La présente invention concerne une méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant de préférence l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, notamment pour la détermination moléculaire de la composition de la flore intestinale dans les selles.

La présente invention concerne également une trousse de détection et quantification d'ADN utile pour la mise en œuvre d'une méthode de détection et quantification d'ADN selon l'invention.

Il est utile de pouvoir déterminer la composition de la flore intestinale (ici appelée microbiote ou microbiote intestinal) chez l'homme car cette flore intervient dans les processus physiologiques de la digestion des boissons et des aliments, et son rôle est soupçonné ou étayé dans différents processus pathologiques digestifs et extradigestifs.

Par exemple, le rôle du microbiote intestinal dans l'obésité est un sujet d'actualité [Turnbaugh PJ et al. - A core gut microbiome in obesity an lean twins. Nature 2009 ;457 : 480-4] . En effet, le statut pondéral d'un individu est le résultat du nombre de calories ingérées (rôle de l'alimentation), du nombre de calories extraites lors de la digestion (rôle du microbiote intestinal), du nombre de calories stockées (rôle des tissus adipeux) et du nombre de calories dépensées (rôle des efforts physiques). Il est maintenant connu que toutes les espèces microbiennes du microbiote intestinal n'ont pas la même capacité à extraire les calories apportées par l'alimentation, certaines espèces ou groupes d'espèces (ici désignés phyla) étant capables de convertir par une cascade de réactions biochimiques, les calories contenues dans les aliments et les boissons, mieux que d'autres espèces ou d'autres phyla. Par exemple, il existe de nombreuses évidences que la composition du microbiote intestinal chez la souris influence la prise de poids y compris chez les souris qui n'ont pas de fond génétique obèse (Leptine -) [Turnbaugh PJ et al . - An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 2006 ;444: 1027-31 ; Turnbaugh PJ et al. - Diet-induced obesity is linked to marked but réversible altérations in the mouse distel gut microbiome. CeII Host Microbe 2008.3 : 213-223; Backhed F. et al. - The gut microbiota as an environmental factor that régulâtes fat storage. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 2004; 101 : 15718-15723; Ley RE et al . - Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444: 1022-3]. Chez l'homme, les travaux expérimentaux ne sont pas possibles et les données sur le rôle du microbiote intestinal dans le statut pondéral des individus reposent essentiellement sur l'observation de la composition du microbiote intestinal dans différentes circonstances. Un premier travail a montré que les individus obèses présentaient un biais du ratio des bactéries du phylum Firmicutes par rapport aux bactéries du phylum Bacteroidetes (ratio Firmicutes/ Bacteroidetes ou F/B) comparés aux individus contrôles dû majoritairement à la baisse des Bacteroidetes chez les sujets obèses [Ley RE et al. - Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444: 1022-3]. En revanche, de nombreuses études avaient montré que Bacteroides thetaiotaomicron entraînait une augmentation de la conversion en calories chez les souris xénobiotiques [Samuel BS et al . -A humanized gnotobiotic mouse model of host- archaeal-bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103 : 10011-10016]. Ces deux données ne sont pas incompatibles, car la baisse du genre Bacteroidetes n'entraine pas forcément la baisse de l'espèce Bacteroides thetaiotaomicron au contraire il pourrait y voir baisse drastique d'autres Bacteroidetes et augmentation relative de Bacteroides thetaiotaomicron.

Par ailleurs, les inventeurs ont testé les amorces utilisées par les différents auteurs qui ont publié sur ce sujet et ont observé que ces amorces ne sont pas absolument spécifiques de B. thetaiotaomicron et amplifient d'autres espèces du genre Bacteroides. Le même travail a montré que la correction du surpoids par un régime hypocalorique ou faible en carbohydrates entraînait une modification progressive du microbiote en un an, celui-ci tendant à devenir comparable à celui des sujets minces [Ley RE et al. - Human gut microbes associated with obesity. Nature 2006 ; 444: 1022-3] .

Plus récemment, il a été montré que des microorganismes appartenant au domaine des Archae, plus précisément de l'ordre des Methanobacteriales, étaient plus abondants chez les individus obèses que chez les individus contrôles ou chez les individus ayant bénéficié d'une chirurgie de l'obésité par « by-pass » intestinal . Cependant, la détermination précise des genres ou des espèces d'Archae associées à l'obésité, n'a pas été faite dans ce travail.

En particulier, les auteurs n'ont pas déterminé précisément laquelle des deux espèces d'Archae méthanogènes connues dans le microbiote intestinal, Methanobrevibacter smithii et Methanosphaera stadmanae, était plus spécifiquement associée au microbiote des individus obèses [Zhang H. et al. - Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ; 106 :2365-70].

D'autres exemples de pathologies au cours desquelles le microbiote intestinal est connu ou suspecté de jouer un rôle comportent la genèse de cancers coliques [Piqué JM et al. - Méthane production and colon cancer. Gastroentorology 1984 ;87 :601-5] et d'autres pathologies digestives inflammatoires chroniques [Peled Y. et al . - Factors affecting méthane production in humans. Gastrointestinal diseases and altérations of colonie flora - Dig. Dis. Sci. 1987; 32 : 267-71; Waever GA et al. - Incidence of methanogenic bacteria in sigmoidoscopy population : an association of methanogenic bacteria in diverticulosis. Gut 1986 ; 27:698-704] .

Ces différents exemples illustrent l'intérêt, tant pour les laboratoires de recherche, que pour les laboratoires de diagnostic médical et vétérinaire, qu'il y a à pouvoir déterminer en routine la composition du microbiote intestinal, et notamment la proportion relative de telle ou telle espèce de microorganisme ou de tel ou tel phylum de microorganismes. Dans l'exemple du statut pondéral de l'individu, il est utile de pouvoir déterminer par la simple cartographie microbienne des selles, si l'individu est prédisposé à une maigreur pathologique ou une obésité, qui peut ne pas être fidèlement reflétée par la simple mesure du poids corporel à un instant donné. Egalement, il est utile de pouvoir mesurer objectivement l'évolution de cette cartographie lors du traitement de la maigreur ou de l'obésité pour analyser l'efficacité du traitement et disposer d'éléments prédictifs de succès thérapeutique avant que la mesure du poids corporel n'atteigne les objectifs du traitement.

Cependant, les méthodes actuellement publiées pour l'analyse du microbiote intestinal ne permettent pas une utilisation en routine, ni dans les laboratoires de recherche ni dans les laboratoires de diagnostic médical ni vétérinaire. Ceci est illustré par le fait que les travaux publiés portent sur un relativement petit nombre d'individus étudiés compris entre 9 [Zhang H. et al. - Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ;106 :2365-70] et 154 [Turnbaugh PJ et al. A core gut microbiome in obèse and lean twins. Nature 2009 ; 457:480-4]. En effet, les travaux réalisés à ce jour sur le microbiobiote ont tous utilisé l'amplification par la technique PCR du gène universel 16S ARN ribosomal suivie soit du clonage et du séquençage par technique de Sangers d'un grand nombre de clones (de l'ordre de 100 clones), soit d'une technique de pyroséquençage à haut débit sur la plateforme 454 Life Sciences - Roche [Zhang H. et al. - Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Proc. Natl. Acad.Sci. 2009 ;106 :2365-70]. Ces techniques ne sont absolument pas utilisables en routine, du fait de leur coût, de leur lourdeur d'utilisation et du délai d'obtention des résultats de quelques semaines. Par ailleurs, les différents travaux réalisés donnent des résultats variables pour les individus contrôles entre les différentes études. Ceci est du en partie à l'absence de contrôle de qualité interne garantissant la qualité de l'extraction des acides nucléiques à partir du prélèvement de selles et de l'absence de témoin interne au prélèvement qui pourrait servir à normaliser les prélèvements et à comparer plus facilement les résultats expérimentaux obtenus chez des individus différents.

Les méthodes mises en œuvre à ce jour ne sont pas fiables en termes d'extraction et quantification de l'ADN procaryote de selles, et ne sont pas, en pratique, adaptées à une mise en œuvre d'analyse de routine, que ce soit en laboratoire d'analyses biologiques ou en laboratoire de recherche.

Dans SCANLAN et al. BMC Microbiology 2008 vol 8, π°l, pages 1471-2181, on décrit l'extraction d'ADN d'échantillons de selles et la détection du gène mcrA de M. smithii dans seulement 24% à 48% des échantillons testés, selon la catégorie d'individus. Le gène mcrA n'est pas un gène spécifique de M. smithii mais se retrouve dans d'autres archaes méthanogènes.

Dans RIDLON et al ., Clinica Chimica Acta 357 (2005 55-64), le gène SSU rDNA de M. smithii est détecté et quantifié dans un seul échantillon et n'est pas, lui non plus, spécifique de M . smithii mais se retrouve dans tout autre archae méthanogène . D'autre part, le protocole d'extraction d'ADN utilisé ne comporte pas de lyse chimique, ni de lyse par la chaleur.

Les inventeurs ont découvert que les méthodes d'extraction mises en œuvre dans l'état de la technique pour extraire l'ADN des selles n'étaient pas suffisamment efficaces pour conduire à des résultats fiables en termes de quantification, en particulier lorsque l'on cherche à quantifier des procaryotes de type Archae à parois épaisses.

Ceci a conduit les inventeurs a développer une nouvelle méthode d'extraction impliquant au moins une lyse mécanique, en préalable à une lyse chimique et, plus précisément, la réalisation d'une deuxième lyse mécanique après la première lyse chimique/enzymatique. Parallèlement et en complément, les inventeurs ont développé des outils de mise en œuvre de PCR quantitatives, avec des jeux d'amorces et de sondes spécifique pour une série de candidats potentiellement intéressants dans l'analyse de la flore intestinale, compte-tenu de certains écrits de la littérature, notamment en ce qui concerne les Bacteroidetes et Firmicutes, mais également compte-tenu de l'analyse personnelle des inventeurs, notamment en ce qui concerne Lactobacillus.

Les inventeurs ont développé un procédé de quantification de certaines espèces de microorganismes et de certains phyla de microorganismes, à partir d'un échantillon de selles, applicable en routine dans les laboratoires de recherche et les laboratoires de diagnostic médical et vétérinaire, et comprenant un marqueur interne de qualité.

Plus particulièrement, les inventeurs mis au point un procédé de quantification moléculaire des bactéries du phylum Firmicutes, dont spécifiquement les bactéries du genre Lactobacillus, et des bactéries du phylum Bacteroidetes. Le choix des phyla Firmicutes et Bacteroidetes a été explicité ci-dessus. Le choix du genre Lactobacillus, qui est un genre du phylum Firmicutes, est justifié par le fait que les promoteurs de croissance et en particulier Lactobacillus étaient associés chez les poulets à une prise de poids très importante en particulier chez ceux qui étaient complémentés en Lactobacillus pendant l'enfance [Khan M et al . - Growth-promoting effects of single-dose intragastrically administered probiotics in chickens. Br Poult Sci 2007, 48: 732-735]. Les inventeurs en ont inféré que ce genre bactérien, pourrait aussi participer à réguler le statut pondéral d'un individu bien qu'aucune donnée n'ait été publiée chez l'Homme, en dépit des conclusions d'importance qui pourraient en être tirées, compte-tenu que le Lactobacillus est présent dans les produits alimentaires issus des industries agro-alimentaires.

Pour cela, les inventeurs ont développé une technique de détermination et de quantification de chacun des espèces/phyla d'intérêt par PCR quantitative en utilisant l'Archae Methanobrevibacter smithii comme un témoin de la qualité de l'extraction des ADNs procaryotes à partir de l'échantillon de selles.

Les inventeurs ont formé l'hypothèse que Methanobrevibacter smithii, un microbe Archae très difficile à extraire, devrait être présent dans tous les échantillons de selles humains, du fait de sa fonction dans la détoxification des produits issus de la transformation des aliments dans l'intestin par synthèse de méthane, et donc que son identification et sa quantification devraient constituer un contrôle positif de la bonne réalisation de l'extraction et de la quantification de l'échantillon.

Les inventeurs ont donc tout d'abord mis au point une technique d'extraction de l'ADN des microorganismes à partir des selles, laquelle leur a permis de vérifier par la présence constante de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les selles humaines la qualité de ce procédé d'extraction. Puis, ils ont mis au point une méthode de quantification des microorganismes d'intérêt, dans la perspective de développer un protocole de routine permettant, à partir d'un prélèvement des selles chez l'homme ou les animaux, de quantifier la présence de microorganismes d'intérêt, notamment Methanobrevibacter smithii, Lactobacillus spp., Firmicutes et Bacteroidetes.

La présente invention fournit donc un protocole très performant d'extraction des ADN procaryotes (Bacteria et Archaea) et de quantification relative de la flore procaryote intestinale exhaustive, performante, reproductible et facile à mettre en œuvre en routine de laboratoire afin de faciliter l'analyse d'un grand nombre d'échantillon dans un but tant diagnostique qu'épidémiologique.

Pour que l'outil de quantification de la flore bactérienne intestinale soit performant, sensible et reproductible il faut qu'en amont la technique utilisée pour l'extraction à partir des selles de l'ADN procaryotes (Bacteria et Archaea) permette l'extraction de la totalité des

ADN. Pou r ce faire, les inventeu rs ont mis au point une techniq ue d'extraction de l'ADN en alternant lyse mécanique et lyse enzymatiq ue, qu'ils ont contrôlée en introduisant dans une sel le témoin des quantités connues de procaryotes (Bacteria, Archaea) dont l'extraction de l'ADN est difficile du fait de la présence d'une paroi cellu laire pa rticulièrement épaisse comme par exemple Methanobrevibacter smithii. En effet, il ne peut y avoir de q uantification fia ble sans une extraction optimale de l'ADN . Les inventeurs ont optimisé toutes les étapes d'extraction de la lyse des bactéries jusqu'a u choix de la méthode d'extraction qu'elle soit manuelle ou automatique, en tenant compte de l'efficacité et de la reprod uctibilité de la méthode. Enfin, les inventeurs ont comparé la technique d'extraction retenue avec celle util isée par les principaux auteu rs qu i ont publ iés su r ce sujet, comme décrit dans l'exemple 1.

La méthode d'extraction d'ADN, ainsi que les outils de quantification par PCR en temps réel développés par les inventeu rs, leur ont permis de confirmer q ue Methanobrevibacter smithii était présent chez 100% des individus, à des taux très variables, notamment selon leur statut pondéral .

Les inventeu rs en ont déduit l'intérêt d'analyser systématiq uement dans les sel les la présence de Methanobrevibacter smithii, au moins à titre de contrôle de la qualité d'extraction de l'ADN des selles dans l'échantil lon testé.

De même, il a été découvert que l'autre procaryote méthanogène

Methanosphaera stad manae, n'était présente que dans les selles de 38% des ind ividus. C'est cette donnée supplémentaire qu i a également cond uit les inventeurs à proposer la détection de Methanobrevibacter smithii à titre de témoin d'u ne bonne extraction de l'ADN .

Ainsi, la présente invention fou rnit une méthode de détection et de préférence de quantification de l'ADN comprenant le cas échéant l'ADN procaryote, extrait d'un échantillon de selles d'un individu, ca ractérisé en ce que l'on contrôle la qual ité de l'extraction de l'ADN en vérifiant si l'on y détecte un ADN spécifiq ue de Methanobrevibacter smithii, de préférence quantifié à u n ta ux d'au moins 10 ⁴ organismes M . smithii/ml de dit échantillon de selles.

On comprend que l'on ne prend ra pas en compte les résultats de détection et quantification d'u n ADN quelconque recherché, extrait d udit échantillon, si le contrôle de la qualité de l'extraction est négatif, c'est- à-d ire si on ne détecte pas ladite séquence spécifique de M . smithii dans l'ADN extrait dud it écha ntillon .

Pl us particulièrement, on quantifie le nombre de copie d'ADN d'au moins une séquence d'ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii par PCR quantitative, choisie parmi les séquences spécifiques suivantes :

- u ne séquence tirée du gène tirée du gène 16S de l'ARN ribosomal, SEQ. ID. N° l =

5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTCGCGCCCCTAGCTTTCGTCCCTCACCGTC AGAATCGTTCCAGTCAGACGCCTTCGCAACAGGCGGTCCTCCCAGGATTACAGA ATTTCACCTCTACCCTGGGAG -3', et,

- u ne séq uence tirée d u gène rpoB, SEQ. ID. N°5 =

5'-AAGGGATTTGCACCCAACACAATTTGGTAAGATTTGTCCGAATGAAAC CCCAGAGGGTCCTAACTGTGGTC -3'

Pl us particulièrement encore, on q ua ntifie le nombre de copies dudit ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii pa r PCR quantitative en temps réel comprenant la coampl ification enzymatique de type PCR d'u ne séq uence spécifique de Methanobrevibacter smithii contenue d'u ne part dans led it ADN extrait de l'échantillon de sel les, et d'a utre part dans u n échantillon des fragments d'ADN synthétique servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ladite séq uence spécifique de Methanobrevibacter smithii étant choisie parmi les séquences suivantes ou leurs séquences complémentaires : • une séq uence du gène 16S ARN amplifiable par les séquences amorces suivantes :

- Amorce sens, SEQ. ID. N°2 : 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3', et

- Amorces antisens, SEQ. ID. N° 3 : 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA

-3', et

• u ne séq uence du gène rpoB amplifiée par des amorces de séquences suivantes :

- Amorce sens, SEQ. ID. N°6 : 5'- AAGGGATTTGCACCCAACAC -3', et

Amorces antisens, SEQ. ID. N°7 : 5'-

GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'.

De préférence, on quantifie au moins deux séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii tirées respectivement du gène 16S ARN ribosoma l et d u gène rpoB. Les inventeu rs ont en effet observé qu'u ne détection Metha nobrevibacter smithii chez 100% des individus, requiert de réaliser la détection su r deux gènes, de préférence, la quantité de M . smithii étant quantifiée à un taux d'au moins 10 ⁴ organismes M . smithii/ml dans ledit échantillon de sel les. En effet, u ne quantification de 10 ⁴ organismes/ml d'échantillon de selles correspond au seu il de sensibilité de détection en dessous d uq uel on ne détecte pas d'ADN avec les amorces SEQ. ID. n°6 et 7 pour le gène rpoB de M . smithii et les amorces SEQ ID. n° 2 et 3 pour le gène 16S ARN de M . smithii.

De préférence, on met en œuvre des réactions d'a mplification et quantification par PCR en Temps Réel, à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques de Methanobrevibacter smithii.

La technique de PCR en Temps Réel, consiste en u ne PCR classique en util isant des amorces de séquence directe et inverse, et comprend une détection du prod uit amplifié basée su r la mesure d'émission de fluorescence proportionnel le à la quantité de gènes ampl ifiés avec une sonde dite « d'hydrolyse ». Pour cela, ladite sonde est marq uée par un émetteur de fluorescence ou fluorophore en 5' et un agent bloquant l'émission de fluorescence en 3'. Cet agent bloquant absorbe la fluorescence émise lorsq ue le fluorophore et l'agent bloquant sont proches. Lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont séparés, l'émission de fluorescence n'est pl us absorbée par l'agent bloquant. Lors de son passage, la Taq polymérase entraîne une hydrolyse de la sonde et donc une libération des nucléotides et d u fluorophore en sol ution . L'émission de fl uorescence sera donc proportionnelle au nombre d'amplifiat. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser u ne sonde hybridée sur l'ADN à copier, cette hydrolyse permettant l'émission de fluorescence, laquel le permet une quantification. Au cou rs de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introdu isant dans le mélange réactionnel deux a morces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux autres amorces et sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec des fluorophores différents.

De préférence encore, on met en œuvre un grand frag ment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand frag ment d'ADN synthétiq ue regroupant desdites séquences spécifiq ues respectivement de chacune desdites bactéries ou espèce procaryote dont les concentrations sont quantifiées. La présence de plusieurs cibles molécu laires sur un même frag ment nucléique permet de quantifier des cibles d ifférentes dans un même échantil lon et de les coquantifier de façon homogène, la q uantification en utilisant la même ga mme d'étalonnage de plusieu rs espèces molécu laires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'une détermination à l'autre au cou rs du temps et évite les biais liés au témoin positif. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5'→3' .

Pl us particul ièrement, on réalise une réaction d'amplification et quantification par PCR en temps réel, en mettant en œuvre des sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement de chacune desdites séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii, à savoir :

1) pour la séquence d u gène 16S ARN ribosomal,

SEQ. ID N°4 = 5'-CCGTCAGAATCGTTCCAGTCAG -3', et

2) pour la séquence du gène rpoB,

SEQ. ID N°8 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG -3', et

- u n g rand fragment d'ADN synthétique servant de sta ndard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant des d ites séquences spécifiques, de préférence sous forme de plasmide, avec une plu ral ité d'échantillons de grand fragment d'ADN synthétique de concentrations différentes connues.

Les séquences des cibles moléculaires amplifiées présentent la structure su ivante, avec les séq uences amorces encadrées et les séquences sondes encadrées et en ital iq ue :

- Pou r SEQ. ID. N°l :

CCGGGTATCTAATCCGGTTCGCGCCCCTAGCTTTCGTCCCTCACCGTCAGAATCG TTCCAGTCAGACGCCTTCGCAACAGGCGGTCCTCCCAGGATTACAGAATTTCACC

TCTACCCTGGGAG , et.

Pou r SEQ. ID. N°5 : AAGGGATTTGCACCCAACACAATTTGGTAAGATTTGTCCGAATGAAACCCCAGAG GGTCCTAACTGTGGTC

Les inventeurs ont donc développé un outil de quantification ayant pour cibles des séquences permettant de quantifier spécifiquement et fidèlement : (I)- les Firmicutes (Fi), (2)- les Bacteroidetes (Ba), (3)- les Lactobacillus (La) afin de connaître par PCR en temps réel quantitative la composition relative du microbiote intestinal de sujets obèses, de sujets minces et de sujets présentant une anorexie mentale.

Plus précisément, dans une méthode selon l'invention, on quantifie en outre conjointement dans ledit ADN extrait dudit échantillon de selles, au moins une séquence spécifique choisie parmi :

1) une séquence consensus spécifique du phylum Bacteroidetes, et

2) une séquence consensus spécifique des bactéries du genre

Lactobacillus, et

3) une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes.

On entend par "séquence spécifique" une séquence du génome de ladite espèce Methanobrevibacter smithii, dudit gène Lactobacillus ou dit phylum Bacteroidetes ou Firmicutes, que l'on ne retrouve dans aucun autre génome de microorganismes ou organismes vivants.

On entend ici par "séquence consensus spécifique" une séquence du génome de ladite espèce Methanobrevibacter smithii, dudit genre Lactobacillus ou, respectivement, dudit phylum Bacteroidetes ou phylum Firmicutes, que l'on retrouve dans toutes lesdites souches de ladite espèce dit genre ou dit phylum et qu'on ne retrouve dans aucun autre génome de microorganisme ou organisme vivant.

En ce qui concerne les bactéries Firmicutes, les inventeurs ont développé un jeu d'amorces et de sondes originaux tirés du gène 16S de 1'ARN ribosomal . Et, s'agissant de Bacteroidetes, une sonde tirée du gène 16S-RNA avait été décrite dans un article Armougon Raoult de BMC Genomics 2008,9 : 576, mais sans les amorces, de sorte qu'il fallait trouver des séquences amorces encadrant la séquence sonde connue, qui optimise le ratio sensibilité/spécificité, en d'autres termes, trouver des séquences amorces encad rant la séquence sonde et que l'on retrouve dans toutes les bactéries d u phylu m Bacteroidetes concerné et que l'on ne retrouve pas dans les autres phyla, notamment Firmicutes.

Pou r ce faire , les inventeurs ont cherché in silico des rég ions du gène codant pour la portion 16S des ARN ribosomiaux permettant l'a mplification de la quasi-totalité des Bacteroidetes d'une part et des Firmicutes d'autre pa rt éliminant tous risques de réactivité croisée entre les deux grou pes. Ces différents systèmes amorces et sondes étant choisis en accord avec les contingences expérimentales les réactivités croisées ont été testées in silico puis expérimentalement en utilisant les ADN extraits à partir de bactéries souches. Les systèmes d'amorces et sondes retenus pour reconnaître les Bacteroidetes ne reconnaissent expérimentalement aucu n ADN provena nt des souches de Firmicutes et vice et versa.

Pou r la cible Lactobacillus, les inventeu rs ont choisi la cible sur le gène tuf et un couple d'amorces et u ne sonde ont été choisis en accord avec les contraintes techniques de la PCR en temps réel . A partir de l'ADN de 20 souches de Lactobacillus non reconnues par le couple d'a morce et la sonde correspondant à la cible molécula ire choisie, 20 séquences d u gènes tuf non déposées dans les Genbank ont été amplifiées et séquencées, des séquences consensus d'amorces et de sondes ont été choisies et testées su r 96 ADN de souches Lactobacillus. Ce système a morces et sondes qu i permet l'ampl ification du maximum de souches de Lactobacill us est conservé.

Les séq uences de Lactobacill us sp sélectionnées présentent u ne plus grande sensibilité et reconnaissent u n plus grand nombre de bactéries que cel les décrites dans la technique antérieu re.

Pl us particu lièrement, on réal ise u ne méthode d'ampl ification quantitative par PCR à l'aide des amorces suivantes :

• pour lad ite séq uence consensus spécifique du phylum

Bacteroidetes : - amorces sens : SEQ. ID N°9 = 5'-AGCAGCCGCGGTAAT-3',

- amorces antisens : SEQ. I D N° 10 : 5'-CTAHGCATTTCACCGCTAC-

3',

• pour ladite séq uence consensus spécifique de bactéries du genre Lactobacillus :

- amorces sens : SEQ. ID N°13 = 5'- TACATYCCAACHCCAGAACG - 3',

dans laquelle Y désigne C ou T, H désig ne A ou C ou T, et

- amorces antisens :

SEQ. ID N° 14 = 5' AAGCAACAGTACCACGACCA -3'.

• pour lad ite séquence consensus spécifiq ue du phylum Firmicutes

- amorces sens : SEQ. ID N° 17 = 5'- GTCAGCTCGTGTCGTGA-3', et

- amorces antisens : SEQ. I D N° 18 = 5'-CCATTGTAKYACGTGTGT- 3'

dans laquelle K désigne G ou T et Y désigne C ou T.

Pl us particulièrement encore, on met en œuvre des réactions d'amplification et quantification par PCR en temps réel à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques choisies pa rmi les séquences su ivantes :

1) pour ladite séquence spécifique du phylu m Bacteroidetes :

SEQ. ID N ⁰ I l = 5'-GGGTTTAAAGGG-3'

2) pour ladite séquence consensus spécifiq ue de bactéries du genre Lactobacill us :

SEQ. ID N° 15 : 5'-AAGCCATTCTTRATGCCAGTTGAA -3', dans laq uelle R désigne A ou G.

3) pour ladite séquence consensus spécifiq ue du phylum Firmicutes :

SEQ. ID N° 19 : 5'-GTCAANTCATCATGCC-S',

dans laquelle N désigne, soit I, soit l'un de A, T, C ou G .

Lesdites séq uences spécifiques ainsi détectées et a mplifiées correspondent à :

1) une séquence spécifiq ue du gène 16S ARN ribosomal de Bacteroides frag ilis,), SEQ. N°12 =

5'-AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTG

GGTTTAAAGGGAGCGTAGGTGGACTGGTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTC AACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGTCAGTCTTGAGTACAGTAGAGGTGGGCGG AATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAG -3'

2) une séq uence consensus spécifique de la bactérie Lactobacill us sp commune aux bactéries Lactobacillus crispatus, Lactobacill us jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners et Lactobacill us acidophilus, au sein du gène tuf coda nt pou r le facteur d'élongation, SEQ. ID N° 16 =

5' -TACATCCCAACTCCAGAACGTGATACTGACAAGCCATTCTTAATGCCA GTTGAAGACGTATTTACTATCACTGGTCGTGGTACTGTTGCTT -3', et

3) une séquence consensus spécifiq ue tirée du gène 16S ARN ribosoma l de Clostrid iu m difficile du phylum Firmicutes, SEQ. ID N°20 =

5'-GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA

ACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGT GACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCT GGGCTACACACGTGCTACAATGG -3'. Les séquences amorces sens et les séquences inverses complémenta ires de l'amorce antisens sont encadrées et les séquences sondes sont encadrées et en italique.

Les séquences SEQ. ID. N° l à 20 décrites ci-dessus sont spécifiées dans le listage de séquences annexé à la présente description.

A la position correspondant à un nucléotide H, N, R, T ou Y da ns les séquences SEQ. ID. N ⁰ IO, 13, 15, 18 et 19, on trouve, dans les séquences cibles complémentaires, des nucléotides variables comme défini ci-dessus.

Les oligonucléotides de séquences SEQ. ID. N°10, 13, 15, 18 et 19 sont donc mis en œuvre, en fait, sous forme de mélanges équ imolaires d'oligonucléotides de séquences différentes, lesd its oligonucléotides de séquences différentes répondant pou r chaq ue séquence SEQ. ID. n° 10, 13, 15, 18 et 19 aux diverses définitions possibles des séquences respectivement n°10, 13, 15, 18et 19, à savoir :

- un mélange équ imolaire de 3 séquences différentes pour SEQ. ID. N ⁰ IO pou r lesq uelles H est A, C et respectivement T,

- un mélange équ imolaire de 2 séquences différentes pour SEQ. ID. N°13 pour lesquelles Y est C et respectivement T,

- un mélange équ imolaire de 2 séquences différentes pour SEQ. ID. N°15 pour lesquelles R est A et respectivement G,

- un mélange équ imolaire de 4 séquences différentes pour SEQ. ID. N° 18, pou r lesq uelles KY sont respectivement GC, GT, TC, et TT,

- un mélange équ imolaire de 4 séquences différentes pour SEQ.

ID. N°19 pour lesquelles N représente A, T, C et respectivement G (lorsque N représente l'u n de A, T, C ou G. En revanche, lorsque N est I (inosine), l'oligonucléotide présente u ne seu le séquence.) Ces mélanges éq uimolaires d'oligonucléotides sont obtenus en mettant en œuvre, lors de la synthèse oligonucléotidique, des mélanges éq uimolaires des d ifférents nucléotides concernés.

Plus particu l ièrement, pour l'ampl ification de ladite séq uence spécifique du phylum Bacteroidetes, on réalise l'étape d'hybridation des amorces et d'élongation à 48°C.

De préférence, on met en œuvre un g rand fragment synthétiq ue d'ADN servant de sta ndard de quantification, ce standa rd qu i contient les séq uences spécifiques des différentes cibles moléculaires sélectionnées précédemment. La présence de plusieurs cibles sur le même fragment permet de q uantifier des cibles différentes dans le même échantil lon et de les co-quantifier de façon homogène en util isant la même gamme d'étalonnage pou r détecter des cibles moléculaires différentes dans la mesu re où les contraintes du choix des amorces et de la sonde le permettent. Cette gamme d'étalonnage conservée dans le temps est le garant de la stabilité d u système de quantification. Cette ga mme d'étalonnage est dil uée de 10 ⁷ à 1 copies de chacu ne des cibles moléculaires pour 5 μl d'échantil lon d'ADN .

Avantageusement, lesdites concentrations Fi (bactérie du phyla Firmicutes), Ba (bactérie du phyla Bacteroidetes) ou La (bactérie Lactobacillus sp) sont déterminées par amplification enzymatique de type PCR en temps réel et quantification de l'ADN desdits fragments d'ADN de séq uences spécifiq ues des bactéries du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus.

De préférence, on détermine lesdites concentrations de bactéries par co-amplification enzymatique du type PCR en temps réel desdits fragments d'ADN de séq uences spécifiq ues respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacil lus contenus d'u ne pa rt dans ledit ADN extrait de l'échantillon, et d'a utre part dans des écha ntillons d'ADN synthétiques comprenant chacune desdites séquences spécifiq ues desdites bactéries servant de standards d'étalonnage de quantification de l'ADN, lesdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus présentant une taille de 70 à 150 nucléotides de préférence de 90 à 120 nucléotides.

La détection et la quantification desdits fragments amplifiés sont réalisées à l'aide de sondes marquées de séquences distinctes de celles des amorces d'amplification et encadrées par celles-ci, pour chacun desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques respectivement du phylum Firmicutes et Bacteroidetes et du genre Lactobacillus, les marqueurs des différentes sondes sont des marqueurs différents entre eux, notamment les marqueurs fluorescents connus de type VIC et FAM.

Plus particulièrement, lesdites séquences consensus spécifiques desdites bactéries sont tirées de :

- pour le phylum Firmicutes : un fragment du gène 16S ARN ribosomal de Clostridium difficile aux positions 1026 à 1203 dont le numéro d'accession dans la banque ribosomal RDP-II ((http://rdp.cme. msu .edu/) est S000260455.

- pour le phylum Bacteroidetes : le fragment des positions 537 à 721 du gène 16S ARN ribosomal de Bacteroides fragilis dont le numéro d'accession dans la banque ribosomal RDP-II est S000000037.

- pour les bactéries du genre bactérie Lactobacillus, une séquence de 90 bases, commune aux bactéries Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ineri et Lactobacillus acidophilus au sein du gène tuf codant pour le facteur d'élongation aux positions 253 à 343 du gène de référence GenBank AY 5621 91.1.

- Pour l'Archae Methanobrevibacter smithii, une séquence de 123 bases du gène 16S ARNr spécifique de l'Archae Methanobrevibacter smithii en position 740 à 862 du gène 16S ARNr de référence Genbank CP000678. On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter et de la quantifier de façon spécifique grâce à la mesure de l'accroissement de la fluorescence liée de la réaction de PCR.

La sonde permet de détecter l'ADN spécifique amplifié et de le quantifier par comparaison de l'intensité du signal avec celui du standard de quantification.

On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymérase amplifiera dans la réaction de PCR.

Au total, les résultats cliniques conduisent les inventeurs à estimer qu'un procédé de détermination du statut de la flore intestinale d'un individu comprend avantageusement la quantification des deux phyla Bactéroïdes et Firmicutes, d'une part, et, d'autre part, des bactéries du genre Lactobacillus et de l'espèce Methanobrevibacter smithii.

Ainsi, on réalise la quantification des quatre dites séquences spécifiques respectivement de Methanobrevibacter smithii, du genre Lactobacillus, du phylum Bacteroidetes et de préférence du phylum Firmicutes.

De préférence encore, on met en œuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdites séquences spécifiques respectivement de chacune desdites bactéries procaryotes. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur un même fragment nucléique permet de quantifier des cibles différentes dans un même échantillon et de les co-quantifier de façon homogène, la quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'u ne détermination à l'autre au cours d u temps et évite les biais liés au témoin positif.

Pl us particu lièrement, on met en œuvre un gra nd fragment synthétique d'ADN serva nt de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit g rand fragment d'ADN synthétiq ue reg roupant des dites séquences spécifiques respectivement de Methanobrevibacter smithii, du genre Lactobacil lus, de phylum Bacteroidetes, et de préférence de phylu m Firmicutes, de préférence encore inséré dans un plasmide.

Da ns les méthodes de quantification d'ADN pour PCR en Temps Réel, il est important de savoir si une réaction positive n'est pas due à une contamination pa r le plasmide recombinant utilisé comme standard de quantification ou comme témoin positif. Pou r résoudre ce problème, un site de coupure pa r u n enzyme de restriction est avantageusement introduit dans au moins une des cibles moléculaires. Ce site étant absent sur la séq uence natu rel le. Donc, par coupu re enzymatiq ue et analyse du fragment amplifié su r gel d'agarose, ou en utilisant u ne sonde de PCR en temps réel qui reconnaît spécifiq uement le site de restriction, on peut ainsi détecter la présence éventuelle du plasmide conta minant.

Ainsi, on peut mettre en œuvre plus particulièrement, les étapes suivantes dans lesquelles :

1. on réa lise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'a u moins une dite séq uence spécifiq ue d'au moins un desd its agents, da ns l'ADN extrait desdits échantillons selon l'invention à tester et dans l'ADN de l'échantillon standard d'éta lonnage, à l'aide d'a u moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentiq ue et ladite séquence spécifique mod ifiée;

2. on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits écha ntillons à tester, comprennent u ne d ite séquence spécifique, et 3. on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de I ¹ ADN provena nt de l'échantillon de standard d'étalonnage, par l'une au moins des éta pes suivantes :

3a . on réalise une digestion enzymatique du produ it de PCR obtenu avec une enzyme correspondant au site de clivage et analyse su r gel d'agarose du produit de digestion en compara ison avec le prod uit de PCR non digéré par l'enzyme de restriction .

Si le fragment digéré provient de l'a mplification de la cible moléculaire insérée dans le plasmide témoin, il contient le site de restriction, et il sera d'u ne taille inférieure au frag ment non digéré.

3b. on réalise une réaction de type PCR en temps réel avec des amorces directes et inverses de l'u ne des cibles moléculaires, et une sonde spécifique de ladite séq uence exogène contenant le site de restriction.

Seu l un fragment provenant du plasmide témoin et contenant la séquence exogène pourra être amplifié.

Avantageusement encore, on réal ise des réactions d'amplification et de q ua ntification en mettant en œuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hyd rolyse spécifiques de chacune des différentes bactéries dites séq uences spécifiques de chacune desd ites bactéries à tester, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantil lon à tester, telle que u ne séquence spécifiq ue de l'albu mine hu maine, et ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encad rée par des séquences aptes à servir comme amorce dans u ne réaction d'a mpl ification du type PCR desd ites séquences spécifiq ues.

Avantageusement encore, on met en œuvre u ne pluralité de réactions d'ampl ifications enzymatiq ues PCR simultanées ou non de chacu ne desdites séquences spécifiques desd ites bactéries avec le même grand fragment d'ADN synthétiq ue étalon, à l'aide d'u ne plu ralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différentes dites bactéries et lesdites amorces pouvant être mises en œuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation.

On connaît différentes méthodes pour construire un grand fragment d'ADN chimère combinant plusieurs fragments, notamment d'origine diverses, notamment la méthode décrite dans FR 2 882 063 dans laquelle on prépare un grand premier fragment d'ADN synthétique double brin de séquence déterminée comprenant un enchaînement dans un ordre déterminé d'une pluralité de n deuxièmes petits fragments d'ADN synthétiques contigus, consistant essentiellement dans la dimérisation d'une pluralité de n oligonucléotides par amplification enzymatique à l'aide d'une enzyme polymérase thermorésistante comprenant :

- une première étape de réaction d'amplification d'acides nucléiques de type PCR en présence d'une dite enzyme polymérase, d'une série de n oligonucléotides de séquences déterminées, sans amorces exogènes, comprenant une série de cycles dans des conditions de températures permettant l'hybridation desdits oligonucléotides, suivie d'une élongation du complexe obtenu, destinée à mettre bout à bout dans un ordre déterminé lesdits oligonucléotides, les séquences desdits oligonucléotides correspondant successivement et alternativement aux séquences sens et anti-sens des différents dits deuxièmes fragments synthétiques, et chaque dit oligonucléotide contenant dans ses régions 5' et 3' des séquences complémentaires de celles des oligonucléotides suivant et précédent, le cas échéant, et

une deuxième étape d'amplification à l'aide d'amorces spécifiques des extrémités 5' et 3' du dit brin directe dudit grand premier fragment synthétique à préparer, permettant de produire des copies identiques dudit grand premier fragment. Cette technique est donc basée sur l'utilisation et la maîtrise d'un artefact de la PCR, qui consiste en l'hybridation des amorces entre elles (dimérisation des amorces). Ce phénomène est observé dans le cas où les conditions de PCR, notamment de température, sont mal adaptées, et que les amorces contiennent des séquences partiellement complémentaires.

La technique de construction consiste donc, à partir des séquences cibles, à choisir les séquences des oligonucléotides, avec une alternance d'oligonucléotides de séquences directes («sens») ou inverses (encore dénommées « reverses » ou «anti-sens»). Afin de rendre possible la mise bout à bout de ces oligonucléotides, on prend soin d'introduire en 3' de la séquence d'un oligonucléotide une séquence nucléotidique complémentaire des premiers nucléotides de l'oligonucléotide suivant. Ces oligonucléotides seront hybrides par leur parties complémentaires, et grâce à l'activité polymérasique, par exemple de la Taq polymérase, une synthèse de 5' en 3' se réalise afin d'obtenir des fragments doubles brins. Le fragment final (assemblé) est synthétisé par PCR en utilisant un couple d'amorces directe et inverse correspondant aux séquences des extrémités du premier grand fragment d'ADN synthétique bicaténaire désiré.

Comme mentionné précédemment, avantageusement, lesdits grands fragments d'ADN synthétiques, sont avantageusement insérés dans un plasmide.

Cette technique de construction générique d'un fragment nucléotidique synthétique permet la mise en contiguïté de plusieurs cibles moléculaires d'intérêt. Il s'agit d'une méthode simple à mettre en œuvre, rapide et fiable, et ne nécessitant pas un équipement lourd et coûteux.

La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic et suivi du rapport Firmicutes/Bacteroidetes dans les prélèvements de selles selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend :

des échantil lons d'ADN standard d'étalonnage à u ne concentration connue comprenant desdites séquences spécifiques de chacu n desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence bactérienne universelle telle que définie ci-dessus, et de préférence encore u n dit g rand fragment d'ADN synthétiq ue regrou pa nt desdits séquences spécifiques de chacu n desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séq uence bactérienne universelle telle q ue définie ci-dessus, ainsi que

- desd its jeux d'amorces spécifiq ues desdits fragments d'ADN synthétiques mod ifiés spécifiques desd ites bactéries et de préférence encore, desdites sondes tels que définis ci-dessus, et

- des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR.

Da ns u n mode de réalisation particu lier, on réalise la quantification des dits ADN procaryotes spécifiques de la bactérie

Methanobrevibacter smithii, du genre bactérien Lactobacil lus, du phylum

Bacteroidetes et respectivement du phylu m Firmicutes, pour assurer le diagnostic et/ou le suivi du statut pondéral d'u n individu .

La méthode de quantification selon l'invention permet de corréler le suivi du statut pondéral d'une personne au suivi des teneu rs en bactéries BA (Bacteroidetes), FI (Firmicutes), LA (Lactobacillus) et M . (Methanobrevibacter smithii), notamment comme suit :

- pour les patients sou mis à u n tra itement antibiotiq ue au long cours, u ne diminution de BA (Bacteroidetes) et une aug mentation de LA (Lactobacillus) représente un risque de prise de poids, sous réserve q ue LA (Lactobacillus) soit supérieur à 10 ⁶ . pour les patients anorexiques, u ne diminution de Methanobrevibacter smithii peut être ind icatrice d'u ne l'évolution favorable de cette pathologie, spontanément ou sous l'effet d'actions thérapeutiq ues médicamenteuses ou non-médicamenteuses- pour les obèses en cours de tra itement pharmaceutique, une aug mentation de BA (Bacteroidetes) et une diminution de LA (Lactobacillus) peuvent être un ind icateur de bonne évolution du traitement.

Enfin, des complémentations ou traitements spécifiques au regard des bactéries concernées peut également contribuer à la thérapeutiq ue des sujets concernés en cherchant à diminuer spécifiquement le taux de M. (Methanobrevibacter smithii) chez les anorexiques, et aug menter le taux de BA (Bacteroidetes) et diminuer le taux de LA (Lactobacill us) chez les obèses ou les personnes en traitement antibactérien en long ue du rée.

La présente invention fournit également une trousse de détection comprenant des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'ampl ification d'ADN de type PCR et au moins un jeu d'ol igonucléotides amorces et de préférence en outre au moins u n oligonucléotide sonde d'hydrolyse utile pour u ne détection et quantification par a mpl ification par PCR, de préférence par PCR en Temps Réel, comprenant au moins des cou ples d'oligonucléotides amorces, a ptes à a mpl ifier :

au moins u ne séquence spécifique de l'Archae Methanobrevibacter smithii, et

- au moins u ne séquence choisie pa rmi :

1) une séquence consensus spécifiq ue du phylum

Bacteroidetes, et

2) u ne séq uence consensus spécifique des bactéries du genre Lactobacill us, et 3) une séquence consensus spécifiq ue du phylum Firmicutes.

Pl us particul ièrement, ladite trousse comprend a u moins l'u n des deux cou ples d'oligonucléotides amorces et, de préférence au moins l'un des oligonucléotides sondes d'hyd rolyse, aptes à amplifier l'u ne au moins desd ites séquences de Methanobrevibacter smithii tirées du gène

16S de l'ARN ribosomal et respectivement du gène rpoB suiva nts :

a) le couple d'oligonucléotides a morces de séquences SEQ. ID N°2 et SEQ. ID N°3 et, de préférence l'ol igonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°4, et

b) le couple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°6 et SEQ. ID N°7, et de préférence l'ol igonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. I D N°8.

Pl us particu l ièrement, u ne trousse selon l'invention comprend les couples d'oligonucléotides amorces avec de préférence les oligonucléotides sondes d'hydrolyse, su ivants :

a) le couple d'oligonucléotides a morces de séquences SEQ. ID N°9 et SEQ. I D N°10, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°l l pour l'amplification d'une séquence consensus spécifiq ue du phylu m Bacteroidetes et,

b) le cou ple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. I D N°13 et SEQ. ID N°14, avec de préférence u n oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°15 pou r l'amplification d'u ne séquence consensus spécifiq ue de bactéries du genre Lactobacill us et,

c) de préférence, le cou ple d'oligonucléotides amorces de séquences SEQ. ID N°17 et SEQ. ID N°18, avec de préférence un oligonucléotide sonde d'hydrolyse de séquence SEQ. ID N°19 pou r l'amplification d'une séquence consensus spécifique du phylum Firmicutes. Plus particulièrement encore, une trousse comprend en outre :

- des échantillons d'ADN standard d'étalonnage comprenant desdites séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii, de bactéries du genre Lactobacillus, phylum Bacteroidetes, et de préférence phylum Firmicutes, tel que défini ci-dessus, et

- de préférence, un dit grand fragment d'ADN synthétique tel que défini ci-dessus.

De préférence, une trousse comprend des réactifs d'extraction comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et un réactif de lyse chimique et/ou enzymatique.

La présente invention fournit également une méthode caractérisée en ce que pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit échantillon de selles, on réalise les étapes dans lesquelles :

1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, de préférence à une dilution de 50 à 150 g/1, et

2) on réa lise une lyse mécaniq ue par méla nge et agitation de lad ite suspension de l'étape 1 avec u n prod uit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, et, de préférence, on réal ise une étape de chauffage à 100°C penda nt 10 minutes, et

3) on réalise une lyse chimiq ue et/ou enzymatique par méla nge et ag itation de la suspension obtenue à l'étape 2) avec u n ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatiq ue, puis

4) on répète l'étape 2) avec le mélange obtenu à l'étape 3), et

5) de préférence, on répète l'étape 3) avec le mélange obtenu à l'étape 4) . De façon connue, on sépare in fine l'ADN soit avec des méthodes connues telles q ue par fixation sur une colonne contena nt du sil icate pu is lavage pou r él uer ladite ADN en le sépara nt de la colonne ou par lavage et centrifugation pour récupérer lesdits fragments d'ADN .

La réa lisation de la première étape de lyse méca nique permet d'optimiser et de favoriser le trava il d'agents chimiques ou enzymatiques de lyse à l'étape 2) en favorisant leur pénétration dans les micro-organismes proca ryotes permettant de dégrader partiellement les parois épaisses des micro-organismes procaryotes à paroi épaisse, et la dégradation totale des pa rois épa isses est obtenue seulement par au moins une deuxième lyse mécanique après ladite première lyse chimique ou enzymatique.

A l'étape 2), le chauffage à 100 ⁰ C permet de final iser la dégradation des composants des parois et membranes des microorgaπismes.

D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la l umière de la description détaillée q ui va suivre de différents exemples de réal isation en référence au listage de séq uence et aux figu res 1 à 4.

- La figu re 1 représente en ordonnée le pou rcentage de séquences

16S de l'ARN ribosomal et en abscisse les résu ltats pour les bactéries du phylu m Firmicutes (FI), puis les bactéries du phyl um Bacteroidetes (BA) . Les taux de sensibilité sont représentés par la première colonne en traits fins, à savoir 88,94% pour des bactéries du phylum Firmicutes et 89,89% pour les bactéries d u phylu m Bacteroidetes. Les taux de spécificité sont représentés par la deuxième colonne en g ras, à savoir 0,83% pour les bactéries du phyl um Firmicutes et 0,01% pour les bactéries du phylum Bacteroidetes.

Les valeurs entre parenthèses indiquent le nombre de séquences hybridant dans le phylum étud ié (sensibilité) et en dehors du phylum étudié (spécificité) . - La figu re 2 représente la quantification des bactéries du phylum Bacteroidetes dans les sel les collectées chez trois groupes d'ind ividus obèses (O), individus contrôle (L) et anorexiques (A).

Le nombre de copies de bactéries Bacteroidetes et porté en Ordonnée et la valeur P inférieure à 0,05 est représentée par le sig ne « * » et la valeur P inférieu re à 0,01 est représentée par « ** ».

La croix indique la moyenne ; le trait horizontal la médiane et le cu be représente la distribution des valeu rs dans l'écart type.

- La figure 3 représente la distribution des q uantités supérieures à 10 ⁶ de nombre de bactéries du genre Lactobacillus détecté et quantifié pa r le procédé selon l'invention dans les selles d'individus anorexiques (A), obèses (O) et contrôle (L).

Les chiffres en ordonnée représentent le nombre d'individus.

Sur la figure 3, I I représente le nombre de copies de Lactobacillus supérieur ou égal à 10 ⁶ , et I I représente le nombre de copies de Lactobacillus inférieur à 10 ⁶ .

La fig ure 4 représente la quantification de l'Archea Methanobrevibacter smithii selon le procédé de l'invention dans les selles des individus anorexiq ues (A), obèses (O) et contrôles (L).

La figu re 4 représente l'écart type (hauteu r du trait vertical) et la moyenne (plateau du cube), les chiffres en ordonnée étant le nombre de copies moyen de Methanobrevibacter smithii .

EXEM PLE N °l. Protocole d'extraction d'ADN selon l'invention et comparaison avec le protocole de référence publié dans la littérature, pour la détection de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les sel les.

L'Archae Methanobrevibacter smithii est un méthanogène, c'est à dire une Archae susceptible de transformer les produits de la digestion des aliments en méthane CH4. Cependant, Methanosphaera stadtmanae est également une Archae métha nogène détectée dans les sel les. Les inventeurs ont parié sur le fait que, éta nt donné l'importance de la réaction biochimique de méthanogenèse pou r la physiologie intestinale, l'Archae Methanobrevibacter smithii et non pas Methanosphaera stadtmanae était présente et détectable dans les selles chez tous les ind ividus. Cette hypothèse a été ensu ite vérifiée et les inventeurs ont observé que Methanobrevibacter smithii était effectivement détectée chez presque tous les individus en combinant la détection du gène 16S ARN ribosoma l avec celle du gène rpoB alors que Methanosphaera stadtmanae n'est détectée que chez moins de 40% des individus en utilisant le même système. Afin de tester cette hypothèse, les inventeurs ont imag iné devoir lyser la paroi des Archae, afin de libérer l'ADN des Archae pour le rendre accessible à la détection moléculaire basée sur la technique PCR. Dans ce but, les inventeu rs ont mis en place par tâtonnements successifs le protocole su ivant. Dans u n premier temps, les inventeurs ont lysé mécaniquement les prélèvements par ag itation en présence de poudre de verre, suivie d'u ne lyse chimiq ue, puis ils ont extrait l'ADN . Les résultats ont montré que seu lement 4/10 (40%) des prélèvements de selles provenant de 10 individus différents présentaient une détection positive de l'ADN de Methanobrevibacter smithii. Afin d'amél iorer encore l'efficacité du protocole, les inventeurs ont alors imaginé d'ajouter une deuxième étape de lyse mécaniq ue par la poudre de verre et ont obtenu u ne détection de l'ADN de Methanobrevibacter smithii dans 10/10 (100%) des mêmes prélèvements de selles. Egalement, l'ajout d'une deuxième étape de lyse méca nique a permis de façon imprévue d'augmenter de un à deux log . le seu il de détection des prélèvements positifs par PCR temps-réel .

Un protocole objet de l'invention est donc le suivant :

1- environ 500 mg de sel les sont suspendus dans 5 ml de tampon Tris-HCL 0,05M pH7,3 le mélange est homogénéisé par agitation manuel le et au vortex jusqu'à obtenir u ne suspension quasiment homogène;

2- 250 μl de suspension sont introduits dans un tu be à vis de 1,5 ml contenant 0,3 g (équivalent à un volume de 10 μ l environ, soit inférieur à 4% d u volu me final) de poudre de verre dont les pa rticules mesu rent moins de 106 μm et sont lavées à l'acide pour éliminer les g raisses, les acides nucléiq ues et les DNAses et les RNAses qui proviennent éventuellement des procédés de fabrication des billes de verre (référence G4649, Sigma, Saint Quentin Fallavier, Fra nce) et ag ités dans le Fast Prep BIO 101 (Qbiogene, Strasbou rg, France) à la vitesse maximale (6,5) pendant 90 secondes;

3- la préparation est ensuite chauffée à 100°C pendant 10 minutes puis ramenée à la température a mbiante. Ensuite, u n protocole standard du Kit NucleoSpin® Tissue Mini Kit (Macherey Nagel, Hoerdt, France) et utilisé comme suit. On ajoute 180μl_ de tampon de lyse Tl et 25μl de protéinase K à 20 mg/ml . Le mélange est incubé à 56°C toute la nuit;

4- puis, on réa lise une deuxième lyse mécaniq ue comme décrite ci-dessus;

5- pu is, on réalise u ne lyse chimique de tampon de lyse d'ADN connus, à savoir 200μl de tampon B3 (mélange en proportions égales des tampons Bl [Guanid ine hydrochloride] et de tampon B2 de composition disponible auprès d u fournisseur) sont ajoutés et le méla nge est incu bé 10 minutes à 70 ⁰ C, ajouter 200μl d'éthanol, méla ngé, appliqué sur une colonne de silice, centrifugé 1min à vitesse maximale, lavé avec 500μl de tampon BW, centrifugé 1 minute à vitesse maximale, lavé avec 600 μl de ta mpon B5 centrifugé 1 minute à vitesse maximale;

6- puis, on dépose lOOμl de ta mpon BE préchauffé à 70 ⁰ C au centre de la colonne, et on laisse incuber à température ambiante 1 à 2 minutes puis éluer l'ADN pa r centrifugation 1 minute à vitesse maximale. Un témoin négatif d'extraction de 250 μL d'eau stérile est introdu it dans chaque série de prélèvements. Les ADN sont conservées à -20°C jusq u'à utilisation. Ils seront alors testés purs et dil ués au 1/10 et au 1/100 afin de mettre en évidence la présence éventuelle d'inhibiteurs de la PCR.

Cette phase de mise a u point étant faite, les inventeu rs ont comparé le protocole objet de l'invention avec le protocole de référence pour l'extraction de l'ADN des procaryotes à partir des selles. Pou r cela, les inventeurs ont collecté 50 échantillons de selles collectés chez 50 ind ividus ayant soumis des selles pour exploration d'une diarrhée. Ces 50 échantillons de sel les ont bénéficié d'une extraction d'ADN en pa rallèle par le protocole objet de l'invention et en utilisant le kit d'extraction QIAAM P Stool DNA mini kit (Qiagen, Courta boeuf, France) décrit dans la littératu re [Eckburg PB. et Al . Diversity of the hu man intestinal microbial flora . Science 2005 Vol ume 308 page 1635- 1638] .

Les principales étapes d u procédé d'extraction d'ADN de référence du kit QIAAM P sont :

1) dilution du prélèvement de selles dans un tampon de type PBS à pH = 7.4 (2) et,

2) incubation u ne nu it à 56°C, en présence de protéinase K,

3) inactivation de la protéinase K par chauffage à 70°C pendant

10 minutes, et

4) extraction de l'ADN total par filtration sur la colonne de sil icate.

Dans cet exemple, les inventeu rs ont comparé le nombre de copie de gène 16S ARN r et d u gêne rpoB par ml de sel les en util isant les deux protocoles d'extraction. Les données nu mériques ont été analysées en util isant le test non-para metric de Kruskal-Wall is dans le log iciel EPIIN FO version 3.4. 1 (center sur dix contrôlant and prévention, Atlanta, GA). Les valeurs P ont été utilisées pour montrer des différences significatives entre les deux méthodes et ont été calcu lées en utilisant la méthode non paramétrique de Kruskal-wallis pour 2 groupes. Une va leur P inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.

En utilisant la méthode de quantification par PCR, commercialisée

Qiagen, le gène 16S ADNr de Methanobrevibacter smithii a été détecté chez 44/50 (90%) des individus et le gène rpoB a été détecté chez 33/50 (66%) des individus. En utilisa nt le protocole objet de l'invention décrit à l'exemple 2, le gène 16S ARN ribosomal a été détecté selon la même méthode de détection et quantification avec les amorces SEQ. ID. n° 6 et 7 et la sonde SEQ. ID. n°8 décrite dans l'exemple 2, chez 50/50 (100%) des individus et le gène rpoB a été détecté chez 49/50 (99%) des individus avec les amorces SEQ. ID. n°2 et 3 et la sonde SEQ. ID. n°4. A partir d'u n gramme de sel les, le protocole d'extraction objet de l'invention a permis de détecter entre 2 et 3 logarithmes de pl us de copie d'ADN q ue le protocole commercia lisé Qiagen avec une valeu r P inférieure ou égale à 0,00001 pour les deux gènes ana lysés. Dans cet exemple, les contrôles négatifs sont restés strictement négatifs. Ces résultats montrent la supériorité du protocole d'extraction selon l'invention, par rapport à un protocole d'extraction habituellement utilisé et commercialisé, tant en nombre d'ind ividus détectés positifs, qu'en q ua ntité d'ADN détecté.

La q ua ntification, dans les selles, des gènes 16S ARN ribosomal et rpoB de l'Archae Methanobrevibacter smithii, extra its par u n protocole d'extraction selon l'invention en comparaison avec un protocole d'extraction commercialisé par QIAGEN (France) donne (en logarithme) le nombre de copies pou r chacu n des deux gènes.

1) Gène 16SARN ribosomal,

- Protocole selon l'invention :

valeu r moyenne 2.05e ¹⁰ , écart-type = 6.13e ^{+ 10} , médiane =

2.73e ⁰⁶ , - Protocole d'extraction QIAGEN :

valeur moyenne 2.66e ⁰⁷ , écart-type = 1.18e ⁰⁸ , médiane = 8.98e ⁰² ,

valeur P = 0.00001

2) Gène rpoB :

- Protocole d'extraction selon l'invention :

valeur moyenne 5.11e , écart-type = 1.48e , médiane =

7.73e 05

- Protocole d'extraction QIAGEN :

valeur moyenne 6.67e ⁰⁵ , écart-type = 3.36e ⁰⁷ , médiane = 4e ⁰² ,

valeur P = 0.00001

Pour la quantification de M. smithii, les inventeurs ont utilisé les séquences amorces SEQ. ID. n°2 et 3 et séquence sonde SEQ. ID. n°4 pour l'amplification du gène 16S de I ¹ ARN ribosomal de M. smithii, et les séquences amorces SEQ. ID. n°6 et 7 et séquence sonde SEQ. ID. n°8 pour l'amplification du rpoB de M. smithii. Les inventeurs ont établi des courbes d'étalonnage de quantification par PCR suivantes pour la détection de M. smithii par amplification du gène 16S ARNr et du gène rpoB, à partir de quantités connues de M . smithii obtenues par culture de M . smithii sur gélose :

Une étude ultérieure de 1 500 selles provenant de 1 500 ind ivid us différents a permis de déterminer u n seuil de détection de 10 ⁴ organismes M . smithii par ml d'échantillon de selle, basé sur la détection combinée des gènes 16S ARNr et rpoB décrits ci-dessus. Une concentration su périeure à 10 ⁴ organismes pa r ml M . smithii a été détectée chez 97% des individus. Pour les 3% restants, le seu il actuel de détection de 10 ⁴ organismes par ml d'échantillon de selle par ml n'était pas atteint.

EXEM PLE N °2. Spécificité et sensibilité d u système de détection des micro-organismes appartenant aux groupes Firmicutes et Bacteroidetes dans les selles.

La détermination d'un système PCR en temps réel sur des clades bactériens Firmicutes et Bacteroidetes a nécessité plusieu rs mois de mise au point et de tâtonnements expérimentaux. Difficultés à la fois bioinformatiques et biotechnologiques. En effet, il s'agissait pou r les inventeurs de mettre au point u ne techniq ue de détection moléculaire des deux phyla bactériens numériquement les plus représentés par le nombre de séquences 16S ARN ribosomal dans les banques électroniques de séquences. En particulier, le phylum Firmicutes est représenté par plus de 94.000 séquences (soit le phyl um le pl us important sur 70 phyla représentés dans RDP-II)[CoIe J R, Chai B, Fa rris RJ, Wang Q, Kulam-Syed-Mohideen AS, McGa rrel l DM et al. : The ribosomal database project (RDP-II) : introducing myRDP space a nd quality control led public data. Nucleic Acids Res 2007, 35 : D169-D172] de 16S ARN ribosomal dans la base de données ribosomal RDP-II. Egalement, le phylum Bacteroidetes est représenté par plus de 34.000 séquences (seul le phyl um Protebacteria est pl us important que celui des Bacteroidetes) . Identifier u n système de 3 frag ments de séquences (amorces et sonde) ciblant la quasi-totalité des espèces des phyla Firmicutes et Bacteroidetes respectivement était u n véritable défi d'autant plus que le système se devait a ussi d'être spécifique ; à savoir qu'un minimum d'espèces en dehors du phylum considéré ne devait être détectable. Ces frag ments de séq uences éta nt déterminées, il a fall u les modifier et adapter les conditions expérimenta les afin que la sensibilité des réactions de PCR en temps réel soit optimale, et surtout qu'il n'y ait pas de détection croisée entre les différents systèmes d'amorces et de sondes dégénérées mises en jeux. Pu is, les spécificités ont été testées en utilisant le maximu m d'ADN de souches bactériennes de référence à différentes concentrations. Il fallait également, sans diminuer la sensibilité de la réaction de PCR, supprimer les fixations pa rasites sur le mil ieu réactionnel dues au fait q ue l'on qual ifie des bactéries qui sont présentes partout dans l'environnement et en grande quantité.

La d ifficu lté, l iée nota mment à la faible variabilité de la séquence nucléique d u gène 16S ARN ribosomal (beaucou p de régions conservées), était donc d'identifier des amorces de PCR et une sonde

(1) dans une rég ion limitée en taille (200 bases au maximu m pour être compatible avec u n système de détection par PCR en temps réel) (2) avec des températures d'hybridation en cohérence avec le système (au minimum 10°C su pplémentaires pour la température de fusion (Tm) de la sonde par rapport à celle des amorces) (3) avec des séquences nucléiq ues le plus faiblement dégénérées possible afin de conserver u ne possibilité d'hybridation de la sonde.

En prenant l'exemple d u système PCR en temps réel pou r le phylu m Firmicutes, plusieu rs mises a u point ont été nécessaires. La sonde ou signatu re de base d u clade Firmicutes déterminée in silico possédait en son cœur u ne suite de bases indéterminées (N) : TCATGCCN[16]ACA. Les inventeurs ont donc tâtonné pour allonger le motif TCATGCC et obtenir la spécificité ainsi perdue via le design des amorces et le tout dans une région devant correspondre à une amplification inférieure à 200 bases environ. Finalement le système PCR en temps réel mis au point pour le clade Firmicutes est une recherche de complémentarité entre les 3 éléments (amorces +sonde). Prise individuellement, chacune des séquences (amorces et sonde) est très sensible au clade Firmicutes mais pas forcément très spécifique. En revanche, la réunion des 3 séquences amorces et sondes SEQ. ID. N°17, N°18 et N°19 confère une grande spécificité et sensibilité pour une utilisation dans la PCR quantitative en Temps Réel.

De même, les trois séquences amorces et sondes SEQ. ID. N°9, N°10 et N°ll pour les bactéries Bacteroidetes confèrent également une grande spécificité et sensibilité pour une utilisation dans la PCR quantitative en Temps Réel.

Cette spécificité est montrée dans cet exemple dans lequel la séquence des amorces a été synthétisée par la société Eurogentec (Seraing, Belgique) et la séquence des sondes a été synthétisée par la société Applied Biosystem. Les réactions d'amplification PCR ont été réalisées sur un appareil MX3000™ System (Stratagene Europe, Amsterdam, Pays-Bas) en utilisant le kit QuantiTect PCR mix de la société Qiagen (Courtaboeuf, France) et 5 pmol de chaque amorce et sonde, 5 μl d'ADN extrait de chacune des 108 espèces bactériennes rapportées dans le Tableau 1 après dilution au 1/10, 1/100, 1/1000, le tout sous un volume réactionnel final de 25 μl. Le programme de PCR en temps réel comportait pour la détection des Bacteroidetes: 95°C 15 min, puis 45 cycles de 95°C 30s, 48°C 45s, 72°C 1 min), et, pour la détection des Firmicutes et des Lactobacillus et Methanobrevibacter smithii: 95°C 15min, puis 45 cycles de 95°C 30s, 60°C 1min. Les concentrations des quantités de sondes et d'amorces ont été adaptées pour chacun des systèmes afin de conserver leur efficacité, Les résultats indiquent que le système de détection des Bacteroidetes présente une sensibilité de 89.89% pu isqu'il détecte 30.237 des 33.639 séquences 16S ARN ribosomal des bactéries du phylu m Bacteroidetes dans la base de données RDP-II (Figu re 1) et que le système de détection des Firmicutes présente une sensibil ité de 88.94% puisqu'il détecte 83.576 des 93.969 séquences du gène 16S ARN ribosomal des bactéries d u phyl um Firmicutes de la base de données RDP-II. L'util isation des deux systèmes de détection Firmicutes et Bacteroidetes sur la base de données RDP-II excluant ces deux phyla ind iq ue un taux de détection faussement positive de 0,83% pour Firmicutes et de 0,01% pour Bacteroidetes.

De même, les systèmes des séquences SEQ. ID. N°2 et N°3 (amorces) et N°4 (sonde) pour le gène 16S de l'ARN ribosomal de Methanobrevibacter smithii et les séquences SEQ. ID. N°6 et N°7 (amorces) et N°8 (sonde) pour le gène rpoB de Methanobrevibacter smithii, ainsi q ue les séquences SEQ. ID. N°13 et N°14 (amorces) et N°15 (sonde) pou r les séquences du gène tuf de Lactobacillus spp. décrites précédemment confèrent u ne gra nde spécificité (99%) et sensibilité (< 50 copies) pour une util isation dans la PCR en Temps Réel .

Les résultats d u tableau 1 sont exprimés en CT, à savoir le nombre de cycles d'amplifications nécessaires pour que l'ampl ification commence, cette valeur de CT en relation avec la concentration du produit nucléique à q uantifier, à savoir que pl us le CT est bas, pl us la concentration est élevée.

Pour la quantification, on a construit un plasmide d'étalonnage comprena nt u n g rand fragment d'ADN synthétique hybride contenant les séquences SEQ. I D. N°l, N°2, N°12, N° 16 et N°20, sous forme de frag ment d'ADN double-brins construit par réaction d'amplification, tel que décrit dans FR-2 882 063. On a créé une gamme plasmidique d'étalonnage de 10 ⁷ dont une copie par puits, pour chaque réaction d'amplification, les dix points de la gamme plasmidique sont testés.

EXEM PLE N°3. Analyse des flores bactériennes et Archae par le procédé de l'invention et statut pondéral des individus.

Plusieurs travaux ont montré que la composition de la flore digestive jouait un rôle dans l'obésité, y compris des travaux expérimentaux chez la souris [Samuel BS, Gordon JI : A humanized gnotobiotic mouse model of host-archaeal-bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103: 10011-10016; Ley RE, Backhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, Gordon JI: Obesity alters gut microbial ecology. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102 : 11070-11075; Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, Magrini V, Mardis ER, Gordon JI : An obesity- associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 2006, 444: 1027-1031]. En particulier, il a été montré que le ratio Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) était associé au phénotype obèse ou contrôle non-obèse, du à une réduction de la proportion de Bacteroidetes chez les personnes obèses, ce qui est étonnant car la bactérie Bacteroides thetaiotaomicron a été associée à l'augmentation de l'obésité [Samuel BS, Gordon JI : A humanized gnotobiotic mouse model of host-archaeal-bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103 : 10011-10016] . Il a été montré que, au cours d'un régime alimentaire amaigrissant, la diminution du ratio F/B chez les patients obèses sous régime était corrélée avec la perte de poids, suggérant que la modulation de ce ratio pouvait constituer une intervention thérapeutique [Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI: Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature 2006, 444: 1022-1023]. Les promoteurs de la prise de poids comme les bactéries du genre Lactobacillus pourraient être impliqués dans ces interventions thérapeutiques, leur rôle ayant été montré dans l'engraissement des animaux de rapport [Khan M, Raoult D, Richet H, Lepidi H, La Scola B: Growth-promoting effects of single-dose intragastrically administered probiotics in chickens. Br Poult Sci 2007, 48: 732-735]. Cependant, la mesure du ratio F/B n'est réalisée actuellement que par des méthodes de métagénomiques, de puce ADN et de séquençage de larges librairies de clones du gène 16S ARN ribosomal, qui sont du domaine de la recherche mais ne sont pas applicables en routine diagnostique. Les inventeurs ont donc pensé utiliser l'invention pour déterminer de manière fiable le ratio F/B par une technique de PCR temps réel, applicable en routine. Après avis favorable du Comité d'Ethique, la technique de quantification selon l'invention a été appliquée à une population de 20 personnes obèses (17 to 72 ans; indice de masse corporelle IMC= 47.09± 10.66), de 20 personnes contrôles (non-obèses, non-anorexiques ; (13 to 68 ans; IMC = 20.68±2.014) et de 9 personnes présentant une anorexie mentale (19 to 36 ans; IMC= 12.73 ± 1.602).

Les résultats (Tableau 2) indiquent que la quantification des

Firmicutes est comparable pour les trois groupes. Les inventeurs ont donc observé que contrairement aux données publiées dans la littérature, les selles des personnes obèses présentent une plus faible quantité de Bacteroidetes (Figure 2) avec une différence statistiquement significative entre le groupe obèses et contrôles d'une part (** p<0.01), et entre le groupe anorexie et contrôle, d'autre part (*p<0.05). Le nombre de Lactobacillus est plus élevé chez les personnes obèses bien que la différence avec les deux autres groupes ne soit pas statistiquement significative. Cependant, en utilisant une valeur seuil de 10 ⁶ Lactobacillus, la différence du nombre de Lactobacillus entre personnes obèses et contrôles (p = 0.0197) et anorexiques (p= 0.0332) est significative (Figure 3).

La détection systématique et la quantification de

Methanobrevibacter smithii ont permis aux inventeurs d'observer que le nombre de Methanobrevibacter smithii (Figure 4) est plus élevé chez les obèses que chez les contrôles avec un ratio obèses/contrôles de 1.72 mais cela de façon non statistiquement significative. En revanche, les inventeurs ont observé de façon imprévue que le nombre de Methanobrevibacter smithii était plus important chez les anorexiques, d'un facteur 3 et 5 respectivement par rapport aux contrôles et aux obèses et que la quantité de Methanobrevibacter smithii était significativement plus importante chez les anorexiques que chez les obèses (p = 0.0501). Le taux de Methanobrevibacter smithii est donc intéressant à relever pour une personne suspectée d'anorexie. Au total, les obèses ont une flore digestive pauvre en Bacteroidetes et riche en Lactobacillus. La flore des anorexiques est similaire à celle des contrôles pour les quantités de Firmicutes, Bacteroidetes et Lactobacillus mais contient plus de Methanobrevibacter smithii. Le procédé de détection et de quantification des composants bactériens du microbiote utilisé et proposé par les inventeurs, permet la détection et la quantification spécifique, fiable, rapide et répétitive de ces quatre groupes de microorganismes dans un grand nombre d'échantillons de selles. Ce procédé peut être très facilement utilisé en pratique courante dans les laboratoires.

Tableau 1. Liste des ADNs microbiens utilisés pour déterminer la sensibilité / spécificité des PCRs en temps réel pour la détection des microorganismes appartenant aux groupes Firmicutes et Bacteroidetes, dans les selles.

A = ADN extrait des 108 souches testé par PCR en temps réel par le système Bacteroidetes.

B = ADN extrait des 108 souches testé par PCR en temps réel par le système Firmicutes.

(Les résultats sont exprimés en Ct; les valeurs en caractères gras indiquent les espèces bactériennes pour lesquelles il existe un défaut de spécificité du système).

Tableau 2. Quantification, selon le procédé de l'invention, des bactéries des phyla Bacteroidetes, Firmicutes, Lactobacillus et de l'Archae Methanobrevibacter smithii dans les selles de 49 individ us contrôles (lean), obèses (Ob) ou présentant u ne maigreur liée à une anorexie mentale (ano).