Verfahren zum Nachweis bakterieller Infektion Bisher werden Bakterien am sichersten durch Koloniebildung in geeigneten Nährme- dien nachgewiesen. Dabei werden die Proben auf Nährböden angesetzt und unter günstigen Wachstumsbedingungen beobachtet. Lässt sich bei hinreichend großer An- zahl von Proben nach genügend langer Inkubationszeit von einigen Tagen kein Keim- wachstum feststellen, geht man davon aus, dass keine Keime vorhanden sind. Diese Methode wird heute praktisch überall dort eingesetzt, wo der Nachweis mikrobieller Infektion verlangt wird. Die ausführliche Beschreibung dieses gebräuchlichen Verfah- rens findet sich in einschlägigen Lehrbüchern, beispielsweise bei A. Koch, Growth Measurements, in : Manual of Methods of General Bacteriology (Gerhardt, Murray, Costilow, Nester, Wool, Krieg, and Philips, eds.), American Society for Microbiology (1981), pp. 179-206.

Dieses Verfahren bietet relativ hohe Sicherheit, hat aber den großen Nachteil, dass die Inkubationszeit bis zum sicheren Nachweis vorhandener Bakterien oft wesentlich län- ger dauert als es sich der Hersteller zur Überprüfung seiner Produkte erlauben kann.

Für die produzierte Ware kann deshalb aus technischen und wirtschaftlichen Gründen die Keimfreiheit nicht garantiert werden.

In den letzten Jahren haben sich deshalb Fluoreszenz-Verfahren eingebürgert, die den Umstand nutzen, dass Bakterien durch chemische Stoffe oder durch biochemische Eingriffe zur Fluoreszenz angeregt werden können. Dies erlaubt den direkten Nach- weis bestimmter Bakterien ohne zeitliche Verzögerung. Die Methode ist vollständig in der Literatur beschrieben, so zum Beispiel in : L. F. Wolff, L. Anderson, G. P. Sandberg, L. Reither, C. A. Binsfeld, G. Corinaldesi, and C. E. Shelburne : Bacteria Concentration Fluorescence Immunoassay (BCFIA) for the Detection of Periodontopathogens in pla- que. J. Periodontol. 63 (1992), 1093-1101.

Die Fluoreszenzmethode kann zwar ohne Zeitverzögerung Bakterien unmittelbar nachweisen, hat aber den Nachteil, dass sie nur für spezielle Bakterien, die sich bio- chemisch zur Fluoreszenz anregen lassen, tauglich ist. Darüber hinaus liegt die Nach- weisgrenze selbst in günstigsten Fällen bei 104 Bakterien/ml. Sie ist deshalb nicht ge- nerell einsetzbar, sondern relativ spezifisch und kostspielig.

Aus den Patenten DE 28 44 217 C, US-PS 4,458,531 EP 0 430 150 B oder DE 199 28 768 C ist ein Verfahren bekannt, das die Photonenemission bis zu einer Empfindlich- keit von 10-17 W (entsprechend einiger weniger Quanten pro Sekunden und pro cm2) im optischen Spektralbereich (von ca. 200-800 nm) zu messen erlaubt.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis bakterieller In- fektion resp. Zum Bestimmen der Anwesenheit von Bakterien und deren Konzentrati- on zu entwickeln, das es ermöglicht, die Photonenemission des Nährmediums mit ho- her Empfindlichkeit und Präzision schnell und sicher zu erfassen, um daraus Rück- schlüsse für weitere Handlungen ziehen zu können. Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt an Hand der Merkmale des Anspruchs 1.

Überraschend zeigte sich, dass das in den vorgenannten Patenten offenbarte Verfah- ren auch geeignet ist, mindestens 100 Bakterien/ml mit größerer Sicherheit, nach we- sentlich kürzerer Zeit als die Standardverfahren und ausnahmslos für alle Bakterien anzuzeigen. Der Erfindung liegt eine weitere Entdeckung zugrunde, die vom Erfinder mit Hilfe des genannten Verfahrens zur Messung einzelner Photonen gemacht wurde.

Dabei zeigte sich, dass alle Bakterien aus ihrem flüssigen Nährmedium (das wegen der notwendigen Oxidationsprozesse auch immer Photonen im genannten Wellenlän- genbereich emittiert) mit zunehmender Konzentration Photonen absorbieren, so dass aus dem Vergleich der Photonenemission des bakterienfreien Mediums und des bak- teriell kontaminierten Mediums zu erkennen ist, ob sich Bakterien im Medium befinden oder nicht. Die Entdeckung wurde in"Biophotons (J. J. Chang, J. Fisch and F. A. Popp, eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London (1998), pp. 19-44) veröf- fentlicht. In weiteren Untersuchungen zeigte sich, dass die Bakterien vorwiegend in ihrer Wachstumsphase die Gesamtemission aus Medium und Bakterien durch eigene Abstrahlung auch erhöhen können. In jedem Fall gibt es aber einen Unterschied zwi- schen der Photonenemission des bakterienfreien Mediums und des mit Bakterien kon- taminierten Mediums.

Der Erfindungsgedanke beruht darauf, dass die mit der Zeit veränderliche Photonen- emission des Nährmediums die Anwesenheit, die Art und die Konzentration eventuell anwesender Bakterien hinreichend frühzeitig und hinreichend sicher anzeigt, da sich die Wechselwirkung der Bakterien-mit dem Nährmedium in der Photonenemission des beobachteten Nährmediums niederschlägt.

Bei dem erfindungsmässigen Messverfahren wird a) die ultraschwache Lichtemission eines geeigneten Nährmediums mit hinreichend empfindlichem Lichtdetektor in Abhängigkeit von der Zeit gemessen, b) das mit einer geeigneten Probe der zu prüfenden Substanz versetzte Nährmedi- um mit dem gleichen Lichtdetektor in Abhängigkeit von der Zeit gemessen, c) aus der Differenz der Photonenemission der bakterienfreien Kontrolle und des mit der zu prüfenden Probe versetzten Nährmediums oder-nach hinreichender Kenntnis der Photonenemission des bakterienfreien Nährmediums-allein aus der Photonenemission des mit der zu prüfenden Probe versetzten Nährmediums der Schluss auf die Anwesenheit, die Art und die Konzentration eventuell vorhan- dener Bakterien gezogen.

Ein solcher Schluss ist gerechtfertigt, sobald die Differenz zwischen der Photonen- emission der geeigneten Kontrolle und des Test-Nährmediums auf einen absoluten Wert ansteigt, der signifikant größer ist als die Wurzel aus der gemessenen Photonen- zahl der Kontrolle. Im Prinzip kann damit die Empfindlichkeit des Verfahrens auf belie- big kleine Bakterienkonzentrationen (und damit beliebig kurze Messzeiten) eingestellt werden. In der Praxis wird man Kontrollmedien mit möglichst hoher Photonenemission auswählen, sobald die Frage der Empfindlichkeit Vorrang gegenüber der Sicherheit des Verfahrens hat. Umgekehrt steigt die Sicherheit im Nachweis von Bakterien mit zunehmender Beobachtungszeit der Photonenemission des Test-Nährmediums, das mit der geeigneten Probe versetzt ist. Die Erfindung wird nachfolgend in einem Beispiel an Hand einer Zeichnung näher be- schrieben.

In der Zeichnung zeigen die : Fig. 1 : Photonenemission des Nährmediums (Kurve 1) im Vergleich zur Photonen- emission des Mediums mit einer bakteriellen Kontamination von 10 000 Bakterien/ml (Kurve 2) im Verlauf von 20 Stunden nach Inkubation, Fig. 2 : Photonenemission des Nährmediums (Kurve 1) im Vergleich zur Photonen- emission des Mediums mit einer bakteriellen Kontamination von 1000 Bak- terien/ml (Kurve2) im Verlauf von 20 Stunden (nach inkubation).

In eine 15 ml Quarzküvette bringt man in das Nährmedium MRS-Laetobacillus-Bouiflon eine definierte Zahl von Bakterien (Lactobacillus brevis DSM Nr. 6235) und in eine wei- tere vergleichsweise nur das Nährmedium. Die Küvette wird jeweils in den Dunkelraum vor den Photodetektor der beschriebenen single-photon-counting Anlage gestellt. Die Temperatur im Dunkelraum wird auf 30° C eingestellt. Die Photonenemission wird in Einheiten von counts/min über einen Zeitraum von 20 Stunden gemessen. Die Daten werden gespeichert und später ausgewertet. Die Messkurven in den Fig. 1 und 2 zei- gen jeweils die Photonenzähiraten für (1) die Kontrollen (Nährmedien ohne Bakterien) und (2) die Nährmedien mit 10 000 (Fig. 1) bzw. 1000 (Fig. 2) eingegebenen Bakteri- en/ml. Es ist zu erkennen, dass bereits nach wenigen Minuten sichere Anzeichen für die Anwesenheit der Bakterien vorliegen. Nach spätestens 20 Stunden kann der siche- re Nachweis geführt werden.