MÉTODO PARA O DESENVOLVIMENTO DE LINHAS DE CÉLULAS

ESTAMINAIS

Domínio Técnico

[0001] A presente divulgação refere-se a um método para o desenvolvimento de linhas celulares estaminais e produtos derivados. Este método pertence aos campos da biologia molecular e cultura de células, e pode ser aplicado em medicina, de preferência na área de transplantação.

[0002] O método agora divulgado permite a obtenção de linhas celulares para uso imediato (do inglês off-the-shelf) preparadas para a perda de um ou mais cromossomas nativos específicos, bem como a sua substituição por cromossomas exógenos equivalentes. Numa realização, o presente método permite criar linhas celulares estaminais humanas preparadas para a perda do par de cromossomas 6 indígena (linhas universais off-the-shelf) e simultaneamente obter a sua substituição pelo par de Cromossomas 6 de um paciente. Deste modo, todas as células resultantes da sua posterior diferenciação, serão portadoras do exato e total complexo principal de histocompatibilidade do paciente, solucionando o problema da incompatibilidade principal em alo- transplantação .

[0003] A presente divulgação descreve um novo tipo de transplantação : alo-auto-transplantação. Antecedentes

[0004] Apesar de ser uma prática comum na atualidade, existem ainda constrangimentos na transplantação de células, tecidos ou órgãos entre seres humanos. Para além da enorme falta de órgãos para transplantar, várias síndromas de rejeição podem acontecer após transplante, levando à destruição do órgão transplantado pelo sistema imunológico do hospedeiro ou, como no caso dos transplantes de Progenitores Hematopoiéticos, à lesão de múltiplos órgãos do hospedeiro por células transplantadas, conhecida como doença do enxerto contra o hospedeiro, (do inglês Graft Versus Host Dísease - GVHD).

[0005] As rejeições são a consequência do reconhecimento pelo sistema imunitário de diferenças entre as proteínas expressas na membrana celular das células do dador e as do hospedeiro. Este reconhecimento é feito a partir dos antigénios de leucócitos humanos (do inglês Human Leukocyte Antígens - HLA), dividindo-se em recetores HLA Classe I e recetores HLA Classe II. Os recetores HLA Classe I são expressos na membrana celular de quase todas as células do corpo humano. Os recetores da Classe II são expressos em células pertencentes ao sistema imunitário, designadas Células Apresentadoras de Antigénios (do inglês: Antígen Presentíng Cells - APC), como é o caso de alguns subtipos de células dendríticas, macrófagos e células B.

[0006] No entanto, este rigoroso e eficiente mecanismo, transforma-se num enorme problema sempre que um paciente necessita de um alo-transplante. Cada diferença, ainda que mínima, entre os recetores HLA das células do dador e o HLA das células do paciente/hospedeiro, desencadeará o seu tipo de Síndroma de Rejeição. A diferença é interpretada pelo sistema imunológico do hospedeiro como se uma ameaça estivesse a acontecer e por isso, uma rápida eliminação dessa ameaça é desencadeada.

[0007] Se no caso de órgãos duplos, como é o dos rins, é possível a realização de um transplante entre seres humanos potencialmente "compatíveis", no caso de órgãos únicos, como é o caso do coração, essa doação só pode ocorrer post mortem. Isto reflete-se numa carência imensa de órgãos para transplantação, agravado pelo fato de que o grau de compatibilidade é sempre parcial. Ou seja, podendo existir igualdade na composição de alguns dos recetores HLA à superfície das células, sempre existirão outros recetores diferentes, os quais condicionarão o aparecimento de graus variáveis de fenómenos de rejeição.

[0008] Face a um episódio de rejeição, o resultado poderá ser a morte do paciente e/ou a destruição do alo-transplante, pelo que atualmente o tratamento pós-transplante inclui imunossupressores e outros medicamentos para evitar a rejeição. No entanto, a imunossupressão tem efeitos secundários nefastos para a qualidade de vida do paciente e pode mesmo colocar a sua sobrevivência em perigo. Complicações infeciosas por vírus, bactérias e infestações por fungos ou parasitas acontecerão, colocando a vida do paciente em perigo. Do mesmo modo, a baixa da vigilância normal do sistema imunológico pode levar ao aparecimento de tumores malignos.

[0009] Apesar destas bem conhecidas complicações, ainda não existem outras alternativas para doentes alo- transplantados . Por isso, protocolos de imunossupressão são prescritos em todos os serviços de aio-transplantação em todo o mundo, a fim de tentar maximizar a sobrevivência, quer dos pacientes quer dos alo-transplantes.

[0010] Recentemente, foram descritas algumas propostas com o objetivo de possibilitar a aio-transplantação sem imunossupressão . Resumidamente, com recurso a diferentes mecanismos, as células alo-transplantadas seriam modificadas de forma a não expressar recetores HLA Classe I ou/e HLA Classe II, ou as células expressariam uma elevada quantidade de recetores HLA Class I específicos (HLA G), ou outros recetores, no sentido de se obterem o que se designou como "alo-transplantes transparentes". Estes alo-transplantes que o sistema imunológico do paciente não consegue reconhecer como não-do-próprio (em inglês: non-self) conferem uma espécie de tolerância imune ao alo-transplante. Contudo, esta "transparência" do sistema imunológico do paciente constitui um enorme problema, porque qualquer infeção, infestação ou transformação cancerosa nas células alo- transplantadas será muito dificilmente detetada em tempo útil.

[0011] Um facto extremamente vantajoso, presente nos humanos, é que a totalidade dos genes muito polimórficos que são traduzidos em recetores HLA, estão reunidos num grande, mas único, complexo de genes conhecido como Complexo de Histocompatibilidade Major (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex), localizado no braço curto do cromossoma 6. Uma exceção é a b-2-microglobulina que é traduzida de um gene não-polimórfico residente no cromossoma 15 humano e que é um componente essencial dos recetores HLA da Classe I.

[0012] Dependendo dos autores o MHC em humanos é composto por entre 4,2 e 7 megabases de sequências de ácido desoxirribonucleico, (ADN) em cada um dos braços curtos do par de cromossomas 6. Com as técnicas atuais de Biologia Molecular, torna-se impossível realizar a substituição de duas sequências tão longas de ADN.

[0013] Outras duas soluções aparentemente muito promissoras, foram também preparadas com o objetivo de poderem resolver o problema das rejeições na aio- transplantação. A proposta mais recente foi da autoria do grupo do Professor Yamanaka, com a criação de linhas de células estaminais a partir de células adultas usando um protocolo de reprogramação. A partir da diferenciação destas células, designadas por Células Estaminais Pluripotentes Induzidas Humanas (hiPSCs, do inglês human induced Pluripotent Stem Cells), seria possível obter as células, tecidos ou órgãos que um paciente necessite, sendo que estes contêm o mesmo, exato e completo conjunto de recetores HLA que todas as restantes células do seu corpo. Assim, a compatibilidade é total e por isso nenhuma síndroma de rejeição será desencadeada. No entanto, todas as células, tecidos ou órgãos produzidos por reprogramação continuarão a expressar as doenças resultantes das mutações de que o paciente é portador, caso estas mutações não sejam corrigidas previamente ou após a reprogramação. Para além disso, as hiPSCs são muito dispendiosas, levam bastante tempo a serem preparadas e levantam algumas questões de segurança, nomeadamente a possibilidade de transformação cancerígena, entre outros.

[0014] Uma outra proposta foi apresentada em 2006 por Tada et.al. O protocolo apresentado baseia-se no facto de que o conjunto de recetores HLA de cada indivíduo é traduzido a partir do MHC, e que o MHC reside no braço curto do cromossoma 6. Sendo possível a substituição do par de cromossomas 6 indígena em Células Estaminais Pluripotentes Humanas (hPSCs, do inglês Human Plurípotent Stem Cells), pelo par de cromossomas 6 de um paciente, poderia tornar-se possível obter qualquer célula, tecido ou órgão que um paciente necessite, conseguindo-se a completa coincidência HLA ou compatibilidade entre as células do transplante e as células do paciente. Esta solução é muito parecida nos seus objetivos e resultados com as hiPSCs, mas contém também uma enorme vantagem sobre as hiPSCs. Do mesmo modo que as hiPSCs, as células produzidas segundo o protocolo de Tada et.al., conseguem ser completamente compatíveis com o paciente porque expressam o seu exato e completo conjunto HLA, mas conseguem simultaneamente adicionar a característica de serem saudáveis, pois a substituição do cromossoma 6 é realizada em hPSCs que estão isentas de mutações patogénicas.

[0015] Esta estratégia, permitiria a ausência de todas as doenças mono- ou multigénicas de que o doente possa padecer, ao contrário do que sucede com as hiPSCs, e simultaneamente permite uma compatibilidade HLA total com o paciente. Apenas as doenças genéticas devidas a mutações patogénicas do cromossoma 6 do paciente não poderão ser corrigidas, a menos que essas mutações sejam corrigidas previamente ou posteriormente à substituição cromossómica nas hPSCs off- the-shelf.

[0016] O documento US 20090264312 descreve um método para a obtenção da perda induzida de um cromossoma específico com recurso a uma técnica que faz uso de uma nuclease Cre com sítios de recombinação LoxP invertidos.A ativação do sistema pela introdução da nuclease Cre induz a transformação do cromossoma preparado com sítios LoxP invertidos, num cromossoma dicêntrico isto é, com dois centrómeros, que a célula rejeita por não ser compatível com a replicação/segregação durante a mitose celular. Contudo, este método nunca evoluiu para o uso clinico, pois a indução de cromossomas dicêntricos, que permite a perda induzida dos referidos cromossomas pelas células, é também causa de graves mutações genómicas nas células que pudessem sobreviver.

[0017] Através do sistema de nuclease CRISPR/Cas9 (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated proteín 9) é também possível induzir a perda de um cromossoma específico. Foi já demonstrado que é possível eliminar o cromossoma humano Y usando diferentes estratégias. Por exemplo, provocando múltiplas clivagens na cadeia dupla no ADN em ambos os braços do cromossoma, induzindo múltiplas clivagens no ADN centromérico específico do cromossoma humano, e clivando o ADN em dois locais próximos e de cada lado do centrómero. Contudo, estas estratégias podem deixar material cromossómico sem meios de seleção e identificação, o que pode levar ao aparecimento de mutações/translocações. Por razões de segurança este método, tal como descrito, não tem aplicação em Medicina. Por outro lado, ainda não foi descrito como é possível manter vivas as células após a perda do cromossoma Y, sem o desenvolvimento de uma metodologia para prover à sua substituição. Esta é outra razão pela qual a descrição de um método de perda específica de um cromossoma só por si não tem aplicação em Medicina, com a eventual exceção de poder vir a ser útil, resolvidas outras dificuldades técnicas, no caso das trissomias.

[0018] Em Zuo et al., os autores descrevem a perda de um cromossoma específico em células estaminais humanas, recorrendo ao sistema de nuclease CRISPR/Cas9, nomeadamente a perda de um cromossoma 21 humano em células portadoras de trissomia 21. No mesmo documento é também descrita a perda especifica do cromossoma Y humano. Estas perdas foram obtidas através do uso de múltiplos ácido ribonucleicos de guia único (sgARN, do inglês single guide ribonucleic acid) específicos para o cromossoma em causa, ou um sgARN específico para sequências repetidas no cromossoma em causa, presentes quer em agrupamentos (do inglês clusters), quer dispersas ao longo do cromossoma. Também neste caso os autores não conseguem garantir a segurança do produto final para o seu uso em Medicina, posto que não é possível garantir que todos os fragmentos em que o cromossoma é clivado serão eliminados das células, e que não darão origem a mutações/translocações. Por outro lado, os autores pensaram a sua estratégia para resolver poliploidias, como podem ser os casos de trissomias. Não se referem em momento algum à substituição de cromossomas equivalentes para resolverem algum problema clínico. Apenas reconhecem a sua utilidade para o desenvolvimento de modelos de doenças.

[0019] Fournier e Ruddle em 1977 descrevem um método que consiste na possibilidade de isolamento de cromossomas inteiros únicos ou em grupos pequenos (2 ou 3), no interior de estruturas designadas por microcélulas e que são compostas por: uma membrana com semelhanças de composição com a da membrana citoplasmática; componentes de citoplasma da célula dadora; e o/s cromossoma/s isolado/s no seu interior. Desde a sua primeira descrição até à atualidade, pequenas modificações foram introduzidas melhorando a eficiência do seu isolamento, conservação e a capacidade de fusão das microcélulas com células euploides ou aneuploides. Esta fusão das células com as microcélulas permite a transferência do/s cromossoma/s isolado/s para o seu interior, passando a fazer parte do seu genoma. Descrição Geral da Divulgação

[0020] A presente divulgação descreve um novo método, industrializável e inventivo capaz de produzir linhas de células estaminais universais off-the-shelf, editadas de forma a poderem perder um cromossoma ou mais, em células eucarióticas, ou o cromossoma das células procarióticas, com a possibilidade de se proceder à sua substituição por outro/s cromossoma/s exógeno/s equivalente/s, possuindo genes de sequências diferentes ou corrigidas. Ao contrário dos demais métodos descritos, o presente método permite o controlo triplo das fases de seleção celular, o que representa uma vantagem de segurança para posterior utilização das células em cenário clinico, nomeadamente na terapia ou tratamento de doenças monogénicas, multigénicas ou em transplantes de substituição por perda da função celular, de células sem mutações patogénicas (p.ex. enfarte do miocárdio por aterosclerose) .

[0021] Numa forma de realização, duas cassetes de sequências de ADN são editadas em genes fechados - i.e. genes não transcritos na fase estaminal das células em causa - na proximidade e de cada lado do centrómero. Estas novas cassetes compreendem promotores, genes de proteínas fluorescentes, genes codificadores de proteínas que conferem resistência a antibióticos e/ou sensibilidade a anti-virais (por exemplo aciclovir) ou a outras drogas (por exemplo tamoxifeno) . Cada uma destas cassetes compreende, ainda, uma sequência de ADN ausente do genoma da espécie cujas células estaminais se pretendem modificar e suscetível de sofrer clivagem da cadeia dupla do ADN pelos sistemas de nucleases editoras (nucleases do sistema de repetições palindrómicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR, do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), dedo de zinco (ZNF, do inglês zinc fingers), nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs, do inglês Transcription Activator-like Effector Nucleases), ou outras).

[0022] Numa forma de realização, a sequência de ADN suscetível de sofrer clivagens da cadeia dupla do ADN pelos sistemas de edição genómica (CRISPR/Cas9, ZNF, TALENs, ou outras), e que não está presente no genoma das células não editadas do organismo em causa é um nulómero.

[0023] Para os efeitos da presente divulgação, um nulómero deve ser entendido como uma sequência curta de ADN que não está presente no genoma das células não editadas do organismo em causa.

[0024] Na presente realização, são considerados produtos derivados todas as células, micro-tecidos (do inglês microtissues), tecidos, ou órgãos obtidos a partir da diferenciação de células estaminais editadas no seu genoma pelo método descrito na presente divulgação. Sendo diferentes das células estaminais que lhe deram origem, só podem delas ser derivadas ou diferenciadas pelo método descrito na presente divulgação, de forma a criar outras linhas celulares estaminais com a mesma edição ou produtos celulares, teciduais ou órgãos para transplantação.

[0025] Numa forma de realização, o método para o desenvolvimento de linhas de células estaminais e produtos derivados consiste na edição de linhas de células estaminais de modo a que fiquem disponíveis como linhas de células estaminais universais off-the-shelf, com a capacidade de perderem um ou mais cromossomas ou como linhas de células estaminais do paciente (Ex. Células Progenitoras Hematopoiétcas, CD34+, células mesenquimatosas, etc), para uso no tratamento de doenças monogénicas ou multigénicas. A perda induzida dos referidos cromossomas é conseguida com recurso a nucleases (CRISPR, ZNF, TALENs, ou outras), que provocam clivagens da cadeia dupla do ADN em sequências especificas, situadas perto e de cada lado do centrómero dos cromossomas editados. Por outro lado, as sequências especificas onde têm lugar as clivagens na cadeia dupla do ADN fazem parte de duas cassetes de genes (Cassete 1 e Cassete 2), cuja composição é importante tanto na fase de identificação e seleção dos clones de células estaminais corretamente editados, como também mais tarde aquando da substituição dos cromossomas deletados por cromossomas equivalentes. Os marcadores de fluorescência e de resistência e/ou de sensibilidade a drogas, incluídos nas cassetes, são os responsáveis por estas características funcionais e técnicas nas células editadas e, mais tarde, nas células em que o cromossoma deletado é substituído por um equivalente.

[0026] Estes artifícios técnicos inovadores permitem resolver problemas relacionados com a segurança da utilização dos produtos derivados, em particular células multipotentes (p. ex. células progenitoras hematopoiéticas) ou células completamente diferenciadas (p. ex. células Beta- pancreáticas), garantindo que provêm de origem clonal e que não se mantém material genómico do cromossoma deletado no interior das células a transplantar. Numa forma de realização, na fase de desenvolvimento das linhas celulares, as proteínas de fluorescência, a resistência a antibióticos e suscetibilidade a drogas, permitem escolher apenas os clones de células que as produzam, e eliminar todas as outras. Na fase de desenvolvimento dos transplantes, permitem selecionar apenas células que não as produzam, sinal de que perderam completamente o par de cromossomas editado e que têm apenas o par de cromossomas de substituição.

[0027] Numa forma de realização, as células estaminais são colhidas dos próprios pacientes, e os cromossomas nativos com mutações patológicas, substituídos por cromossomas de dadores saudáveis, através do método descrito na presente divulgação. Os produtos derivados são então utilizados no tratamento de doenças monogénicas ou multigénicas.

[0028] Numa outra forma de realização, são obtidas linhas de células estaminais universais off-the-shelf, preparadas a partir do método descrito na presente divulgação, em que ocorre a perda do cromossoma que contém os genes que traduzem os recetores HLA. No caso da espécie humana, estes genes encontram-se no cromossoma 6. Assim, o cromossoma 6 indígena do dador é removido, e substituído por um cromossoma 6 exógeno, isolado a partir de células do paciente e futuro hospedeiro. Consequentemente, as células diferenciadas a partir de células estaminais humanas off-the-shelf passam a expressar exatamente os mesmos recetores HLA do paciente, sendo completamente compatíveis com o paciente. Da mesma forma, aglomerados de células, micro-tecidos, tecidos ou órgãos derivados das células estaminais modificadas são também compatíveis, e podem ser transplantados no paciente sem os habituais riscos de rejeição.

[0029] No caso da substituição do par de cromossomas 6 indígena nas células estaminais humanas pelo par de cromossomas 6 de um paciente, não só se consegue evitar ou reduzir a necessidade de recurso à terapêutica imunossupressora, mas igualmente importante, mantem-se a integridade do funcionamento normal de todo o sistema imunológico do paciente. Isto representa uma mudança radical em relação ao paradigma atual que assenta exclusivamente no combate/redução da atividade do sistema imunológico para tentar reduzir o mais possível os fenómenos de rejeição. Por outro lado, os custos da terapêutica imunossupressora, anti- infeciosa e tempos de internamento hospitalar são substancialmente reduzidos. Também os custos sociais (familiares e institucionais), relacionados com a terapêutica crónica imunossupressora e anti-infeciosa das complicações, são substancialmente reduzidos.

[0030] Numa forma de realização, as células estaminais originais são saudáveis, não apresentando mutações causadoras de doenças. Logo, os produtos derivados das linhas de células estaminais universais off-the-shelf editadas pelo método descrito na presente divulgação, são saudáveis, podendo ser utilizadas no tratamento de doenças que dependem de mutações mono ou multigénicas, exceto se a mutação em causa se encontrar no cromossoma 6 do doente.

[0031] Numa forma de realização, quer o cromossoma 6 humano do paciente, que irá substituir o cromossoma 6 indígena das células estaminais universais off-the-shelf, quer o cromossoma de dador saudável que irá substituir o cromossoma mutado do paciente, podem ser transferidos pela técnica de transferência cromossómica mediada por microcélulas (do inglês: Microcell Mediated Cromossome Transfer (MMCT)). Noutra outra forma de realização, os cromossomas exógenos podem ser transferidos através da microinjeção do conteúdo das microcélulas nas células de destino. Em ambos os casos, o material genético é transferido juntamente com o sistema de nuclease responsável pela posterior clivagem das sequências normalmente ausentes do genoma, mas presentes nos cromossomas nativos editados, (CRISPR, ZNF, TALENs, ou outras).

[0032] Métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula a identidade percentual da sequência e realiza uma análise estatística da semelhança entre as duas sequências. O software para executar a análise BLAST está disponível ao público no National Center for Biotechnology Information (NCBI). As percentagens globais de similaridade e identidade também podem ser determinadas usando um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4:29. MatGAT: um aplicativo que gera matrizes de similaridade/identidade usando proteínas ou sequências de ADN). Os valores de identidade de sequência, que são indicados na presente divulgação como uma percentagem, foram determinados em toda a sequência de bases, utilizando BLAST com os parâmetros padrão.

[0033] A presente divulgação diz respeito a um método para a edição do genoma de células estaminais compreendendo os seguintes passos: (i) preparar pelo menos uma cassete genética, em que a cassete genética compreende um promotor, um marcador, e uma sequência genética ausente do genoma das células estaminais a editar, em que o marcador compreende pelo menos um gene codificador de uma proteína de: fluorescência, resistência a antibiótico, sensibilidade a drogas, ou suas combinações; e em que a sequência genética ausente do genoma das células estaminais a editar é clivável por pelo menos um sistema de nucleases de edição genómica, de preferência o sistema de CRISPR, ZNF, TALENs, ou as suas misturas; (ii) inserir pelo menos uma cassete genética num cromossoma da célula a editar por meio de clivagens na cadeia dupla do ADN perto e de cada lado do centrómero do cromossoma da célula a editar, sendo estas clivagens da cadeia dupla do ADN produzidas por nucleases de preferência do sistema CRISPR, ZNF, TALENS, Transposases , recombinases sítio- específicas de tirosina (do inglês tyrosine síte-specífíc recombinases, T-SSRs), recombinases sítio-específicas da serina (S-SSRs); e (iii) selecionar as células editadas com o marcador introduzido na referida cassete genética.

[0034] Numa forma de realização, a sequência genética ausente do genoma das células estaminais a editar compreende um nulómero.

[0035] Numa forma de realização, o nulómero compreende pelo menos uma sequência com pelo menos 90% de identidade das seguintes sequências: Seq. ID N° 24, Seq. ID N° 25, Seq. ID N° 26, Seq. ID N° 27, Seq. ID N° 28, Seq. ID N° 29, Seq. ID N° 30, Seq. ID N° 31, Seq. ID N° 32, Seq. ID N° 33, Seq. ID N° 34, Seq. ID N° 35, Seq. ID N° 36, Seq. ID N° 37, Seq. ID N° 38, Seq. ID N° 39, Seq. ID N° 40, Seq. ID N° 41, Seq. ID N° 42 ou suas misturas, múltiplos ou frações.

[0036] Numa outra forma de realização, a sequência de nulómero compreende 95% de identidade com a Seq. ID N° 24, Seq. ID N° 25, Seq. ID N° 26, Seq. ID N° 27, Seq. ID N° 28, Seq. ID N° 29, Seq. ID N° 30, Seq. ID N° 31, Seq. ID N° 32, Seq. ID N° 33, Seq. ID N° 34, Seq. ID N° 35, Seq. ID N° 36, Seq. ID N° 37, Seq. ID N° 38, Seq. ID N° 39, Seq. ID N° 40, Seq. ID N° 41, Seq. ID N° 42, ou suas misturas,seus múltiplos ou frações; de preferência 96%, 97%, 98%, 99% ou idênticas.

[0037] Numa forma de realização, o método descrito na presente divulgação compreende adicionalmente um passo de substituir o cromossoma indígena que compreende a cassete genética por um cromossoma equivalente exógeno não editado.

[0038] Numa forma de realização, a substituição do cromossoma que compreende a cassete genética por um cromossoma equivalente é feita por transferência cromossómica mediada por microcélulas.

[0039] Numa forma de realização, o marcador codifica para uma proteína que confere sensibilidade a drogas, de preferência ao tamoxifeno, aciclovir ou suas combinações.

[0040] Numa forma de realização, a edição do genoma da célula a editar tem por objeto a deleção total de pelo menos um cromossoma, de preferência um par de cromossomas.

[0041] Numa forma de realização, o cromossoma da célula a editar é o cromossoma 6.

[0042] Numa forma de realização, as clivagens na cadeia dupla do ADN ocorrem pela adição de nucleases, de preferência nucleases CRISPR, ZNF, TALENs, Transposases, recombinases sítio-específicas de tirosina (do inglês tyrosine site- specific recombinases, T-SSRs), recombinases sítio- específicas da serina (S-SSRs) ou outras.

[0043] A presente divulgação compreende, ainda, uma cassete genética que compreende pelo menos um promotor, um marcador, e uma sequência genética ausente do genoma das células estaminais a editar, em que o marcador compreende pelo menos um gene codificador de uma proteína de fluorescência, de resistência a antibiótico, de sensibilidade a drogas, ou suas combinações; e em que a sequência genética ausente do genoma das células estaminais a editar é clivável por pelo menos um sistema de nucleases de edição genómica, de preferência CRISPR, ZNF, TALENs, ou as suas misturas. Numa forma de realização, a sequência genética ausente do genoma das células estaminais a editar compreende um nulómero.

[0044] Numa forma de realização, o nulómero compreende pelo menos uma sequência com pelo menos 90% de identidade das sequências Seq. ID N° 24, Seq. ID N° 25, Seq. ID N° 26, Seq. ID N° 27, Seq. ID N° 28, Seq. ID N° 29, Seq. ID N° 30, Seq. ID N° 31, Seq. ID N° 32, Seq. ID N° 33, Seq. ID N° 34, Seq. ID N° 35, Seq. ID N° 36, Seq. ID N° 37, Seq. ID N° 38, Seq. ID N° 39, Seq. ID N° 40, Seq. ID N° 41, Seq. ID N° 42 ou suas misturas, múltiplos ou frações.

[0045] A presente divulgação descreve ainda uma cassete genética tal como descrita neste documento para o uso em medicina ou em medicina veterinária.

[0046] Numa forma de realização, a cassete genética é para o uso no tratamento de doenças genéticas, nomeadamente doenças monogénicas ou multigénicas, de preferência hemofilia, drepanocitose, talassémia, anemia de Fanconi, síndroma de Alagille, doença congénita da glicosilação, ou retinite pigmentosa.

[0047] Numa forma de realização, a cassete genética compreendende pelo menos 90% de identidade com a Seq. ID N°43, ou Seq. ID N° 44.

[0048] Noutra forma de realização, a cassete genética compreende pelo menos 95% de identidade com Seq. ID N° 43, ou Seq. ID N° 44. [0049] Numa outra forma de realização, a cassete genética compreende pelo menos 99% de identidade com Seq. ID N° 43, ou Seq. ID N° 44.

[0050] A presente divulgação descreve também um vetor que compreende pelo menos uma cassete genética descrita na presente divulgação.

[0051] Um aspeto da presente divulgação compreende as células estaminais editadas, obtidas pelo método descrito na presente divulgação, que compreendem a cassete descrita na presente divulgação.

[0052] Numa forma de realização, as células estaminais editadas compreendem pelo menos a substituição de um cromossoma indígena por um cromossoma exógeno, sem compreender resíduos, i. e. material cromossómico, do cromossoma indígena.

[0053] A presente divulgação compreende também uma célula, micro-tecido, tecido ou órgão obtido a partir da diferenciação das células estaminais editadas, descritas na presente divulgação, após substituição do par de cromossomas editado pelo seu equivalente exógeno.

[0054] Um aspeto da presente divulgação compreende a célula, micro-tecido, tecido ou órgão, descritas na presente divulgação, para o uso em medicina.

[0055] Numa forma de realização, a célula, micro-tecido, tecido ou órgão são para o uso no tratamento de doenças genéticas, de preferência doenças monogénicas ou multigénicas, de maior preferência hemofilia, drepanocitose, talassémia, anemia de Fanconi, síndroma de Alagille, doença congénita da glicosilação, ou retinite pigmentosa. [0056] Numa outra forma de realização, a célula, micro- tecido, tecido ou órgão são para o uso na diminuição da rejeição da célula, micro-tecido, tecido ou órgão transplantados .

[0057] Ainda noutra forma de realização, a célula, micro- tecido, tecido ou órgão são para o uso na eliminação ou diminuição de doença autoimune.

[0058] Numa forma de realização, a célula, micro-tecido, tecido ou órgão são para o uso na eliminação ou diminuição de uma doença infeciosa num paciente, em particular da Síndroma da imunodeficiência humana adquirida (SIDA).

[0059] Numa outra forma de realização, a célula, micro- tecido, tecido ou órgão são para o uso em transplantes, para a substituição material ou funcional integral, ou para complementação de uma função diminuída de células, tecidos ou órgãos de um sujeito. Numa forma de realização, a célula, micro-tecido, tecido ou órgão diminuem a rejeição por parte do sujeito transplantado. Numa outra forma de realização, a resposta imune do sujeito transplantado é eliminada ou diminuída.

[0060] Numa forma de realização, a célula, micro-tecido, tecido ou órgão são para o uso na substituição de progenitores hematopoiéticos de um paciente, (conhecido como transplante de medula óssea), após exposição terapêutica ou acidental ou em ambiente de guerra a radiações ionizantes, quimioterapia, substância tóxica ou suas combinações.

[0061] A presente divulgação compreende, ainda, uma célula, micro-tecido, tecido ou órgão, descritas na presente divulgação, para uso em medicina ou medicina veterinária. Numa forma de realização, a célula, micro-tecido, tecido ou órgão são para o uso no tratamento de doenças genéticas, de preferência doenças monogénicas ou multigénicas, de maior preferência hemofilia, drepanocitose, talassémia, anemia de Fanconi, síndroma de Alagille, doença congénita da glicosilação, ou retinite pigmentosa. Numa outra forma de realização, a célula, micro-tecido, tecido ou órgão são para o uso no tratamento de Hemofilia A, Trombastenia de Glanzmann, Trombastenia Atípica Equina, Doença de von Willebrand, Deficiência de pre-calicreína, Miopatia do armazenamento de polissacaridos Tipo 1 e Tipo 2, Deficiência da Enzima de Ramificação do Glicogénio, ou Miopatia das cadeias pesadas 2X da miosina, em equinos; deficiência da beta-manosidase, Deficiência da adesão leucocitária bovina, Deficiência hereditária do Zinco, ou Citrulémia, em bovinos; Hemofilia A; ou Doença de von Willebrand, em caninos.

Breve Descrição das Figuras

[0062] Para uma mais fácil compreensão, juntam-se em anexo as figuras, as quais representam realizações preferenciais que não pretendem limitar o objeto da presente descrição.

[0063] Figura 1: Representação esquemática do cromossoma 6 humano e localização do gene BAG2 1 junto ao centrómero 2 no braço longo 4. O gene LGSN 3 está localizado junto ao centrómero 2, mas no braço curto 5.

[0064] Figura 2: Representação de uma forma de realização da transfeção da linha virgem de células estaminais, com CRISPR/Cas9 + sgARN/BAG2 6 e Cassete 17 para a edição do Gene BAG2 do Cromossoma 6 Humano. A nuclease CRISPR/Cas9 + sgARN/BAG2 6 provoca uma clivagem da cadeia dupla do ADN no gene BAG2. Essa clivagem é depois reparada pela célula com a integração do conjunto das sequências compreendidas na Cassete 17 com exceção dos braços de homologia HA5' e HA3' (inserto 8), com recurso a Reparação Dirigida por Homologia, (do inglês - Homology Directed Repair - HDR). No inserto 8 o [PGKpmt] significa promotor da fosfoglicerato quinase; [PuroR] significa transferase da resistência à Puromicina; [GFP] significa Proteína de Fluorescência Verde; [2pA] representa a sequência de poliadenilação.

[0065] Figura 3: Representação de uma forma de realização da transfeção da linha de células estaminais previamente editada no gene BAG 2, com CRISPR/Cas9 + sgARN/LGSN 11 e Cassete 2 9 para a edição do Gene LGSN do Cromossoma 6 Humano. A nuclease CRISPR/Cas9 + sgARN/LGSN 11 provoca uma clivagem da cadeia dupla do ADN no gene LGSN. Essa clivagem é depois reparada pela célula com a integração do conjunto das sequências compreendidos na Cassete 29 com exceção dos braços de homologia HA5' e HA3' (inserto 10), com recurso a Reparação Dirigida por Homologia (HDR). No inserto 10, [EOS pmt] corresponde à sequência do aumentador (do inglês: enhancer) SSR2 a jusante da sequência do gene SOX2; [TK] corresponde à sequência truncada do gene da Timidina quinase do vírus Herpes simples; [SV40pA] corresponde à sequência de poliadenilação do SV40; [EFloc pmt] corresponde ao promotor do fator de elongamento humano EFl ; [NeoR] corresponde à sequência da aminoglicosídeo transferase; [mCherry] corresponde à sequência do derivado monomérico da proteína fluorescente vermelha DSRed; [bGH pA] corresponde à sequência de poliadenilação da hormona de crescimento bovina.

[0066] Figura 4: Representação de uma forma de realização da deleção do Cromossoma 6 Humano. Para ser produzida a deleção do Cromossoma 6 humano, a linha de células estaminais duplamente editada perto e de cada lado do centrómero (gene BAG2 e gene LGSN) é transfectada com CRISPR/Cas9/Nulómero gARN 12 e 13. A nuclease produz duas clivagens da dupla cadeia do ADN do cromossoma, separando-o em 3 partes. Um cromossoma nestas circunstâncias sofre deleção em 40% das células por não poder segregar durante a mitose.

[0067] Figura 5: Teste da reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reactíon) para avaliação da inserção correta do inserto no gene BAG2 em hiPSCs. Imagem da electroforese em gel de agarose a 0,8% dos produtos de PCR/ADN genómico de células co-transfetadas com CRISPR/Cas9 + sgARN/BAG2 + Cassetel. Os algarismos 15;16;17;18;19;20;21 representam os iniciadores que corrrespondem à SEQ. ID N° 15, SEQ. ID N° 16, SEQ. ID N° 17, SEQ. ID N° 18, SEQ. ID N° 19, SEQ. ID N° 20 e SEQ. ID N° 21, respetivamente. 15+16 = 5'fora do construto até ao promotor PGK (PGKpmt) (~1900bp); 15+17 = 5'fora do construto até ao Braço de Homologia 5'(5'BH) (~500bp); 20+21= 3'fora do construto até ao Braço de Homologia 3'(3'BH)(~900bp); 16+18 = Braço de Homologia 5'(5'BH) até ao promotor PGK (PGKpmt)(~600bp); 19+20= 3' fora do construto até ao Nulómero (~1800bp). WT= ADN genómico de células Virgens (Controlo negativo).

[0068] Figura 6: Citometria de Fluxo, percentagem da expressão de Proteína Fluorescente Verde (do inglês green fluorescent protein, GFP) em 4 amostras de Células Estaminais Pluripotentes Humanas Induzidas (do inglês human induced Pluripotent Stem Cell (hiPSCs). Co-transfeção de CRISPR/Cas9-BAG2sgRNA + Cassetel de acordo com o protocolo descrito neste documento. [0069] Figura 7: Citometria de Fluxo, percentagem da expressão de Proteína Fluorescente Verde (GFP) em 2 amostras (10 ⁶ células/amostra) de hiPSCs. Dia 6 da Co-transfeção de CRISPR/Cas9-BAG2sgRNA + Cassetel de acordo com protocolo descrito neste documento. Previamente à realização da citometria de fluxo as células foram coradas com recurso ao kit: LIVE/DEAD™Fixable Dead Cell Stain Kit, ThermoFisher Scientific™. Este método permite ter uma avaliação mais rigorosa da percentagem das células GFP+ que estão viáveis na cultura.

Descrição Detalhada da Divulgação

[0070] Na presente divulgação não foram utilizadas linhas de células estaminais que tenham implicado a destruição de embriões humanos. Na presente divulgação foram utilizadas células estaminais pluripotentes humanas (hPSC, do inglês human plurípotent stem cells), nomeadamente: células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSC, do inglês human induced plurípotent stem cells).

[0071] Numa forma de realização, as hiPSCs são obtidas a partir de células adultas humanas, nomeadamente fibroblastos . A indução de pluripotência ocorre através da sobre-expressão dos Fatores de Yamanaka, i.e. Oct4, Sox2, C- mic e KLF4, que pode ser feita a partir da transfecção dos próprios fatores recombinantes, a partir de vetores retrovirais, a partir de pequenas moléculas químicas, a partir de microRNAs, a partir de Transposões Piggy-Bac, que promovem a sua sobre-expressão nas células adultas, levando à sua reprogramação para a condição de células pluripotentes.

[0072] Numa forma de realização, as alterações genéticas introduzidas em genes inativos das células a alterar garantem que não existe nenhuma alteração ao normal funcionamento celular na fase de cultura, em que as células editadas são mantidas até à sua posterior utilização. Numa fase posterior de diferenciação celular já não existem genes editados, porque o cromossoma indígena editado já foi perdido pelas células, e substituído pelo seu equivalente que não contém a referida edição. Assim, não existirão genes passíveis de ficarem inoperativos (do inglês knockout) por edição, nas células, micro-tecidos, tecidos, ou órgãos preparados por este método, para uso em transplantação.

[0073] Numa forma de realização, a presença de marcadores de fluorescência e de seleção antibiótica e de genes de sensibilização a drogas (p.ex. aciclovir, tamoxifeno ou outras), permitem obter clones corretamente editados, tornando possível a seleção de clones, livres de eventuais contaminações com células não editadas.

[0074] Numa forma de realização, a presença de uma sequência nulomérica constitui mais um artifício inventivo, que permite que possam existir clivagens da cadeia dupla do ADN simultâneas, junto a ambos os lados do centrómero, levando à deleção/perda do cromossoma portador dessa edição. Além disso, a presença da sequência nulomérica evita que se produzam clivagens da cadeia dupla do ADN dos cromossomas equivalentes de substituição. Como as células normais necessitam de um conjunto de cromossomas normais (euploidia), sempre que a perda/deleção induzida de um par de cromossomas específicos tenha lugar nessa célula, outro par de cromossomas equivalente tem de lhe ser fornecido. Essa substituição cromossómica deve ser simultânea com a perda, para que não existam tempos de hipoploidia. Mesmo coabitando por momentos dentro da célula (tetraploidia temporária), os cromossomas de substituição não possuem a referida sequência nulomérica. Logo, o sistema de nuclease editora (ZNF, TALENs, CRISPR, ou outro sistema) não pode promover a sua perda pela célula, pois este sistema apenas cliva a cadeia dupla do ADN que contém a sequência nulomérica. A presença da sequência nulomérica garante assim que as clivagens na cadeia dupla do ADN, e consequente perda/deleção do par de cromossomas editados, não acontece no par de cromossomas exógenos substituto/s. Como o par de cromossomas substituto não possui essa sequência, fica livre de clivagens da cadeia dupla do seu ADN, mantendo toda a sua integridade sequencial e funcional, e a célula retornará à sua euploidia normal.

[0075] Numa forma de realização, os clones corretamente editados podem originar linhas de células estaminais universais ou pessoais off-the-shelf, a partir das quais é possível obter a deleção de um par cromossómico específico. Esta característica abre uma porta à industrialização de linhas de células universais bem como de linhas de células estaminais pessoais, uma vez que ficarão disponíveis para uso imediato (off-the-shelf) para a utilização na preparação de produtos derivados. Um produto off-the-shelf adquire vantagens de escala e de disponibilidade imediata com grande poupança de tempo de laboratório, e facilitando a sua disponibilização a tempo para os pacientes. A questão da rapidez de preparação do produto derivado final a transplantar ao paciente, tem implicações muito importantes no aumento da probabilidade de sobrevivência do paciente, bem como na redução dos custos totais, (económicos e sociais) do tratamento e no aumento da qualidade de vida do paciente e família.

[0076] Numa forma de realização, o par de cromossomas de substituição pode ser fornecido às células utilizando a técnica de transferência cromossómica mediada por microcélulas (MMCT, do inglês Microcell Mediated Chromosome Transfer) (Fournier e Ruddle 1977), em simultâneo com os componentes do sistema de nuclease editora, (CRISPR, ZNF, TALENs, ou outros) que clivam o nulómero, ou uma outra sequência adequada, ausente do genoma normal das células estaminais da espécie a editar, de cada lado do centrómero.

[0077] Numa outra forma de realização, o par de cromossomas de substituição pode ser fornecido às células destinatárias por técnicas de microinjeção juntamente com o sistema de nuclease editora (CRISPR, ZNF, TALENs, ou outros).

[0078] Numa forma de realização, as células que após o protocolo de substituição cromossómica possam conter alguma porção do par de cromossomas deletado, são positivamente e/ou negativamente selecionadas pelos marcadores de fluorescência e de resistência antibiótica e de sensibilidade a drogas (por exemplo, aciclovir, tamoxifeno, ou suas misturas), presentes nos insertos (do inglês insert).

[0079] Numa forma de realização, as células corretamente substituídas não apresentam fluorescência, nem resistência antibiótica nem sensibilidade às drogas programadas. As células obtidas a partir do método descrito na presente divulgação podem ser utilizadas no tratamento de diversas patologias monogénicas, tais como hemofilias, drepanocitose, talassémia, entre outras.

[0080] Numa forma de realização, é feita a substituição do cromossoma portador do gene mutado em células estaminais colhidas do doente (com exceção do cromossoma 6), sendo o cromossoma substituído por um cromossoma equivalente saudável, colhido de dador saudável. As células resultantes são posteriormente diferenciadas e transplantadas no paciente.

[0081] Numa outra forma de realização, são utilizadas células estaminais universais off-the-shelf com substituição do par de cromossomas 6 indígena pelo par de cromossomas 6 do paciente. As células resultantes são, assim, compatíveis com o paciente, podendo ser transplantadas sem ocorrer rejeição por parte do hospedeiro. Mais ainda, visto que as células são preparadas a partir de células estaminais off- the-shelf saudáveis, o cromossoma mutado do paciente está ausente das células a transplantar.

[0082] De seguida, são apresentados dois exemplos de forma a expor as implicações práticas, industriais, e clínicas do método da presente divulgação. A Hemofilia A (Fator VIII) e a Hemofilia B (Fator IX) são duas doenças hemorrágicas congénitas humanas que dependem de mutações no cromossoma X Humano. A produção de 6% do valor normal de Fator VIII ou do Fator IX é suficiente para permitir um nível normal da coagulação sanguínea. As células estaminais universais off-the-shelf masculinas contêm um cromossoma X normal, produtor dos fatores VIII e IX normais. Por isso o transplante de uma quantidade mínima de células diferenciadas, capaz de produzir 6% ou mais do nível normal dos fatores VIII e IX pode providenciar os níveis adequados dos fatores referidos, curando os doentes, apesar de em todas as outras células do corpo do paciente continuarem a existir mutações responsáveis pelos anteriores baixos níveis de Fator VIII ou Fator IX.

[0083] Como segundo exemplo, a drepanocitose, doença hematológica humana congénita, é dependente de uma única mutação na posição 6 do gene da cadeia b da hemoglobina. Numa forma de realização, esta doença pode ser curada a partir da substituição do par de cromossomas 11 do doente por um par de cromossomas 11 normais em células estaminais do paciente e sua posterior diferenciação em células progenitoras hematopoiéticas; ou pela transplantação de células progenitoras hematopoiéticas diferenciadas a partir de células estaminais universais off-the-shelf, cujo par de cromossomas 11 indígena é normal e onde o par de cromossomas 6 indígena foi substituído pelo par de cromossomas 6 do paciente, para anular a rejeição das células transplantadas.

[0084] A Biologia Molecular possui técnicas capazes de identificar e reproduzir os processos envolvidos na replicação do ADN celular, bem como na sua transcrição em ácido ribonucleico (ARN) e a tradução do ARN em proteínas.

[0085] São técnicas comummente utilizadas em Biologia Molecular e previstas no âmbito da presente divulgação as seguintes :

[0086] Edição Genómica - Na presente divulgação é necessário proceder à integração (do ingês - knock-in) de ADN novo em localizações precisas dentro do genoma das células estaminais que se pretende modificar. Para isso, é necessário ter acesso a esse material genético com a sequência ou sequências de nucleótidos adequada. O referido material genético é obtido por síntese industrial, quer na totalidade da sequência quer em parcelas que posteriormente se ligam artificialmente, ou por subclonagem dos seus diversos promotores e genes. No último caso, o construto é obtido utilizando técnicas de PCR para a produção de cada um dos braços de homologia e de subclonagem de plasmídeos contendo as sequências dos promotores e genes do inserto. A sequência assim obtida é designada o "construto" (do inglês - construct). O construto é composto por dois braços de homologia, (braço de homologia 5' ou Esquerdo, e braço de homologia 3' ou Direito), intercalados pelo inserto. O inserto é a nova sequência que irá fazer parte do genoma da célula estaminal que se pretende modificar/preparar/editar. São os braços de homologia que permitem, por complementaridade com ADN do local onde pretendemos integrar o inserto, que este seja conduzido e copiado para o local especifico e não noutro qualquer local aleatório no genoma.

[0087] Numa forma de realização, a presente divulgação descreve a construção da totalidade do construto Cassete 1 (SEQ. ID N° 43) no laboratório.

[0088] Numa forma de realização, a subclonagem compreendeu os habituais passos de digestão com enzimas de restrição adequadas (nucleases), de plasmideos preparados artificialmente ou adquiridos à indústria, posterior ligação das sequências de nucleótidos nos referidos plasmideos e transfecção de células competentes adquiridas à indústria, (E. Coli especialmente preparadas), seguindo o protocolo recomendado pelos fabricantes. Posteriormente procedeu-se ao isolamento dos clones destas células competentes corretamente editadas por técnica de PCR e/ou sequenciação. Um ou mais clones desejados foram conservados congelados a

-80°C.

[0089] Clivagens da Cadeia Dupla do ADN - A integração do inserto é facilitada quando concomitantemente à presença do construto, o ADN do local onde o inserto é integrado estiver clivado/aberto. Existem vários sistemas de nucleases para proceder a essa clivagem da dupla hélice do ADN: ZFN, TALENs, transposases, CRISPR, T-SSRs, S-SSRs e outras. [0090] Numa forma de realização, na presente divulgação foi utilizado o sistema CRISPR/Cas9 como ferramenta para proceder à clivagem da dupla cadeia do ADN (DSB, do inglês: Double Strand Break) no local exato do genoma a editar.

[0091] Reparação dirigida por homologia (HDR, do inglês Homology Directed Repaír) - Este é um dos processos que uma célula que sofreu uma lesão do seu ADN pode utilizar, para fazer a sua reparação. Esta estratégia é frequentemente utilizada em técnicas de Biologia Molecular para proceder à edição genómica por inserção de ADN novo no genoma.

[0092] Numa forma de realização, uma vez obtida a clivagem das duas cadeias do ADN, (DSB), se dentro da célula estiver simultaneamente co-transfectado o construto, por HDR a célula poderá copiar o inserto para o local do corte, passando assim o genoma da célula a expressar a nova informação genética. Esta técnica tem uma eficiência muito baixa, sobretudo em células estaminais humanas. Mas é atualmente a mais eficiente para realizar a edição genómica pretendida .

[0093] Transfecção - Designa-se por transfecção a técnica que permite a introdução dentro das células a editar do material genético preparado para essa edição, bem como de outros elementos capazes de o promoverem, por exemplo a nuclease CRISPR/Cas9 e o sgARN. Os principais métodos de transfecção são a Lipofecção, a electroporação, ou microinjecção .

[0094] Numa forma de realização, na presente divulgação foi usada a lipofecção com Lipofectamine™ 3000 (Thermo Fisher Scientific) . [0095] Separação de células ativadas por fluorescência (FACS, do inglês Fluorescence Associated Cell Sortíng) Trata-se de uma técnica que permite a seleção e enriquecimento de uma população celular tendo por base a expressão de uma ou mais proteínas fluorescentes. É uma técnica que pode ser utilizada como única ferramenta de seleção ou, previamente ou posteriormente à seleção por expressão de uma molécula de resistência antibiótica.

[0096] Célula Estaminal - Consideram-se células estaminais todas as células que ainda não sofreram um processo de diferenciação final e que apresentam a capacidade de se dividirem em células iguais a si mesmas (divisão simétrica), ou que apresentam a capacidade de se dividirem dando origem a uma célula igual a si mesma e uma outra que segue para um passo de diferenciação (divisão assimétrica).

[0097] Durante o período de vida dos mamíferos existem pelo menos 5 tipos de Células Estaminais: Células

Totipotentes, Células Pluripotentes, Células Multipotentes, Células Oligopotentes e Células Unipotentes.

[0098] Na presente divulgação foram utilizadas células pluripotentes. Estas células podem dar origem. i.e., diferenciar-se, em qualquer dos três tipos de tecidos embrionários: ectoderme, mesoderme e endoderme, e podem ser mantidas em cultura por períodos muito longos mantendo todas as suas propriedades originais. Atualmente estão disponíveis meios apropriados para a sua cultura designados serum e feeder-free por não possuírem na sua composição componentes de origem animal, e não necessitarem de ser cultivadas sobre uma camada de células, normalmente uma camada de fibroblastos embrionários de murganho. A cultura das células em meios serum e feeder-free permitem ultrapassar algumas questões de segurança levantadas pelas autoridades reguladoras, quando estas células ou os produtos delas derivados se destinam a ser utilizados na área clinica.

[0099] Numa forma de realização, foram utilizadas hiPSCs.

[00100] No âmbito da presente divulgação entende-se por transplantação a deslocação de células, tecidos ou órgãos, desde o seu local de origem para outro local dentro de um mesmo indivíduo (auto-transplantação), ou entre indivíduos da mesma espécie (alo-transplantação), ou ainda entre indivíduos de espécies diferentes (xeno-transplantação).

[00101] Numa forma de realização, o método da presente divulgação poderá ser empregue na edição de células estaminais pluripotentes embrionárias não humanas, que poderão ser utilizadas em tratamentos no âmbito da medicina ou medicina veterinária.

[00102] As células estaminais pluripotentes embrionárias não humanas podem diferenciar-se em todos os tipos de células derivadas da ectoderme, mesoderme e endoderme embrionárias, ou seja, mantêm a capacidade de formarem qualquer tipo de célula, micro-tecido, tecido ou órgão presente no organismo. Tornam-se, por isso, importantes para o desenvolvimento de linhas de células estaminais universais off-the-shelf, preparadas para perderem o seu par de cromossomas responsável pela codificação do complexo de histocompatibilidade major (MHC) da espécie em causa.

[00103] Numa forma de realização o método de desenvolvimento de linhas de células estaminais compreende a edição de linhas de células estaminais num ou mais pares de cromossomas, na proximidade e de cada lado do centrómero, com cassetes de genes compreendendo: Cassete 1 (Seq. ID N° 43) - compreende um Braço de Homologia 5' ou Esquerdo, um promotor, um gene de proteína fluorescente, um gene de resistência antibiótica, um nulómero adequado a poder ser clivado pelos diversos sistemas de nucleases (ZNF, TALEN, CRISPR, ou outros), sequência 2pA, Braço de Homologia 3'ou Direito e respetivas sequências de ligação. Esta Cassete 1 deve editar de preferência um gene não ativo das células estaminais, situado nas proximidades e num dos lados (3' ou 5'), do centrómero;

Cassete 2 (Seq. ID N° 44) - compreende um Braço de Homologia 5' ou Esquerdo, um promotor, um gene de sensibilidade a drogas (tamoxifeno, aciclovir), uma sequência de poliadenilação do vírus SV40, (SV40pA), um nulómero com a mesma sequência do nulómero presente na sequência da Cassete 1, um promotor, um gene de resistência antibiótica diferente do gene presente na Cassete 1, um gene de proteína fluorescente diferente do gene presente na Cassete 1, uma sequência de poliadenilação da hormona de crescimento bovina, (bGHpA), e um Braço de Homologia 3' ou Direito. Esta Cassete 2 deve editar de preferência um gene inativo das células estaminais, situado nas proximidades e do outro lado do centrómero (em relação à Cassete 1). A edição da Cassete 1 e da Cassete 2 deve ser preferencialmente obtida em tempos de edição diferentes, uma vez que sendo necessário proceder a clivagens da cadeia dupla do ADN por qualquer dos sistemas de edição (CRISPR, ZNF, TALEN, ou outros) simultâneos à introdução dos construtos, mais de 40% das células a editar sofreriam a deleção dos cromossomas em causa, e consequente morte celular, diminuindo muito a eficiência do presente método.

[00104] Numa forma de realização, o método para o desenvolvimento de linhas de células estaminais compreende a inclusão de sequências nuloméricas complementadas por uma sequência designada por motivo adjacente ao protoespaçador (PAM, do inglês Protospacer Adjacent Motíf), nas cassetes de genes a expressar em linhas de células estaminais. A introdução de uma sequência nulomérica no genoma complementada pela sequência PAM, sequência necessária para o reconhecimento do local de clivagem na dupla cadeia de ADN pelas nucleases do sistema CRISPR (CRISPR/Cas9 ou outra), permite garantir que a utilização do sistema CRISPR irá encontrar um único local de clivagem no genoma editado, ultrapassando o problema de clivagem fora do local adequado (do inglês off-targeting). Também dá garantias de que os outros sistemas de edição genómica, (ZNF, TALENs ou outros) irão encontrar uma única sequência no genoma para realizarem clivagens da cadeia dupla do ADN.

[00105] É este artificio importante que permite, a deleção dos cromossomas editados e por isso possuidores da sequência nulomérica e simultaneamente evita a deleção dos cromossomas de substituição, por não conterem sequências nuloméricas. No exemplo relativo à deleção do par de cromossomas 6 editado, é construído um sistema CRISPR que perante dois pares de cromossomas 6 (o par indígena e o par transferido/ substituto), encontre o par portador do nulómero e aí promova clivagens da cadeia dupla do ADN e respetiva deleção, poupando o par de cromossomas substituto. A partir desse momento as células possuirão apenas o exato MHC do paciente, ou seja, expressarão exatamente o mesmo conjunto de recetores HLA do paciente.

[00106] Numa outra forma de realização o presente método para o desenvolvimento de linhas de células estaminais, mas em que as sequências de nulómeros foram substituídos na Cassete 1 e na Cassete 2 por sequências normalmente inexistentes no genoma da espécie a que as células estaminais a editar pertencem, e que sejam adequadas à clivagem pelos sistemas de nucleases de edição genómica (ZNF, TALENs, CRISPR, ou outros).

[00107] As sequêncas nuloméricas são também adequadas para a utilização de outros sistemas de nucleases além do sistema CRISPR, nomeadamente ZNF, TALEN, e outras que venham a ser inventadas ou descobertas e que se baseiem no principio de condução da nuclease a sequências especificas do genoma.

[00108] Numa forma de realização, a divulgação compreende a introdução de sequências nuloméricas ou outras normalmente ausentes do genoma do organismo a modificar, fazendo uso dos sistemas de edição genómica, (CRISPR, ZNF, TALEN ou outros). O sistema de nucleases CRISPR compreende uma grande diversidade de nucleases de origem bacteriana que têm a particularidade de poderem provocar clivagens da cadeia dupla do ADN com grande especificidade, porque a nuclease é conduzida para o local da clivagem por uma sequência de não mais de 20 bases de ARN, designada ARN de guia único, (sgARN). No entanto, a clivagem só acontecerá se a sequência de ADN genómico complementar do sgARN for precedida ou seguida de uma sequência designada por motivo adjacente ao protoespaçador (PAM, do inglês Protospacer Adjacent Motíf). A sequência PAM e a sua posição relativa, depende da nuclease CRISPR que se utilizar.

EXEMPLO

[00109] Numa forma de realização, foi feita a escolha ín sílíco do local ideal de clivagem da CRISPR-Cas9 (crARN) bem como dos plasmideos vetores portadores da Cassete 1 e da Cassete 2 para a edição (do inglês: gene editing) dos genes inativos flanqueadores do centrómero.

[00110] Numa primeira fase, foram selecionados dois genes inativos nas hiPSCs da linha que se pretende modificar geneticamente. Numa forma de realização, e de forma a editar o cromossoma 6 humano, foram escolhidos os genes BAG2, gene inativo em hiPSCs, flanqueador do centrómero no braço longo do cromossoma 6 humano; e LGSN, gene também inativo em hiPSCs e flanqueador do centrómero no braço curto do cromossoma 6 humano (Figura 1). A importância de que sejam genes inativos, prende-se com o facto de que após a edição, estes genes ficam inoperativos (do inglês, knockout). Assim, a sua inativação pela edição, impossibilitaria a sobrevivência ou a correta expansão das células modificadas, caso a sua atividade fosse essencial para estas funções. A sequência anotada dos genes escolhidos, (p. ex. BAG2 - CRCh38:6:57171726:57190433:1 e LGSN - CRCh38:6:63275351:63320583:1), pode ser obtida em Emsembl.org, (p. ex. GenBank format ou Word™ Microsoft™ compatível).

[00111] De seguida, procedeu-se à importação das sequências obtidas para uma das várias ferramentas bioinformáticas CRISPR-Cas9 (p.ex. CRISPR Finder; CT-Finder; CCTop-CRISPR-Cas9 ou qualquer outra disponível). A ferramenta bioinformática CRISPR apresenta diversos locais nas sequências selecionadas onde a nuclease CRISPR-Cas9 pode produzir clivagens na dupla cadeia do ADN (DSBs). Foram selecionadas entre as sequências apresentadas, duas ou três com as melhores pontuações (do inglês scores). A nuclease CRISPR-Cas9 é guiada para o local de clivagem por uma sequência de ARN designada ARN guia, gARN (do inglês: guide- RNA). Para a utilização do sistema CRISPR/Cas9, estas sequências são complementares e imediatamente a montante de uma sequência do tipo NGG, no ADN do gene escolhido, conhecida como PAM.

[00112] Numa forma de realização, as sequências obtidas são testadas, de forma a selecionar as mais eficazes após transfeção celular. Após as transfeções, os melhores gARNs foram eleitos com recurso a um Protocolo de endonuclease T7 gene 3 ADN endonuclease 1 (T7E1), (p.ex. EnGen™Mutation Detection Kit da New England BioLabs™ (NEB), seguindo as instruções recomendadas pelo fabricante.

[00113] Numa forma de realização, foi escolhida a Seq. ID N° 1 para o local de clivagem do gene BAG2 pelo sistema CRISPR/Cas9 e Seq. ID N° 2 para o local de clivagem do gene LGSN pelo sistema CRISPR/Cas9. Foram também utilizados os iniciadores (do inglês prímers) com Seq. ID N° 3 e Seq. ID N° 4 para o ensaio T7E1 no gene BAG2; e os iniciadores Seq. ID N° 5 e Seq. ID N° 6 para o ensaio T7E1 no gene LGSN.

[00114] Numa forma de realização, a Cassete 1/Gene BAG2 (Seq. ID N° 43) compreende um Braço de Homologia 5' ou Esquerdo (do inglês: 5'HA ou Left Homology Arm ou LeftHA, 1783 pares de bases, pb); um promotor PGK (do inglês: Phosphoglycerate Kínase promoter - PGK pmt); um gene de resistência à puromicina; o gene da Proteína de Fluorescência Verde Melhorado (do inglês: Enhanced Green Fluorescent Protein - EGFP), uma sequência de poliadenilação (do inglês: poliadenilation sequence - Poli-A ou pA); um nulómero; e um braço de homologia 3'ou Direito (do inglês: 3'HA ou Ríght Homology Arm ou Ríght HA, 1590 pb).

[00115] No âmbito da presente descrição designa-se por "plasmídeo p925", ou apenas p925, um plasmídeo que expressa resistência à ampicilina para a seleção dos clones perfeitamente editados, assim como uma cassete que compreende o promotor PGK, o gene de Resistência à Puromicina e o gene da proteína EGFP e uma sequência Poli A.

[00116] Numa forma de realização, foram utilizados diferentes iniciadores na preparação dos diversos componentes da Cassete 1/Gene BAG2:

• Seq. ID N° 7 e Seq. ID N° 8 foram utilizadas como iniciadores para a síntese da sequência do Braço de

Homologia 5', (1783pb), preparada para a subclonagem

(ou inserção) em sítios de reconhecimento para as endonucleases de restrição EcoRI e BamHI no plasmídeo p925, (PGK-PuroR-EGFP-2pA);

• Seq. ID N° 9 e Seq. ID N° 10 foram utilizadas como iniciadores para a síntese da sequência do Braço de

Homologia 3', (1590pb), preparada para a subclonagem

(ou inserção) em sítios de reconhecimento para as endonucleases de restrição BamHI e Notl no plasmídeo (p925);

• Iniciadores Seq. ID N° 11 e Seq. ID N° 12 foram utilizados para a síntese das sequências de poliadenilação e nulómero, preparadas para a subclonagem (ou inserção) em sítios de reconhecimento para as endonucleases de restrição Xbal e Notl no plasmídeo (p925).

[00117] O vetor de edição do gene BAG2 pode ser obtido de duas formas distintas. Numa forma de realização, é possível comprar à indústria o vetor completo, entregue sob a forma de plasmídeo em células competentes congeladas. A cultura dessas células competentes permite obter o vetor após o seu isolamento com recurso a sistemas de purificação tais como o Wizard™ Plus SV MINIPREPS DNA Purification System (Promega™) ou outro sistema equivalente. Numa outra forma de realização, pode ser feita a preparação do vetor por subclonagem dos seus diversos promotores e genes, quer num plasmideo virgem (do inglês: empty backbone plasmid), ou de outro mais completo e adequado.

[00118] Na realização do presente exemplo, foi feita a subclonagem num plasmideo (p925), contendo o promotor PGK, o gene de resistência à puromicina (PuroR), o gene da proteína EGFP, e uma sequência Poli A, bem como um gene de resistência à Ampicilina para seleção das células competentes corretamente transformadas.

[00119] Numa forma de realização, a subclonagem foi efetuada em três passos.

[00120] O primeiro passo compreende a subclonagem da sequência Poli A + nulómero em sítios Xbal e Notl no plasmideo p925. As sequências Poli A e do nulómero foram subclonadas a jusante da sequência do gene EGFP, para permitir simultaneamente a seleção dos clones de células off-the-shelf corretamente editadas bem como, numa fase posterior à de substituição cromossómica, a eliminação dos clones de células com manutenção da expressão do gene PuroR e do gene EGFP. (Figura 4). Os iniciadores Seq. ID N° 11 e Seq. ID N° 12 foram utilizados na reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reactíon) para a síntese das sequências Poli A + nulómero preparadas para a sua subclonagem (ligação) nos sítios Xbal e Notl adequados no plasmideo p925.

[00121] Numa forma de realização, para a reação da PCR foi preparada uma solução com a mistura dos vários reagentes (MIX), de acordo com a Tabela 1. Após preparação, foram misturados 47,5uL da MIX obtida a 2,5uL/40ng p925ADN [20ng/uL]. A reação PCR prosseguiu num termociclador (Applied Systems Thermocycler™), nas condições indicadas na Tabela 2.

Tabela 1: Concentração de reagentes utilizados na reação PCR.

Tabela 2: Condições da PCR num termociclador.

[00122] Após a PCR, foi feita eletroforese em gel de agarose a 0,8% de uma amostra de 5uL do produto da PCR, para confirmar a presença de uma banda de 470bp, que contem o produto da PCR composto pela sequência de Poliadenilação e nulómero. Verificando-se a presença da banda, procedeu-se à electroforese de todo o restante produto da PCR num gel de agarose a 0,8%. A banda de 470bp foi extraída do gel, com um kit apropriado, (p. ex. Wizard™ SV Gel and PCR clean-up System - PROMEGA™), seguindo as instruções do fabricante. O produto obtido (PCR ADN) foi ressuspendido em 20uL de PCRH2O, isto é, água livre das enzimas ARNase e ADNase.

[00123] O produto obtido, e já ressuspendido, foi submetido à dupla digestão das endonucleases de restrição Xbal + NotIHF, utilizando as condições mencionadas na Tabela 3, durante 2 horas a 37°C.

Tabela 3 : Condições utilizadas na digestão do ADN obtido na reação PCR pelas enzimas de restrição Xbal e NotIHF.

[00124] Após a dupla digestão Xbal + Notl, o produto obtido foi purificado com uma mistura de fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, precipitado em etanol e ressuspendido em 20uL de PCR H2O. Após purificação e precipitação, o inserto obtido contém a sequência Poli A + Nulómero, pronta a ligar ao vector p925.

[00125] Numa forma de realização, o vector p925 é preparado para a ligação ao inserto obtido. Para tal, foi feita uma dupla digestão com endonucleases de restrição Xbal e Notl, e uma defosforilação. [00126] A dupla digestão com Xbal e Notl foi feita com uma amostra de 5ug de ADN do plasmídeo p925, usando as condições descritas na Tabela 4. Após a preparação da solução, a amostra foi incubada 2 horas a 37°C

Tabela 4 : Condições experimentais para a dupla digestão por endonucleases Xbal e NotIHF do plasmídeo p925.

[00127] Após a dupla digestão Xbal + NotIHF, uma amostra de 5uL do produto obtido foi submetido a uma electroforese num gel de agarose a 0,8%, para confirmar a presença da banda correta. Após confirmação, o ADN do produto foi purificado com fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, precipitado em etanol, e ressuspendido em 20uL de PCRH2O

[00128] Após purificação, precipitação e ressuspensão do produto de ADN, este foi defosforilado, utilizando as condições descritas na Tabela 5. A reação foi feita a 37°C durante 10 minutos, sendo terminada por aumento da temperatura (5 minutos a 75°C). Após a reação, foi feita nova purificação com fenol/clorofórmio/álcool isoamilico e precipitação com etanol. O produto obtido (vetor p925/duplamente digerido Xbal+ NotI/Defosforilado) está pronto para a subclonagem (ligação) com o inserto (Poli A + Nulómero), e pode ser conservado a -20°C para uso futuro. Tabela 5: Condições experimentais para a desfosforilação.

[00129] Antes de proceder à ligação do vetor p925/duplamente digerido Xbal + NotI/Defosforilado com o inserto (Poli A + nulómero), foi feita uma electroforese em gel de agarose a 0,8% de uma amostra de luL do primeiro e de 2uL do segundo para avaliar as suas concentrações relativas. Foi obtido um rácio de 1:5 entre o vetor e o inserto, respetivamente .

[00130] A ligação (subclonagem) do vetor p925/duplamente digerido Xbal+ NotI/Defosforilado com o inserto (Poli A + nulómero) foi realizada de acordo com a Tabela 6.

Tabela 6: Mistura de reagentes de ligação.

[00131] Numa forma de realização, foram pipetados 8uL da mistura referida na Tabela 6 e 2uL do inserto (Poli A + nulómero) para um tubo de fundo redondo (Tubo 1). Num outro tubo de fundo redondo (Tubo 2, controlo negativo), foram pipetados 8uL da mistura e 2uL de PCR H2O. Ambos os tubos foram incubados a 15°C durante pelo menos duas 2 horas, de preferência durante uma noite. Após incubação, foi feita a transformação de células competentes E. coli (adquiridas à indústria) com 5uL do conteúdo de cada Tubo 1 e Tubo 2. A existência de colónias corretamente inseridas foi confirmada por sequenciação, cujas amostras foram conservadas a -80°C em glicerol. (Sigma Aldrich® - 66DE65 and 66DE66). A partir de uma colónia corretamente inserida, foi feita uma inoculação em lOOmL de solução LB ampicilina 100 num frasco Erlenmeyer, que foi incubado toda a noite num agitador horizontal. Após a incubação, foi feita uma extração de uma MIDI ou MAXI-prep (p.ex. QIAGEN™ Midi ou Maxi Kit), para a obtenção de uma quantidade suficiente de plasmideo, a ser utilizado nos passos seguintes.

[00132] Numa forma de realização, o método descrito na presente divulgação compreende um segundo passo de subclonagem, para a ligação do Braço de Homologia 5' ou Esquerdo, a montante do promotor PGK no plasmideo p925/PoliA+nulómero) . O Braço de Homologia 5' ou Esquerdo (1873bp), foi ligado (subclonado) num sitio EcoRI imediatamente a montante do promotor PGK no plasmideo p925/PoliA+nulómero . Foi providenciada a presença de um sitio BamHI na extremidade 5' da sequência para permitir o isolamento do vetor completo para a edição do gene BAG2.

[00133] Numa forma de realização, o produto da PCR foi obtido a partir de ADN genómico (do inglês: genomíc DNA - gDNA) de células HEK293T, pela utilização do Kit NZY Tissue gDNA Isolation Kit (NZYtech®), seguindo as instruções do fabricante. Utilizando os iniciadores Seq. ID N° 7 e Seq. ID N° 8, foi preparada uma solução com a mistura dos vários reagentes (MIX), de acordo com a Tabela 7, sendo depois misturados 45uL da MIX obtida a 5uL (200ng) de gDNA [41ng/uL] isolado das HEK293T. A reação de PCR prosseguiu num termociclador (Applied Systems Thermocycler™), nas condições indicadas na Tabela 8.

Tabela 7: Concentração de reagentes utilizados na reação PCR.

Tabela 8: Condições da PCR no termociclador. [00134] Após a PCR, foi feita eletroforese em gel de agarose a 0,8% de uma amostra de 2uL do produto da PCR, para confirmar a presença de uma banda de 1783pb correspondente ao fragmento de ADN que contém a sequência do Braço de Homologia Esquerdo da Cassete 1. Verificando-se a presença da banda, o restante ADN obtido na reação de PCR foi purificado por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, e digerido com a enzima de restrição EcoRI, de acordo com a Tabela 9, durante 2 horas a 37°C.

Tabela 9 : Condições experimentais para a digestão do produto da PCR (Braço de Homologia Esquerdo BAG2) pela enzima EcoRI.

[00135] Após a digestão, foi feita eletroforese em gel de agarose a 0,8% de uma amostra de 2uL do produto da digestão, para confirmar a presença de uma banda de 1783pb correspondente ao fragmento de ADN produzido por PCR e que contem o Braço de Homologia Esquerdo da Cassete 1. Verificando-se a presença da banda, o produto digerido remanescente foi isolado com recurso à extração e purificação da banda do gel de agarose a 0,8% utilizando o sistema Wizard™ SV Gel and PCR clean-up System - PROMEGA®, seguindo as instruções do fabricante. O produto obtido (Braço de Homologia Esquerdo BAG2 digerido) foi depois purificado por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, precipitado em etanol e ressuspendido em 20uL PCR H ₂ 0. [00136] De seguida, foi feita a ligação do vetor p925/PoliA+nulómero ao inserto Braço de Homologia Esquerdo BAG2, digerido. Numa forma de realização, o plasmideo p925/PoliA+nulómero foi digerido com a enzima de restrição EcoRI (Tabela 10), para preparar o vetor para a ligação (subclonagem) com o produto de PCR Braço de Homologia Esquerdo também digerido com EcoRI, previamente isolado. A digestão ocorreu durante 2 horas, a 37°C.

Tabela 10: Condições experimentais para a digestão do vetor plasmideo p925/PoliA+nulómero pela enzima EcoRI.

[00137] A digestão completa foi confirmada através de electroforese em gel de agarose a 0,8% de 5ul do produto digerido. Verificando-se a digestão completa, o produto digerido foi purificado por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico e precipitado em etanol. Por fim, o produto foi desfosforilado, seguindo o protocolo referido na Tabela 11. Após incubação durante 10 minutos a 37°C em banho de água, a reação foi terminada incubando 5 minutos a 75°C. O produto obtido foi purificado por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico e precipitado em etanol. Tabela 11: Protocolo de desfosforilação.

[00138] Numa forma de realização, o vetor p925/PoliA digerido e desfosforilado foi ligado ao inserto Braço de Homologia Esquerdo BAG2, também já digerido por EcoRI, utilizando as condições descritas na Tabela 12.

Tabela 12: Preparação da solução de reagentes (MIX) para ligação do vetor p925/PoliA digerido e desfosforilado ao inserto Braço de Homologia Esquerdo BAG2.

[00139] Numa forma de realização, foram pipetados para um tubo de fundo redondo (Tubo 1) 4uL da MIX e 6uL do inserto (Braço de Homologia Esquerdo BAG2 digerido). Num outro tubo (Tubo 2, tubo controlo negativo), foram pipetados 4uL da MIX e 6uL PCR H2O. Ambos os tubos foram incubados a 15°C durante pelo menos 2 horas, de preferência durante toda a noite. Após incubação, foi feita a transformação de células competentes E. coli (adquiridas à indústria) com 5uL do conteúdo de cada Tubo 1 e Tubo 2. Após a transformação, foi feita a extração dos plasmideos de várias colónias, usando o sistema Wizard™ Plus SV Minipreps DNA Purification System, 250 preps, PROMEGA™, e o ADN obtido quantificado, usando a Nanodrop™. A correta inserção dos plasmideos foi confirmada através de enzimas de restrição e/ou sequenciação, usando métodos amplamente conhecidos no estado da arte.

[00140] A partir de uma colónia corretamente inserida, foi feita uma inoculação em lOOmL de solução LB ampicilina 100 num frasco Erlenmeyer, que foi incubado toda a noite num agitador horizontal.Após a incubação, foi feita uma extração de uma MIDI ou MAXI-prep (p.ex. QIAGEN™ Midi ou Maxi Kit), para a obtenção de uma quantidade suficiente de plasmideo, a ser utilizado nos passos seguintes.

[00141] Numa forma de realização, após o isolamento do plasmideo p925/PoliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo corretamente inserido, um terceiro passo de subclonagem foi iniciado, para efetuar a ligação do Braço de Homologia Direito a jusante do nulómero ao vetor p925/PoliA+ Nulómero/Braço de Homologia Esquerdo.

[00142] O Braço de Homologia 3' ou Direito, (1590bp), foi ligado (subclonado), num sitio Notl imediatamente a jusante do nulómero no plasmideo p925/PoliA+Nulómero/Braço de Homologia Esquerdo. Foi providenciada a presença de um sitio BamHI na extremidade 3' da sequência para permitir futuramente o isolamento do vetor completo para a edição do gene BAG2. [00143] O produto da PCR foi obtido de ADN genómico de células HEK293T pela utilização do kit NZY Tissue gDNA Isolation Kit (NZYtech®), seguindo as instruções do fabricante. Utilizando os iniciadores Seq. ID N° 9 e Seq. ID N° 10, foi preparada uma solução com a mistura dos vários reagentes (MIX), de acordo com a Tabela 13, sendo depois misturados 45uL da MIX obtida a 5uL (200ng) de gDNA [41ng/uL] isolado das HEK293T. A reação PCR prosseguiu num termociclador (Applied Systems Thermocycler™), nas condições indicadas na Tabela 14.

Tabela 13: Concentração de reagentes utilizados na reação

PCR.

Tabela 14: Condições da PCR no termociclador.

[00144] Após a PCR, foi feita eletroforese em gel de agarose a 0,8% de uma amostra de 2uL do produto da PCR, para confirmar a presença de uma banda de 1590pb que corresponde ao fragmento de DNA produzido por PCR e que contém o Braço de Homologia Direito. Verificando-se a presença da banda, o restante ADN obtido na reação de PCR foi purificado por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, precipitado em etanol, e digerido com a enzima de restrição Notl, de acordo com a Tabela 15, durante 2 horas a 37°C.

Tabela 15: Condições experimentais para a digestão do Braço de Homologia Direito BAG2 pela enzima Notl. [00145] A digestão completa foi confirmada através de eletroforese em gel de agarose a 0,8% do produto digerido. Verificando-se a digestão completa, o produto digerido foi isolado e purificado por extração do gel após electroforese em gel de agarose a 0,8% usando o sistema Wizard™ SV Gel and PCR clean-up System - PROMEGA™, seguindo as instruções do fabricante. De seguida, foi feita a purificação do produto obtido por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, seguindo-se de precipitação em etanol. Por fim, o precipitado obtido, que contém o Braço de Homologia Direito BAG 2 (Cassete 1) pronto para ser ligado (subclonado), foi ressuspendido em 2OuL PCR H ₂ 0.

[00146] Antes de ser feita a ligação do inserto Braço de Homologia Direito BAG2, foi necessário preparar o vetor p925/PoliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo BAG2, por digestão com a enzima NotIHF. Para isso, o vetor foi tratado com Plasmid-Safe™ ATP-Dependent DNase (EPICENTRE®), utilizando os reagentes descritos na Tabela 16. A mistura foi incubada a 37°C durante 30 minutos, e após este período a enzima Plasmid-Safe™ DNAse foi inativada por incubação a 70°C, por 30 minutos, parando a reação.

Tabela 16: Tratamento do vetor p925/PoliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo BAG2 com Plasmid-Safe™ ATP-Dependent DNase (EPICENTRE®).

[00147] O produto da reação foi purificado por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, precipitado com etanol e ressuspendido em 20ul PCR H2O.

[00148] Após o tratamento com Plasmid-Safe™, o plasmideo p925/PoliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo foi digerido com a enzima de restrição NotIHF durante 2 horas a 37°C em banho de água, segundo o protocolo indicado na Tabela 17.

Tabela 17: Condições utilizadas na digestão do plasmideo p925/PoliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo pela enzima de restrição NotIHF [00149] Após digestão completa, confirmada por eletroforese em gel de agarose a 0,8%, o plasmideo resultante foi purificado por fenol/clorof órmio/álcool isoamilico, precipitado com etanol, e ressuspendido em 20ul PCR H2O. Por fim, o produto foi desfosforilado, seguindo o protocolo referido na Tabela 18. Após incubação durante 10 minutos a 37°C em banho de água, a reação foi terminada incubando 5 minutos a 75°C. O produto obtido foi purificado por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, precipitado em etanol, e ressuspendido em 50uL PCR H2O.

Tabela 18: Protocolo de desfosforilação do vetor p925/PoliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo tratado e digerido.

[00150] Numa forma de realização, o vetor p925/PoliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo digerido e desfosforilado foi ligado ao inserto Braço de Homologia Direito BAG2, também já digerido por Notl, utilizando as condições descritas na Tabela 19. Tabela 19: Preparação da solução MIX para ligação do vetor PoliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo digerido e desfosforilado ao inserto Braço de Homologia direito BAG2.

[00151] Numa forma de realização, foram pipetados para um tubo de fundo redondo (Tubo 1) 4uL da MIX e 6,4uL do inserto (Braço de Homologia Direito BAG2 digerido). Num outro tubo (Tubo 2, tubo controlo negativo), foram pipetados 4uL da MIX e 6uL PCR H2O. Ambos os tubos foram incubados a 15°C durante pelo menos 2 horas, de preferência durante toda a noite. Após incubação, foi feita a transformação de células competentes E. coli (adquiridas à indústria) com 5uL do conteúdo de cada Tubo 1 e Tubo 2. Após a transformação, foi feita a extração dos plasmideos de várias colónias, usando o sistema Wizard™ Plus SV Minipreps DNA Purification System, 250 preps, PROMEGA™, e o ADN obtido quantificado, usando a Nanodrop™. A correta inserção dos plasmideos foi confirmada através de enzimas de restrição e/ou sequenciação, usando métodos amplamente conhecidos no estado da arte.

[00152] A partir de uma colónia corretamente inserida, foi feita uma inoculação em lOOmL de solução LB ampicilina 100 num frasco Erlenmeyer, que foi incubado toda a noite num agitador horizontal.Após a incubação, foi feita uma extração de uma MIDI ou MAXI-prep (p.ex. QIAGEN™ Midi ou Maxi Kit), para a obtenção de uma quantidade suficiente de plasmideo, a ser utilizado nos passos seguintes.

[00153] Depois do isolamento do plasmideo p925/poliA+nulómero/Braço de Homologia Esquerdo/Braço de Homologia Direito corretamente inserido, designado por R52, o construto (do inglês construct) do vetor completo, para a edição do Gene BAG2 no braço longo do cromossoma 6 humano, ficou concluído (Figura 2), (Seq. ID N° 43).

[00154] Numa forma de realização, o construto R52, preparado para a edição do gene BAG2, está flanqueado por dois sítios de reconhecimento para a enzima de restrição BamHI. Tirando vantagem desta característica intencional, o vetor para a edição do gene BAG2 foi preparado pela sua excisão por digestão com BamHI, através da reação descrita na Tabela 20.

Tabela 20: Mistura de reagentes preparada para a digestão do construto R52 pela enzima de restrição BamHI

[00155] Numa forma de realização, foram pipetados 94uL da MIX e 6uL de ADN plasmidico R52 para um microtubo, que foi depois incubado durante 2 horas a 37°C num banho de água. Depois da digestão com BamHI, o ADN foi purificado por fenol/clorofórmio/álcool isoamilico, seguindo-se uma precipitação em etanol. Após a precipitação, o construto R52 ficou pronto para a transfeção celular, em que transfeção designa o procedimento em que ADN é levado a entrar dentro das células com o objetivo de conseguir alterações no seu genoma.

[00156] Após a preparação do construto, foi feita a transfeção de células estaminais pluripotentes humanas (hiPSCs) no gene BAG2, com o vetor R52 que contém a Cassete

1.

- Cultura de hiPSCs:

[00157] A cultura de células hiPSCs imediatamente após descongelamento foi feita em placas de 6 poços para cultura de células aderentes, previamente revestidas com Matrigel™ Corning™, seguindo as instruções do fabricante. As hiPSCs foram semeadas em cada um dos poços, na presença de meio de cultura mTeSR™l STEMCELL Technologies™ suplementado a 1% com uma solução de Penicilina 10.000UI/mL/Estreptomicina lO.OOOug/mL (Sigma®), sendo depois incubadas a 37°C em atmosfera húmida de 5%CC> ₂ . O meio de cultura foi trocado diariamente.

[00158] Após três passagens, as células foram semeadas em placas de 12 ou de 24 poços de fundo plano, previamente revestidos com Matrigel™ Corning™, seguindo as instruções do fabricante. O meio de cultura, regime de mudança de meio e as condições de incubação foram mantidas.

- Transfeção das hiPSCs em cultura:

[00159] Quando as células atingiram ~10% de confluência, o meio de cultura foi suplementado com Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies™ (Rocki), seguindo-se uma incubação durante 2 horas previamente à introdução dos materiais de transfeção.

[00160] A edição do gene BAG2 deu-se pela via da reparação do ADN celular designada por Reparação Dirigida por Homologia (HDR). Para isso, foi necessária a transfeção simultânea de CRISPR-Cas9/BAG2gARN, para ser feita uma clivagem da dupla cadeia do ADN (DBS) num local escolhido, e de um construto com a sequência do ADN (inserto) a incorporar no local da clivagem. Esta introdução simultânea de dois elementos diferentes na célula com um objetivo comum designa-se por co-transfeção .

[00161] Numa forma de realização, foi efetuada a co- transfeção de CRISPR-Cas9/BAG2gARN (~250ng ADN/poço) com o construto R52 (~250ng ADN/poço) em placas de 24 poços, utilizando as células previamente preparadas nos referidos poços ao atingirem 10% de confluência. A co-transfeção foi conseguida por lipofeção com recurso a Lipofectamine™ 3000 Transfection Reagent, Thermo Fisher Scientific, seguindo as instruções do fabricante. Na Figura 5 é apresentado o resultado das reações PCR obtidas em amostras de ADN genómico de hiPSCs VIRGENS (WT) como controlo negativo, e ADN genómico de hiPSCs da mesma linha das WT mas co-transfetadas, com recurso aos iniciadores SEQ. ID N° 15, SEQ. ID N°16, SEQ. ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ. ID N°19, SEQ. ID N° 20 e SEQ ID N° 21, as quais permitiram avaliar a presença de células corretamente editadas. As condições para as PCRs encontram- se listadas na Tabela 21 e foram preparadas com os tubos de todos os reagentes colocados em gelo. Tabela 21: Concentração de reagentes utilizados nas reações de PCR.

[00162] Numa forma de realização, foram pipetados 279uL de MIX para cada um de 2 microtudos separados (microtubo 1 e microtubo 2).

A- Ao microtubo 1 foram adicionados 30uL do ADN genómico WT= Virgem;

B- Ao microtubo 2 foram adicionados 30uL do ADN genómico das hiPSCs co-transfetadas;

C- Foram preparados 5 microtubos marcados com os algarismos correspondentes às respetivas SEQ. ID N° 15 a 21: SEQ. ID N° 15 + SEQ. ID N° 16 = 5'fora do construto até ao promotor PGK (PGKpmt); SEQ. ID N° 15 + SEQ. ID N° 17 = 5'fora do construto até ao Braço de Homologia 5'(5'BH)(~500bp); SEQ. ID N° 20 + SEQ. ID N° 21 = 3'fora do construto até ao Braço de Homologia 3' (3'BH)(~900bp); SEQ. ID N° 16 + SEQ. ID N° 18 = Braço de Homologia 5'(5'BH) até ao promotor PGK (PGKpmt); SEQ. ID N° 19 + SEQ. ID N° 20 = 3 fora do construto até ao Nulómero, para as 5 diferentes reações de PCR de controlo negativo (ADN genómico WT=Virgem);

D- Foram preparados outros 5 microtubos marcados com os algarismos correspondentes às respetivas Seq. ID N° 15 a 21: SEQ. ID N° 15 + SEQ. ID N° 16 = 5'fora do construto até ao promotor PGK (PGKpmt); SEQ. ID N° 15 + SEQ. ID N° 17 = 5'fora do construto até ao Braço de Homologia 5'(5'BH)(~500bp); SEQ. ID N° 20 + SEQ. ID N° 21= 3'fora do construto até ao Braço de Homologia 3'(3'BH)(~900bp); SEQ. ID N° 16 + SEQ. ID N° 18 = Braço de Homologia 5'(5'BH) até ao promotor PGK (PGKpmt); SEQ. ID N° 19 + SEQ. ID N° 20 = 3' fora do construto até ao Nulómero, para as 5 diferentes reações de PCR efetuadas com ADN genómico das células co-transfetadas.

E- 46uL da mistura de reagentes do microtubo 1 (A-), foram pipetados para cada um dos 5 microtubos (C-) de reação de PCR (genómico WT) adicionados de 2uL de cada um dos iniciadores FWD e REV marcados (SEQ. ID N° 15 a 21), e

F- 46uL da mistura de reagentes do microtubo 2 (B-), foram pipetados para cada um dos 5 microtubos (D-) de reação de PCR (co-transfetadas) adicionados de 2uL de cada um dos iniciadores FWD e REV marcados (SEQ. ID N° 15 a 21).

[00163] De imediato foram iniciadas num termociclador as reações de PCR realizadas nas condições referidas na Tabela 22.

Tabela 22: Condições das PCR no termociclador. [00164] Após a PCR, foi feita electroforese de uma amostra de 3uL de cada um dos microtubos, num gel de agarose a 0,8%, (Figura 5).

[00165] Na Figura 6 são apresentados os resultados da avaliação por Citometria de Fluxo (Citómetro Becton Dickinson FACS Calibur®) das percentagens de células que expressam a Proteína Fluorescente Verde (GFP) em quatro amostras diferentes de uma linha de Células Estaminais Pluripotentes Humanas induzidas (hiPSCs), (linha TCLab, Passagem 37), co-transfetadas de acordo com a presente divulgação. A análise foi realizada com recurso ao programa informático Flowing Software.

[00166] Na Figura 7 são apresentados os resultados da avaliação por Citometria de Fluxo (Citómetro Becton Dickinson FACS Calibur®) das percentagens de células que expressam a Proteína Fluorescente Verde (GFP) em duas amostras diferentes de uma outra linha de Células Estaminais Pluripotentes Humanas induzidas (hiPSCs), (Linha GEpi/ GIBCO, Passagem 50). Esta avaliação foi realizada após marcação das células não viáveis com recurso ao Kit: LIVE/DEAD™Fixable Dead Cell Stain Kit, ThermoFisher Scientific™. Esta marcação das células não viáveis permite aumentar a certeza em relação às células transfetadas e expressadoras de GFP que podem ser expandidas em cultura (viáveis). A análise foi realizada com recurso ao programa informático Flowing software®.

[00167] Os valores das percentagens obtidas em ambas as linhas celulares e com os dois métodos diferentes estão dentro dos limites referidos nos trabalhos de vários autores.

- Seleção das hiPSCs em cultura, resistentes à puromicina: [00168] Após 48 horas do processo transfeção, foi iniciada a seleção das células editadas. Para tal, o meio de cultura foi suplementado com puromicina (0,1 ug/mL). Numa forma de realização, a seleção de clones GFP+/Resistentes à puromicina foi feita através do aumento da concentração da puromicina no meio de cultura, com incrementos de 0,025ug/mL/dia até um máximo de 0,2ug/mL (Figura 6 e Figura7). Após 15 dias de seleção com puromicina, células GFP+ são selecionadas por Fluorescence Associated Cell Sorting (FACS). Após a sua expansão em cultura, e por método de diluição seriada, clones derivados de células únicas são isolados e expandidos. Após a sua expansão, os clones corretamente editados são selecionados de acordo com o teste para a seleção de clones de hiPSCs descrito na presente realização.

- Teste para a seleção dos Clones de hiPSCs corretamente editados:

[00169] Uma vez obtida a cultura de clones, é feita a seleção dos clones corretamente editados. Para tal, são realizadas reações PCR seguidas de sequenciação do Gene BAG2 nos clones cultivados, utilizando iniciadores amplificadores de sequências de fora para dentro dos construtos do Gene BAG2 (Cassete 1) e do Gene LGSN (cassete2) em ambas as extremidades 5' e 3'. É também feita a confirmação de que as sequências inseridas estão corretas, através da amplificação de sequências dentro dos insertos. Para a avaliação da correta inserção no Gene BAG2 foram utilizados os iniciadores Seq. ID N° 15, Seq. ID N° 16, Seq. ID N° 17, Seq. ID N° 18, Seq. ID N° 19, Seq. ID N° 20, Seq. ID N° 21 (Figura 5). Após a identificação dos clones corretamente editados no Gene BAG2, é feita a sua cultura e expansão, de forma a construir um banco destas células. As células corretamente editadas são submetidas a uma nova edição, no Gene LGSN com a Cassete 2 (Figura 3).

- Edição do Gene LGSN por HDR com a Cassete 2 (Figura 3), (Seq. ID N° 44):

[00170] Para a edição do Gene LGSN, são preparados dois vetores, a fim de serem transfectados nas células da linha de hiPSCs (já corretamente editadas no Gene BAG2). O primeiro vetor, o vetor CRISPR-Cas9 nuclease e LGSNgARN para realizar DSBs no Gene LGSN, é preparado a partir da nuclease CRISPR- Cas9 obtida comercialmente, (e.g. TrueCut Cas9 Protein v2® ThermoFisher®), e LGSNgARN sintético (TrueGuide Synthetic gRNA® ThermoFisher®), seguindo as instruções do fabricante. A Seq.ID N° 2 foi a guia escolhida após ensaio com T7E1, (EnGen® Mutation Detection Kit, NewEngland Biolabs, Inc.), para a inserção do inserto da cassete 2 no Gene LGSN.

[00171] Numa forma de realização, o segundo vetor, o vetor Cassete 2 para o gene LGSN (Figura 3, Seq. ID N° 44) é adquirido a fornecedores externos.

[00172] Após a preparação dos vetores de acordo com as indicações dos fabricantes, é feita a edição HDR do gene LGSN com a Cassete 2, em clones de hiPSCs corretamente editadas com a Cassete 1 no Gene BAG2.

- Cultura de hiPSCs/BAG2-Cassete 1 editadas:

[00173] Numa forma de realização, a cultura de hiPSCs/BAG2-Cassete 1 é feita em placas de 6 poços para cultura de células aderentes, previamente revestidas com Matrigel™ Corning™, seguindo as instruções do fabricante. As células hiPSCs são semeadas em cada um dos poços, na presença de meio de cultura mTeSR™! STEMCELL Technologies™ suplementado a 1% com uma solução de Penicilina 10.000UI/mL/Estreptomicina lO.OOOug/mL (Sigma®), sendo depois incubadas a 37°C em atmosfera húmida de 5%CC> ₂ . O meio de cultura foi trocado diariamente.

[00174] Três passagens após descongelamento, as células são semeadas em placas de 12 ou 24 poços de fundo plano, previamente revestidos com Matrigel™ Corning™, seguindo as instruções do fabricante. O meio de cultura, regime de mudança de meio e as condições de incubação foram mantidas.

- Transfeção das hiPSCs/BAG2-Cassete 1 editadas, em cultura:

[00175] Numa forma de realização. quando as células atingiram ~10% de confluência, o meio de cultura foi suplementado com Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies™ (Rocki), seguindo-se uma incubação durante 2 horas previamente à realização da co-transfeção.

[00176] A edição correta do gene LSGN é feita por HDR, com a transfeção simultânea do vetor CRISPR-eCas9/LGSNgARN (~250ng ADN/poço) e o construto LSGN (~250ng ADN/poço), em placas de 24 poços com hiPSCs a ~10% de confluência, com recurso a Lipofeção por Lipofectamine™ 3000 Transfection Reagent, ThermoFisher Scientific, seguindo as instruções do fabricante .

- Seleção das hiPSCs em cultura resistentes à puromicina e neomicina:

[00177] Numa realização, após 48 horas do processo de transfeção, é iniciada a seleção das células editadas resistentes à puromicina e neomicina. Numa forma de realização, a seleção de clones mCherry+/resistentes à neomicina, é feita através do aumento da concentração da neomicina no meio de cultura em incrementos 10ug/mL no meio de cultura iniciando com uma concentração de 40ug/mL até 200ug/mL dependendo da linha de hiPSCs utilizada. Após 15 dias de seleção com neomicina, as células em cultura são selecionadas com recurso a Fluorescence Associated Cell Sorting (FACS), para a expressão dupla de Proteína Fluorescente Verde (GFP) e Proteína Fluorescente Vermelha (mCherry). Estas células são depois cultivadas e expandidas. Após uma passagem, clones derivados de células únicas são selecionados com recurso a um processo de diluição seriada. Os clones resultantes são avaliados quanto à sua correta edição.

- Seleção dos Clones de hiPSCs corretamente editados nos Genes BAG2 e LGSN:

[00178] Numa forma de realização, uma vez obtida a cultura de clones, é feita a seleção dos clones corretamente editados. Para tal, são realizadas reações PCR, seguida de sequenciação do Gene BAG2 e do Gene LGSN dos clones cultivados utilizando iniciadores amplificadores de sequências de fora para dentro dos construtos do Gene BAG2 (Cassete 1) e do Gene LGSN (Cassete 2), em ambas as extremidades 5' e 3'. É também feita a confirmação de que as sequências inseridas estão corretas, a partir da amplificação por PCR de sequências dentro dos insertos. Para a confirmação da correta inserção do inserto no Gene BAG2 podem ser utilizados os iniciadores com as sequências: Seq. ID N° 13, Seq. ID N° 14, Seq. ID N° 15, Seq. ID N° 16, Seq. ID N° 17, Seq. ID N° 18, Seq. ID N° 19, Seq. ID N° 20 e Seq. ID N° 21. Para a confirmação da correta inserção do inserto do Gene LGSN podem ser utilizados os correspondentes iniciadores: Seq. ID N° 45, Seq. ID N° 46, Seq. ID N° 47, Seq. ID N°48, Seq ID N° 49, seq ID N° 50, Seq. ID N° 51, Seq. ID N° 52, Seq ID n°53 e Seq. ID N° 54.

- Linha de hiPSC Off-the-shelf:

[00179] Após a identificação dos clones corretamente editados, é feita a sua cultura e expansão de forma a construir um banco destas células. As células corretamente editadas em ambos os genes BAG2 e LSGN constituem o produto off-the-shelf de hiPSCs preparadas para perderem o seu par de cromossomas 6. (Figura 4)

[00180] Numa forma de realização, estas células permitem a substituição do seu par de cromossomas 6 indígena, pelo par de cromossomas 6 de um paciente e a obtenção de células saudáveis, (não portadoras de eventuais mutações presentes no genoma do paciente) e com o exato e completo conjunto de recetores HLA do paciente. Por isso, estas células off-the- shelf têm grande relevância, no campo da transplantação, visto que o problema de rejeição por incompatibilidade HLA é ultrapassado.

- Preparação do vetor CRISPR-Cas9/NulómerogARN para a perda do par de cromossomas 6 das hiPSCs/editadas nos genes BAG2 e LSGN:

[00181] Numa forma de realização, para se conseguir a perda dirigida do par de cromossomas 6 das hiPSCs off-the-shelf, foi preparado um vetor CRISPR-Cas9/nulómerogARN. Este vetor compreende uma nucleasse CRISPR-Cas9 e nulómerogARN, que determina a clivagem do par de cromossomas 6 das hiPSCs/BAG2- LSGN editadas, flanqueando os centrómeros. A Seq. ID N° 42 foi utilizada como nulómero para a construção do vetor, e as Seq. ID N° 22 Seq. ID N° 23 como iniciadores para a modificação do plasmídio ADDGENE™ #71814 eCas9, capaz de produzir nuclease CRISPR/Cas9 e o sgRNA correspondente ao nulómero .

[00182] Numa outra forma de realização, foram adquiridos a partir da indústria a nuclease CRISPR-Cas9,

(ThermoFisher®) nuclease Cas9 (TrueCut Cas9 Protein v2® ThermoFisher®) e o nulómerogARN sintético (TrueGuide Synthetic gRNA® ThermoFisher®).

[00183] Numa forma de realização, podem ser utilizadas as seguintes sequências de nulómeros, suas misturas, múltiplos ou frações, complementadas por uma sequência PAM do tipo NGG ou NGA 5' para CRISPR/Cas9: Seq. ID N° 24, Seq. ID N° 25, Seq. ID N° 26, Seq. ID N° 27, Seq. ID N° 28, Seq. ID N° 29, Seq. ID N° 30, Seq. ID N° 31, Seq. ID N° 32, Seq. ID N° 33, Seq. ID N° 34, Seq. ID N° 35, Seq. ID N° 36, Seq. ID N° 37, Seq. ID N° 38, Seq. ID N° 39, Seq. ID N° 40, Seq. ID N° 41, Seq. ID N° 42. Para outras nucleases do sistema CRISPR, a sequência PAM e a sua respetiva posição são variáveis, o que deve ser tomado em conta, se estiverem a ser utilizadas em vez da nuclease CRISPR/Cas9.

[00184] Numa forma de realização, a cassete 1 com o promotor PGK, plasmideo R52, compreende a Seq. ID N° 43, um construto com origem em ADN sintético.

[00185] Numa outra forma de realização, a cassete 2 compreende a Seq.ID N° 44, que é um construto com origem em ADN sintético.

Lista de Sequências:

Tabela 23: Sequências relativas ao gARN (ADN complementar) Tabela 24: Sequências de iniciadores e Nulómeros.

SEQ ID N° 43 - SEQUÊNCIA DO VECTOR CASSETE 1 para a edição do Gene BAG2: cggatcctat agggttgaag ctttgagaga agcagcaact gctgttgagc aagagaaaga aatccttctg gaaatgatcc acagtatcca aaatagccag gacatgaggc agatcagtga cggtgagagc catctccaca gaaggggctc atcttttaca ctcctttaaa gagtttatga taagtgtggg tcaatttttg cttgactttt ggtatgcgta caccaggcca cagcatttaa tgtgagccac agagagcagc tgcagctgtc agttcattac agcagccact tactcagaga tttcttccag catgctctct accccaagcc cctggctagg agagatagga aaaagcctgc aagctcagaa aagctggccc caagcagtaa ggccatgtgt tttatcccag gttcacagtc ctaacttcag ttcctcacaa gttactggac tgcaagagat taaaaaagca gaggaagagg gtgagagagt ggaagcagag aagtagagac caaaaaaaaa aaaaaaaaaa agatgaattg aggtacaaca taaagagaag ggacaaaatg cagagaaaat gaggaaactt gtaggaccaa taaaaggcat gaatgtaaaa atgtgctgtc attttctttt ttcttttttt gagatggagt tttactcgtc acccaggctg gagtgcaatg gcgcgatctt ggctcactgc aacctctgcc tcctgggttg aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt agctgggatt acaggcacgt gccaccacgc ctggctaatt tttatatttt tagtaaagac agggtttcac catgttggcc aagctggtct caaactcctg acctcaggtg atccgcctgc ctcagcctcc caaagtgctg ggattacagg catgtgacat ctgcctaacc tgtgctgtca ttttcatgtg aagaacatga aataggaata ggtcacttct gattttcttt tattggcact ggacttccta cttgggctcc tttggtgcca cacaggccac atggtactgg gccaagtggc tggtgaggta agtaagcaac ctaaatccag atcaaaactg ttacacatct ataggtaggc catgatctag tctctacgct atcctgccca aagatcaatg aattaggaag ttacagaagc aggagcttgc tgactttctc atataaataa tgaaatgttg atagagctcc tcgtgctggc caagacttta gaccactgtc ctgcttctat ctggagaagg atgaagtcag tgcctagtat tgacgacaga agacagctta tcttctatcg tggctacatt ttctcaacca aaatttgggg cattgtattc tgataaatgc acatgtcgtt ctggagagat ctgggacatc tgatctctgg agctctaccc agcataaacc ctatatgtgc ttactgctca cagtgttaag acttgatctc catcccagtt acaaatgcat acctacccaa acttttgcag acatgccaat ttgagaagtc atctggtatc ccatatatgc agattgtcag gaagtggtat tctacaacct ctttctgtaa tctaatacat ttcatcagtt aatcttacat gctatagttt cagcttttat ctctaaaaaa atttcatggc agaggtaaag aaaataataa atttagtcac aaacaaatgc cttaatgttt ttgacacaga taagtttaca tctcatattg atttttagga gaaagagaag aattaaatct gactgcaaac cgttgaattc gtcgacctcg aaattctacc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acctgcatcc atctagatcc gtcgacaaaa tctatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaatat ctagagcggg atgcagaaat tgatgatcta ttaaacaata aagatgtcca ctaaaatgga agtttttcct gtcatacttt gttaagaagg gtgagaacag agtacctaca ttttgaatgg aaggattgga gctacggggg tgggggtggg gtgggattag ataaatgcct gctctttact gaaggctctt tactattgct ttatgataat gtttcatagt tggatatcat aatttaaaca agcaaaacca aattaagggc cagctcattc ctcccactca tgatctatag atctatagat ctctcgtggg atcattgttt ttctcttgat tcccactttg tggttctaag tactgtggtt tccaaatgtg tcagtttcat agcctgaaga acgagatcag cagcctctgt tccacataca cttcattctc agtattgttt tgccaagttc taattccatc agaagctggg tacgctcgga ccgacgtatc ggatgcggcc gctgatggga agaactctca ccgttgaagt gtcagtagaa acaattagaa acccccagca gcaagaatcc ctaaagcatg ccacaaggat tattgatgag gtggtcaata agtttctgga tgatttggga aatgccaaga gtcatttaat gtcgctctac agtgcatgtt catctgaggt gccacatggg ccagttgatc agaagtttca atccatagta attggctgtg ctcttgaaga tcagaagaaa attaagagaa gattagagac tctgcttaga aatattgaaa actctgacaa ggccatcaag ctattagagc attctaaagg agctggttcc aaaactctgc aacaaaatgc tgaaagcaga ttcaattagt cttcaaacct aagagcattt acacaataca caaggtgtaa aaatgataaa atactatttt aattgataac tagttctttg ttaggtataa ccacttagtt gacactgata gttgtttcag atgaggaaaa tattccatca agtatcttca gttttgtgaa taacaaaact agcaatattt taattatcta tctagagatt ttttagattg aattcttgtc ttgtactagg atctagcata tttcactatt ctgtggatga atacatagtt tgtggggaaa acaaacgttc agctaggggc aaaaagcatg actgcttttt cctgtctggc atggaatcac gcagtcacct tgggcattta gtttactaga aattctttac cttaagcagc acacacattt actacacaca cagtgttaac aaagcactgt gcttagaggg taaaaaggaa tcacaaaaca agaatctttc caaagttgtc tcattcagca atgttaaggc atctgtatca aattattttg gatgtaaaga ttcctgtgtc tcataatatg aatgtatttt ttgatataca agaaactgac ataaaatgtg agaaaaccac ctataattta ccactgtgaa caattatata tctatctgct tcatcttttc tcaaatgcat caattctcta aaattcctat attgtaactt gccttttttt aaaaaagtta gatgctgata taaagtctgc ttaattgtca acttaatgag ctctattttg tgtagttata tctttatcca ttcctctttt atggacattt aggttgtttc caacttgttg ctattactgc aacatatttt tgtacacagg actttttcct tctttcattt ttgtttttct ctgtataaag gcccagcagt gaattatatt gggtcaaagg atatagacgt tttcatggcc tcacacatat taaacttttt ttgtataaag gttacagcaa tttatacttt tttcagtaat taaaatatag ctatttcact gaaatatttc cagcactgag cattaatacc tagtttgcat tttgtttact aaaaaggttg accagtgtgt tgattcttct tttatctgat aaagtgtgaa gcaactagag aacacttatt tgttcaaagt aactagtcct attgatatac aaaaaccaca acaacttccc tggatactat tttg

SEQ ID N° 44 - SEQUENCIA DO VECTOR CASSETE 2, para edição do GENE LGSN: agtcactggc caagaaagtg cattgtttat agagaattta aaaacaggcc aggtgaggtg gctcatgtct gtagcctgta atcccagcac tttggaaggc tgaggcaggt ggatcatttg aggtcaggag tttgagacca gaccggctaa catggtgaaa ccccatctct actagaaata taaaaaatta gcgtggcatg gtggcatgcc ctgtaaaccc agctactcag gaggctgagg caggaggatc acttgagccc aggaggcaga gattgcagtg agccaagatc atgccactgc actccagcct gggtgacaga gtgagactct gtctcaaaaa aataaattaa ttaattaaaa ataaataaat aaataataaa atctactaaa atctgactgc tttttattgt aaccatatgc tgggaattcc tactgtcctg ccttaggaca caatgattcc taggattgag cctgttgccc aaattaactt ctagttttag cagtgtctca catctgttga aatctagttg gagttccaaa atgtgttatg aaaacacctt ccataccttt cttatggccc ctcaaatcct ctgtaatgat ttttgtattc attttcagag cagaaaactg tctctcttcc tactcataca ttcctctgtt tgttcttttt tttttctact actgtcatcc taattctaac cctctttaca ttgtaaatat tttgattggt tatttttata tatttacgtt gtaagcttat atttgccatc ttttatgaca cttatgtagg aataactttt atttgtcctt ttgcttctcc caaaaaagaa atgaagatgt 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acttcatcta taaaaccaat tcattctccc aa [00186] A presente divulgação não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma e de substituições de caracteristicas técnicas por outras equivalentes, dependendo dos requisitos de cada situação, tal como definido nas reivindicações anexas.

[00187] O termo "compreende" ou "compreendendo" quando utilizado neste documento destina-se a indicar a presença das caracteristicas, elementos, inteiros, passos e componentes mencionados, mas não impede a presença ou a adição de uma ou mais outras caracteristicas, elementos, inteiros, passos e componentes, ou grupos dos mesmos.

[00188] As seguintes reivindicações definem realizações adicionais da presente descrição.

Referências

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• B. Roberts, A. Haupt, et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell Volume 28 October 15, 2017

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Roberts, B., Gunawardane, R.N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp . (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).

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• Molecular Cloning: a laboratory manual/ 4th Edition; Tom Maniatis; 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press.

• (2007) ABSENT SEQUENCES: NULLOMERS AND PRIMES, - GREG HAMPIKIAN and TIM ANDERSEN - Pacific Symposium on Biocomputing 12:355-366(2007)

• (2017) CRISPR/Cas9-mediated targeted chromosome elimination, Zuo et al. Genome Biology (2017) 18:224

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• METHOD FOR REMOVING DESIRED CHROMOSOME AND TALOR-MADE MEDI CAL TREATMENT UTILIZING THE SAME; Patente N° US 2009/0264312 A1 de 22 de Outubro de 2009, inventores: Takashi Tada, Kyoto (JP); Norio Nakatsuji, Kyoto (JP); Hiroyuki Matsumura, Kyoto (JP); Masako Tada, Tokyo (JP)