FARBER SOF YA BORISOVNA (RU)
MARTYNOV ARTUR VIKTOROVICH (UA)
FARBER SOF YA BORISOVNA (RU)
MARTYNOV ARTUR VIKTOROVICH (UA)
| WO2010096331A1 | 2010-08-26 |
| US5567301A | 1996-10-22 |
SMIRNOVA YU. A. ET AL.: "Flu Virion as a Substrate for Proteolytic Enzymes", RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY, vol. 34, no. 3, 2008, pages 369 - 374
MARTYNOV A.V. ET AL.: "New approach to design and synthesis of therapeutic and preventive drugs, taking into account interspecies polymorphism of receptors (Method of precisionpartial modification)", ANNALS OF MECHNIKOV INSTITUTE, vol. 5-15, no. 4, 2007, pages 8 - 9
SARAH L. NOTON ET AL.: "Identification of the domains of the influenza A virus M1 matrix protein required for NP binding, oligomerization and incorporation into virions", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 88, 2007, pages 2280 - 2290
PIERCE BIOTECHNOLOGY, ANTIBODY LABELING, 2004, U.S.A., pages 40 - 43
KEPENG ET AL.: "Identification of protein - protein interactions of the occlusion - derived virus-associated proteins of Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 91, 2010, pages 659 - 670
ВАСИЛЬЕВА, Галина Семеновна (RU)
| Формула изобретения 1. Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении ха- рактерных для заболевания специфических белков-мишеней в реакции их специфического взаимодействия с другими белками-реагентами, отличающийся тем, что берут специфи- ческий для данного заболевания белок-мишень, гидролизуют протеолитическими фермен- тами, модифицируют химическую структуру образовавшейся смеси (ансамбля) олигопеп- тидов таким образом, чтобы их заряд изменился на противоположный, и используют да- лее уже в качестве белков-реагентов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед изменением заряда молекул композиции олигопептидов их ковалентно модифицируют флюоресцирующим агентом, а затем кова- лентно модифицируют химическую структуру образовавшейся смеси (ансамбля) олиго- пептидов с изменением их заряда на противоположный и используют в методе иммуноф- люоресцентного анализа. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед изменением заряда молекул композиции олигопептидов их ковалентно модифицируют бивалентным сшивающим агентом, а затем ковалентно модифицируют химическую структуру образовавшейся смеси (ансамбля) оли- гопептидов с изменением их заряда на противоположный, затем добавляют маркерный фермент, образовавшийся конъюгат фермента и композиции пептидов используют в ме- тоде иммуноферментного анализа. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента ис- пользуют трипсин. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента ис- пользуют папаин. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента ис- пользуют химотрипсин. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента ис- пользуют пепсин. 8. Способ по п.4-7, отличающийся тем, что продукт реакции между композицией моди- фицированных пептидов и специфическим белком-мишенью выявляют методом гель- электрофореза по увеличению массы белка-мишени. 9. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве флюоресцирующего агента исполь- зуют флюоресциинизотиоцианат. 10. Способ по п.2, отличающийся тем, что где в качестве флюоресцирующего агента ис- пользуют родамин. 1 1. Способ по п.З, отличающийся тем, что в качестве маркерного фермента использу- ют пероксидазу. 12. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют глутаровый диальдегид. 13. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют малеимид 14. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют малоновый диальдегид. 15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ковалентную модификацию структуры ком- позиции олигопептидов с заменой заряда проводят янтарным ангидридом. 16. Способ по п. 1, где ковалентную модификацию структуры композиции олигопептидов с заменой заряда проводят монохлоруксусной кислотой. 17. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве белка-мишени используют инак- тивированный температурой или радиацией микроорганизм. 18. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве белка-мишени используют инди- видуальный белок инактивированного температурой или радиацией микроорганизма. 19. Способ по п.п.17 -18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма использу- ют вирусы. 20. Способ по п.п.17 -18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма использу- ют бактерии. 21. Способ по п.п.17 - 18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма использу- ют микроскопические грибы. 22. Устройство для осуществления способа для быстрой лабораторной диагностики забо- леваний детекции путем определения наличия в биологическом материале четко опреде- ленного белка, который содержит пластинку, нанесенный на нее проводящий слой, обра- зующий электроды, защитное диэлектрическое покрытие, контактные выводы, иммуно- химическую биоматрицу на поверхности одного из электродов содержащую сорбирован- ные специфические к определяемому белку иммуноглобулины, отличающееся тем, что в качестве биоматрицы используют пришитый к металлической поверхности гидролизован- ный протеолитическими ферментами и модифицированный с заменой заряда молекул на противоположный детектируемый антиген. |
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно, к методам лабораторной диагности- ке и предназначено для замены существующих методов иммунодиагностики с примене- нием иммуноглобулинов на патентуемый значительно менее затратный метод.
Предшествующий уровень техники
Среди существующих лабораторных методов диагностики заболеваний, где ис- пользуются специфические иммуноглобулины, наиболее распространены иммунофер- ментный метод и метод иммунофлюоресценции.
Иммуноферментный анализ, или ИФА (англ. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)— это лабораторный иммунологический метод качественного определения и ко- личественного измерения антигенов, а также иммуноглобулинов и гормонов. Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время со- ставляет более 90%. Тест-системы для иммуноферментной диагностики выявляют широ- кий круг различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и др.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) дает возможность определения антител
(IgG, IgA, IgM) к возбудителям инфекции в крови. Эти антитела вырабатываются орга- низмом в ответ на инфицирование. Антитела выявляются при взаимодействии со специ- альными препаратами, содержащими соответствующие антигены, образующие с антите- лами прочный комплекс, который можно обнаружить разными способами. В основе мето- да лежит принцип взаимодействия иммуносорбента— антигена возбудителя инфекции с выявляемыми антителами. В зависимости от того, какие антитела использованы, тест- система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса. Материалом для исследования служит сыворотка или плазма венозной крови, взятой натощак.
Для диагностики венерических заболеваний используются три класса иммуноглобулинов: М, A, G.
Благодаря тому, что иммуноглобулины разных классов вырабатываются в опреде- ленной последовательности, с помощью ИФА можно диагностировать инфекцию на раз- ных стадиях, и отслеживать динамику развития процесса. Последовательность выработки иммуноглобулинов разных классов следующая: Первыми появляются IgM-антитела. Как правило, это происходит через 1-3 недели с момента заражения. Время обнаружения ан- тител зависит как от самой инфекции, так и от особенностей иммунной системы конкрет- ного человека. Появляются симптомы острой инфекции. Обнаружение IgM-антител в ана- лизе указывает на наличие острой фазы заболевания или на обострение хронических ин- фекционных заболеваний.
Через месяц начинают вырабатываться IgA-антитела, основная часть которых кон- центрируется на слизистых оболочках, где реализуется их защитная функция.Последними появляются IgG-антитела, как правило, на 4 неделю с момента заражения. После лечения хламидиоза, микоплазмоза, трихомониаза их уровень значительно снижается, так как им- мунитет против этих заболеваний не развивается. Следует обратить внимание на то, что обнаружение иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) указывает только на наличие антител, а не на наличие возбудителя. Поэтому в некоторых случаях иммуноферментный анализ мо- жет давать и ложные результаты— как ложноположительные, так и ложноотрацательные. Однако, специфичность лучших тест-систем ИФА рекомбинантного типа в настоящее время приближается к 100%.
Таким образом, за счет несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики. Достоинства ИФА— возможность ранней диагно- стики инфекции, возможность прослеживать динамику развития процесса, быстрота и удобство в работе. Недостаток ИФА— относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не сам возбудитель.
Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления, как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцент- ным красителем. Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помо- щью флюоресцентной микроскопии. Существуют три модификации иммунофлюорес- центного анализа. 1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюорес- центного микроскопа. 2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить ан- титела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывает- ся с немечеными антителами. Комплексы антиген— антитело выявляются с помощью ме- ченых антител к иммуноглобулинам. 3. Метод конкурентной иммунофлюоресценции ос- нован на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.
Известен способ детекции вируса гриппа и компоненты для его использования ['], где не используются антитела. В этом методе патентуются компоненты, способные спе- цифически связываться с активными участками нейраминидазы вируса гриппа и новые компоненты для использования в этом методе. В качестве веществ, специфически взаимо- действующих с гриппозной нейраминидазой патентуются синтетические производные аналоги нейраминовой кислоты. Предполагается использование синтетических производ- ных нейраминидазы в антительных тест-системах вместо иммуноглобулинов. Недостат- ком метода является полностью синтетический характер производных нейраминидазы и соответственно сложность синтеза и производство тест-системы, что значительно увели- чивает ее цену, необходимость синтеза производного к каждому штамму вируса гриппа со своей нейраминидазой, невозможность использования метода для детекции других ин- фекций и выявления других белков, кроме гриппозных.
Также известен иммунодиагностический способ и набор к нему для детектирова- ния вирусных антигенов, таких как простой герпес [ 2 ]. Вирусный антиген иммуноконъю- гирован со специфическим иммуноглобулином IgG против вирусного антигена и сорби- рован на нерастворимой матрице. Матрица взаимодействует при контакте с моноклональ- ными иммуноглобулинами IgM, мечеными биотином. Наличие антигена вируса герпеса выявляется реакцией авидина с биотином. Метод является аналогом иммуноферментного анализа. Недостатком метода является необходимость получения специфических имму- ноглобулинов против вирусных антигенов с применением животных либо использования гибридом для получения моноклональных антител, что значительно удорожает конечный продукт. Также в методе используют многократную ковалентную конюгацию иммуногло- булинов с биотином и специфических иммуноглобулинов с нерастворимым матриксом, что значительно уменьшает специфичность и чувствительность иммуноглобулинов от че- го значительно падает точность проведенных исследований. Кроме того, метод предна- значен только для детекции вирусных антигенов и не может быть использован для выяв- ления бактериальных, грибковых и других низкоиммуногенных белков, к которым у им- мунизированных животных трудно индуцировать синтез специфических иммуноглобули- нов. Известен биосенсор для детекции наличия в биологическом материале четко определенного белка, который содержит пластинку, нанесенный на нее проводящий слой, образующий электроды, защитное диэлектрическое покрытие, контактные выводы, имму- нохимическую биоматрицу на поверхности одного из электродов содержащую сорбиро- ванные специфические к определяемому белку иммуноглобулины [ ].
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставлена задача разработать способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний и прибор для его осуществления, основанный на выявлении специфических белков, способный выявлять любой белок, специфический для конкретной болезни, в том числе низкоиммуногенный белок, к которому невозможно или трудно по- лучить специфический иммуноглобулины. В предлагаемом способе не используются им- муноглобулины и животные для их получения, процедуры получения белка - реагента сводится к нескольким простым процедурам и позволяет разрабатывать тест-системы для выявления новых и малоизученных инфекционных заболеваний к кратчайшие сроки.
Поставленная задача решается путем разработки способа быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанного на выявлении характерных для заболевания спе- цифических белков-мишеней в реакции их специфического взаимодействия с другими белками-реагентами, отличающегося тем, что берут специфический для данного заболе- вания белок-мишень (вьщеленный из микроорганизма, вируса или микроскопического грибка), гидролизуют протеолитическими ферментами, модифицируют химическую структуру образовавшегося макромолекулярного ансамбля из олигопептидов путем аци- лирования янтарным ангидридом или алкилированием монохлоруксусной кислотой. Реак- цию ведут таким образом, чтобы их заряд изменился на противоположный, и используют далее уже в качестве белков-реагентов в методах иммунофлюоресцентного и иммунофер- ментного анализов или с применением импедансного биосенсора вместо специфических и антивидовых иммуноглобулинов. В качестве протеолитчиеских ферментов могут быть использованы: пепсин, трипсин, папанин, химотрипсин. Между полученным макромоле- кулярным ансамблем кислых олигопептидов и флюоресциирующим веществом флюорес- цеинизотиоцианатом или другим флюоресцентным зондом могут быть получены флюо- ресцирующие конюгаты для дальнейшего применения в методе флюоресцирующих анти- тел (прямой или непрямой иммунофлюоресценции). Аналогично могут быть получены конюгаты между супрамолекулярным ансамблем кислых пептидов и ферментом пероксидазой для дальнейшего использования этого конъюгата в иммуноферментном анализе.
Поставленная задача решается также путем разработки устройства для быстрой ла- бораторной диагностики заболеваний путем определения наличия в биологическом мате- риале четко определенного белка, которое содержит пластинку, нанесенный на нее прово- дящий слой, образующий электроды, защитное диэлектрическое покрытие, контактные выводы, иммунохимическую биоматрицу на поверхности одного из электродов содержа- щую сорбированные специфические к определяемому белку иммуноглобулины, отли- чающегося тем, что в качестве биоматрицы используют пришитый к металлической по- верхности гидролизованный протеолитическими ферментами и модифицированный с за- меной заряда молекул на противоположный детектируемый антиген.
Вместо иммуноглобулинов авторами использован ансамбль из олигопептидов - продуктов гидролиза детектируемых впоследствии специфических антигенов, но с изме- ненными на противоположные зарядами молекул. Ансамбль - термин из супрамолекуляр- ной химии. Объекты супрамолекулярной химии— супрамолекулярные ансамбли, строя- щиеся самопроизвольно из комплементарных, т. е. имеющих геометрическое и химиче- ское соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших простран- ственных структур в живой клетке [4,5]
Специфическое взаимодействие обусловлено эффектом конъюгации и гибридиза- ции гомогенных пептидов, но имеющих противоположный заряд - самосборка на мишени супрамолекулярного ансамбля. Метод позволяет исключить этап получения специфиче- ских иммуноглобулинов и соответственно отказаться от использования животных, уско- рить до нескольких дней разработку тест-систем для новых и малоизученных инфекцион- ных заболеваний, значительно снизить стоимость производства тест-систем при той же чувствительности метода, но при значительно большей его специфичности.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1.- Фотография эпителиальных клеток мазка, не инфицированных вирусом герпеса в патентуемом методе Фиг. 2. - Инфицированные вирусом герпеса 1 типа клетки букального эпителия, выявленные патентуемым методом
Фиг.З.- Структура (схема) предлагаемого устройства -импедансного биосенсора (вид сверху) : 1 - электроды (золотые, платиновые, иридиевые или др..), 2- кремниевая подложка, 3- иммунохимическая ячейка с сорбированным пептидогидролизатом, 4- изолирующая подложка (стеклянная, кремниевая, пластмассовая, резиновая или др.), к иммунохимической ячейке с двух сторон подведены электроды.
Фиг.4 - Структура (схема) предлагаемого устройства - импедансного биосенсора (вид сбо- ку): 1 - электроды (золотые, платиновые, иридиевые или др..), 2- кремниевая под- ложка, 3- иммунохимическая ячейка с сорбированным пептидогидролизатом, 4- изо- лирующая подложка (стеклянная, кремниевая, пластмассовая, резиновая или др.), к иммунохимической ячейке с двух сторон подведены электроды.
Фиг.5.- Принцип работы предлагаемого устройства - импедансного многоэлектродного иммунохимического биосенсора на золотой подложке: а - между антителами и ан- тигенами в растворе нет реакции, б- между антителами и антигенами а растворе идет преципитация (образование комплекса и осадка), что отражается на характере импе- дансной кривой.
Устройство работает следующим образом. При внесении в иммунохимическую ячейку 3 биологического материала при наличии иммунохимической реакции (между ацилированными пептидами с поверхности ячейки и специфическим антигеном) с течени- ем времени импедансная кривая меняется. При отсутствии иммунохимической реакции импедансная кривая остается неизменной. Это позволяет производить детекцию наличия в биологическом материале четко определенного белка.
Наиболее быстрыми и точными методами селективной детекции ДНК, РНК и бел- ков являются биосенсоры, принцип работы которых основан на импедансе, адмитансе и электронной проводимости ДНК [1 - 3]. Аппаратная часть детекторов давно изучена и хорошо проработана: регистрацию сигналов осуществляют электрохимическими метода- ми: хроноамперометрией, циклической вольтамперометрией и электрохимической импе- дансной спектроскопией (ЭИС) [4 - 6]. Основным узким местом биосенсоров является электрод: он либо имеет ограниченное время службы либо настолько высокочувствите- лен, что дает ложноотрицательные срабатывания. В настоящее время все чаще применяе- ются иммунобиосенсоры, принцип работы которых основан на выявлении реакции обра- зования комплексов антиген-антитело электрохимическим путем. На один из электродов наносят антитела (пришивают малеимидом или имидами кремниевых кислот) и регистрируют импеданс в контрольном растворе. Затем вносят опытный раствор с опре- деляемым антигеном. В случае образования иммунных комплексов между нанесенными на электрод антителами и антигенами меняется картина вольтамперометрической кривой. При этом легко определяется корреляция между количеством антигена в пробе и характе- ром кривой. Аналогично можно выявлять и специфические антитела в растворе, если на электрод сорбировать специфический антиген. Недостатком метода является необходи- мость применения иммуноглобулинов (антител) для выявления антигенов. Иммуноглобу- лины являются наиболее дорогостоящим компонентом биосенсора в связи с тем, что для получения эффективного иммунобиосенсора нужны поликлональные иммуноглобулины вакцинированного животного (чаще всего кролей). Соответственно, для получения про- мышленных количеств иммуноглобулинов нужен виварий и система для очистки белков крови, хроматографического выделения иммуноглобулинов. Предлагаемый нами метод позволяет заменить иммуноглобулины на определяемый антиген, но с измененными на противоположный зарядами молекул. Перед нанесением на электрод такие антигены фрагментируют протеолетическими ферментами и модифицируют антигдридами дикар- боновых кислот либо хлорпроизводными кислот. В этом случае сорбированные фрагмен- ты антигена приобретают свойства афинности и комплементарности к своим немодифи- цированным производным. Кроме того, в отличие от водороных связей между иммуног- лобулинами и антигенами, между ацилированными фрагментами и нативным антигеном образуется ионная связь. Реакция идет очень быстро, буквально за несколько секунд. Это позволяет создавать биосенсоры для мгновенного определения опасных микробных и ви- русных возбудителей в биологических средах, если речь идет о жизни и смерти пациента. На фиг.5 приведен импеданс для многоэлектродного золотого чипа-биосенсора.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Получение тест-системы для диагностики гриппа, содержащего нейраминидазу N1 и геммаглютинин HI .
Берут амниотическую жидкость после инфицирования куриного эмбриона вирусом гриппа H1N1 и инкубирования до накопления максимального количества вируса в извест- ных стандартизованных условиях, очищают известными методами содержащийся там ви- рус гриппа, концентрируют его путем диализа. К полученному концентрату добавляют раствор трипсина с расчетом, чтобы соотношение фермент: белок составляло 1 :100, ос- тавляют в термостате при 37° С на 12 часов. Концентрацию растворимых олигопептидов - продуктов гидролиза определяли спектрофотометрически при 280 нм и 260 нм. Спектрофотометрический метод определения белка основан на способности аромати- ческих аминокислот (триптофан, тирозин и в меньшей степени фенилаланин) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм. Условно принято считать, что при концентрации белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1 при использовании кюветы с толщиной слоя 10 мм. В качестве раство- ра сравнения использовали растворитель препарата. Концентрация испытуемого белка в растворе должна быть от 0,05 до 2 мг/л. Определению белка данным методом мешают присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов (более 20 %). В этом случае оптическую плотность одного и того же раствора измеряют при двух длинах волн— 260 и 280 нм; со- держание белка X (мг/мл) рассчитывают по формуле Калькара:
Полученную смесь олигопептидов и РНК кипятят 10 минут, затем образовавшийся осадок негидролизованных биополимеров отделяют центрифугированием при 5g в тече- ние 20 минут. К надосадочной жидкости добавляют флюоресцеина изотиоцианата в соот- ношении к белку 1/10000, оставляют раствор при +5°С на 5 часов, затем добавляют твер- дый янтарный ангидрид в соотношении к концентрации белка 2:1. Полученную смесь реа- гента далее используют в методе флюоресцирующих антител. Также в наборе используют конъюгированный с родамином стандартизованный бычий сывороточный альбумин.
Пример 2. Детекция инфицирования вирусом гриппа H1N1.
У пациентов, у которых подозревают грипп, берут бронхиальное отделяемое, мазок слизистой носа, кровь. Каждую пробу ресуспензируют в 0,9 % забуференном растворе на- трия хлорида, центрифугируют. Процедуру ресуспендирования и центрифугирования по- вторяют трижды для очистки клеток от сопутствующих растворимых компонентов. Оса- док клеток отбирают микропипеткой и наносят на предметное стекло, другим стеклом суспензию клеток равномерно распределяют по стеклу. Дают мазку высохнуть, опускают для фиксации в раствор ацетона либо фиксируют смесью Никифорова до высыхания маз- ка. На высушенный мазок наносят полученную в примере 1 композицию пептидов и ос- тавляют в термостате при 37° С на 40 минут во влажной камере для предотвращения вы- сыхания мазка. Затем мазок промывают забуференным 0,9% раствором натрия хлорида и наносят 0,1 % раствор меченного родамином бычьего сывороточного альбумина, также оставляют на 20 минут в термостате во влажной камере. Обработка альбумином необхо- дима для блокирования лишних эпитопов клеток, не связавшихся со специфическими флюоресцирующими пептидами. Затем мазок вынимают из термостата, промывают дистиллированной водой и высушивают. Детектируют флюоресцирующие зеленым цве- том клетки в флюоресцентном микроскопе. Инфицированные вирусом клетки флюорес- цируют зеленым цветок, здоровые клетки флюоресцируют красным цветом. Если вместо предметного стекла использовать камеру Горяева или флюорометрическую насадку, то можно сосчитать процентное соотношение инфицированных вирусом клеток.
Для проверки работоспособности метода разработанную тест-систему проверяли в сравнительном тесте со стандартизованными и зарегистрированными РНИФ-тест- системой, ПЦР-тест-системой и клуьтуральным методом. Для детекции брали образцы тканей больных, находящихся в стационарах в период эпидемии гриппа возрастом от 12 до 75 лет обоего пола.
В качестве контролей использовали стандартизованную тест-систему для реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) выявления антигенов вируса гриппа H1N1 производства НИИ Гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург, Российская Федерация), ревертаз- ный ПЦР-диагностикум TaqMan (США) и выделение вируса in ovo с его детекцией стан- дартизованным методом гемагглютинации. На рисунке 1 представлены результаты срав- нения стандартного метода РНИФ и патентуемого способа.
Таблица 1.- Сравнительные результаты обследования пациентов двух групп - с кли- ническими признаками гриппа, находящиеся в стационаре в период эпидемии гриппа и контрольная группа, проходящая плановое обследование без клиниче- ских признаков гриппа
Способ Выявлено вирусный анти- Выявлено антиген в мазке Выявлено антиген в леко- ген в бронхиальном отде- из слизистой носа цитах крови
ляемом (Всего пациен- (Всего пациен-
(Всего пациен- тов/выявлено/%) тов/выявлено/%) тов/выявлено/%)
Опытная Контроль Опытная Контроль Опытная Контроль группа (с (без клини- группа (с (без клини- группа (с (без клини- клинически- ческих при- клинически- ческих при- клинически- ческих при- ми призна- знаков ми призна- знаков ми призна- знаков ками гриппа) гриппа) ками гриппа) гриппа) ками гриппа) гриппа)
Патентуемый (180/107/59) (40/4/10) (180/102/57) (40/2/5) (180/1 10/61) (40/4/10)
Контрольный (180/62/34) (40/1/2,5) (180/69/38) (40/0/0) (180/68/38) (40/2/5)
РНИФ
Контрольный (180/102/57) (40/6/15) (180/100/55) (40/5/12) (180/100/55) (40/4/10)
ПЦР -
Как видно из таблицы 1 , результаты анализа, полученные с помощью разработанного ме- тода наиболее близко коррелируют с золотым стандартом вирусологии - культуральным методом выделения вирусом и методом ПЦР как в группе пациентов с клиническими при- знаками гриппа, так и у практически здоровых людей. Таким образом, предлагаемый ме- тод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, по точности приближается к культуральному методу детекции вирусов, который является стандартом вирусологиче- ской диагностики. Пример 3. Получение тест-системы для диагностики герпеса 1 типа
Берут амниотическую жидкость после инфицирования куриного эмбриона вирусом герпеса (штамм Л-2) и инкубирования до накопления максимального количества вируса в известных стандартизованных условиях, очищают известными методами содержащийся там вирус герпеса, концентрируют его путем диализа. К полученному концентрату добав- ляют раствор трипсина с расчетом, чтобы соотношение фермент: белок составляло 1 : 100, оставляют в термостате при 37° С на 12 часов. Концентрацию растворимых олигопепти- дов - продуктов гидролиза определяли спектрофотометрически при 280 нм и 260 нм как описано в примере 1.
Полученную смесь олигопептидов и ДНК кипятят 10 минут, затем образовавшийся осадок негидролизованных биополимеров отделяют центрифугированием при 5g в тече- ние 20 минут. К надосадочной жидкости добавляют флюоресцеина изотиоцианата в соот- ношении к белку 1/10000, оставляют раствор при +5°С на 5 часов, затем добавляют твер- дый янтарный ангидрид в соотношении к концентрации белка 2: 1. Полученную смесь реа- гента далее используют в методе флюоресцирующих антител. Также в наборе используют конъюгированный с родамином стандартизованный бычий сывороточный альбумин.
Пример 4. Детекция инфицирования вирусом герпеса 1 типа
У пациентов, с признаками лабиальной герпесвирусной инфекции берут мазки из очага поражения, мазки лейкоцитов крови. Каждую пробу ресуспензируют в 0,9 % забу- ференном растворе натрия хлорида, центрифугируют. Процедуру ресуспендирования и ю центрифугирования повторяют трижды для очистки клеток от сопутствующих растворимых компонентов. Лейкоциты дополнительно выделяют стандартизованным ме- тодом на градиенте фиккол/ферографин. Осадок клеток отбирают микропипеткой и нано- сят на предметное стекло, другим стеклом суспензию клеток равномерно распределяют по стеклу. Дают мазку высохнуть, опускают для фиксации в раствор ацетона либо фиксиру- ют смесью Никифорова до высыхания мазка. На высушенный мазок наносят полученную в примере 3 композицию пептидов и оставляют в термостате при 37° С на 40 минут во влажной камере для предотвращения высыхания мазка. Затем мазок промывают забуфе- ренным 0,9% раствором натрия хлорида и наносят 0,1 % раствор меченного родамином бычьего сывороточного альбумина, также оставляют на 20 минут в термостате во влажной камере. Обработка меченным альбумином необходима для блокирования лишних эпито- пов клеток, не связавшихся со специфическими флюоресцирующими пептидами. Затем мазок вынимают из термостата, промывают дистиллированной водой и высушивают. Де- тектируют флюоресцирующие зеленым цветом клетки в флюоресцентном микроскопе. Инфицированные вирусом клетки флюоресцируют зеленым цветом (Фиг.2), здоровые клетки флюоресцируют красным цветом (Фиг.1). Если вместо предметного стекла исполь- зовать камеру Горяева или флюорометрическую насадку, то можно сосчитать процентное соотношение инфицированных вирусом клеток.
Для проверки работоспособности метода разработанную тест-систему проверяли в сравнительном тесте со стандартизованными и зарегистрированными РНИФ-тест- системой, ПЦР-тест-системой и клуьтуральным методом. Для детекции брали образцы у больных, находящихся на амбулаторном исследовании с жалобами на лабиальный герпес возрастом от 22 до 60 лет обоего пола.
В качестве контролей использовали стандартизованную тест-систему для реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) выявления антигенов вируса герпеса 1 типа производства «Лабдиагностика» (г. Москва, Российская Федерация), ПЦР-диагностикум ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Российская Федерация) и выделение вируса in ovo с его детекцией стандартизованным методом иммунофлюоресценции фирмы «Лабдиагности- ка». На рисунке 1 представлены результаты сравнения стандартного метода РНИФ и па- тентуемого способа.
Таблица 2.- Сравнительные результаты обследования пациентов двух групп - с кли- нически и признаками лабиальной герпесвирусной инфекцией и контрольная группа, проходящая обследование без клинических признаков лабиального гер- песа Способ Выявлено вирусный антиген в Выявлено антиген в лейкоцитах
мазке с очага поражения (Всего пациентов/выявлено/%) (Всего пациентов/выявлено/%)
Опытная Контроль (без Опытная группа (с Контроль (без клиниче- группа (с клинических клиническими призна- ских признаков лаби- клиническими признаков ла- ками лабиального гер- ального герпеса) признаками биального песа)
лабиального герпеса)
герпеса)
Патентуемый (43/43/100) (18/4/10) (43/43/100) (18/6/33)
Контрольный (43/34/34) (18/1/2,5) (43/40/93) (18/6/33)
РНИФ
Контрольный (43/102/57) (18/6/15) (43/36/84) (18/0/0)
ПЦР
Культивирование (43/43/100) (18/3/7) (43/12/28) (18/4/22)
in ovo, детекция
РНИФ
Как видно из таблицы 2, результаты анализа, полученные с помощью разработанного ме- тода наиболее близко коррелируют с методом РНИФ и культуральным методом выделе- ния вирусов, как в группе пациентов с клиническими признаками лабиального герпеса, так и у здоровых людей. Таким образом, предлагаемый метод обладает высокой чувстви- тельностью и специфичностью, по точности коррелируется с методом РНИФ.
Промышленная применимость способа и устройства.
Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении спе- цифических белков и устройство для его осуществления могут быть внедрены на фарма- цевтических и биотехнологических предприятиях без изменения технологического цикла и не требуют нового уникального оборудования или реактивов. Способ позволяет исклю- чить этап получения специфических иммуноглобулинов и соответственно отказаться от использования животных, ускорить до нескольких дней разработку тест-систем для новых и малоизученных инфекционных заболеваний, значительно удешевить стоимость произ- водства тест-систем при той же чувствительности метода при значительно большей его специфичности, метод коррелируется по специфичности и чувствительности с культу- ральным методом выделения вируса и полимеразной цепной реакцией, не требует слож- ного и дорогостоящего оборудования. Использованные источники информации
1 US Patent N 6242582 Method of detection of influenza virus and compounds for use therein // Phillip Reece, Wen- Yang Wu, Betty Jin, Guy Kripper, Keith Watson
2 US Patent N 4535057 Immunoassay employing monoclonal herpes simplex antibody and bio- tin-avidin detection system// Gordon Dressman, Cynthia Kendall
3 Патент США 5567301
4 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/79240
5 Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995.-P. 103 (Chapter 7)