Eine wichtige Problematik in der Diagnostik und in der Forschung betrifft die exakt definierte Probenpräparation. Die heute gebräuchlichen Technologien, wie z. B. Zentrifugation, Filtrierung, Magnetseparation und FACS (Fluorescence Acti- vated Cell Sorting) haben verschiedenste Nachteile, wie eingeschränkte Spezi-

fität, niedrige Durchsatzrate, geringes Reinigungsvermögen oder auch teure Vorrichtungen zur Isolierung und Reinigung von Zellen, Organellen oder Biomo- lekülen (z. B. Proteinkomplexen). Die wichtigsten Anwendungen für die Reini- gung von Zellen, Organellen und Biomolekülen (z. B. Proteinkomplexen) finden sich in Bereichen der Biopharmazie, Biotechnologie, Umweltanalytik, Lebens- mitteltechnologie und in der Medizin. Die angewandten Techniken sind entweder präparativ (Biopharmazie und Biotechnologie) oder analytisch (Umweltanalytik, Lebens-mitteltechnologie und in der Medizin) ausgerichtet.

Die Free-Flow-Elektrophorese (FFE) ist eine der vielversprechendsten Technol- gien für die Auftrennung aller möglicher Teilchen [vgl. Krivanova L. & Bocek P. <BR> <BR> <P>(1998) "Continuous free-flow electrophoresis"Electrophoresis 19 : 1064-1074].

Im Proteomics-Bereich ist die FFE die Technologie der Wahl für die definierte Voraufteilung von komplexen Proteinproben in Bezug auf deren unterschiedli- chen pI-Wert (Ionisierungsgrad). Die Auftrennung von Zellen durch die FFE er- folgt auf Grund der elektrophoretischen Mobilität der Zellen. Die entsprechen- den Prinzipien wurden bereits gründlich charakterisiert [vgl. z. B. Bondy B., Bau- er J., Seuffert I. und Weber G. (1995)"Sodium chloride in separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis", Electrophoresis 16 : 92-97], hingegen wurde die FFE bislang nur wenig akzeptiert, weil die meisten Zell-Typen sich in ihrer Oberflächenladung nur geringfügig unterscheiden und eine Auftrennung dieser Zelltypen deshalb schwierig ist. Eine erste Verbesse- rung brachte die Einführung der Immuno-FFE, bei der spezifische Antikörper an definierte Oberflächenepitope der aufzutrennenden Zellen gebunden werden und so über eine veränderte Nettoladung der Zelloberfläche eine modifizierte elekrophoretische Mobilität dieser Zellen in der FFE erzielt werden konnte [vgl. <BR> <BR> z. B. Hansen E. und Hannig K. (1982) "Antigen-specific electriophoretic cell se- paration (ASECS) : isolation of human T and B lymphocyte subpopulations by free-flow electrophoresis after reaction with antibodies", J. Immunol. Methods 11, 51 : 197-208].

Ein gattungsgemässes FFE-Verfahren wird in der internationalen Patentanmel- dung PCT/EP01/14408 beschrieben. Es handelt sich dabei um ein Elektrophore-

se-Verfahren in einer Vorrichtung mit einem von einem Trennmedium durch- flossenen Trennraum, der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch die- se beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist.

Zudem umfasst diese FFE-Vorrichtung eine Pumpe zum Zuführen des Trennme- diums, welches über Medienzuführungen in den Trennraum gelangt und diesen über Auslässe wieder verlässt. Die FFE-Vorrichtung umfasst ausserdem Elektro- den zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium sowie Probeaufga- bestellen zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen bzw.

Analyten und Fraktionierstellen zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium. Diese abgetrennten Teilchen können einer Analyse oder einer präparativen Weiterverarbeitung zugeführt werden. Zum Beeinflus- sen des Strömungsprofils des Trennmediums kann vorgesehen sein, dass zwei oder mehrere separate Förderkanäle einer Dosierpumpe mit dem Trennraum im Bereich der elektrodennahen Fraktionierauslässe verbunden sind, um Medium zuzugeben.

Das Patent US 5,948, 231 offenbart Verbindungen, Verfahren und Vorrichtungen zum Ausführen von ultraschnellen Bindungs-Assays in der Kapillar-Elektropho- rese oder in anderen Elektroseparations-Techniken wie z. B. in der Free Flow Elektrophorese.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die präparative bzw. analytische Isolation von Teilchen, wie Zellen, Organellen und Biomolekülen (z. B. Proteinkomplexen) und dergleichen, bzw. von Biopartikeln oder Biopoly- meren in der FFE weiter zu verbessern.

Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe-gemäss einem ersten Aspekt-gelöst, indem ein Free-Flow-Elektrophorese-Verfahren zum Trennen von Teilchen, ins- besondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Bio- molekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben, mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 1 vorgeschlagen wird.

Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe-gemäss einem zweiten Aspekt-gelöst, indem eine Free-Flow-Elektrophorese-Vorrichtung zur Durchführung des Ver- fahrens zum Trennen von Teilchen, insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komple- xen derselben, mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 18 vorgeschla- gen wird.

Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe-gemäss einem dritten Aspekt-gelöst, indem Trennmittel zum Trennen von Teilchen, insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben in einer Free-Flow-Elektrophorese-Vorrichtung, ent- sprechend den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 26 bzw. 27 vorge- schlagen werden.

Weitere bevorzugte Merkmale ergeben sich jeweils aus den abhängigen Ansprü- chen.

Als Teilchen oder"particle"gelten im Zusammenhang mit der vorliegenden Er- findung z. B. alle partikulären Masseneinheiten vorzugsweise biologischen Ur- sprungs, wie Zellen, Viren, Zellorganellen, Vesikel, Zellkerne und Membranen sowie Teile oder Aggregate derselben ; zudem Biomoleküle, wie Lipide, Proteine, DNA, RNA und Zucker, sowie Komplexe oder Aggregate von Biomolekülen, wie Lipoproteine, Glykoproteine, Lipopolysaccharide usw.. Zu diesen Teilchen zählen auch organische und anorganische Moleküle, wie Pharmaka, Polymere und der- gleichen.

Ein erfindungsgemässes Verfahren zum Trennen von solchen Teilchen auf Grund der selektiv modifizierten Oberflächenladung-insbesondere zum Auftrennen von Zellen oder Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen, bzw. von Tei- len oder Komplexen derselben mittels der Free-Flow-Elektrophorese-Technik umfasst folgende Vorteile :

Magnet-Beads eignen sich nicht zur präparativen Trennung von Teilchen ; zu- dem kann mit Magnet-Beads nur jeweils ein einziger Teilchentypus isoliert werden. Magnet-Bead-Anwendungen können deshalb-falls gleichzeitig posi- tiv und negative geladene Ladungsträger verwendet werden-durch die er- findungsgemässe FFE ersetzt werden. Die erfindungsgemässe FFE erlaubt ei- ne simultane Isolation von mindestens zwei Teilchentypen mit einer maxi- malen Effizienz, weil die individuelle elektrophoretische Mobilität der Teilchen wesentlich und selektiv erhöht wird.

Viele FACS-Anwendungen können durch FFE-Anwendungen ersetzt und mit wesentlich kostengünstigeren und schnelleren Vorrichtungen, nach Wunsch auch automatisiert, durchgeführt werden.

Spezifisch ausgewählte, lebende Zellen können dank der Spezifität der ver- wendeten Antikörper und der Trennkraft der FFE qualitativ und quantitativ bzw. im präparativen oder analytischen Massstab isoliert werden.

Erstmals wird es möglich, eine sanfte Präparation zur Gewinnung einer hochreinen Population von Organellen auszuführen.

Im präparativen bzw. analytischen Massstab können Teilchengemische in re- lativ grosser Menge innerhalb kurzer Zeit exakt getrennt werden. Als ein Bei- spiel dient die Aufreinigung zirkulierender Tumorzellen aus Vollblut (Tumor- zellen kommen im Verhältnis von 1 to6 bis 1 : 108 in Vollblut vor) : Aus hepari- nisiertem Vollblut wurden die weissen Blutkörperchen (2 ml MNC-Fraktion aus 10 ml Vollblut) inkl. der Tumorzellen mittels eines Dichtegradienten von den roten Blutkörperchen abgetrennt und nach entsprechender Markierung der Tumorzellen (Inkubation mit epitopspezifischen Antikörpern mit"charge la- bels") auf die FFE zur Trennung aufgegeben. Die Zugabe erfolgte mit 4 bis 10 ml/Stunde. Die gereinigten Tumorzellen konnten in 2-8 ml Endvolumen ge- wonnen werden.

Die vorgeschlagene Free Flow Elektrophorese (FFE)-Vorrichtung ermöglicht die Durchführung verschiedener Trenntechniken mit unterschiedlichen und selektiven Trennparametern.

Das vorgeschlagene FFE-Verfahren ermöglicht nicht nur die Isolation sondern auch die selektive Depletion von Teilchen aus einem Teilchengemisch, wie z. B. eine Abreicherung von abundanten Proteinen (z. B. Trennen von Serum- albumin aus Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blutplasma).

Das Festsetzen von auf Grund ihrer besonderen biologischen Relevanz abge- trennten Teilchen an den Elektroden und daraus resultierende, wesentliche Verluste dieser Teilchen, können mit einem Fokussierkissen aus einem elek- trisch hoch-leitenden Kissenmedium erfolgreich verhindert werden.

Bevorzugte und beispielhafte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens bzw. der erfindungsgemässen Vorrichtung zum Trennen von Teil- chen auf Grund ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung-insbeson- dere zum Auftrennen von Zellen oder Zellbestandteilen, Organellen oder Bio- molekülen, bzw. von Teilen oder Komplexen derselben mittels der Free-Flow- Elektrophorese-Technik-werden im Folgenden an Hand von schematischen Zeichnungen-weiche die Erfindung lediglich veranschaulichen, deren Umfang aber nicht einschränken-näher erläutert. Dabei zeigen : Fig. 1 zu trennende Zellen, welche : Fig. 1A ohne bestimmte Epitope, Fig. 1B mit zwei Epitopen eines ersten Typs, Fig. 1C mit drei Epitopen eines zweiten Typs ausgestattet sind ; Fig. 2 einen epitop-spezifischen Antikörper und ladungstragende Moleküle ;

Fig. 3 zu trennende Zellen mit entsprechenden Epitopen, wobei in : Fig. 3A die beiden Epitope des ersten Typs negativ ladungsmarkiert sind, wodurch die Netto-Oberflächenladung der Zellen stark negativ wird, und in Fig. 3B die drei Epitope des zweiten Typs positiv ladungsmarkiert sind, wodurch die Netto-Oberflächenladung der Zellen stark positiv wird ; Fig. 4 ein Prinzipschema einer erfindungsgemässe Vorrichtung zum gleich- zeitigen Trennen von zwei ladungsmarkierten Zelltypen ; Fig. 5 eine schematische Darstellung von erfindungsgemäss verwendbaren Trennungsmitteln in einer möglichen Anordnung und Wechselwir- kung mit einem zu trennenden Teilchen ; Fig. 6 schematisierte Draufsichten auf erfindungsgemässe Vorrichtungen, wobei : Fig. 6A und 6D eine CHIEF-Vorrichtung mit einem linearen pH-Gradienten und einem homogenem Feld ; Fig. 6B und 6E eine PZE-Vorrichtung mit einem homogenen pH-Wert und einem homogenen Feld ; und Fig. 6C und 6F eine CITP-Vorrichtung mit einem pH-Gradienten und einem Feld-Gradienten zeigen ; Fig. 7 eine schematische Mengen-Verteilung von ladungstragenden Zellen gleichen Typs : Fig. 7A ohne Verwendung, und Fig. 7B mit Verwendung eines erfindungsgemässen Fokussier- kissens.

Figur 1 zeigt zu trennende Zellen als Beispiel für zu trennende Teilchen 1, 1', 1".

Diese Zellen, können ohne bestimmte Epitope (vgl. Fig. 1A) ausgestattet sein.

Solche Zellen weisen eine relativ geringe negative Netto-Oberflächenladung auf und sind in der FFE nur sehr schwer zu trennen. Weisen die Zellen aber Epitope eines ersten Typs 2' (Fig. 1B) oder eines zweiten Typs 2" (Fig. 1C) auf, so kön- nen diese Zellen mit ladungstragenden Molekülen bzw. Ladungsträgern epitop- spezifisch markiert werden. Allgemein kann somit die Netto-Oberflächenladung von Teilchen selektiv verändert werden, indem geladene Bindungsmoleküle an diese Teilchen gebunden werden. Diese Bindung kann auf einer Antigen-Anti- körper-Wechselwirkung beruhen. Weitere, zur erfindungsgemässen Modifikation der Netto-Oberflächenladung von Teilchen verwendbare Wechselwirkungen zum Ankoppeln von Bindungsmolekülen an die zu trennenden Teilchen umfassen auch Rezeptor-Ligand-, Enzym-Substrat-und Protein-Protein-Wechselwirkun- gen. Auch eine Chelatbildung oder eine auf allgemeinen Molekül-Wechselwir- kungen beruhende Bindung, sei diese ionisch oder auf Van-der-Waals-Kräften bzw. auf Wasserstoffbrücken beruhend, aber auch eine kovalente Bindung kann für diesen Zweck verwendet werden.

Mit der erfindungsgemässen FFE-Vorrichtung bzw. mit dem erfindungsgemässen FFE-Verfahren können relevante Zellen aus Körperflüssigkeiten (z. B. dissemi- nierte Tumorzellenn aus Blut, Sputum, Ascites, Urin, Lavagen etc. ) bzw. aus<BR> Gewebehomogenaten (z. B. solide Tumoren in Niere, Thymus etc. ) oder Orga- nellen aus Zellhomogenaten (z. B. Calciosomen,"coated vesicles", Endosomen, Endopiasmatisches Retikulum, Golgi-Zisternen, Lysosomen, Peroxisomen und Mitochondrien) sowie Proteine aus Proteomen oder Expressionssystemen isoliert werden.

Figur 2 zeigt einen epitop-spezifischen Antikörper sowie zwei monomerische oder polymerische Ladungsträger oder"charge label" (vgl."CL"in Fig. 5) in Form von Kationen 4 oder Anionen 5. Ein Ladungsträger 4,5 ist ein bei einem gegebenen pH-Wert ionisiertes Molekül. Es kann anionisch oder kationisch, mo- nomer oder polymer sein. Mit Hilfe von solchen Ladungsträgern 4,5 kann die Netto-Oberflächenladung von Teilchen gezielt verändert werden. Geladene Par- tikel, wie z. B. Beads können auch als Ladungsträger verwendet werden.

Beispiele von anionischen Ladungsträgern 5 sind : Polyglutaminsäure (PGA) ; anionische oder derivatisierte Proteine, wie Albumin ; anionische Polysaccharide, wie Heparin oder Algininsäure, Polyasparaginsäure, Polyacrylsäure und Polya- minsäuren mit einer negativen Netto-Ladung bei einem brauchbaren pH (z. B. im Bereich von pH 4 bis 10). Anionische Polymere mit einem Molekulargewicht von 500 bis etwa 500'000 Dalton werden bevorzugt. An ein spezifisches Bindungs- molekül können auch mehrere monomerische oder polymerische Ladungsträger gebunden werden, um die Netto-Oberflächenladung der zu trennenden Teilchen noch stärker auszubilden. Beispiele von bevorzugten kationischen Ladungsträ- gern 4 umfassen homopolymere oder copolymere Proteine mit einem bevor- zugten Molekulargewicht von 500-500'000 Dalton ; quaternäre Ammoniumver- bindungen mit zwischen 1 % bis 10 % Stickstoffanteil (ohne Gegenion). Kom- merziell erhältliche quaternäre Ammonium-Polymerverbindungen umfassen z. B. die Produkte MERQUAT. RTM. (Calgon, Pittsburgh, PA, USA), CELQUAT. RTM.

(National Starch and Chemical Corp., Bridgewater, NJ, USA), GAFQUAT. RTM.

(GAF Corp., Wayne, NJ, USA) und MAGNIFLOC. RTM (CYTEC Ind., Indianapolis, IN, USA) sowie Hexadimetrinbromid (POLYBRENE. RTM) und Diethylaminoethyl- Dextran (beide von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Diese und weitere anionischen und kationischen Ladungsträger sind im Patent US 5,670, 381 beschrieben, auf welches hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

Ein solcher Antikörper (vgl. Fig. 2) wird in der Folge als Bindungsmolekül 3 oder "binding molecule"bezeichnet. Die Bindung zwischen einem Bindungsmolekül 3 und einem Teilchen 1"sowie die Bindung zwischen einem Ladungsträger 4,5 und dem Bindungsmolekül 3 kann kovalent oder nicht-kovalent (z. B. adsorptiv, auf Van-der-Waals-Kräften oder Wasserstoffbrücken, auf einer Biotin-Streptavi- din-Wechselwirkung etc. beruhend) sein. Das Bindungsmolekül 3 kann z. B. ein Antikörper (vgl. Fig. 2), Streptavidin, Biotin, Rezeptor, Ligand, Cheiatbildner (z. B. Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure = Ni-NTA), ein niedrig-affiner Binder (Pro- tein-Protein-Wechselwirkung) oder ein chemisch aktiviertes Molekül (z. B. akti- vierter Ester, Affinitätslabel) sein. Den Komplex bestehend aus Bindungsmolekül 3 und Ladungsträger 4 bzw. 5 nennen wir geladenes Bindungsmolekül 6 oder "charge label binding molecule".

Figur 3 zeigt zu trennende Zellen mit entsprechenden Epitopen 2', 2". Dabei sind in Fig. 3A die beiden Epitope des ersten Typs 2'negativ und in Fig. 3B die drei Epitope des zweiten Typs 2"positiv ladungsmarkiert. Die Netto-Oberflächen- ladung der markierten Zellen ist deshalb stark verändert, so dass sich diese Zellen mit ihrer spezifisch veränderten Netto-Oberflächenladung in der FFE un- terschiedlich verhalten. Den Komplex aus Teilchen 3 und geladenem Bindungs- molekül 6 nennen wir ladungsmodifiziertes Teilchen 7', 7" oder"charge modified particle". Vorzugsweise wird die Netto-Oberflächenladung der Zellen so verän- dert, dass sich ein Zelltyp in einem Trennmedium 8 einer erfindungsgemässen Vorrichtung gegen die Kathode 9 und der andere Zelltyp gegen die Anode 10 bewegt, wie dies im Prinzipschema von Figur 4 dargestellt ist. Dabei entfernen sich die zwei Gruppen ladungsmodifizierter Teilchen 7', 7" bzw. die zwei ladung- modifizierten Zelltypen 7', 7" im Wesentlichen gleichzeitig von den unmarkierten bzw. nicht-ladungsmodifizierten Hintergrundzellen 7, welche sich im Wesentli- chen in der Mitte (oder zumindest in einer grossen Entfernung von den Elektro- den 9,10 im Trennmedium 8 der erfindungsgemässen Vorrichtung bewegen.

Der Pfeil gibt dabei die Hauptfliessrichtung des Trennmediums 8 an. In einem Sammelbereich 11 werden die verschiedenen, von einander getrennten Zellty- pen aufgesammelt und einer Weiterverwendung zugeleitet. Das Sammeln ge- schieht in an sich bekannter Weise über in einer Reihe angeordnete Ablassöff- nungen. Die Auflösung der FFE wird im Wesentlichen durch das Migrationsver- halten der Teilchen 7,7', 7" und die Grösse und Anzahl der Ablassöffnungen be- stimmt. Der Trennraum 14 umfasst dabei den Raum für das Trennmedium 8 und die beiden seitlichen, elektrodennahen Bereiche 19 für die mit dem Kissen- medium 20 gebildeten Fokussierkissen 12,13 (vgl. auch Fig. 7).

Die Masse der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" wird durch die FFE in etwa in einer Normalverteilung den Ablassöffnungen zugeleitet, wenn man von einem (ungewollten) Anhaften von ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" an den Oberflä- chen der Elektroden 9,10 absieht. In Fig. 7A ist so eine Normalverteilung in einer schematischen Querschnittsansicht dargestellt. Weil aber dieses Migrati- onsverhalten der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" zu einer schlechten Auflö- sung der FFE führen kann, wird vorzugsweise je ein Fokussierkissen 12,13 aus

einem ebenfalls fliessfähigen elektrisch hoch-leitenden Trennmaterial, in der unmittelbaren Nähe der Elektroden 9,10 vorgesehen. Dieses Fokussierkissen 12,13 verhindert durch seine hohe elektrische Leitfähigkeit, dass die ladung- modifizierten Teilchen 7', 7" bis ganz zur jeweiligen Elektrode diffundieren kön- nen. An der Grenze zwischen dem Trennmedium 8 und dem Kissenmedium 20 kommt es zu einer Konzentration der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7", wie dies in Fig. 7B dargestellt ist. Vorzugsweise fliessen dabei Trennmedium 8 und Kissenmedium 20 in die gleiche Richtung.

Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung von erfindungsgemäss verwendba- ren Trennungsmitteln in einer möglichen Anordnung und Wechselwirkung mit einem zu trennenden Teilchen. Das ladungsmodifizierte Teilchen 7', 7" besteht hier aus einem Protein P an welches in an sich bekannter Weise eine Kette von Histidinmolekülen H (ein sogenanntes"His Tag") angehängt worden ist. An die- ses His Tag gebunden ist ein geladenes Bindungsmolekül 6. Dieses geladene Bindungsmolekül 6 besteht aus Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure = Ni-NTA), wel- ches an zwei Histidinmoleküle bindet. Der anionische Ladungsträger 5 ist hier kovalent an die Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure, das Bindungsmolekül 3 gebun- den.

Figur 6 zeigt schematisierte Draufsichten auf erfindungsgemässe Vorrichtungen.

Diese Free-Flow-Elektrophoresevorrichtung umfassen zumindest einen mit ei- nem Trennmedium 8 durchfliessbaren Trennraum 14. Dieser Trennraum ist durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt. Diese FFE-Vorrichtung umfasst zudem eine Dosierpumpe (nicht dargestellt) zum Fördern des Trennmediums 8, welches über Medienzuführungen 15, 15' in den Trennraum 14 gelangt und die- sen über Auslässe 16 wieder verlässt. Des Weiteren umfasst die FFE-Vorrich- tung Elektroden 9,10 zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium 8 sowie Probeaufgabestellen 17 zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemi- sches von Teilchen 7,7', 7" und Fraktionierstellen 18 zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium 8. Zwei separate Förderkanäle 15'der Dosierpumpe sind mit dem Trennraum 14 im Bereich der elektrodenna-

hen Fraktionierauslässe 16'verbunden, um Medium zuzugeben. Diese zwei se- paraten Förderkanäle der Dosierpumpe dienen vorzugsweise zum Ausbilden je eines elektrisch hoch-leitenden Fokussier oder Führungskissens für die ladung- modifizierten Teilchen 7', 7" in den elektrodennahen Bereichen 19 des Trennme- diums 8 und sind mit einem separaten Mediumbehäiter (nicht dargestellt) zum Bereitstellen eines elektrisch hoch-leitenden Kissenmediums verbunden.

Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen isoelektrischen Fokussierung (CHIEF) beruht auf dem unterschiedlichen pI-Wert der zu trennenden Teilchen.

Dabei entspricht dieser pI-Wert den pH-Wert des umgebenden, inhomogenen Mediums, gegenüber dem die Teilchen neutral erscheinen. Die FFE von Teilchen auf Grund ihres unterschiedlichen isoelektrischen Punktes ermöglicht die Iso- lierung von Analyten bzw. Teilchen mit geringsten Differenzen in ihren pI- Werten. Am isoelektrischen Punkt pI (d. h. an der Stelle des Trennmediums 8, welche gerade den pH-Wert aufweist, bei dem für ein gegebenes Teilchen (z. B. ein Proteinmolekül) die Anzahl negativer und positiver Ladungen gleich gross ist) ist die Gesamtladung bzw. Netto-Oberflächenladung dieses Teilchens gleich null. Der im Trennmedium 8 einer CHIEF-Vorrichtung inhärente Fokussiereffekt bewirkt, dass ein Teilchen 1', 1", welches vom pI wegdiffundiert, automatisch wieder eine (positive oder negative) Netto-Oberflächenladung erhält und durch das elektrische Feld wieder zum pI hin bewegt wird.

Auf Grund der Wechselwirkung von Analyten bzw. Teilchen mit einem einzigen Bindungsmolekül oder"binding molecule"mit hoher Ladungsdichte ist eine we- sentliche Veränderung des pI-Wertes und somit eine schnelle und vollständige Trennung des Komplexes aus Teilchen und Bindungsmolekül von den übrigen Spezies der Probe zu erwarten. Das Verfahren der kontinuierlichen isoelektri- schen Fokussierung ist besonders geeignet zur mikropräparativen bis präparati- ven Isolierung von Biopolymeren allgemein und von Biopartikeln, deren biologi- sche Funktion bzw. deren Integrität im Bereich der gewählten Spannbreite des pH-Gradienten im Trennmedium gesichert ist. Dies gilt im Fall von vielen Ver- tretern der Viren, Bakterien, Zellorganellen und Membrandomänen, da durch

Zugabe von"osmotischen Expandern"die Erhaltung eines idealen osmotischen Druckes gesichert werden kann : Durch Zugabe von ungeladenen Substanzen (z. B. Zucker, als nicht-ionischer, osmotischer Expander) und/oder von Salzen (z. B. Na1, ales ionischer, osmotischer Expander) kann ein für einen Zelltyp op- timaler osmotischer Druck, d. h. isomolale Konditionen erzeugt werden (z. B. für Säugerzellen 250-310 mosmol).

Figur 6 zeigt eine erfindungsgemässe Vorrichtung zur Trennung von ladung- modifizierten Teilchen 7', 7"von nicht-ladungsmodifizierten Teilchen 7 in einem Trennmedium 8, welches in einem Trennraum 14 zwischen zwei Elektroden 9,10 fliesst (grosser Pfeil, 8). Der Trennraum 14 umfasst dabei den Raum für das Trennmedium 8 und zwei seitliche, elektrodennahen Bereiche 19 für die mit dem Kissenmedium 20 gebildeten Führungs-bzw. Fokussierkissen. Die Elektro- den 9,10 sind vorzugsweise als Elektrodenräume ausgebildet, von einem durch eine elektrische Zuleitung 23, 23' kontaktierten Elektrodenpuffer 24 durchflossen und weisen gegenüber dem Trennraum 14 eine vorzugsweise semipermeable Membran 25 auf. Der Elektrodenpuffer 24 wird über separate Zuleitungen 26, 26' in die Elektrodenräume eingeleitet (in Fig. 6 nur teilweise gezeigt) und verlässt diese auch über separate Auslässe 27,27'. Zum Umwälzen und gegebe- nenfalls auch zum Kühlen des Elektrodenpuffers wird vorzugsweise eine zusätz- liche Pumpvorrichtung (nicht gezeigt) verwendet.

Figur 6A zeigt eine solche CHIEF-Vorrichtung mit einem linearen pH-Gradienten.

Ein Trennmedium 8 fliesst in laminarer Bewegung (vorzugsweise von unten nach oben in einem schräg gehaltenen Trennraum) zwischen den beiden Elek- troden (grosser Pfeil), wird im Bereich der Auslassöffnungen durch einen Ge- genfluss von Trennmedium (kleiner Pfeil) abgebremst und verlässt den Trenn- raum 14 in Fraktionen über die Auslassöffnungen. Eine Probe mit drei zu tren- nenden Teilchengruppen wird über den Probeneinlass dem Trennmedium zuge- geben und durch den laminaren Fluss des Trennmediums mitbewegt. Die drei Teilchengruppen werden im pH-Gradienten, welcher durch das zwischen den Elektroden im Trennmedium erzeugte elektrische Feld erzeugt wird, kontinuier- lich aufgetrennt, fokussiert und in getrennten Fraktionen gesammelt. Wie aus

Fig. 6D ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des Trennmediums 8 zwi- schen den beiden vorzugsweise vorgesehenen Fokussierkissen 12,13-mit ho- her Leitfähigkeit in den elektrodennahen Bereichen 19-relativ gering und ho- mogen. Der pH-Gradient wird im Trennmedium 8 zwischen den beiden Fokus- sierkissen aufgebaut.

Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen FFE-Zonenelektrophorese (PZE) beruht auf dem Unterschied im Wert der elektrophoretischen Mobilität der zu trennenden Teilchen gegenüber dem verwendeten Trennmedium. Die FFE-Zo- nenelektrophorese ermöglicht somit die Isolierung von Analyten bzw. Teilchen auf Grund ihrer unterschiedlichen Grösse und/oder Form und/oder Netto-Ober- flächenladung.

Auf Grund der Wechselwirkung von Teilchen mit einem einzigen Bindungsmole- kül mit hoher Ladungsdichte ist eine wesentliche Veränderung des Wertes der elektrophoretischen Mobilität und damit eine schnelle und vollständige Trennung des Komplexes aus Teilchen und Bindungsmolekül 3 von den übrigen Spezies der Probe zu erwarten. Das Verfahren der kontinuierlichen FFE-PZE ist beson- ders geeignet im Fall der Trennung von"empfindlichen"Biopartikeln und Kom- plexen, bei deren Trennung besondere Anforderungen an das Trennmedium ge- stellt werden müssen. Dies insbesondere dann, wenn die biologische Funktion und Integrität dieser Teilchen auch nach der Trennung gewährleistet sein sollen.

Als besondere Anforderungen gelten in diesen Fällen : Eng begrenzter pH- Bereich der Trennmedien, gute Pufferkapazität der Trennmedien, physiologische Verträglichkeit der verwendeten Puffersubstanzen, Mindestgehalte von diversen "essentiellen"Kationen und Anionen etc.. Obwohl die üblichen Zellkulturmedien als wenig kompatibel mit allen Techniken der Elektrophorese gelten, ist die er- folgreiche Trennung von Zellen mit FFE-PZE möglich.

Figur 6B zeigt eine solche PZE-Vorrichtung, in welcher die Proben an Hand ihrer Ladung und zu einem geringeren Mass an Hand ihrer Form und Grösse aufge- trennt werden. Wie aus Fig. 6E ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des

Trennmediums 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13-mit hoher Leitfä- higkeit in den elektrodennahen Bereichen 19-relativ gering und homogen. Der pH-Wert ist im ganzen Trennmedium gleich.

Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen Isotachophorese (CITP) beruht ebenfalls auf dem Unterschied im Wert der elektrophoretischen Mobilität der zu trennenden Teilchen. Im Unterschied zur FFE-PZE erfolgt die Trennung in inho- mogenen Trennmedien und bietet wegen eines inhärenten"Fokussierungsef- fektes"eine bessere Auflösung : Wenn während der CITP aus einer aufgetrenn- ten Bande von Teilchen (z. B. Proteinen) einzelne Teichen wegdiffundieren, so gelangen diese Teilchen in ein Medium mit unterschiedlicher elektrischer Feld- stärke, wodurch die Teilchen beschleunigt oder verlangsamt werden. Der inhä- rente Fokussiereffekt bedingt, dass die langsamer oder schneller wandernden Teilchen wieder in der Hauptfraktion einfinden.

Diese FFE-Trenntechnik ist prinzipiell für Biopartikei und Zellen geeignet, deren Trennung in Medien ohne spezielle"essentielle Kationen" (z. B. Mg++ oder Ca++) bzw."essentielle Anionen" (z. B. Cl-), die für die Stabilität und Vitalität von Zel- len wichtig sind, nicht möglich ist.

Figur 6C zeigt eine solche CITP-Vorrichtung, in welcher sogenannte"diskrete Spacer"verwendet werden. Solche diskrete Spacer sind Ionen mit wohlbe- kannter, definierter Mobilität, welche sich in der CITP zwischen zu trennende Teilchen drängen und dazu beitragen, dass die Trennung effizient abläuft. Als solche diskrete Spacer lassen sich auch exakt definierte Ampholyte einsetzen.

Wie aus Fig. 6F ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des Trennmediums 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13-mit hoher Leitfähigkeit in den elektrodennahen Bereichen 19-zumindest teilweise gradientenartig ausgebildet und inhomogen. Zusätzlich wird ein zumindest teilweiser pH-Gradient im Trennmedium 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12, 13 aufgebaut, wobei sich die Bereiche der beiden Gradienten im Wesentlichen decken und sowohl die

pH-Werte als auch die elektrische Leitfähigkeit im Bereich der Fokussierkissen 12,13 jeweils unterschiedlich hoch sind.

Diverse Kombinationen dieser Trenntechniken (CHIEF und FFE-PZE bzw. CHIEF und CITP) sind möglich. So können z. B. verschiedene Trennmedien gleichzeitig im Trennraum der FFE-Apparatur verwendet und damit auch gleichzeitig unter- schiedliche Trennparameter genutzt werden.

Die erfindungsgemäss vorgeschlagene Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäss vorgeschlagene Verfahren erlauben die Durchführung von kontinuierlichen Be- triebsarten, bei denen die Trennung der Teilchen 7,7,', 7" bei kontinuierlichem Trennmediumfluss, permanenter Anwendung des elektrischen Feldes während der gesamten Trennung und kontinuierlichem Sammeln durchgeführt wird. Da- bei wird zwischen kontinuierlich präparativen (Probe wird kontinuierlich bei gleichbleibenden Trennbedingungen zugegeben) und semipräparativ/analyti- schen (diskontinuierliche Probenzugabe bei gleichbleibenden Trennbedingun- gen) unterschieden.

Bei einer ebenfalls möglichen, diskontinuierlichen Betriebsart strömt das Trenn- medium 8 kontinuierlich : Die Probenaufgabe erfolgt bei abgeschalteter Hoch- spannung ; nach dem Stoppen der Probenaufgabe wird der Mediumtransport abgeschaltet bzw. stark gedrosselt bzw. reduziert. Darauf wird die Hochspan- nung eingeschaltet, bis die Probenauftrennung erfolgt ist. Nach einer vorgege- benen Zeit wird die Spannung ausgeschaltet und die aufgetrennte Probe mit erhöhtem Mediumdurchfluss aus der Trennkammer eluiert und gesammelt.

Es kann zudem vorgesehen sein, dass mittels einer weiteren Dosierpumpe bzw. separaten Förderkanälen der Mediumpumpe-vorzugsweise am den Medienzu- führungen 15, 15' entgegengesetzten Ende der FFE-Vorrichtung-ein Hilfsmedi- um 21 über Hilfsmediumzuführungen 22 in die Trennkammer 14 geleitet und gemeinsam mit dem Trennmedium 8 über die Fraktionierstellen 18 abgeführt (vgl. Figuren 6A bis 6C) wird.

Figur 7 zeigt den Effekt der Fokussierkissen 12,13, wobei die Grenze des Fokus- sierkissens mit dem elektrisch hoch-leitenden Kissenmedium 20, welches im Wesentlichen parallel zu der Elektrode 9,10 verläuft, gestrichelt angedeutet ist.

Wird kein Fokussierkissen erzeugt (Fig. 7A), so stellt sich in etwa eine Normal- verteilung (schraffiert) der an Hand der selektiv veränderten Netto-Oberflächen- ladung von einem Rest einer Probe abgetrennten Teilchen ein. Es kann auch vorkommen, dass sich Teilchen an der Elektrode 9,10 festsetzen (nicht gezeigt), so dass zum Teil wesentliche Verluste an diesen, z. B. auf Grund ihrer besonde- ren biologischen Relevanz abgetrennten Teilchen, eintreten. Dies kann mit ei- nem Fokussierkissen 12,13 aus einem elektrisch hoch-leitenden Kissenmedium 20 erfolgreich verhindert werden (vgl. Fig. 7B) : Dank der hohen elektrischen Leitfähigkeit verhält sich das Fokussierkissen wie eine Elektrode 9,10, wobei- dank der hohen elektrischen Leitfähigkeit des Kissenmediums 20-verhindert wird, dass Teilchen bis zur tatsächlichen Elektrode 9,10 gelangen können. Wie in Fig. 7B gezeigt, bildet sich an der Kissengrenze eine Konzentration der iso- lierten Teilchen (schraffiert) aus, welche das Mass einer Normalverteilung (ge- strichelt dargestellt) bei Weitem übertrifft. Über eine Fraktionierstelle 18, die gerade in diesem Bereich positioniert ist, kann somit eine wesentlich grössere Menge dieser Teilchen in höherer Konzentration der FFE-Vorrichtung entnom- men und der Weiterverwendung zugeführt werden. Insbesondere für die Iso- lierung von Zellen, Organellen, Membranteilen oder Komplexen von Biomolekü- len, welche an Hand ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung mittels der FFE vom Rest einer Probe abgetrennt werden sollen, stellt die Verwendung eines solchen Fokussierkissens 12,13 eine wesentliche Verbesserung dar. Hin- gegen erscheint die Verwendung eines Fokussierkissens bei der Feintrennung von identische Untereinheiten aufweisenden Biomolekülen bzw. derer Komplexe als weniger vorteilhaft. Die Führungs-oder Fokussierkissen 12,13 werden somit durch einen Puffer 20 gebildet, der im Vergleich zum Trennmedium 8 eine stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweist. Da die elektrophoretische Trennlei- stung abhängig von der Feldstärke ist, und sich umgekehrt proportional zur Leitfähigkeit verhält, nimmt die elektrophoretische Trennleistung in den Fokus- sierkissen 12,13 so stark ab, dass die ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" an der

Grenzfläche zwischen dem Trennmedium 8 und den Fokussierkissen 12,13 fo- kussiert werden.

Im Folgenden werden drei Ausführungsbeispiele für Immun-FFE vorgestellt : Beispiel A : Reinigung von zirkulierenden Tumorzellen aus Vollblut Eine Zusammenfassung der Wertigkeit von disseminierten Tumorzellen findet sich in : Bockmann B, Grill HJ, Giesing M. Molecular characterization of minimal residual cancer cells in patients with solid tumors. Biomol. Eng 2001 ; 17 : 95- 111.

Als Zelloberflächenmarker wird das für Epitheizellen spezifische Membranprotein "Epitheliales Glycoprotein" (EGP) verwendet. Dieses EPG wird auch von Tumor- zellen epithelialer Tumoren exprimiert (Moldenhauer G, Momburg F, Möller P, Schwartz R, Hämmerling GJ. Epithelium-specific surface glycoprotein of Mr 34,000 is widely distributed carcinoma marker. BrJ Cancer 1987 ; 56 : 714-21).

Gegen ein Epitop des EGP gibt es einen in der Literatur gut beschriebenen monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung Ber-EP4 (Latza U, Niedobitek G, Schwarting R, Nekarda H, Stein H. Ber-EP4 : new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia. J Clin Patho/1990 ; 43 : 213-9).

Dieser monoklonale Antikörper wird auf 2 Arten für die Immun-FFE modifiziert : A) Ein Ladungsträger 4,5 wird direkt und kovalent an den Antikörper (das Bin- dungsmolekül 3) gekoppelt.

B) An das Antiserum wird kovalent Streptavidin gekoppelt. An das Streptavidin werden dann, frei wählbar, biotinylierte Ladungsträger 4,5 gebunden.

Zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen wird Citrat-oder Heparin-Vollblut von Patient (inn) en mit z. B. Mamma-, Ovarial-oder Colonkarzinom entweder direkt eingesetzt oder wie folgt vorbereitet : 1. Isolierung der weissen Blutkörperchen (Mononuclear Cells, MNC) über einen Dichtegradienten, mittels an sich bekannter Methoden.

2. Zugabe der entsprechend, mit Ladungsträgern 4,5 modifizierten Antikörper.

3. Inkubation mittels an sich bekannter Methoden.

4. Auftrennung der Zellen in der Immun-FFE : In einem ersten Versuch wurden Trennbedingungen und Trennmedium ge- wählt, wie sie aus Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995)"So- dium chloride in the separation medium enhances cell compatibility of Free Flow Electrophoresis", Electrophoresis 16 : 92-97 bekannt sind. Auf diese Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen.

In einem weiteren Versuch wurde ein Trennmedium verwendet, wie es in der internationalen Anmeldung PCT/EP01/10036 beschrieben ist. Auf diese Anmeldung wird hier ausdrücklich Bezug genommen.

Beispiel B : Isolierung von Peroxysomen Peroxysomen sind Zellorganellen, die oxidative Reaktionen mit molekularem Sauerstoff durchführen. Sie generieren Sauerstoffperoxid für oxidative Zwecke.

Hoch-angereicherte Peroxysomen könne z. B. aus Rattenleber über eine auf- wendige Dichtegradienten-Zentrifugation nach der Methode von Lüers et al.

Isoliert werden (Lüers GH, Hartig R, Mohr H, Hausmann M, Fahimi HD, Cremer C, Völkl A. Immuno-isolation of highly purified peroxisomes using magnetic beads and continuous immunomagnetic sorting. Electrophoresis 1998 ; 19 : 1205- 210) : 1. Homogenisierung der Rattenleber mit an sich bekannten Methoden.

2. Zentrifugation des Homogenisats bei 1,900 x g zur Entfernung von Zellker- nen, Zelldebris, Mitochondrien und noch intakten Zellen.

3. Zentrifugation des Überstandes bei 25,000 x g.

4. Das resultierende Pellet enthält dann die sogenannte"light microsomal frac- tion" (inkl. Peroxysomen, Mikrosomen und einige Mitochondrien mit Lyso- somen) und stellt somit eine Mischung dar, welche auch die Peroxysomen umfasst.

Zur Anreicherung von Peroxysomen mit einer modifizierten Immun-FFE gibt es bereits eine Methode (Voelkl A, Mohr H, Weber G, Fahimi HD. Isolation of pero- xisome subpopulations from rat liver by means of immune free-flow electro- phoresis. Electrophoresis 1998 ; 19 : 1140-1144). Diese bekannte Methode zur Anreicherung von Peroxysomen mit Immun-FFE wird jedoch durch das Einfüh- ren von Ladungsträgern 4,5 wie folgt modifiziert : 1. Homogenisierung der Rattenleber wie bekannt.

2. Zentrifugation bei 400 x g zur Entfernung von Zellkernen, Zelldebris, und noch intakten Zellen.

3. Der Überstand wird mit einem mit Ladungsträgern 4,5 modifizierten Anti- körper gegen ein Membranprotein der Peroxysomen (z. B. PMP70 ; 70 kDa grosses cytoplasmatisches Membranprotein von Peroxysomen, Antikörper gegen das C-terminale, elf Aminosäuren lange, cytoplasmatische Ende) in- kubiert.

4. Die Auftrennung mit Immun-FFE erfolgte, wie durch A. Völkl, H. Mohr, G.

Weber und H. D. Fahimi beschrieben (Electrophoresis 1998, 19,1140-1144), bei einer Trennmedium-Temperatur von 4°C und bei einem pH von 8.0 in einem elektrischen Feld von 1'000 V und 100 mA sowie einer Trennmedium- Flussgeschwindigkeit von ca. 5 ml/Fraktion pro Stunde. Die Proben wurden mit etwa 2 ml/Stunde in die Trennkammer eingeführt und die aufgetrennten Fraktionen wurden mit Hilfe einer 96-Kanal-Peristaltikpumpe gesammelt.

Jeder einzelne Trennversuch dauerte etwa 60 bis 90 Minuten.

Beispiel C : Isolierung von rekombinanten Proteinen

Zur Expression rekombinanter Proteine gibt es Vektoren, die am 5'oder 3'Ende eines Konstruktes eine Kassette von 5-10 Histidinen an das zu exprimierende Protein anhängen können (His-Tags, vgl. Fig. 5). Diese zusätzlichen Histidine werden zur späteren Reinigung der exprimierten Proteine verwendet. Andere Vektoren enthalten z. B. Glutathion-S-Transferase als zusätzliches Element. Die- se Vektoren eignen sich zur Expression rekombinanter Proteine z. B. in E. coli, Baculovirus-infizierten Bakterien und Säugerzellen. Entsprechende Methoden zur Herstellung rekombinanter Proteine sind dem Fachmann bekannt.

Die derzeitigen Möglichkeiten zur Aufreinigung von rekombinant exprimierten Proteinen beruhen hauptsächlich auf affinitätschromatographischen Methoden.

Diese Methoden sind relativ leicht anwendbar und-je nach Menge der zu reini- genden Proteine-skalierbar. Die affinitätschromatographische Reinigung re- kombinanter Proteine hat jedoch mehrere signifikante Nachteile : 1. Ausbluten der Affinitätsmatrix 2. Verstopfen der Säulen bedingt durch die Probenmatrix (Zell-Lysate) 3. Unspezifische Bindung von Proteinen 4. Enzymatische Lyse von Proteinen (Proteolyse) Die Reinigung von rekombinanten Proteinen mit poly-His-Tags mittels immobili- sierten Ni-NTA (Nickel Nitrilotriacetic Acid) Chelate ist dem Fachmann bekannt.

Die feste Phase kann für präparative Reinigungen in Chromatographiesäulen gepackt sein (z. B. Ni-NTA-Agarose), für analytische Anwendungen stehen (z. B.

Ni-NTA) Magnetpartikel zur Verfügung.

Besonders geeignet für die Reinigung rekombinanter Proteine ist die in Fig. 5 dargestellte, erfindungsgemässe Immun-FFE, die folgende Schritte umfasst : 1. Lyse der Zellen (z. B. Hefen, Bakterien, Säugerzellen) nach an sich bekann- ter Methode.

2. Bindung von Ladungsträgern 4,5 an die His-tagged Proteine :

Variante 1 : Bindung der Ladungsträger 4,5 an ein Bindungsmolekül 3 in Form von Ni-NTA und Bindung dieses geladenen Bindungsmo- leküls 6 an die His-Tags ; oder Variante 2 : Bindung der Ladungsträger 4,5 an ein Bindungsmolekül 3 in Form eines anti-poly-His Antikörpers und Bindung dieses gela- denen Bindungsmoleküls 6 an die His-Tags.

3. Inkubation nach an sich bekannter Methode.

4. Separation mittels FFE (qualitativ aber auch quantitativ möglich) : In einem ersten Versuch wurden Trennbedingungen und Trennmedium ge- wähit, wie sie aus Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995)"So- dium chloride in the separation medium enhances cell compatibility of Free Flow Electrophoresis", Electrophoresis 16 : 92-97 bekannt sind. Auf diese Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen.

In einem weiteren Versuch wurde ein Trennmedium verwendet, wie es in der internationalen Anmeldung PCT/EP01/10036 beschrieben ist. Auf diese Anmeldung wird hier ausdrücklich Bezug genommen.

5. Sammeln der isolierten His-tagged Proteine Die His-tagged Proteine können entweder nun direkt verwendet werden oder die His-Tags werden vor der weiteren Verwendung enzymatisch abge- spalten.

Zum Abtrennen der His-Tags von den Proteinen gibt es mehrere Möglichkeiten : Für Variante 1 : a) Ablösen des Chelats durch an sich bekannte Inkubation mit Imidazol und ggf. erneute Reinigung des Proteins auf FFE ; b) An sich bekannte enzymatische Abspaltung des His-Tags mit Thrombin oder Exoprotease und ggf. erneute Reinigung des isolierten Proteins auf FFE.

Für Variante 2 : c) Ablösen der Antikörper mit an sich bekannten Methoden, z. B. durch Verän- dern der Salzkonzentration oder des pH.

d) Enzymatische Abspaltung der His-Tags mit an sich bekannten Methoden. e) Erneute Reinigung mit FFE.

Der Charge Label bzw. die Ladungsträger oder das den Ladungsträger tragende Agens (z. B. Biomolekül) kann auch zusätzlich (z. B. mit einem Farbstoff) mar- kiert sein. Dadurch wird eine Detektion während oder nach der FFE möglich.

Ladungsträger könnten auch alle Arten von Partikeln sein (z. B. Beads aller Art, wie Latex, Agarosepartikel, Kolloide, etc. ). Ladungsträger können auch prak- tisch beliebige Kombinationen von Beads und/oder Antikörpern und/oder la- dungstragenden Molekülen und/oder Fluoreszenzmarkern und/oder Farbstoffen sein. Beads können z. B. mit Fluoreszenz-oder anderen Farbstoffen gefärbt sein.

Beads können gleichzeitig eine Fluoreszenzmarkierung (innen oder aussen), den Charge Label und das Bindungsmolekül (z. B. Antikörper oder Ni-NTA) tragen.

Falls Beads verwendet werden, welche eine enzymatisch spaltbare Brücke besit- zen, dann können nach erfolgter Reinigung (z. B. Reinigung von rekombinanten Proteinen mit Ni-NTA) die Beads vom gereinigten Molekül abgespalten werden.

Besonders bevorzugt werden Beads, welche fluoreszierend sind und an der Oberfläche mit Ladungsträgern und Bindungsmolekülen versehen sind.

Mögliche Maßnahmen zur Erhaltung der biologischen Aktivität bzw. Vitalität von Biopartikeln bei den verschiedenen FFE-Trenntechniken ergeben sich aus der folgenden Tabelle 1 : Massnahme PZE CITP CHIEF Anwendung von Medien innerhalb des physiologischen +++ ++ pH-Bereiches Anwendung von nicht ionischen Expandern +++ +++ +++ Anwendung von ionischen Expandern +++ ++ Anwendung von"essentiellen Kationen"+++ ++ Anwendung von"essentiellen Anionen"+++ Trennung im idealen Temperaturbereich +++ +++ +++ schnelle"Stabilisierung"der Biopartikel nach der FFE-+++ +++ +++ Trennung

Erklärungen : PZE : kontinuierliche Free Flow Zonenelektrophorese CITP : kontinuierliche Free Flow Isotachophorese CHIEF : kontinuierliche isoelektrische Fokussierung +++ = uneingeschränkte Anwendung ++ = nur geringfügig eingeschränkte Anwendung + = nur in Sonderfällen anwendbar = Anwendung nicht möglich Die erfindungsgemässe Auftrennung von Teilchen ermöglicht ein konzentriertes Sammeln bzw. eine Anreicherung von biologisch relevanten Teilchen, deren Analyse bzw. deren Verwendung in diagnostischen oder therapeutischen Ver- fahren wegen des zu hohen Hintergrundes an gleichzeitig anwesenden, ver- wandten, aber irrelevanten Teilchen bisher nicht zugänglich war. Die vorge- stellte FFE-Methoden und Vorrichtungen ermöglichen somit Isolation und dem- zufolge die Nutzung von naturgemäss in äusserst geringen Konzentrationen vorliegenden Teilchen bzw. die Bereitstellung derer biologisch relevanten Infor- mationen zur Verwendung in diagnostischen oder therapeutischen Verfahren.

Zudem können die isolierten Teilchen zum Auffinden und Charakterisieren von Targets für die Entwicklung von Medikamenten, von Targets für die Anwendung in der Diagnostik, der Therapie-Auswahl und dem Therapiemonitoring sowohl für Menschen, als auch für Tiere und Pflanzen dienen.

Anwendungen der erzielten Ergebnisse umfassen z. B. aus Vollblut isolierte Tu- morzellen zur Target-Identifikation in der Entwicklung von Medikamenten gegen migrierende Tumorzellen.

Für die gleichen Merkmale gelten in allen Figuren die identischen Bezugszei- chen, auch wenn diese nicht ausdrücklich zitiert sind. Die offenbarten, erfindungsgemässen Verfahren eignen sich-gegebenenfalls nach entsprechender Anpassung-auch für die Anwendung in verschiedensten Gebieten der Chromatographie, wie beispielsweise in der Affinitätschromatogra- phie von organischen oder anorganischen Molekülen und Polymeren.