Titel

Verfahren und Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen

Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum

Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen und eine Vorrichtung zum

Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Gebiet mikrofluidischer Systeme,

beispielsweise für sogenannte Chiplabors bzw. Westentaschenlabors (Lab-On-A-

Chip).

In der molekularen Diagnostik besteht oftmals eine Notwendigkeit zum Nachweis von pathogener DNA oder RNA in einer Probe. Als pathogene DNA oder RNA wird die aus einem Pathogen, z. B. einem Virus oder einem Mikroorganismus, z. B. einem Bakterium oder Pilz, gewonnene DNA oder RNA bezeichnet. Unter der Probe wird insbesondere eine Blutprobe verstanden, jedoch können prinzipiell auch andere flüssige oder verflüssigte Patientenproben, z. B. Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ein ausgespülter Abstrich oder eine verflüssigte Gewebeprobe, gemeint sein, insbesondere wenn diese Blut oder Spuren von

Blut enthalten. Ein Krankheitsbild, bei dem dies relevant ist, ist z. B. eine Sepsis. Bei einer vermuteten Sepsis besteht beispielsweise Interesse, Pathogene aus Blut nachzuweisen sowie gegebenenfalls Resistenzen gegenüber bestimmten Antibiotika zu bestimmen. Aufgrund der Konzentrationsverhältnisse zwischen Pathogenen und Leukozyten, beispielsweise 10 bis 1000 pro Milliliter gegenüber

10 ⁶ bis 10 ⁷ pro Milliliter, befindet sich in diesem Fall ein sehr starker Hintergrund an humaner DNA in der Probe. Kommerziell verfügbare Verfahren zur selektiven Aufreinigung von pathogener DNA z.B. aus Blut setzen beispielsweise chemische Reagenzien ein, um zunächst eine selektive Lyse von humanen Zellen zu erreichen. Anschließend werden die humanen Nukleinsäuren enzymatisch verdaut. Pathogene werden im Anschluss beispielsweise durch Zentrifugation und Dekantieren des Überstands isoliert. Ein derartiges Verfahren wird beispielsweise in der DE102005009479A1 offenbart.

Die US 2010/0285578 A1 offenbart Vorrichtungen und Verfahren zum Gewinnen von Nukleinsäuren aus biologischen Proben.

Offenbarung der Erfindung

Vor diesem Hintergrund werden ein verbessertes Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen und eine verbesserte Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.

Gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Aufbereitung einer biologischen Probe insbesondere zur selektiven Gewinnung pathogener Nukleinsäuren aus einer Probe realisiert werden, die auch nicht-pathogene Nukleinsäuren enthält, beispielsweise aus Blutzellen. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel hierbei ein Konzept zur thermischen Vorbehandlung einer Probe und/oder ein Konzept zur Aufbereitung einer Probe mittels einer Membran, Mikrokanalstruktur oder dergleichen. So ist insbesondere eine Kombination einer thermischen Vorbehandlung, bei der Begleitzellen selektiv lysiert werden, mit einem enzymatischen Verdau sowie einer Abtrennung mittels Filtration vorgesehen mit dem Ziel, aus einer auch Begleitzellen enthaltenden Probe aufgereinigte Zielzellen-Nukleinsäuren zu erhalten. Hierbei ist beispielsweise eine Abtrennung von Leukozyten, z. B. mit humaner DNA, aus einer Blutprobe denkbar, die auf das Vorhandensein von Pathogenen untersucht werden soll. Insbesondere sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft in Systemen oder Laborroutinen, die in der molekularen Diagnostik verwendet werden, bzw. für mikrofluidische Lab-on-Chip-Systeme zur molekularen

Diagnostik einsetzbar.

Vorteilhafterweise ermöglichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in einer Probe enthaltene Zielzellen-Nukleinsäuren, z. B. pathogene DNA, von einem Hintergrund an Begleitzellen-Nukleinsäuren, z. B. humaner DNA, zuverlässig abzutrennen. Dadurch wird vermieden, dass die Begleitzellen- Nukleinsäuren nachfolgende Amplifikations- und Detektionsschritte stört, und eine Sensitivität einer Detektion bzw. Diagnostik wird somit verbessert. Bei einer thermischen Vorbehandlung einer Probe kann durch insbesondere

enzymatischen Verdau zuverlässig vermieden werden, dass die Probe geliert, was beispielsweise eintreten würde, wenn eine Temperatur zu hoch ist und/oder eine Zeitdauer der Vorbehandlung zu lang ist. Hierbei kann das Gelieren der

Probe auch im Hinblick darauf vermieden werden, dass eine bezüglich des Gelierens kritische Temperatur und Zeitdauer auch von Eigenschaften der Probe wie z. B. dem Hämatokrit abhängt. Durch einen beispielsweise enzymatischen Verdau kann vermieden werden, dass die Probe einen Filter verstopft. Dadurch ist es möglich, auch große Probenmengen zu verarbeiten. Eine Filtration ermöglicht es hierbei, nur wenige Pathogene, z. B. 10 bis 1000, aus einem relativ großen Blutvolumen, z. B. 1 bis 10 Milliliter, zu akkumulieren. Dadurch kann eine effektive Konzentration von Zielzellen-Nukleinsäuren erhöht und eine

nachfolgende Amplikation und Detektion erleichtert werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind besonders gut geeignet zur Automatisierung, insbesondere in einem mikrofluidischen System. Hierbei kann eine Durchführung erleichtert und eine Gefahr von Kontaminationen herabgesetzt werden.

Es kann gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eine

zuverlässige Isolierung und Aufkonzentration von Zielzellen-Nukleinsäuren aus einer Probe erreicht werden. Dadurch kann eine Effizienz nachfolgender Amplifikations- und/oder Detektionsschritte verbessert werden. Eine

erfindungsgemäße Abtrennung der Begleitzellen bietet gegenüber einer chemischen selektiven Lyse der Begleitzellen den Vorteil, dass eine Anzahl benötigter Reagenzien und Arbeitsschritte minimiert werden kann. Dadurch kann auch eine zur Probenaufbereitung benötigte Zeit verkürzt werden. Ferner besteht hinsichtlich der Aufreinigung von Zielzellen-Nukleinsäuren ein Vorteil dahin gehend, dass Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auf einfache Weise in ein mikrofluidisches System, z. B. ein Lab-on-Chip-System (LOC) zur molekularen Diagnostik, integriert werden können. Auch kann eine erreichbare Separationseffizienz von Zielzellen-Nukleinsäuren bezüglich Begleitzellen- Nukleinsäuren erhöht werden und kann eine Anzahl benötigter Filter bzw.

Membranen minimiert werden. Die Filtration kann insbesondere auf

Unterschieden typischer Zellgrößen beruhen und ist daher universell einsetzbar. Es ist daher keine Anpassung an spezifische Zielzellen erforderlich, wie es beispielsweise bei Antikörper-basierten Verfahren der Fall ist.

Ein Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen weist folgende Schritte auf:

Akkumulieren der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe;

Aufschließen der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und

Aufreinigen der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.

Die Zielzellen können pathogene Zellen bzw. Pathogene, z. B. Viren oder Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Pilze, umfassen, die DNA und/oder RNA als Nukleinsäuren aufweisen. Der Einfachheit halber wird im Folgenden häufig von Nukleinsäuren gesprochen, wobei damit DNA und/oder RNA gemeint ist. Die Begleitzellen können menschliche Zellen, beispielsweise Blutzellen oder dergleichen umfassen. Unter der Probe kann insbesondere eine Blutprobe verstanden werden, oder es können auch andere flüssige oder verflüssigte Patientenproben, z. B. Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ausgespülte Abstriche oder verflüssigte Gewebeproben, verstanden werden, insbesondere wenn diese Blut oder Spuren von Blut enthalten. Im Schritt des Aufreinigens können die in dem Zielzellen-Lysat enthaltenen Nukleinsäuren aufgereinigt und einer nachfolgenden Analyse zugeführt werden, durch die ein Vorhandensein bestimmter Pathogene oder Gene, z. B. Resistenzgene, überprüft werden kann. Diese nachfolgende Analyse kann z. B. durch Sequenzierung, Polymerase- Kettenreaktion (PCR, Polymerase chain reaction), Echtzeit-PCR bzw. Real-Time- PCR und/oder Detektion bzw. Hybridisierung auf einem Microarray erfolgen.

Das Aufreinigen der Zielzellen-Nukleinsäuren aus der Probe kann nach dem Aufschließen bzw. Lysieren der Zielzellen durch anschließende Adsorption der Zielzellen-Nukleinsäuren an einer festen Phase, z. B. einem Silikafilter oder Mikropartikeln bzw. sogenannten Beads, erfolgen. Neben chemischen und enzymatischen Methoden zur Lyse gibt es dabei auch mechanische Methoden, z. B. mittels Ultraschall oder Mikrokügelchen bzw. Beads. Ziel des Aufreinigens ist es, die Zielzellen-Nukleinsäuren in aufkonzentrierter Form einer

darauffolgenden Amplifikation und/oder Detektion zur Verfügung zu stellen. Auch bei einem Abtrennen der Zielzellen-Nukleinsäuren von Zelltrümmern und

Proteinen können Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft zum Einsatz kommen. Insbesondere Humanblutproben können jedoch zusätzlich große Mengen an Begleitzellen mit humaner DNA enthalten. Eine Möglichkeit zur Abtrennung der Zielzellen von den Begleitzellen kann darin bestehen, zunächst die Begleitzellen, z. B. Blutzellen, die in der Probe enthalten sind, selektiv aufzuschließen bzw. zu lysieren und von den Zielzellen abzutrennen. Im

Anschluss können die Zielzellen lysiert werden und können die Zielzellen- Nukleinsäuren aufgereinigt werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ermöglichen es, die Zielzellen-Nukleinsäuren vom in der Probe vorhandenen Hintergrund an Begleitzellen-Nukleinsäuren abzutrennen. Diese

Begleitzellen-Nukleinsäuren würden ansonsten eine nachfolgende Amplifikation und Analyse der Zielzellen-Nukleinsäuren stören und es unter Umständen schwierig bis unmöglich machen, das Vorhandensein der Zielzellen zu detektieren. Somit kann verhindert werden, dass die Begleitzellen-Nukleinsäuren in einer nachfolgenden Amplifikation und Analyse zur Bildung von

unerwünschten Nebenprodukten und einer Herabsetzung der Sensitivität führen.

Bei einem entsprechenden Verfahren kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum

Aufschließen und Vorschädigen der Begleitzellen und einen Teilschritt des

Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels Filtration aufweisen. Gemäß einer Ausführungsform kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum

Aufschließen und Vorschädigen der Begleitzellen, einen Teilschritt des Lysierens der im Teilschritt des Temperierens vorgeschädigten Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und des Verdaus von aus den Begleitzellen freigesetzten Nukleinsäuren durch Enzyme und einen Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels Filtration aufweisen. Dabei kann die

Lysetemperatur geeignet ausgewählt sein, dass die in der Probe enthaltenen Begleitzellen zerstört oder vorgeschädigt werden, wobei die in der Probe enthaltenen Zielzellen intakt bleiben. Im Teilschritt des Abtrennens können die Zielzellen mittels eines Akkumulationsfilters zurückgehalten werden. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effektive und zuverlässige Akkumulation der Zielzellen erreicht werden kann. Dabei kann die thermische Behandlung aufgrund unterschiedlicher Zellwandbeschaffenheit gezielt eingesetzt werden. Aufgrund des Lysierens kann ein Verstopfen bei der Filtration verhindert werden.

Dabei kann der Teilschritt des chemischen oder enzymatischen Lysierens und des enzymatischen Verdaus vor, während oder nach dem Teilschritt des

Temperierens ausgeführt werden. Hierdurch kann im Teilschritt des Lysierens eine Viskosität der Probe gesenkt werden. Dabei können im Teilschritt des Lysierens und des Verdaus insbesondere temperaturbeständige Enzyme verwendet werden, z.B. Nukleasen, Proteinasen oder Lysozym. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass dadurch bereits während der thermischen Vorbehandlung ein Gelieren der Probe zuverlässig vermieden werden kann.

Alternativ können im Schritt des Akkumulierens mittels zumindest einmaliger Filtration die Begleitzellen von der Probe abgetrennt werden. Dabei können die

Begleitzellen mittels einer Abtrenneinrichtung zurückgehalten werden, die einen Filter, eine Membran, Mikrostrukturen oder dergleichen aufweisen kann. Die Abtrennung erfolgt hier aufgrund der unterschiedlichen Größe von Ziel- und Begleitzellen, d.h. die Begleitzellen werden zurückgehalten, sofern sie größer als die Zielzellen sind. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die

Begleitzellen frühzeitig im Verfahren aus der Probe entfernt werden können. Dabei kann im Schritt des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der

Begleitzellen über mehrere in Reihe geschaltete Abtrenneinrichtungen gespült werden. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass durch die mehrfache Filtration eine Abtrennungseffizienz noch vergrößert werden kann.

Dadurch kann die Zahl der Begleitzellen, die sich im Filtrat befinden, und somit die Menge der unerwünschten Nukleinsäuren weiter verringert werden.

Auch kann im Schritt des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der Zielzellen mehrmals über eine Abtrenneinrichtung gespült werden. Die Zielzellen werden hierbei aufgrund ihrer Größe auf dem Filter zurückgehalten. Insbesondere können die Zielzellen hierdurch von im Teilschritt des Lysierens lysierten oder vorgeschädigten Begleitzellen abgetrennt werden. Hierbei kann die

Abtrenneinrichtung zwischen Spülvorgängen von den Begleitzellen gereinigt werden. Das Reinigen kann erfolgen, indem Wasser oder ein Puffer in bezüglich einer Filtrationsrichtung umgekehrter Richtung über die Abtrenneinrichtung gespült wird. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass ein Aufbau vereinfacht wird und nur eine Abtrenneinrichtung benötigt wird. Durch das Reinigen bzw. Waschen der Abtrenneinrichtung, wobei die Begleitzellen von der Abtrenneinrichtung entfernt werden können, kann ein Flusswiderstand an der

Abtrenneinrichtung herabgesetzt werden, sodass eine nachfolgende Filtration einfacher und schneller, d. h. bei niedrigeren Drücken und höheren Flussraten, durchgeführt werden kann. Ferner kann dadurch auch verhindert werden, dass sich Begleitzellen von der Abtrenneinrichtung lösen und ins Filtrat gelangen. Somit wird die erreichbare Abtrennungseffizienz erhöht.

Gemäß einer Ausführungsform kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Verdünnens der Probe aufweisen. Hierbei kann die Probe mit Wasser oder einem wässrigen Puffer verdünnt werden. Eine solche

Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine Viskosität der Probe herabgesetzt wird, womit eine Verarbeitbarkeit der Probe verbessert wird. Weist der Schritt des Akkumulierens den Teilschritt des Temperierens der Probe auf, so kann der Teilschritt des Verdünnens vor oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt werden. Auf diese Weise kann einerseits ein Gelieren während der thermischen Behandlung noch zuverlässiger vermieden werden oder können andererseits durch osmotischen Schock auch Begleitzellen, die während der thermischen Behandlung vorgeschädigt wurden, effektiv weiter lysiert werden.

Insbesondere können im Schritt des Aufschließens der Zielzellen die Zielzellen mittels eines Lysepuffers und zusätzlich oder alternativ mittels

Ultraschalleinkopplung aufgeschlossen werden. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass weniger Reagenzien benötigt werden, z.B. kann ein zusätzlicher Lysepuffer für das Aufschließen der Zielzellen eingespart werden. Durch Ultraschall hervorgerufene Druckwellen und Kavitation führen dazu, dass Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden.

Eine Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen weist folgende Merkmale auf: eine Einrichtung zum Akkumulieren der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe; eine Einrichtung zum Aufschließen der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und eine Einrichtung zum Aufreinigen der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.

Die vorstehend genannte Vorrichtung zum Aufbereiten kann in Verbindung mit einer Ausführungsform des Verfahrens zum Aufbereiten vorteilhaft eingesetzt bzw. verwendet werden, um eine Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials aufzubereiten, um Nukleinsäuren der Zielzellen extrahieren zu können. Die Vorrichtung ist ausgebildet, um die Schritte des Verfahrens zum Aufbereiten in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden. Die Vorrichtung kann als ein mikrofluidisches System ausgeformt sein, insbesondere für ein sogenanntes Chiplabor bzw.

Westentaschenlabor bzw. Lab-On-A-Chip. Bei einer entsprechenden Vorrichtung kann die Einrichtung zum Akkumulieren Temperiermittel zum Temperieren der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen oder Vorschädigen der Begleitzellen aufweisen.

Gemäß einer Ausführungsform kann die Einrichtung zum Akkumulieren

Temperiermittel zum Temperieren der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen oder Vorschädigen der Begleitzellen, eine Vorratskammer für eine Pufferlösung zum Lysieren der im Schritt des Temperierens aufgeschlossenen oder vorgeschädigten Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und einen Akkumulationsfilter zum Abtrennen der Zielzellen von der Probe aufweisen. Hierbei können die Temperiermittel eine Heizeinrichtung oder eine Heizeinrichtung sowie eine Kühleinrichtung aufweisen. Auch können die

Temperiermittel ausgebildet sein, um zu heizen und/oder zu kühlen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effektive und zuverlässige Selektion der Zielzellen erreicht wird. Dabei kann die thermische Behandlung aufgrund unterschiedlicher Zellwandbeschaffenheit gezielt eingesetzt werden. Aufgrund der Lyse kann ein Verstopfen bei der Filtration verhindert werden. Insbesondere kann durch die Temperiermittel die

Selektionstemperatur genau eingestellt werden. Wenn die Temperiermittel auch eine Kühleinrichtung aufweisen, kann die Probe vor der Lyse auf ein zweites definiertes Temperaturniveau, z. B. Raumtemperatur, gebracht werden, sodass eine Dauer der thermischen Vorbehandlung besonders genau eingestellt werden kann und auch eine Gelierung der Probe besonders sicher vermieden werden kann.

Dabei können die Temperiermittel mit einer Probenkammer oder einem zwischen einer Probenkammer und einer Aufschlusskammer angeordneten Probenkanal thermisch gekoppelt sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die thermische Behandlung der Probe anwendungsabhängig auf stationäre

Weise oder in einem Durchflussprinzip erfolgen kann.

Zudem kann der Akkumulationsfilter der Einrichtung zum Akkumulieren auch durch die Einrichtung zum Aufschließen und zusätzlich oder alternativ die Einrichtung zum Aufreinigen nutzbar sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass ein Filter eingespart wird, wenn die Zielzellen auf dem Akkumulationsfilter lysiert werden und der Akkumulationsfilter auch zur DNA- Aufreinigung genutzt wird. Um dies zu realisieren, kann ein zum Aufschließen verwendeter Lysepuffer so eingestellt sein, dass beim Aufschluss freigesetzte Zielzellen-Nukleinsäuren direkt an den Akkumulationsfilter binden. Alternativ kann im Anschluss an den Aufschluss ein Bindepuffer auf den

Akkumulationsfilter gegeben werden, ohne den Lysepuffer vom

Akkumulationsfilter zu verdrängen. Eine Mischung von Lysepuffer und

Bindepuffer im Akkumulationsfilter kann hierbei diffusiv erfolgen. Alternativ kann die Einrichtung zum Akkumulieren zumindest eine

Abtrenneinrichtung zum Abtrennen der Begleitzellen von der Probe aufweisen. Hierbei kann die zumindest eine Abtrenneinrichtung einen Abtrennfilter, eine Filtermembran, einen Filterkanal mit einer Mehrzahl von integrierten Säulen oder Pfosten und zusätzlich oder alternativ einen mit Filterporen versehenen Abschnitt aufweisen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die

Begleitzellen frühzeitig im Verfahren zuverlässig aus der Probe entfernt werden können. Weist die zumindest eine Abtrenneinrichtung siebartige Mikrostrukturen auf, die in Kanälen und Kammern eines mikrofluidischen Systems ausgeformt sind und insbesondere im gleichen Herstellungsschritt wie andere Strukturen des mikrofluischen Systems herstellbar sind, vereinfacht sich so eine Fertigung der

Vorrichtung, da separate Schritte zur Integration einer separaten

Abtrenneinrichtung entfallen. Alternativ kann auch eine Membran mit einer definierten Porengröße mittels eines solchen Verfahrens direkt in einem Boden eines mikrofluidschen Kanals oder einer Kammer abgeformt sein.

Auch können die Abtrenneinrichtung und ein Rücklaufkanal zwischen einer Probenkammer und einer Aufschlusskammer parallel geschaltet sein. Hierbei kann auch eine Wascheinrichtung bzw. Spüleinrichtung zum Reinigen der Abtrenneinrichtung von herausgefilterten Begleitzellen vorgesehen sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die Probe zum Abtrennen der

Begleitzellen mehrmals über eine Abtrenneinrichtung gespült werden kann, wodurch eine Abtrennungseffizienz erhöht werden kann. Die Einrichtung zum Reinigen der Abtrenneinrichtung erleichtert durch Senkung des Flusswiderstands an der Abtrenneinrichtung eine Durchführbarkeit der Abtrennung noch weiter. Ferner kann die Einrichtung zum Akkumulieren mehrere zwischen einer

Probenkammer und einer Aufschlusskammer in Reihe geschaltete

Abtrenneinrichtungen zum Abtrennen der Begleitzellen aufweisen. Dabei können die Abtrenneinrichtungen gleichartig oder verschiedenartig sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass durch die mehrfache Filtration eine Abtrennungseffizienz weiter vergrößert werden kann.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum Aufbereiten gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; und

Figuren 2 bis 15 Vorrichtungen zum Aufbereiten gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung.

In der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren

dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche

Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.

Fig. 1 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 100 zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren 100 zum Aufbereiten ist in

Verbindung mit einer Vorrichtung, wie der Vorrichtung zum Aufbereiten aus einer der Figuren 2 bis 15 vorteilhaft ausführbar. Das Verfahren 100 weist einen Schritt 1 10 des Akkumulierens der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe auf. Auch weist das Verfahren 100 einen Schritt 120 des Aufschließens der Zielzellen durch chemische und zusätzlich oder alternativ durch physikalische Lyse auf, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen. Ferner weist das Verfahren 100 einen Schritt 130 des Aufreinigens der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen- Lysat auf, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren. Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist der Schritt 1 10 des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen der Begleitzellen, einen Teilschritt des Lysierens der Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und des Verdaus der aus den

Begleitzellen freigesetzten Nukleinsäuren durch Enzyme und einen Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels Filtration auf. Dabei wird gemäß einem Ausführungsbeispiel der Teilschritt des Lysierens und des Verdaus vor, während oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt, wobei im Teilschritt des Lysierens und Verdaus eine Viskosität der Probe gesenkt wird.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden im Schritt 1 10 des Akkumulierens mittels zumindest einmaliger Filtration die Begleitzellen von der Probe abgetrennt.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 1 10 des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der Begleitzellen über mehrere in Reihe geschaltete Abtrenneinrichtungen gespült. Alternativ wird gemäß einem Ausführungsbeispiel im Schritt 1 10 des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der Begleitzellen mehrmals über eine Abtrenneinrichtung gespült. Dabei wird die

Abtrenneinrichtung zwischen Spülvorgängen von den Begleitzellen gereinigt.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist der Schritt 1 10 des Akkumulierens einen Teilschritt des Verdünnens der Probe auf.

Im Schritt des Aufschließens 120 werden gemäß einem Ausführungsbeispiel die Zielzellen mittels eines Lysepuffers und zusätzlich oder alternativ mittels

Ultraschalleinkopplung aufgeschlossen.

Fig. 2 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei ist die Vorrichtung 200 als ein mikrofluidisches System oder ein Teil eines mikrofluidischen Systems ausgeführt. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei eine Probenkammer 210, eine Temperiereinrichtung in Gestalt eines Heizers 220, eine Vorratskammer 230 für einen ersten Puffer, ein Filter 240, eine Abfallkammer 250, eine Lysepuffer-Vorratskammer 260 und eine

Sammelkammer 270.

Der Heizer 220 ist benachbart zu der Probenkammer 210 angeordnet. Dabei ist der Heizer 220 mit der Probenkammer 210 thermisch gekoppelt. Die

Vorratskammer 230 ist mit der Probenkammer 210 mittels einer Fluidverbindung verbunden. Der Filter 240 ist zwischen der Probenkammer 210 einerseits und der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 andererseits angeordnet. Hierbei ist die Probenkammer 210 mittels einer Fluidverbindung über den Filter 240 mit der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 verbunden. Die Lysepuffer-Vorratskammer 260 ist mit einer Fluidverbindung zwischen der Probenkammer 210 und dem Filter 240 fluidleitfähig verbunden.

Die Probenkammer 210 weist eine z. B. mittels Stopfen, Deckel oder Klebefolie wieder verschließbare Öffnung zum Einbringen der Probe auf. Bei dem Heizer 220 handelt es sich beispielsweise um einen Peltier-Heizer oder Folienheizer. Die Abfallkammer 250 dient zur Aufnahme von Filtrat. Die Sammelkammer 270 dient zur Aufnahme von Lysat.

Somit zeigt Fig. 2 eine Topologie der Vorrichtung 100 bzw. eines

mikrofluidischen Systems, bei dem eine thermische Behandlung der Probe stationär in der Probenkammer 210 durchgeführt wird. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen.

Fig. 3 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 2 ähnlich. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei die Probenkammer 210, der Heizer 220, die Vorratskammer 230 für den ersten Puffer, der Filter 240, die Abfallkammer 250, die Lysepuffer-Vorratskammer 260, die Sammelkammer 270, ein Mikrokanal 315 und ein Kühler 320.

Zwischen der Probenkammer 210 und der Vorratskammer 230 ist der Mikrokanal 315 angeordnet. Die Probenkammer 210 ist mittels einer Fluidverbindung über den Mikrokanal 315 mit der Vorratskammer 230 verbunden. Der Heizer 220 und der Kühler 320 bilden die Temperiereinrichtung. Dabei sind der Heizer 220 und der Kühler 320 benachbart zu dem Mikrokanal 315 angeordnet. Der Heizer 220 und der Kühler 320 sind mit dem Mikrokanal 315 thermisch gekoppelt. Die Vorratskammer 230 ist hierbei zwischen dem Mikrokanal 315 und dem Filter 240 angeordnet. Der Filter 240 ist zwischen der Vorratskammer 230 einerseits und der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 andererseits angeordnet. Die Lysepuffer-Vorratskammer 260 ist mittels einer Fluidverbindung mit der Vorratskammer 230 verbunden.

Somit zeigt Fig. 3 eine Topologie der Vorrichtung 200 zur Durchführung einer thermischen Behandlung im Durchflussmodus. Dabei wird die Probe aus der Probenkammer 210 durch den temperierbaren Mikrokanal 315 in die

Vorratskammer 230 gepumpt, in der sich der erste Puffer befindet. Der temperierbare Mikrokanal 315 ist durch den Heizer 220 beheizbar und bei Bedarf durch den Kühler 320 kühlbar, z. B. einen Peltier-Kühler. Mittels des Kühlers 320 als zweitem thermisch aktivem Element ist die erwärmte Probe vor einerm Mischen mit dem ersten Puffer auf ein definiertes Temperaturniveau, z. B.

Raumtemperatur, temperierbar. Dies hat den Vorteil, dass eine Dauer der thermischen Vorbehandlung besonders genau eingestellt werden kann und somit eine Gelierung der Probe besonders sicher vermieden werden kann. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen.

Fig. 4 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 3 ähnlich, wobei in Fig. 4 die Vorrichtung 200 in einer Ausführung als Mehrschichtaufbau in einer Schnittansicht dargestellt ist, wobei die Kammern der Vorrichtung 200 in der Darstellung weggelassen sind. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Heizer 220, der Filter 240, der Mikrokanal 315, ein weiterer Mikrokanal 415, eine erste strukturierte Polymerschicht 481 , eine Polymerfolie 482, eine zweite strukturierte Polymerschicht 483 und eine polymere Deckelfolie 484.

Die strukturierten Polymerschichten 481 und 483 sind beispielsweise aus thermoplastischen Polymeren, z. B. PP, PC, PE, PS, COP, COC etc., ausgeformt. Die Polymerfolie 482 ist beispielsweise aus thermoplastischen Polymeren, thermoplastischen Elastomeren, Elastomeren oder dergleichen ausgeformt. Die Deckelfolie 484 weist beispielsweise eine thermoplastische Folie, Klebefolie oder dergleichen auf.

Der weitere Mikrokanal 415 erstreckt sich zwischen dem temperierbaren

Mikrokanal 315 und dem Filter 240. Die erste strukturierte Polymerschicht 481 , die Polymerfolie 482, die zweite strukturierte Polymerschicht 483 und die polymere Deckelfolie 484 repräsentieren den Mehrschichtaufbau der Vorrichtung 200 gemäß dem in Fig. 4 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass sie kostengünstig herstellbar ist und mittels der Polymerfolie 482 auch aktive Elemente wie Ventile realisiert werden können. Weiterhin ist ein Vorteil dieses Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, dass der temperierbare Mikrokanal 315 lediglich durch die dünne Deckelfolie 484 vom Heizer 220 getrennt ist. Dadurch kann eine Temperatur in dem temperierbaren Mikrokanal 315 besonders genau eingestellt werden. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen.

Fig. 5 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 4 ähnlich. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Heizer 220, der Filter 240, der

Mikrokanal 315, die erste strukturierte Polymerschicht 481 , die polymere

Deckelfolie 484, ein weiterer Heizer 520, eine beheizbare Amplifikationskammer 570 und beispielhaft zwei Drehventile 590.

Dabei repräsentieren die erste strukturierte Polymerschicht 481 und die polymere Deckelfolie 484 den Mehrschichtaufbau der Vorrichtung 200 gemäß dem in Fig. 5 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Ein erstes der

Drehventile 590 ist zwischen dem Mikrokanal 315 und dem Filter 240 angeordnet und ausgebildet, um eine Fluidverbindung zwischen denselben freizugeben oder zu blockieren. Ein zweites der Drehventile 590 ist zwischen dem Filter 240 und der Amplifikationskammer 570 angeordnet und ausgebildet, um eine

Fluidverbindung zwischen denselben freizugeben oder zu blockieren. Der weitere

Heizer 520 ist benachbart zu der Amplifikationskammer 570 angeordnet und mit derselben thermisch gekoppelt. Somit ist der Filter 240 zwischen den beiden Drehventilen 590 angeordnet.

Somit ist in Fig. 5 eine Ausführung der Vorrichtung 200 als Mehrschichtaufbau mit lediglich zwei Schichten gezeigt. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass die Vorrichtung 200 besonders kostengünstig herstellbar ist. Eine

Steuerung der Flüssigkeiten erfolgt hier mittels der Drehventile 590. Weiterhin weist eine solche Ausführung die zusätzliche, mittels des weiteren Heizers 520 beheizbare Amplifikationskammer 570 auf, in der nach einer Aufreinigung der Zielzellen-Nukleinsäuren eine Amplifikation derselben mittels PCR durchgeführt werden kann.

Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die Figuren 1 bis 5 ein Konzept zur thermischen Vorbehandlung einer Probe unter Verwendung des Verfahrens 100 sowie der Vorrichtung 200 gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden

Erfindung dargelegt.

Im Schritt 1 10 des Akkumulierens wird gemäß einem Ausführungsbeispiel in einem ersten Teilschritt die eigentliche thermische Vorbehandlung der Probe durchgeführt. Dabei erfolgt ein Erhitzen der Probe beispielsweise auf eine

Temperatur bzw. Lysetemperatur zwischen 60 und 90 Grad Celsius,

insbesondere zwischen 65 und 85 Grad Celsius. Die Temperatur ist dabei so abgestimmt, dass die in der Probe enthaltenen Begleitzellen, zum Beispiel Blutzellen wie Leukozyten, zerstört oder vorgeschädigt werden und die in den Begleitzellen enthaltenen Nukleinsäuren, also humane DNA, zumindest zum Teil freigesetzt werden, wobei die in der Probe enthaltenen Zielzellen, z. B.

Pathogene, intakt bleiben. Eine solche selektive Lyse der Begleitzellen ist möglich, da die Zielzellen als Pathogene eine robustere Zellwand besitzen und dadurch gegenüber thermischen Belastungen stabiler sind. Das Erhitzen der Probe kann z. B. stationär in einem der Probenkammer 210 oder im

Durchflussmodus in einer Kapillare, einem Schlauch oder einem Kanal wie dem Mikrokanal 315 erfolgen. Die in diesem Teilschritt entstehende Flüssigkeit wird als erstes Lysat bezeichnet. Im Schritt 1 10 des Akkumulierens erfolgt dann in einem zweiten Teilschritt ein

Mischen des ersten Lysats mit einem ersten Puffer, der Enzyme, z. B. Proteasen, DNAsen und Lysozym, enthält, aus der Vorratskammer 230. Dieser erste Puffer bewirkt einen Verdau bzw. eine Zerkleinerung der im ersten Teilschritt entstandenen bzw. freigesetzten beschädigten Zellen, Zelltrümmer, Proteine und DNA-Stränge der Begleitzellen. Dieser Verdau ist essentiell für einen

nachfolgenden Teilschritt der Filtration, da eine Gelierung des ersten Lysats vermieden, die Viskosität des ersten Lysats herabgesetzt und somit ein

Verstopfen des Filters 240 verhindert wird. Auch ist in der Filtration eine

Abtrennung von noch intakten zellulären Bestandteilen des ersten Lysats einfacher möglich. Die in diesem Teilschritt entstehende Flüssigkeit wird als verdautes Lysat bezeichnet.

Im Schritt 1 10 des Akkumulierens erfolgt dann in einem dritten Teilschritt die Filtration, wobei das verdaute Lysat wird über den Filter 240, z. B. einen Steril-, Gewebe- oder Silikafilter, geleitet wird. Noch intakte zelluläre Bestandteile, insbesondere die Zielzellen, werden aufgrund ihrer Größe auf dem Filter 240 zurückgehalten und somit akkumuliert.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird vor dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren die Probe mit einem wässrigen Puffer verdünnt, z. B. in einem Verhältnis zwischen 10:1 und 1 :10. Dies hat den Vorteil, dass die

Viskosität der Probe herabgesetzt wird und ein Gelieren während der thermischen Behandlung noch zuverlässiger vermieden wird. Bei Bedarf kann die Verdünnung mit dem wässrigen Puffer auch nach dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren erfolgen. Dies hat den Vorteil, durch den hierdurch ausgelösten osmotischen Schock auch Begleitzellen, die in dem ersten Teilschritt nur vorgeschädigt wurden, effektiv lysiert werden.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden in dem zweiten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren weitere Komponenten hinzugegeben, z. B. Detergenzien, wie z. B. Saponine, SDS oder dergleichen, chaotrope Salze oder basische Komponenten, wie z. B. NaOH. Dies hat den Vorteil, dass auch Begleitzellen, die in dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren nur vorgeschädigt wurden, effizient lysiert werden und deren Nukleinsäuren freigesetzt werden. Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der erste Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren nach dem zweiten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum

Akkumulieren ausgeführt. Dadurch wird bereits während der thermischen Vorbehandlung ein Gelieren der Probe zuverlässig vermieden. In diesem Fall werden temperaturbeständige Enzyme im ersten Puffer verwendet.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden die Zielzellen, anstatt dieselben im Schritt 120 des Aufschließens auf dem Filter 240 zu lysieren, vor dem

Vermischen mit dem Lysepuffer vom Filter 240 heruntergespült, z. B. indem ein Puffer, z. B. ein wässriger Puffer, in Gegenrichtung über den Filter 240 gespült wird.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der Filter 240, falls die Zielzellen im Schritt 120 des Aufschließens auf dem Filter 240 lysiert werden,

vorteilhafterweise auch direkt im Schritt 130 des Aufreinigens genutzt. Dies hat den Vorteil, dass ein Filter eingespart wird. Um dies zu realisieren, kann der Lysepuffer so eingestellt sein, dass im Schritt 120 des Aufschließens freigesetzte Zielzellen-Nukleinsäuren direkt an den Filter 240 binden. Alternativ kann im Anschluss an den Schritt 120 des Aufschließens ein Bindepuffer auf den Filter 240 gegeben werden, ohne den Lysepuffer vom Filter 240 zu verdrängen. Das Mischen von Lysepuffer und Bindepuffer im Filter 240 erfolgt dann diffusiv.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird während des Schrittes 120 des

Aufschließens das verdaute Lysat auch erhitzt oder mit Ultraschall beaufschlagt. Eine thermische Belastung bzw. durch den Ultraschall hervorgerufene

Druckwellen und Kavitation führen dazu, dass die Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden.

Ein möglicher weiterer Ablauf zum Aufbereiten der Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren der Nukleinsäuren der Zielzellen wird im Folgenden beschrieben.

Im Schritt 120 des Aufschließens werden die Zielzellen lysiert. Dabei entsteht ein zweites Lysat. Die Lyse bzw. der Aufschluss erfolgt durch Zugabe des

Lysepuffers aus der Lysepuffer-Vorratskammer 260 auf den Filter 240. Dieser Lysepuffer kann z. B. Enzyme enthalten, z. B. Proteinase K, Proteasen und Lysozym. Diese Enzyme bewirken eine Zerstörung der Zellwand der Zielzellen und somit eine Freisetzung der Zielzellen-Nukleinsäuren. Die Zellwand der Zielzellen kann auch auf andere Art und Weise zerstört werden, z. B. durch Zugabe von chemischen Reagenzien, z. B. chaotropen Salzen, Detergenzien wie z. B. Saponinen, SDS oder dergleichen, ß-Mercaptoethanol oder basischen

Komponenten wie z. B. NaOH.

Im Schritt 130 des Aufreinigens werden die Zielzellen-Nukleinsäuren aus dem zweiten Lysat heraus aufgereinigt, z. B. durch Adsorption an einer festen Phase.

Typischerweise schließt sich an den Schritt 130 des Aufreinigens eine Analyse der Zielzellen-Nukleinsäuren an. Ziel dieser Analyse kann es z. B. sein, ein Vorhandensein bestimmter Pathogene und Resistenzgene nachzuweisen.

Typischerweise werden hierzu zunächst die Zielzellen-Nukleinsäuren selektiv amplifiziert, z. B. mittels einer PCR. Bei der PCR wird durch Zugabe eines PCR-

Mastermix und durch wiederholtes Anfahren verschiedener Temperaturniveaus eine exponentielle Verstärkung der Nukleinsäuremenge erreicht. Der PCR- Mastermix enthält typischerweise eine Pufferlösung, Nukleotide, Polymerase, Primer, Magnesiumchlorid sowie gegebenenfalls Bovine Serum Albumin (BSA). Danach erfolgt z. B. eine Detektion der amplifizierten Zielzellen-Nukleinsäuren mittels Hybridisierung auf einem Microarray.

Vorteilhaft bei der Realisierung des Konzepts zum Aufbereiten in einem mikrofluidischen System unter Verwendung einer thermischen Vorbehandlung der Probe ist, dass das Verfahren 100 in einem mikrofluidischen System besonders definiert und reproduzierbar durchgeführt werden kann, da die Temperaturen, die Volumina und, bei Durchführung des Verfahrens im

Durchflussmodus, die Flussraten besonders genau eingestellt werden können. Ferner kann eine Gefahr einer Kontamination der Probe von außen bzw. der Umgebung durch die Probe minimiert werden, da das Verfahren 100 in der

Vorrichtung 200 als einem abgeschlossenen System durchgeführt wird.

Fig. 6 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden

Erfindung. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei eine Probenkammer 210, ein Filter 240, eine Abfallkammer bzw. Auffangkammer 250 für Lysat und Waschpuffer, eine Lysepuffer-Vorratskammer 260, eine Sammelkammer bzw. Eluat-Auffangkammer 270, lediglich beispielhaft drei Membranen 620 als

Abtrennfilter, eine Lysekammer 630 zum Auffangen von Filtrat, eine Bindepuffer- Vorratskammer 662, eine Waschpuffer-Vorratskammer 664 und eine

Elutionspuffer-Vorratskammer 666. Dabei ist die Vorrichtung 200 als ein mikrofluidisches System oder ein Teil eines mikrofluidischen Systems ausgeführt. Das Aufbereiten erfolgt unter Verwendung der lediglich beispielhaft drei

Membranen 620 zur dreifachen Filtration der Probe.

Zwischen der Probenkammer 210 und der Lysekammer 630 sind die drei Membranen 620 in Reihe angeordnet. Die Probenkammer 210 ist mittels einer Fluidverbindung über die drei Membranen 620 mit der Lysekammer 630 verbunden. Die Lysepuffer-Vorratskammer 260 und die Bindepuffer- Vorratskammer 662 sind mittels einer Fluidverbindung mit der Lysekammer 630 verbunden. Der Filter 240 ist zwischen der Lysekammer 630 einerseits und der Auffangkammer 250 für Lysat und Waschpuffer sowie der Eluat-Auffangkammer 270 andererseits angeordnet. Die Lysekammer 630 ist hierbei zwischen den Membranen 620 einerseits und dem Filter 240 andererseits angeordnet.

Die Waschpuffer-Vorratskammer 664 und die Elutionspuffer-Vorratskammer 666 sind fluidleitfähig mit einer Fluidverbindung zwischen der Lysekammer 630 und dem Filter 240 verbunden. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen.

Fig. 7 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei entspricht die in Fig. 7 gezeigte Vorrichtung 200 der Vorrichtung aus Fig. 6 mit der Ausnahme, dass lediglich eine Membran 620 vorgesehen ist und zusätzlich eine Rückführungsleitung 725 zwischen der Lysekammer 630 und der Probenkammer 210 angeordnet ist. Hierbei wird die Rückführungsleitung 725 benutzt, um die Probe im Kreis wiederholt über die Membran 620 zu pumpen. Dies hat den Vorteil, dass nur eine Membran 620 benötigt wird. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen. Fig. 8 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 in Fig. 8 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 7 mit der Ausnahme, dass zusätzlich eine Mehrzahl von Mikroventilen 890 zur

Flüssigkeitssteuerung, eine Pumpe 895 und eine von der Vorrichtung aus Fig. 7 geringfügig abweichende Verschaltung von Kammern vorgesehen sind. Die Probe wird hierbei mehrfach von der Probenkammer 210 mittels der Pumpe 895 über die Membran 620 in die Lysekammer 630 und anschließend zurück in die Probenkammer 2 gepumpt. Eine Lyse bzw. ein Aufschluss erfolgt in der

Probenkammer 210 durch Hinzupumpen von Lysepuffer aus der Lysepuffer- Vorratskammer 260. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen. Fig. 9 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 in Fig. 9 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 7 mit der Ausnahme, dass zusätzlich eine Abfallkammer 950 eine weitere

Waschpuffer-Vorratskammer 964 gezeigt sind. Die weitere Waschpuffer-

Vorratskammer 964 ist fluidleitfähig mit einer Fluidverbindung zwischen der Probenkammer 210 und der Membran 620 verbunden. Die Abfallkammer 950 ist fluidleitfähig mit einer Fluidverbindung zwischen der Membran 620 und der Lysekammer 630 verbunden. Hierbei wird nach jeder Filtration aus der weiteren Waschpuffer-Vorratskammer 964 ein Waschpuffer in Gegenrichtung über die

Membran 620 in die Abfallkammer 950 gepumpt. Die Membran 620 wird dadurch regeneriert, d. h. die akkumulierten Begleitzellen werden weggespült. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen. Fig. 10 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 in Fig. 10 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 9 mit der Ausnahme, dass zusätzliche Mikroventile 890 und eine Pumpe 1095 mit umkehrbarer Pumprichtung gezeigt sind. Eine solche Konfiguration ermöglicht es, mittels der Pumpe 1095, deren Pumprichtung invertierbar ist, die Membran 620 zwischen Filtrationsschritten zu waschen. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen.

Fig. 1 1 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 4 bzw. Fig. 8 bzw. Fig. 10 ähnlich, wobei in Fig. 1 1 die Vorrichtung 200 in einer Ausführung als Mehrschichtaufbau in einer Schnittansicht dargestellt ist. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Mikrokanal 315 als Zuführkanal, die erste

strukturierte Polymerschicht 481 , die Polymerfolie bzw. Zwischenschicht 482, die zweite strukturierte Polymerschicht 483, die polymere Deckelfolie bzw.

Deckelschicht 484, die Membran 620, eines der Ventile 890, ein Abführkanal 1 1 15, ein Steg 1 191 , eine Ventilkammer 1 192 und ein Steuerkanal 1 193.

Die Membran 620 ist zwischen dem Mikrokanal 315 und dem Abführkanal 1 1 15 angeordnet. Das Ventil 890 weist den Steg 1 191 , die Kammer 1 192, in welche die Zwischenschicht 482 auslenkbar ist, und den Steuerkanal 1 193 auf. Die erste strukturierte Polymerschicht 481 weist z. B. eine Dicke von 0,1 bis 25 Millimeter auf. Die Zwischenschicht 482 weist z. B. eine Dicke von 0,01 bis 1 Millimeter auf. Die zweite strukturierte Polymerschicht 483 weist z. B. eine Dicke von 0,1 bis 25 Millimeter auf. Die Deckelschicht 484 weist z. B. eine Dicke von 0,01 bis 1 Millimeter auf. Fig. 12 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei entspricht die Vorrichtung 200 der Vorrichtung aus Fig. 1 1 mit der Ausnahme, dass die Vorrichtung 200 in Fig. 12 anstelle der Membran 620 einen Filterkanal 1220 bzw. Mikrokanal mit Pfosten strukturen bzw. Pfosten zum

Abfiltern der Begleitzellen aufweist. Der Filterkanal 1220 z. B. in der ersten strukturierten Polymerschicht 481 ausgeführt.

Fig. 13 zeigt einen Ausschnitt der ersten strukturierten Polymerschicht 481 der Vorrichtung aus Fig. 12. Es ist erkennbar, dass der Filterkanal 1220 bzw.

Mikrokanal mit Pfostenstrukturen bzw. Pfosten 1325 in der ersten strukturierten Polymerschicht 481 ausgeformt ist. Die Pfostenstrukturen bzw. Pfosten 1325 weisen z. B. eine zylindrische Form auf. Eine Breite des Filterkanals 1220 liegt beispielsweise zwischen 100 Mikrometer und 10 Millimeter und typischerweise bei 1 Millimeter. Eine Länge des Filterkanals 1220 liegt beispielsweise zwischen 1 Millimeter und 25 Millimeter und typischerweise bei 5 Millimeter. Eine Tiefe des

Filterkanals 1220 liegt beispielsweise zwischen 50 Mikrometer und 5 Millimeter und typischerweise bei 500 Mikrometer. Eine Breite der einzelnen Pfosten 1325 liegt beispielsweise zwischen 50 Mikrometer und 1 Millimeter und typischerweise bei 200 Mikrometer. Ein Abstand zwischen den einzelnen Pfosten 1325 liegt beispielsweise zwischen 5 Mikrometer und 20 Mikrometer und typischerweise bei

10 Mikrometer.

Fig. 14 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und

Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei entspricht die Vorrichtung 200 der Vorrichtung aus Fig. 12 mit der Ausnahme, dass die Vorrichtung 200 in Fig. 14 anstelle des Filterkanals Mikrokanal mit Pfostenstrukturen bzw. Pfosten in der ersten strukturierten Polymerschicht 481 ein in der zweiten strukturierten Polymerschicht 483 ausgeführtes Mikrosieb 1420 aufweist. Das Mikrosieb 1420 ist ausgebildet, um die Begleitzellen abzufiltern.

Fig. 15 zeigt einen Ausschnitt der zweiten strukturierten Polymerschicht 483 der der Vorrichtung aus Fig. 14. In der zweiten strukturierten Polymerschicht 483 sind der Abführkanal 1 1 15 und das Mikrosieb 1420 ausgeformt, das eine

Mehrzahl von Poren 1525 aufweist. Ein Durchmesser der einzelnen Poren 1525 liegt beispielsweise zwischen 5 Mikrometer und 25 Mikrometer und

typischerweise bei 10 Mikrometer. Im Folgenden wird unter Bezugnahme insbesondere auf die Figuren 1 und 6 bis

15 ein Konzept zur Aufbereitung einer Probe mittels einer Membran unter Verwendung des Verfahrens 100 sowie der Vorrichtung 200 gemäß

Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung dargelegt. In dem Schritt 1 10 des Akkumulierens wird die Probe, insbesondere eine

Blutprobe mit einem Volumen zwischen 100 Mikroliter und 10 Milliliter, über die Membran 620 oder die Mikrostrukturen 1220 oder 1420 geleitet und das entstehende Filtrat wird aufgefangen. Beispielsweise wird hierzu eine siebartige Membran 620 verwendet, z. B. mit einer Dicke zwischen 100 und 1000

Mikrometer und einer Porengröße zwischen 5 und 15 Mikrometer, z. B. zwischen 7 und 10 Mikrometer. Die Probe kann z. B. mittels einer Pumpe 895, 1095 bzw. durch Pumpen mittels einer Spritze, einer Spritzenpumpe, einer peristaltischen Pumpe oder einer Membranpumpe oder durch Anlegen eines Überdrucks, z. B. zwischen 100 Millibar und 2 bar, z.B. 500 Millibar, über die Membran 620 geleitet werden. Alternativ kann die Probe auch durch Zentrifugalkräfte über die

Membran 620 geleitet werden. In dem Schritt 1 10 des Akkumulierens werden die in der Probe enthaltenen Begleitzellen aufgrund ihrer Größe von der Membran 620 bzw. den Mikrostrukturen 1220 oder 1420 zurückgehalten. Andere

Bestandteile der Probe und die Zielzellen können aufgrund ihrer kleineren Größe die Membran 620 bzw. die Mikrostrukturen 1220 oder 1420 passieren und sind im Filtrat enthalten.

Im Schritt 120 des Aufschließens werden die im Filtrat enthaltenen Zellen, insbesondere die Zielzellen, aufgeschlossen bzw. lysiert. Dies geschieht z. B. indem dem Filtrat ein Lysepuffer zugegeben wird. Dieser Lysepuffer kann z. B. Enzyme enthalten, z. B. Proteinase K, Proteasen und Lysozym. Diese Enzyme bewirken eine Zerstörung der Zellwand der Zielzellen und somit eine Freisetzung der Zielzellen-Nukleinsäuren. Die Zellwand der Zielzellen kann auch auf andere Art und Weise zerstört werden, z. B. durch Zugabe von chemischen Reagenzien, z. B. chaotropen Salzen, Detergenzien wie z. B. Saponinen, SDS oder dergleichen oder basischen Komponenten wie z. B. NaOH. Die in dem Schritt

120 des Aufschließens entstehende Flüssigkeit wird als Lysat bezeichnet und enthält die Zielzellen-Nukleinsäuren, z. B. pathogene DNA.

Im Schritt 130 des Aufreinigens werden die im Lysat enthaltene Zielzellen- Nukleinsäuren aufgereinigt. Dies kann z. B. durch Adsorption an einer festen

Phase, z. B. einem Filter, z. B. einem Silikafilter, oder Beads, z. B. Silikabeads, geschehen. Bei der Aufreinigung auf dem Filter 240 wird beispielsweise folgender Ablauf durchgeführt. Es erfolgt ein Mischen des Lysats mit einem Bindepuffer, z. B. Ethanol, und ein Spülen der Mischung über den Filter 240. Der Bindepuffer stellt die chemischen Bedingungen so ein, dass die Zielzellen-

Nukleinsäuren am Filter 240 adsorbieren. Danach erfolgt ein Spülen eines Waschpuffers, z. B. eines Ethanol enthaltenden Waschpuffers, über den Filter 240. Dies führt dazu, dass Zelltrümmer und Proteine vom Filter 240

heruntergespült werden. Die Zielzellen-Nukleinsäuren bleiben am Filter 240 adsorbiert. Bei Bedarf kann das Spülen mit dem Waschpuffer auch mehrmals wiederholt werden, was die Waschwirkung erhöht. Schließlich erfolgt ein Spülen eines Elutionspuffers, z. B. Wasser, über den Filter 240. Dabei werden die Zielzellen-Nukleinsäuren vom Filter 240 heruntergespült. Die Zielzellen- Nukleinsäuren stehen dann im Elutionspuffer in hoher Konzentration und

Reinheit zur Verfügung.

An den Schritt 130 des Aufreinigens schließen sich typischerweise weitere Schritte zur Analyse der im Lysat enthaltenen Zielzellen-Nukleinsäuren an. Ziel dieser Analysen ist es z. B., das Vorhandensein bestimmter Pathogene und Resistenzgene nachzuweisen. Typischerweise werden hierzu zunächst die Zielzellen-Nukleinsäuren selektiv amplifiziert, z. B. mittels einer Polymerase-

Kettenreaktion. Danach kann z. B. eine Detektion mittels Hybridisierung auf einem Microarray erfolgen.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 1 10 des Akkumulierens die Probe über mehrere Membranen 620 gespült, z. B. zwei bis fünf Membranen

620. Bei den einzelnen Spülvorgängen wird typischerweise eine

Abtrennungseffizienz von unter 80 Prozent, teilweise nur von 40 bis 50 Prozent, erreicht. Durch die mehrfache Filterung wird die Abtrennungseffizienz vergrößert. Dadurch wird die Zahl der Begleitzellen, die sich im Filtrat befinden, und somit die Menge der Begleitzellen-Nukleinsäuren verringert.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 1 10 des Akkumulierens, anstatt mehrere Membranen 620 für die mehrfache Filtration zu verwenden, die Probe bzw. das Filtrat auch mehrfach über dieselbe Membran 620 gespült, z. B. zweimal bis fünfmal. Dies hat den Vorteil, dass der Aufbau vereinfacht wird und nur eine Membran 620 benötigt wird.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 1 10 des Akkumulierens, falls nur eine Membran 620 für die mehrfache Filtration verwendet wird, die Membran 620 vorteilhafterweise zwischen Filtrationsvorgängen gewaschen, um die akkumulierten Begleitzellen von der Membran 620 zu entfernen. Dies hat den Vorteil, dass ein durch die Akkumulation der Begleitzellen auf der Membran 620 heraufgesetzter Flusswiderstand der Membran 620 durch das Herunterwaschen der Begleitzellen zwischen den Filtrationsschritten wieder herabgesetzt wird, sodass die nachfolgende Filtration einfacher und schneller, d. h. bei niedrigeren Drücken und höheren Flussraten, durchgeführt werden kann. Ferner vorteilhaft dabei ist, dass bei einer großen Menge von Begleitzellen auf der Membran 620 die Gefahr, dass sich Begleitzellen wieder von der Membran 620 lösen und ins Filtrat gelangen, reduziert wird. Hierdurch wird die erreichbare

Abtrennungseffizienz gesteigert. Durch Waschen des Filters 620 wird die Anzahl der Begleitzellen auf der Membran 620 verringert und somit die

Abtrennungseffizienz erhöht. Das Waschen kann z. B. geschehen, indem Wasser oder ein Puffer in Gegenrichtung über den Filter 620 gespült wird.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 120 des Aufschließens die Lyse zusätzlich oder alternativ mittels Ultraschall durchgeführt werden. Durch den Ultraschall hervorgerufene Druckwellen und Kavitation führen dazu, dass die Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden. Bei Bedarf kann hierdurch auch auf die Zugabe eines Lysepuffers verzichtet werden. Gemäß einem Ausführungsbeispiel sind für den Schritt 1 10 des Akkumulierens anstelle der Membran 620 bzw. Filtermembran siebartige Mikrostrukturen 1325, 1525 in Kanäle und/oder Kammern des mikrofluidischen Systems eingebracht. Beispielsweise können das versetzt angeordnete Pfosten 1325 mit einem Durchmesser zwischen 5 und 50 Mikrometer sein, die mit einem Abstand zwischen 5 und 15 Picometer in dem Filterkanal 1220 angeordnet sind. Diese können beispielsweise durch ein Replikationsverfahren wie Heißprägen im gleichen Herstellungsschritt wie die übrigen Strukturen des mikrof luischen Systems hergestellt werden und vereinfachen so eine Fertigung, da separate Schritte zur Integration der Filtermembran 620 entfallen. Alternativ kann auch eine Membran mit der beschriebenen Porengröße mittels eines solchen

Verfahrens direkt im Boden eines mikrofluidschen Kanals oder einer Kammer abgeformt werden.

Vorteilhaft bei der Realisierung des Konzepts zum Aufbereiten in einem mikrofluidischen System unter Verwendung Membran ist, dass das Verfahren 100 in einem mikrofluidischen System besonders definiert und reproduzierbar durchgeführt werden kann, da die Art der Anströmung der Membran 620 bzw. der Mikrostrukturen 1220 und 1420, die Flussraten und Drücke genau eingestellt werden können. Ferner kann eine Gefahr einer Kontamination der Probe von außen bzw. der Umgebung durch die Probe minimiert werden, da das Verfahren 100 in der Vorrichtung 200 als einem abgeschlossenen System durchgeführt wird. Auch kann bei Durchführung in einem mikrofluidischen System das Verfahren 100 automatisiert durchgeführt werden, selbst wenn bei mehrfacher Filtration der Aufbau kompliziert ist, viele Komponenten benötigt werden und viele Arbeitsschritte durchgeführt werden.

Die beschriebenen und in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele sind nur beispielhaft gewählt. Unterschiedliche Ausführungsbeispiele können vollständig oder in Bezug auf einzelne Merkmale miteinander kombiniert werden. Auch kann ein Ausführungsbeispiel durch Merkmale eines weiteren Ausführungsbeispiels ergänzt werden. Ferner können Verfahrensschritte wiederholt sowie in einer anderen als in der beschriebenen Reihenfolge ausgeführt werden.