sa variation modifie l'environnement physico-chimique des micro-organismes dont il influence les activités métaboliques et la physiologie.

Les levures sont utilisées très largement pour la fabrication des boissons fermentées.

Chez la levure, le bilan redox de la fermentation est normalement équilibré par la production d'éthanol. De plus, la levure utilise une partie des sucres fermentescibles pour synthétiser de la biomasse et des produits secondaires dont le principal est le glycérol, troisième constituant du vin après l'éthanol et l'eau. La production de ce dernier dépendra de la quantité de co-enzymes réduits disponibles pour les biosynthèses. Lors de

la fermentation des sucres, la formation de l'éthanol et du glycérol est ainsi essentielle pour maintenir la balance redox.

D'autres produits sont également synthétisés en quantités suffisamment importantes pour modifier les caractéristiques sensorielles du produit final. II s'agit essentiellement des acides organiques. La formation des acides organiques tels que le succinate ou l'acétate lors de la fermentation a également une influence sur la balance rédox. Le succinate est formé par voie oxydative via le citrate et l'a-cétoglutarate ou par voie réductrice via l'oxaloacétate, si bien que les conditions de fermentation restent essentielles. L'acétate est également formé à partir de l'acétaldéhyde par une aldéhyde déshydrogénase.

La levure se caractérise aussi par la production de composés volatils intervenant dans les arômes fermentaires, à savoir, les alcools supérieurs, les aldéhydes et les esters. Ces produits sont issus des métabolismes glucidiques, lipidiques et azotés, et de ce fait, leur production est également dépendante d'une modification possible de la répartition des flux lors d'une variation du potentiel redox.

A partir du métabolisme des sucres, la souche de levure synthétise aussi des oligosaccharides de réserve comme le glycogène et le tréhalose, souvent en réponse à un stress environnemental. Ces deux oligosaccharides peuvent s'accumuler quand le carbone est épuisé dans le milieu mais aussi lorsque la souche ne dispose plus de source azotée ou soufrée ou encore lors d'un stress thermique ou osmotique.

Les sucres de réserve jouent un rôle important pour améliorer la stabilité et le séchage des levures, de ce fait, leurs concentrations constituent un paramètre critique dans la production de « poudres de levures actives » (Active Dry Yeast en anglais). En effet, pour faire face aux températures élevées du cycle de séchage, des fractions de glycogène sont utilisées pour fournir l'énergie de maintenance à la cellule alors que le tréhalose est lui, utilisé comme un facteur stabilisant les membranes. Pendant le séchage, les levures peuvent accumuler de grandes quantités de tréhalose (10-15% du poids sec) et d'ailleurs, la

qualité des levures séchées seraient en relation directe avec le contenu en tréhalose cellulaire. La survie à la déshydratation est corrélée avec la synthèse de tréhalose et lors de la réhydratation, le tréhalose est dégradé.

En fait, le tréhalose se fixe sur les groupements phosphates des membranes et en remplaçant l'eau il stabilise ces dernières lors de la déshydratation. En plus d'agir comme des facteurs de stockage et protecteurs, ces sucres peuvent jouer également un rôle dans la progression du cycle cellulaire à faible taux de croissance sous une limitation en carbone.

Compte tenu des connaissances actuelles, des variations du potentiel redox semblent pouvoir modifier la répartition des produits et éventuellement des intermédiaires métaboliques.

Jusqu'à présent, pour modifier le potentiel d'oxydo-réduction d'un milieu de fermentation, on procède soit par traitement thermique (comme la pasteurisation) soit par ajout de molécules d'addition oxydo-réductrices (telles l'acide ascorbique, des sulfites......).

Néanmoins, ces méthodes peuvent modifier les caractéristiques des produits obtenus et ne peuvent pas être mises en oeuvre systématiquement dans les domaines agroalimentaire (oenologie par exemple), pharmaceutique ou vétérinaire en raison des normes imposées.

L'invention a ainsi pour objectif de remédier aux inconvénients précités et de fournir un procédé de culture de micro-organismes permettant de modifier les flux métaboliques dans les cellules en faisant varier le potentiel redox du milieu.

L'invention a aussi pour objectif de fournir un procédé de fermentation utilisant des levures dans la perspective d'une application agroalimentaire en particulier en oenologie, ou d'une application pharmaceutique ou vétérinaire, faisant intervenir des moyens non toxiques et non préjudiciables pour les produits finaux.

Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé permettant d'accélérer ou de simplifier les procédés de fabrication par fermentation.

L'objectif de l'invention est aussi de fournir un procédé permettant d'améliorer les durées de conservation en particulier des ferments ou levains.

Un objectif de la présente invention est également de fournir des produits fermentés tels que des boissons présentant un faible degré d'alcool (vins, bières, etc.) ettou des propriétés organoleptiques modifiées.

Un autre objectif de la présente invention est encore de fournir des ferments, levures-aliments ou extraits de levures présentant des propriétés améliorées notamment du point de vue conservation, nutritionnel et/ou organoleptique.

A ces fins, l'invention a pour objet un procédé de culture de micro- organismes permettant d'abaisser le potentiel d'oxydoréduction du milieu de culture, caractérisé en ce que l'on effectue ladite culture en conditions réductrices obtenues par un gaz réducteur comparé à l'air, gaz réducteur comprenant de l'hydrogène et/ou de l'azote.

L'invention a aussi pour objet un procédé de culture de micro- organismes permettant de modifier les flux métaboliques lors de ladite culture, caractérisé en ce que l'on effectue ladite culture de micro- organismes en conditions réductrices obtenues par un gaz réducteur comparé à t'air, comprenant de l'hydrogène et/ou de l'azote.

Elle a encore pour objet de tels procédés de culture de micro- organismes pour la production de boissons non gazeuses à degré alcoolique réduit, notamment boissons à base de vin et boissons distillées, de boissons alcoolisées gazeuses, notamment pétillants de raisin, vins mousseux, champagnes, bières et cidres, de ferments notamment levains de panification, levures-aliments et extraits de levures.

Elle a encore pour objet les produits obtenus par les procédés précités.

L'invention a également pour objet l'utilisation de conditions réductrices obtenues par un flux gazeux tel que précité pour abaisser le potentiel d'oxydoréduction d'un milieu de culture de micro-organismes pour la préparation de produits fermentes destinés à l'industrie

agroalimentaire, à l'industrie pharmaceutique ou para-pharmaceutique, ou à l'industrie vétérinaire.

Elle a encore pour objet l'utilisation des conditions réductrices précitées pour modifier les flux métaboliques lors de la culture de micro- organismes.

Elle a aussi pour objet l'utilisation des conditions réductrices précitées pour la préparation des produits précédemment mentionnés.

Le procédé selon l'invention va être décrit plus en détails ci-après.

Les inventeurs ont mis en évidence de manière tout à fait surprenante, que l'on pouvait faire varier te potentiel redox d'un milieu de culture de micro-organismes au moyen d'un flux gazeux réducteur comparé à l'air tel qu'un flux gazeux (différent de l'air) contenant de l'hydrogène et/ou l'azote, et que les conditions réductrices ainsi obtenues permettaient de modifier les flux métaboliques lors de la culture.

Ils ont ainsi montré que l'on pouvait orienter les flux métaboliques vers la production de composés spécifiques et/ou modifier, de manière contrôlée, les propriétés des produits obtenus.

De manière plus spécifique, les inventeurs ont montré que l'on pouvait modifier les flux métaboliques ou la cinétique de prise de mousse fors de la fermentation de levures, dans le cadre d'applications oenologiques.

Ils ont encore montré que l'on pouvait augmenter la quantité de sucres de réserve produite lors de la culture de micro-organismes pour la production de biomasse.

Ils ont également mis en évidence que l'on pouvait augmenter la viabilité des micro-organismes en conditions réductrices telles que définies et prolonger la durée de conservation des ferments obtenus.

Selon l'invention, par « conditions réductrices », on se réfère aux conditions obtenues à l'aide d'un flux gazeux qui est réducteur comparé à t'air, mis au contact d'un milieu de culture, permettant d'abaisser le potentiel d'oxydoréduction dudit milieu de culture par rapport à la valeur

qu'il aurait en l'absence dudit flux gazeux, c'est-à-dire à J'air, toutes choses étant égaies par ailleurs.

L'invention couvre ainsi les cultures en milieux réducteurs proprement dits (on a abaissé le potentiel redox en dessous de 0) mais également le cas où le flux gazeux permet d'abaisser le potentiel d'oxydoréduction d'un milieu initialement oxydant, même si le potentiel final atteint à l'aide dudit flux gazeux reste positif en soi (on est alors au final toujours en milieu oxydant).

On rappelle que les valeurs du potentiel redox dépendent notamment de [a composition du milieu de culture et de son pH, la référence utilisée pour apprécier la baisse du potentiel redox obtenue conformément à l'invention, présentant la même composition de milieu à pH semblable.

Selon le procédé de l'invention, les conditions réductrices telles que définies ci-dessus sont obtenues au moyen d'un gaz différent de l'air et plus réducteur que ce dernier en ce sens qu'il permet d'atteindre, dans le milieu de culture des micro-organismes, un potentiel redox inférieur à celui obtenu dans les conditions classiques de culture, comme défini par l'expression « conditions réductrices ». II est composé d'hydrogène ou d'azote seul ou en mélange, l'un et/ou l'autre de ces gaz pouvant être en mélange avec un ou plusieurs autres gaz appelés ici « gaz complémentaire (s) acceptable (s) du point de vue de la culture ».

Le gaz complémentaire peut ainsi être choisi parmi les gaz inertes, notamment l'argon, l'hélium, mais aussi parmi l'oxygène, le dioxyde de carbone et le protoxyde d'azote et les mélanges en toutes proportions d'un ou plusieurs de ces gaz ; le gaz complémentaire peut être constitué d'un seul gaz ou d'un mélange de gaz.

II est considéré comme « acceptable du point de vue de la culture » en ce sens qu'il n'interfère pas de manière négative avec celle-ci et permet donc un développement satisfaisant voire amélioré, des micro- organismes.

11 est en outre choisi parmi les gaz répondant aux normes et autorisations du domaine d'application considéré (par exemple, oenologie, denrées alimentaires, produits pharmaceutiques ou vétérinaires, etc.).

Ceci s'entend bien sur des normes du moment connues sachant qu'elles évoluent en permanence en autorisant régulièrement l'arrivée et l'utilisation de nouveaux composés (voir par exemple les dérogations actuellement accordées en France pour l'utilisation d'ozone).

Le gaz complémentaire est de préférence sélectionné parmi le dioxyde de carbone et l'oxygène ainsi que leurs mélanges.

Lorsqu'il s'agit d'un mélange, le flux gazeux contient de préférence au moins 0,5% en volume d'hydrogène et/ou d'azote, plus préférentiellement entre 3 et 50% en volume d'hydrogène et/ou d'azote.

Pour des raisons de facilité de mise en oeuvre et de sécurité, la teneur en hydrogène est préférentiellement choisie inférieure à 5%.

Comme on l'aura compris à la lecture de ce qui précède, la composition du flux gazeux peut varier selon les souches mises en oeuvre et les applications visées ainsi que selon les contraintes de coût éventuellement imposées. A titre d'exemple, on peut citer l'utilisation préférentielle de mélanges hydrogène/azote pour la culture de micro- organismes destinés à des applications oenologiques ou encore à la production de biomasse ou à la culture de bactéries lactiques.

De manière typique, on peut citer également l'emploi de mélanges hydrogèneloxygène par exemple pour la production de biomasse selon la nature des micro-organismes (levures) mis en oeuvre.

On peut encore mentionner l'emploi d'un flux d'azote seul pour favoriser l'accumulation des sucres de réserve (notamment glycogène, tréhalose) lors de la production de biomasse.

Conformément à l'invention, le procédé est réalisé selon les processus de culture classiquement utilisés pour les micro-organismes considérés.

Il peut s'agir en particulier de fermentation, en utilisant notamment les levures, ou encore d'autres processus de croissance de micro- organismes selon les applications choisies.

Des moyens pour mettre le milieu de culture en contact avec le flux gazeux précité sont en outre prévus.

Le gaz selon l'invention peut être appliqué, avant et/ou pendant la réalisation de la croissance des micro-organismes, par tous moyens connus.

Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre de manière continue ou discontinue, ce dernier mode étant souvent préféré d'un point de vue industriel.

Comme démontré plus en défaits plus loin dans la présente demande, le procédé selon l'invention permet de modifier les flux métaboliques des micro-organismes. Par « modification des flux métaboliques », on entend l'orientation contrôlée de la production lors d'une culture de micro-organismes, c'est-à-dire l'obtention de produits spécifiques éventuellement aux dépens d'autres produits normalement obtenus, mais également la modification des caractéristiques de ces flux, notamment du point de vue de la vitesse de production, de la montée en pression le cas échéant, etc.....

En d'autres termes, le procédé permet d'orienter et de contrôler lesdits Flux métaboliques lors de la culture des micro-organismes de manière à obtenir au final une composition différente de celle qu'on obtiendrait en réalisant la même culture dans les conditions classiques, éventuellement accompagnée de la production de substances spécifiques nouvelles qui ne sont pas habituellement obtenues lors de la production classique, c'est-à-dire sans contact avec le gaz réducteur tel que défini selon l'invention.

Le procédé de l'invention permet également de modifier les flux métaboliques au niveau des caractéristiques de la réaction. De manière typique, on peut citer le cas de fermentations utilisant des levures en récipient fermé (par exemple bouteille) dont la cinétique de prise de

mousse peut être améliorée en conditions réductrices comme décrites précédemment.

La modification des flux métaboliques peut également correspondre à une accumulation des sucres de réserve, en particulier tréhalose et glycogène, dans les cellules produites.

On décrit ci-après des applications plus spécifiques de l'invention qui ne doivent toutefois pas être considérées comme limitatives et ne sont données qu'à titre illustratif.

Selon un mode de réalisation dé l'invention, le procédé est appliqué à des micro-organismes du type utilisé en oenologie, pour la préparation de boissons alcoolisées non gazeuses (sans prise de mousse) telles que boissons cl base de vins ou boissons distillées.

II s'agit généralement de fermentations utilisant des levures du genre Saccharomyces, principalement réalisées en cuve (récipient ouvert) typiquement de manière discontinue.

Lorsque l'on se place en conditions réductrices telles que définies selon l'invention, on produit par exemple des boissons à teneur en glycérol plus élevée par comparaison aux mêmes types de boissons produites dans les conditions classiques, c'est-à-dire sans abaissement du potentiel redox du milieu.

L'augmentation de la production de glycérol se fait aux dépens de la production d'éthanol. On peut ainsi obtenir directement des boissons faiblement alcoolisées non gazeuses en évitant fa désalcoolisation par un processus d'extraction, employé jusqu'à présent pour produire de telles boissons.

Le procédé selon l'invention s'applique donc notamment à la production de boissons à degré alcoolique réduit, par exemple boissons à base de vins faiblement alcoolisées. Dans ce cas, on préfère maintenir une teneur en éthanol d'au moins 5% en volume pour restituer les arômes et saveurs du vin, appréciés par les consommateurs, du fait de la rétention des composés volatils à l'origine de ces propriétés organoleptiques, dans l'ethanol.

L'invention peut cependant être appliquée à la production de boissons à degré alcoolique inférieur au seuil précité auquel cas, on peut produire des boissons faiblement alcoolisées avec de nouvelles propriétés organoleptiques.

Le procédé selon l'invention s'applique également à la production de boissons qui, à degré alcoolique équivalent, ont des propriétés organoleptiques améliorées, par exemple dans le domaine des boissons distillées.

Le procédé de l'invention présente l'avantage de permettre une récupération sensiblement totale et la non dégradation des composés non volatils ainsi que l'absence de formation de mauvais goûts liés au procédé de traitement, notamment pour la désalcoolisation classique.

Le procédé selon l'invention permet ainsi de contrôleur les caractéristiques des boissons produites par fermentation, en particulier du point de vue des propriétés organoleptiques et de leur degré d'alcool. Il permet notamment de conserver ou renforcer les propriétés organoleptiques habituelles d'une boisson tout en en diminuant son degré alcoolique. Dans d'autres cas, il permet de produire des boissons présentant de nouvelles caractéristiques organoleptiques ou de textures non accessibles par les procédés classiques. On peut citer par exemple l'obtention de vins à teneur en glycérol élevée qualifiés de vins « gras ».

Le procédé selon l'invention est ainsi applicable à tout type de fermentation utilisant des levures ou autres micro-organismes de la même espèce que les levures où la diminution de la production d'éthanol etlou l'augmentation de la production de glycérol sont recherchées.

Selon une variante de mise en oeuvre, le procédé est appliqué à des fermentations de levures réalisées en récipient fermé (par exemple bouteille ou tonneau) pour la production de boissons avec prise de mousse.

II s'agit par exemple de fermentation de levures principalement du genre Saccharomyces, utilisée pour la production de vins mousseux, bières ou cidres.

Dans ce cas, en conditions réductrices telles que définies selon l'invention, on peut améliorer la cinétique de la prise de mousse en accélérant la montée en pression dans la bouteille.

On peut ainsi préparer des boissons de type champagnes, vins mousseux, pétillants de raisin, bières ou cidres, par un procédé plus facile et plus rapide.

Selon d'autres modes de réalisation de l'invention, le procédé est appliqué à des micro-organismes pour la préparation de ferments, levures-aliments ou encore extraits de levures, utilisés dans le domaine alimentaire mais également dans le domaine médical ou vétérinaire.

A titre d'exemples, on peut citer la culture d'espèces des genres Saccharomyces et Candida pour fa production de ferments ou levains de panification ; la culture d'espèces des genres Saccharomyces, Kluyveromyces et Candida pour la production de levures-aliments notamment à usage pharmaceutique ou vétérinaire, et d'extraits de levures ; la culture de bactéries des genres Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus et Streptococcus thermophilus pour la production de bactéries lactiques utilisées dans l'industrie laitière.

Lorsqu'on se place en conditions réductrices telles que définies conformément à l'invention, on produit par exemple davantage de sucres de réserve, notamment tréhalose et glycogène.

La teneur en sucres de réserves est un facteur important et même un paramètre critique dans la production de zu poudres de levures actives » (Active Dry Yeast) qui sont obtenues par un procédé de déshydratation desdites levures.

On observe parallèlement une bonne viabilité des microorganismes dans les conditions réductrices de l'invention.

Le procédé décrit permet donc d'améliorer la production de telles levures déshydratées.

II est ainsi applicable dans le domaine de la diététique où les levures sèches alimentaires sont utiles en tant qu'ingrédients alimentaires naturels, riches en protéines, vitamines du groupe B et minéraux.

II est également applicable en pharmacie et parapharmacie où les levures sèches enrichies peuvent être incorporées dans des compléments nutritionnels, en particulier par la forte biodisponibilité des oligo-éléments qu'elles contiennent, et où les extraits de levures sont utiles en fermentation pharmaceutique mais aussi en microbiologie notamment pour la préparation de milieux de croissance.

Le procédé de la présente invention est encore applicable au domaine de l'alimentaire où les levures autolyses sont des ingrédients particulièrement bien adaptés à t'àromatisation notamment pour la préparation de snacks aromatisés ou de biscuits salés et où les extraits de levures sont des ingrédients traditionnels des bouillons, potages, etc. mais aussi des ingrédients riches en facteurs de croissance, en peptides et en acides aminés utiles pour les procédés de culture de microorganismes.

Le procédé selon l'invention est applicable à toute industrie utilisant des levains vivants telle que l'oenologie, la brasserie, la cidrerie, la panification mais également la pharmacie, la parapharmacie, le vétérinaire notamment avec l'essor des agents probiotiques.

L'invention est ainsi relative à tous les produits obtenus par le procédé décrit précédemment.

L'invention est illustrée à l'aide des exemples donnés ci-après, à titre non limitatif, en référence aux dessins dans lesquels : 'ta figure 1 est un diagramme montrant la production d'éthanol et de glycérol obtenue pour différents potentiels redox (Eh) dans le cas d'une fermentation continue sur milieu minimum, en référence à t'exempte 1 ; les figures 2a à 2d et 3a à 3d sont des courbes montrant respectivement les rendements en éthane et en glycérol observés en l'absence de gaz et sous trois bullages différents (engendrant quatre potentiels redox différents) au cours d'une fermentation alcoolique, en référence à l'exemple 2 ;

les figures 4,5 et 6 représentent les courbes montrant respectivement l'évolution de la production d'éthanol, de la pression dans la bouteille et du degré alcoolique (paramètres déterminants d'une prise de mousse) en fonction du temps, dans le cas d'une fermentation en bouteille avec prise de mousse, en référence à t'exempte 3 ; les figures 7,8 et 9 représentent des courbes rapportant respectivement le potentiel redox (Eh), le suivi de la quantité de sucre résiduel et le suivi de la production de glycérol au cours du temps (paramètres annexes d'une prise de mousse) dans le cas d'une fermentation en bouteille avec prise de mousse, en référence à l'exemple 3 ; . les figures 10 et 11 sont des diagrammes illustrant l'analyse quantitative des sucres de réserve, glycogène et tréhalose, en fonction du potentiel redox (Eh) respectivement sur milieu minimum et sur milieu jus de raisin, en référence à l'exemple 4 ; les figures 12 et 13 sont des courbes montrant la viabilité des cellules au cours de leur conservation respectivement dans de l'eau physiologique et dans le vin, en référence à l'exemple 5.

EXEMPLES I-Effet des conditions réductrices selon l'invention sur la valeur du potentiel d'oxydoréduction d'un milieu de fermentation.

Pour cette étude, on a utilisé trois types d'atmosphères, à savoir azote seul, mélange azote/hydrogène à raison de 4% d'hydrogène et hydrogène seul.

On a observé l'effet d'un bullage de ces différents gaz sur la valeur du potentiel redox (Eh) d'un milieu minéral ayant la composition suivante convenable pour la croissance de Saccharomyces cerevisiae :

Composition du milieu minéral : Quantités pour 1 litre d'eau distillée (NH4)2SO4 5g KH2PO4 3g MgSO4, 7H20 0,5g EDTA 15mg ZnS04, 7H20 4,5mg Cocu2, 6H20 0,3mg Cal2, 2H20 4,5mg FeS04, 7H20 3mg NaMo04, 2H20 0,4mg H3BO3 1 mg KCI 0, 1 mg Silicone antimoussant 0, 025ml Ergostérol 10mg Tween 80 420mg Ethanol 1 mM 46mg Glucose 23g Biotine 0,05mg Calcium pantothénate 1mg Acide nicotinique 1mg Inositol 25mg Thiamine HCl 1mg Acide para-aminobenzoëque 0,2mg Pyridoxine HCI 1 mg pH=4, 1 On a également observé l'effet de ces gaz sur milieu jus de raisin correspondant à une application oenologique.

Dans un premier temps, on a observé la valeur du Eh sur le milieu stérile (c'est à dire non ensemencé) et dans un deuxième temps sur milieu ensemencé.

On fait buller dans le milieu de fermentation le gaz ou le mélange de gaz jusqu'à fixer la valeur du Eh. Ces expérimentations sont réalisées à 25°C et au pH du milieu considéré qui reste constant.

Le tableau 1 ci-dessous rapporte les valeurs du potentiel Redox (Eh) obtenues sur milieu minimum.

Tableau I Azote Azote/hydrogène Hydrogène Milieu stérile +250 mV-200 mV-300 mV (pH = 4. 13) (pH = 4. 14) (pH = 5) Milieu +100 à +70 mV-100 mV-300 mV ensemencé(*) (pH = 5) (pH = 5) (pH = 5) (*) souche Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 Le tableau 2 indique lui les valeurs du potentiel Redox (Eh) obtenues sur milieu jus de raisin.

Tableau 2 Azote Azote/Hydrogène Hydrogène Jus de raisin stérile +300 mV-100 mV-200 mV (pH = 3. 01) (pH = 3. 04) (pH = 3.02) Jus de raisin +100 à +300 mV-100 mV-200 mV ensemencée) (pH=3) (pH=3) (pH=3) (**) souche Saccharomyces cerevisiae RC 212

A titre comparatif, le potentiel du milieu jus de raisin stérile est de 400 mV en conditions classiques (absence de flux gazeux selon l'invention).

II-Effet des conditions réductrices selon l'invention sur les flux métaboliques de la fermentation.

EXEMPLE 1 : ETUDE SUR MILIEU MINIMUM.

On a utilisé la souche Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 qui se développe sur un milieu minéral en glucose limitant et supplémenté en vitamines et acides gras insaturés correspondant à la composition donnée au paragraphe 1. Les levures sont cultivées en anaérobiose, en continu, à une température constante de 30°C et un pH maintenu à 5. Les taux de dilution D (rapport du débit d'alimentation au volume du liquide) sont balayés de 0,05 h~1 à 0,3h-'.

Trois valeurs du Eh sont appliquées grâce à l'utilisation des différents gaz soit 100 mV,-100 mV et-300 mV.

On étudie la modification des flux métaboliques, lors de la fermentation, par analyse quantitative de la distribution des flux métaboliques : Les résultats observés sont rapportés en figure 1 qui présente la quantité (en gA) d'éthanol et de glycérol pour les trois conditions de Eh précitées à D = 0, 1h-1. En milieu réduit, le flux carboné est dévié vers la production de glycérol au dépend de l'éthanol.

Les résultats obtenus lors du suivi de la stoechiométrie métabolite- substrat sont donnés au tableau 3.

Aux vus des résultats présentés dans ce tableau, on constate qu'en conditions réductrices (gaz hydrogène et mélange hydrogène/azote), la synthèse de glycérol est augmentée par rapport aux conditions oxydantes (sous azote) et ce, au dépend de celle de l'éthanol qui est fortement diminuée. Dans ces conditions, le ratio glycérol/éthanol est doublé lorsque l'on passe d'une fermentation sous azote à une fermentation sous hydrogène.

EXEMPLE 2 : ETUDE SUR MILIEU JUS DE RAISIN.

On a utilisé une souche oenologique de Saccharomyces cerevisiae RC 212. La fermentation est menée en discontinu (batch) pendant 145 heures sur milieu jus de raisin contenant environ 165 g/l de sucres fermentescibles et la température est maintenue à 25°C. II s'agit d'un milieu industriel dont les propriétés physico-chimiques et les concentrations en éléments nutritifs sont différentes du milieu minéral. Ce milieu présente la capacité de reproduire le phénomène à concentration élevée en sucres et avec un substrat se composant d'un mélange glucose-fructose équilibré. Cette expérience permet également de contrôler te phénomène en culture discontinue.

Quatre conditions de potentiel redox (Eh) sont testées en utilisant : -un réacteur sans beilage de gaz (Figures 2a et 3a) -un réacteur avec un bullage azote (Figures 2b et 3b) -un réacteur avec un bullage azote/hydrogène (Figures 2c et 3c) -un réacteur avec un bullage hydrogène (Figures d2 et 3d).

Au cours du temps, on a suivi la biomasse, le pH, l'évolution du Eh, la production d'éthanol et de glycérol ainsi que la quantité de sucres résiduels.

Les résultats présentés correspondent à une moyenne de 3 répétitions.

Its sont illustrés sur les figures 2a à 2d pour l'méthanol et sur les figures 3a à 3d pour le glycérol.

Les concentrations en sucres dans les moûts étant variables (150 à 350 gA de jus selon les cépages), il convient d'interpréter les résultats obtenus en prenant en compte les ratios éthanol formé/sucres fermentescibles (en mol/mol) et glycérol formé/sucres fermentescibles (en mol/mol) mais aussi le rapport glycérol/éthanol.

Cette analyse de la stoechiomètrie métabolites-sucres confirme, comme lors de l'étude sur milieu minimum en chémostat, le fait que l'on favorise la voie du glycérol au dépend de celle de l'éthanol lorsque la levure se retrouve en conditions réductrices.

Ces résultats montrent que dans le cadre d'une application en vinification, il est possible de produire une boisson fermentée à faible degré alcoolique, tout en maintenant (ou en augmentant) la production de glycérol qui intervient dans le corps et la rondeur des vins.

Le tableau 3 ci-dessous donne les résultats obtenus lors du suivi de la stoechiométrie métabolite-substrat dans le cas : (1) d'une fermentation en chémostat à D = 0, 1h-1 sur milieu minimum (23 g/l de glucose) : exemple 1, (2) d'une fermentation discontinue sur jus de raisin à 100 heures (165 gfi de sucres fermentescibles) : exemple 2.

Les rendements rapportés correspondent aux coefficients directeurs des droites de régression des figures 2a-2d et 3a-3d : Figure 2a : y = 1,79x-105,00 ; Rendement = 94 % Figure 2b : y = 1,29x + 23,47 ; Rendement = 93 % Figure 2c : y = 0, 91x + 45,92 ; Rendement = 96 % Figure 2d : y = 0,85x + 72,42 ; Rendement = 88 % Figure 3a : y = 0,06x-3,51 ; Rendement =98 % Figure 3b : y = 0,10x-6,92 ; Rendement = 95 % Figure 3c : y = 0,09x-4,46 ; Rendement = 93 % Figure 3d : y = 0,11x-8,08 ; Rendement = 94 % A titre comparatif, ce tableau indique les valeurs rapportées par Michnick et al, 1997 (Yeast, vol. 13,783-793) et Oura, 1977 (Process Biochemistry, vol. 4,19-35) dans fart antérieur, la seconde référence correspondant à une synthèse de 5 auteurs différents.

Tableau 3 Ihnd/sucn s ayceml/sucrfs P4io BIA : mol/mol (B) oérd/anol en mol/md (A " CbndidottsTmi N/I 1 Raj Tànoin N2 N/l 1 Rpa-ts Tùn N :/I I Rapports (1) (2) (3) (3) l (I) (3l (2) (1) (2) (3) (3) (2) (1) (2) (3) (3y (2) Fa : l stMàD= \ 1,50 1,06 0,93 \ 0,62 \ 0,1 0,1 0,11\ L1 \ 0,06 0,09 0,11 \ 2 Qlh-l Famaitaticti ' 1, 79 1, 29 0,91 0, 85 0, 47 AM 0,06 0,09 0,10 0,11 1, 83 1, 22 0,03 0,07 0,11 0,13 4, 3 1,86 de raisin (à 100 heures) hems) bibliviiqud1, 74 0, (f7 0, 04 M(1997) Oura (1977) 1,71-1,89 0, 10-0, 06 0, 03-0, 06 Témoin : sans modification du Redox<BR> (a) et (b) : témoin des conditions classiques (sans modification du Redox) en culture discontinue (batch)

EXEMPLE 3 : ETUDE SUR MILIEU CHAMPAGNE.

On utilise une souche oenologique de levure de tirage du genre Saccharomyces. Le milieu se constitue d'un vin de base additionné d'une liqueur enrichie en sucres.

Quatre conditions de Eh sont testées en utilisant : -une mise en bouteille sans bullage de gaz, -une mise en bouteille avec un bullage azote, -une mise en bouteille avec un bullage azote/hydrogène, -une mise en bouteille avec un bullage hydrogène.

Au cours du temps (6 semaines), on a suivi l'évolution du Eh, la production d'éthanol et de glycérol, la viabilité des cellules de levures, l'évolution de la pression ainsi que la quantité de sucres résiduels (glucose + fructose).

-Suivi des paramètres déterminant pour évaluer la prise de mousse : 11 s'agit en fait de la mesure de la production d'éthanol, de l'évolution de la pression et du calcul du degré alcoolique atteint.

Aux vus des courbes présentées sur les figures 4,5 et 6, on constate qu'au bout de 3 semaines, on atteint les 12,5° dans les bouteilles quelles que soient les conditions de Eh testées. On rappelle que selon la législation, cette valeur est exigible pour toute fabrication de Champagne.

-Suivi des paramètres annexes : II s'agit là de la mesure du Eh et des quantités de glycérol et de sucres résiduels.

En référence à la figure 7, la mesure du Eh sur 6 semaines permet de conclure que la valeur se maintient dans les bouteilles au cours du temps.

Pour ce qui est de la quantité des sucres résiduels, aux vus des courbes de la figure 8, selon les conditions de Eh testées la consommation du sucre, par la levure, ne se fait pas de la même manière.

La souche placée en conditions réductrices consomme les sucres

fermentescibles beaucoup plus rapidement que sous un environnement oxydant.

Enfin, en référence à la figure 9, on voit que la production de glycérol n'est pas sensiblement modifiée par les différentes conditions appliquées.

Cette étude montre le changement de la physico-chimie du produit, pendant la fermentation en bouteille, du fait de la modification du Eh en utilisant différentes conditions réductrices.

III-Effet des conditions réductrices selon l'invention sur la teneur en sucres de réserve.

EXEMPLE 4 : ETUDE SUR MILIEU MINIMUM On a réalisé une croissance en batch de Saccharomyces cerevisisae CBS 8066 sur un milieu minéral limitant en glucose dont la composition correspond à celle donnée au 1, A 30*C et sous agitation à 300 rpm (rotation par minute).

Deux conditions de Eh sont testées : -un réacteur sous un bullage azote, -un réacteur sous un buttage hydrogène.

La croissance est menée pendant 14 heures, à la suite desquelles, un échantillon de cellules est prélevé pour effectuer le dosage du tréhalose et du glycogène selon le protocole établi par Parrou et François, 1997 (Analytical Biochemistry, vol. 248,186-188).

Les résultats présentés correspondent à une moyenne de 2 dosages.

L'analyse quantitative de l'accumulation des sucres de réserve au sein de la cellule de levure rapportée sur la figure 10, montre qu'en présence de conditions réductrices selon l'invention, la souche synthétise des oligosaccharides de réserve en quantité plus importante qu'en conditions oxydantes en réponse à cette modification de t'environnement physico-chimique.

EXEMPLE 5 : ETUDE SUR MILIEU JUS DE RAISIN.

On a utilisé une souche oenologique de Saccharomyces cerevisiae RC 212. La fermentation est menée en discontinu (batch) pendant 145 heures sur milieu jus de raisin contenant environ 165 gA de sucres fermentescibles et la température est maintenue à 25°C.

Quatre conditions de Eh sont testées en utilisant : -un réacteur sans buttage de gaz -un réacteur avec un bullage azote -un réacteur avec un bullage azote/hydrogène (conditions selon l'invention) -un réacteur avec un bullage hydrogène (conditions selon l'invention).

On a prélevé les cellules pour le dosage du tréhalose et du glycogène au bout de 128 heures de fermentation alcoolique, quand la quasi-totalité des sucres fermentescibles a été consommée (environ 99.9%).

On a mesuré, dans le même temps, la viabilité des cellules au bleu de méthylène. Les échantillons prélevés sont ensuite conservés à 4°C sans précaution particulière si ce n'est qu'une partie des cellules est reprise dans de l'eau physiologique et !'autre partie dans le milieu vin dans lequel elles ont été prélevées. Un suivi au cours du temps de la viabilité a été réalisé.

-Dosage du tréhalose et du gtvcoqène : Les résultats présentés correspondent à une moyenne de 2 répétitions.

A partir de l'analyse quantitative illustrée sur la figure 11, on peut remarquer que la levure accumule plus de sucres de réserve lorsqu'elle est en conditions réductrices conformément à l'invention plutôt qu'en conditions oxydantes.

On remarque que cette accumulation est optimale sur le milieu placé sous azote, gaz non réducteur mais conduisant à un abaissement

du potentiel redox du milieu par rapport à la valeur qu'il aurait eu en l'absence de gaz (azote).

-Suivi de la viabilité au cours du temps : Aux vus des courbes données sur les figures 12 et 13, il est très intéressant de noter que la viabilité est optimale pour les cellules issues du réacteur placé sous azote/hydrogène. Dans ce cas, la valeur du Eh correspondant à ce mélange apparaît comme la plus optimale pour permettre une meilleure conservation des cellules de levure au cours du temps.