Méthode de diagnostic d'une vaginose bactérienne par détection de Methanobrevibacter smithii

La présente invention concerne un diagnostic microbiologique monopléxé rapide de la vaginose bactérienne (ci-après abrégé en « VB ») c'est à dire par détection d'un seul micro-organisme et le cas échéant de façon non quantitative. Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode de diagnostic de l'état de la flore bactérienne vaginale au regard de la présence d'une vaginose bactérienne (VB), le cas échéant pour le suivi de l'état de la flore bactérienne vaginale et de sa prise en charge thérapeutique. Pendant longtemps, la VB qui est une infection fréquente avec des conséquences néfastes pour la grossesse et le foetus, a été définie du point de vue microbiologique par une quasi- disparition de la flore vaginale normale composée principalement de I actoba ci I les au profit d'autres bactéries, notamment Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. et mycoplasmes génitaux [Spiegel CA, CMR

1991 ; Thorsen P, AJGO 1998] . La VB est un motif fréquent de consultation médicale, elle est notamment impliquée dans la susceptibilité aux infections sexuellement transmissibles comme le VIH, et pour les grossesses dans la prématurité et la naissance d'enfants de petit poids. Sa prévalence chez la femme, y compris durant la grossesse, se situe entre 8 et 23% [Guise JM, AJPM 2001] selon les méthodes actuelles d'investigation.

Actuellement, le diagnostic de la VB repose sur le score de Nugent et les critères d'Amsel . Le score de Nugent est la méthode la plus couramment rapportée dans la littérature, considérée par certains comme la technique de référence, même si elle n'est pas réalisée en routine dans les laboratoires de microbiologie clinique du fait du caractère fastidieux de sa mise en œuvre [Fredricks DN, N EJM 2005 ; Thomason JL, AJOG

1992 ; Ison CA, STD 2002 ; Nugent RP, JCM 1991]. Le score de Nugent identifie la VB grâce à une analyse morphologique semi-quantitative des bactéries après coloration de Gram. C'est donc une technique subjective dont la reproductibilité a été mise en cause [Sha BE, JCM 2005 ; Schwebke JR, OG 1996] . Les critères cliniques d'Amsel (pH vaginal supérieur à 4,5 ; leucorrhées grisâtres homogènes adhérentes; odeur azotée après adjonction de KOH à 10%; présence de clue-cells) représentent la seconde approche diagnostique [Amsel R AJM 1983]. Comme le score de Nugent, il est de détermination délicate et non utilisé en pratique clinique courante.

Une des limites de ces méthodes diagnostiques est l'absence d'identification de certains microorganismes impliqués dans la VB. D'une part, la détection microscopique des microorganismes par la coloration de Gram reposant sur la structure de leur paroi, les microorganismes sans paroi tels que des mycoplasmes ou de structure particulière de paroi tels que les archaea, ces derniers microorganismes ne peuvent pas être détectés par la coloration de Gram et donc leur présence n'est pas prise en compte par le score de Nugent. D'autre part, l'apport de la biologie moléculaire a permis d'identifier de nouvelles bactéries pouvant être impliquées dans la VB mais leur mise en évidence par les 2 méthodes diagnostiques existantes est impossible. Atopobium vaginae est la principale nouvelle espèce bactérienne caractérisée. Sa présence a été corrélée à la VB dans quelques articles sans toutefois qu'une appréciation quantitative fiable de sa place relative par rapport aux autres microorganismes ait été réalisée [Bradshaw CS, JID 2006, Rodriguez JM, IJSB 1999 ; Ferris MJ, BMCID 2004 ; Ferris MJ, JCM 2004 ; Verhelst R, BMCM 2004]

Dans l'article publié en 2006 par Bradshaw et col . [Bradshaw CS, JID 2006], il était notamment décrit une relation entre la détection des bactéries A. vaginae et G. vagina/is et la VB, mais ces résultats étaient insuffisants pour réaliser un diagnostic de VB et/ou un suivi de l'évolution d'une VB fiables. En effet, les données présentées dans ce travail permettaient le dépistage desdites bactéries et non pas leur réelle quantification. De plus, ce dépistage a montré une bonne sensibilité, A. vaginae et G. vaginaiis étant détectées respectivement chez 96% et 99% des patientes atteintes de VB. Cependant, sa spécificité est mauvaise car A. vaginae est détectée chez 12% des patientes présentant une flore normale et G. vaginalis chez 60%. Les auteurs ont alors tenté une approche dite « semi-quantitative » en classant les charges bactériennes comme faibles ou élevées par comparaison des CT (« Cycle Treshold ») médians de détection des microorganismes au sein de tous les échantillons analysés. Ainsi, les auteurs ont estimé une charge médiane de 4 x 10 ⁵ copies pour G. vaginalis (médiane correspondant à 21 cycles) et 4 x 10 ⁶ copies pour A. vaginae (médiane à 18 cycles). Les charges élevées de G. vaginalis (>4 x 10 ⁵ ) et d'A. vaginae (>4 x 10 ⁶ ) étaient significativement plus présentes chez les patientes présentant une VB par rapport aux patientes avec une flore normale. Cependant, ces valeurs présentaient encore une mauvaise sensibilité, A. vaginae et G. vaginalis étant seulement détectées respectivement chez 49% et 71% des patientes atteintes d'une VB. De plus, 16 patientes (28%) avec une rechute de VB après traitement présentaient une concentration en G. vaginalis en dessous du seuil donné (Table 3). Quarante patientes (70%) avec une rechute de VB présentaient aussi une concentration en dessous du seuil en A. vaginae.

L'approche « semi-quantitative » des auteurs n'est donc pas applicable en tant qu'outil diagnostique et de suivi immédiat des patients. En fait, les techniques utilisées pour obtenir ces résultats étaient insuffisantes sur plusieurs points. Tout d'abord, les techniques de PCR n'étaient pas suffisamment sensibles car les cibles moléculaires amplifiaient de trop longs fragments (fragment de l'ARN 16S ribosomique de 430 paires de base pour A. vaginae et de 291 paires de base pour G. vaginalis ). Avec une séquence ciblée aussi longue, la sensibilité lors d'une réaction de PCR est faible. En outre, les techniques de PCR en temps réel utilisaient pour la détection et quantification un marquage du produit d'amplification en SyberGreen, méthode beaucoup moins spécifique que celles qui utilisent des sondes d'hydrolyse marquées qui nécessitent une triple spécificité (deux amorces plus la sonde, pou r amplifier un fragment dont la taille n'excède pas 150 paires de bases).

Enfin, deux des inventeurs de la présente invention ont mis en place un test diagnostic de VB multiplexe basé sur la détection et la quantification moléculaires d'au moins les deux bactéries Atopobium vaginae et Gardnerella vaginalis dans les prélèvements vaginaux [Bretelle F, Clin Infect Dis. 2015;60 :860-7; Ménard JP,. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010; 29 : 1547-52; labor. Obstet Gynecol. 2010; 115 : 134-40; . Clin Infect Dis. 2008;47 : 33-43 et WO 2008/062136]

En conclusion, exceptée la méthode décrite dans ces dernières références et WO 2008/062136, les techniques actuelles de diagnostic de la VB, reposent sur des critères qui sont peu fiables.

Cependant, la mise en œuvre de ce test diagnostique multipléxé et quantitatif de WO 2008/062136 suppose un ensemble complexe d'opérations de préparation des réactifs puis de réalisation et d'interprétation.

Plus particulièrement, dans WO 2008/062136, on détermine la présence d'une vaginose bactérienne ou l'échec du traitement thérapeutique en cours si les concentrations de fragments d'ADN des deux séquences spécifiques des bactéries Atopobium vaginae et respectivement Gardnerella vaginalis dans un échantillon de prélèvement de sécrétions vaginales de patiente contenant au moins 10 ⁴ cellules humaines/ml, sont telles que l'une au moins des 2 conditions a) et b) suivantes est respectée : a) la concentration Ca en dit fragment d'ADN û'Atopobium vaginae est supérieure ou égale à 10 ⁸ copies/mL, et b) la concentration Cg en dit fragment d'ADN de Gardnerella vaginalis est supérieure ou égale à 10 ⁹ copies/ml_.

Une concentration de bactérie Atopobium vaginae supérieure ou égale au seuil de 10 ⁸ permet de détecter environ 90% des vaginoses. La quantification de la bactérie Gardnerella vaginalis vient en complément dans le cas où la concentration en Atopobium vaginae serait inférieure au seuil de 10 ⁸ bactéries/ml, pour détecter une vaginose, car le seuil de détection de G. vaginalis supérieur ou égal à 10 ⁹ bactéries/mL ne permettrait à lui seul de détecter qu'environ la moitié des vaginoses. C'est pourquoi, selon cette méthode, il est nécessaire de quantifier les concentrations d'ADN pour les deux bactéries.

D'autre part, on relève que le développement d'une vaginose bactérienne est confirmé si les concentrations Ca, Cg et Cl d'au moins trois fragments de séquences spécifiques présents en une seule copie dans l'ADN des bactéries A. vaginae (Ca), G. vaginalis (Cg) et respectivement Lactobacillus sp. (Cl) dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétions vaginales de patiente sont telles que le rapport des concentrations CI/(Ca+Cg) diminue entre les 2 échantillons prélevés successivement dans le temps à intervalle de temps suffisant, de préférence au moins 1 mois.

On entend ici par « développement d'une vaginose » une aggravation d'une vaginose déjà détectée ou, dans certains cas, un risque d'apparition d'une vaginose, c'est-à-dire d'un déséquilibre ou une anomalie de la flore vaginale risquant de devenir pathologique.

De même, l'échec du traitement en cours en fonction des concentrations des séquences spécifiques présentes en une seule copie dans l'ADN des bactéries est confirmé si le rapport des concentrations CI/(Ca + Cg) diminue ou n'augmente pas entre les 2 échantillons prélevés à intervalle de temps suffisant, de préférence au moins 1 mois.

Plus particulièrement, la concentration en bactéries du genre Lactobacillus sp. vient en complément ou confirmation dans le cas où les conditions de concentrations en A. vaginae et G. vaginalis sont réunies.

De préférence, on détermine une vaginose bactérienne si lesdites concentrations sont telles que les 3 conditions suivantes sont respectées : a- concentration Ca en dit fragment d'ADN de séquence spécifique û'Atopobium vaginae supérieure ou égale à 10 ⁸ copies/mL, b- concentration Cg en en dit fragment d'ADN de séquence spécifique de Gardnereiia vaginalis supérieure ou égale à 10 ⁹ copies/ml_, et c- concentration Cl en dit fragment d'ADN de séquence spécifique de Lactobacillus sp. inférieure ou égale à 10 ⁷ copies/ml_.

Lesdites concentrations Ca, Cg ou Cl sont déterminées par amplification enzymatique de type PCR en temps réel et quantification de l'ADN desdits fragments d'ADN de séquences spécifiques des bactéries respectivement Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis et le cas échéant Lactobacillus sp, ainsi que, de préférence, d'un fragment d'ADN humain présent dans tout prélèvement biologique humain contenant des cellules.

Le but de la présente invention est de simplifier la mise en œuvre du diagnostic de laboratoire de la VB en fournissant un test monopléxé (c'est à dire par détection d'un seul micro-organisme) et si possible non- quantitatif.

En continuant à investiguer les microorganismes associés spécifiquement à la VB, les inventeurs ont découvert de façon surprenante qu'une archaea méthanogène dénommée Methanobrevibacter smithii et elle-seule testée parmi toutes les autres archaea methanogènes présentes chez l'homme (explicitées à l'exemple 2), était détectée dans 100% des prélèvements vaginaux obtenus chez les patientes diagnostiquées par ailleurs avec une VB et dans 0% des prélèvements vaginaux obtenus chez des patientes sans VB selon la méthode de référence par quantification de Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis et le cas échéant Lactobacillus sp décrite dans WO 2008/062136. En effet, aucune autre archaea méthanogène n'a été détectée par les techniques reposant sur l'amplification et le séquençage du gène ribosomal 16S ARN, techniques qui permettent la détection de toute espèce d'archaea méthanogène.

Ce résultat était inattendu car même si la détection de cette archaea méthanogène avait été rapporté en 1990 dans deux prélèvements vaginaux collectés chez deux patientes présentant u ne VB, les prélèvements vaginaux collectés chez une autre patiente présentant une VB ne présentait pas toutefois d'archaea dans cette publication [Belay N, J Clin Microbiol. 1990;28:1666-8] . Ce travail était non seulement limité dans le nombre d'échantillons étudiés, mais était aussi limité dans la méthode d'identification laquelle était purement phénotypique par simple observation visuelle des colonies mise en œuvre et ne donnant pas 100% de positivité d'association à la VB en termes de spécificité, et ne permettait pas d'induire l'utilisation de la détection de M. smithii comme un test diagnostique de la VB. Les inventeurs ont démontré selon la présente invention la possibilité d'un diagnostic microbiologique fiable, rapide et simplifié de la VB, notamment simple à mettre en œuvre en routine dans les laboratoires d'analyse microbiologique clinique et dans les points-de-soins (« point-of- care ») [Drancourt M, in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 2016 Jul; 29(3) :429-47]

Pour ce faire, les inventeurs ont élargi les études précédentes de la flore microbienne de la VB, à l'étude des archaea méthanogènes par des méthodes de détection moléculaire et de détection par culture.

Dans l'état de l'art, les différentes archaea méthanogènes détectées chez l'homme l'ont été dans les microbiotes du tube digestif et de la cavité buccale. Parmi ces 15 espèces d'archaea méthanogènes, seules 7 ont été isolées et cultivées chez l'homme (tel qu'explicité au tableau A de l'exemple 2).

Cette étude rapportée dans les exemples ci-après, a montré de façon inattendue qu'une archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii pouvait être présente dans des prélèvements vaginaux et que seuls les prélèvements vaginaux de patientes présentant une VB étaient porteurs d'une archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, alors que l'archaea M. smithii n'était jamais détectée dans les prélèvements vaginaux de femmes indemnes de VB ; et que la détection de séquence spécifique de certains gènes présents en une seule copie tels que les gènes mcrA , rpoB et 16S ARN de Methanobrevibacter smithii pouvaient constituer un test diagnostic monopléxé et non-quantitatif de la présence de M. smithii dans un prélèvement de la cavité vaginale. Ainsi, selon la présente invention il a été démontré que la présence de

Methanobrevibacter smithii est associée à une VB de façon très spécifique et significativement et que toute détection de cette archaea rend le diagnostic facile et fiable.

Plus précisément la présente invention fournit une méthode de diagnostic in vitro de la présence d'une vaginose bactérienne chez une patiente, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes suivantes dans lesquelles : a) on réalise une extraction de l'ADN total contenu dans l'échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale par une méthode apte à l'extraction de l'ADN des archaea méthanogènes comprenant de préférence au moins deux étapes de lyse d'ADN enzymatique et/ou mécanique, et b) on détermine la présence d'une vaginose bactérienne si l'on détecte dans l'ADN extrait dudit échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale de la dite patiente, la présence de ladite séquence spécifique d'ADN humain et d'au moins une séquence d'acide nucléique spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, les concentrations des fragments d'ADN de ladite séquence spécifique d'ADN humain et de la dite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii dans ledit échantillon de prélèvement de sécrétions vaginales étant supérieures ou égales chacunes à 10 ¹ copies/ml_.

Ce seuil de 10 copies a été déterminé par des essais comparatifs avec une gamme de dilution comme explicité à l'exemple 1 ci-après.

La présente invention permet donc le diagnostic et suivi in vitro de l'état de la flore bactérienne vaginale au regard de la présence d'une vaginose bactérienne, et le cas échéant pour le suivi de son traitement thérapeutique, en détectant la présence de la seule archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii. En particulier, on détermine la présence de Methanobrevibacter smithii en détectant la présence d'au moins une séquence d'acide nucléique spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii présente en une seule copie dans la dite archaea Methanobrevibacter smithii contenue dans l'ADN extrait dudit échantillon de prélèvement de sécrétions vaginales de la dite patiente, ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii présentant une taille inférieure à 150 nucléotides.

Plus particulièrement, à l'étape b), on réalise les étapes suivantes : b. l) on effectue l'amplification enzymatique du type PCR d'au moins une dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii dans l'ADN extrait dudit échantillon de prélèvement de sécrétion vaginale, et b.2) on effectue la détection de fragments amplifiés de ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii de préférence par séquençage, par électrophorèse sur gel d'agarose ou à l'aide de sondes marquées spécifiques de la dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii de séquences distinctes de celles des dites amorces d'amplification. Plus particulièrement, on réalise une méthode dans laquelle : on réalise un protocole spécifique d'extraction de l'ADN total contenu dans le prélèvement d'origine vaginale. Ce protocole d'extraction peut être un protocole simplifié incluant l'extraction de d'ADN de Methanobrevibacter s/77 /f/7// laquelle archaea est de paroi épaisse et difficile à en extraire l'ADN ou bien un protocole standard antérieurement décrit tel qu'exposé dans les exemples 1 à 3.

Plus particulièrement, on réalise une méthode d'extraction de l'ADN total contenu dans le prélèvement d'origine vaginale incluant l'extraction de d'ADN de Methanobrevibacter smithii dans laquelle on réalise les seules étapes suivantes : 1) on effectue une lyse mécanique du dit échantillon de sécrétions vaginales, de préférence par sonication, notamment par un sonicateur à ultrasons par exemple un sonicateur Branson 2510 (Branson, Rungis, France) puissance 4 (c'est-à-dire à puissance maximale), à 50 % du cycle actif (c'est-à-dire pendant 30 secondes), et

2) on effectue une lyse enzymatique du dit échantillon, notamment à l'aide d'un extracteur d'ADN tel que l'appareil Qiagen EZ1 XL et le kit Qiagen EZ1® DNA Tissue.

De préférence, ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii présente une taille de 70 à 150 nucléotides de préférence de 90 à 120 nucléotides.

De préférence encore, on réalise des réactions d'amplification et quantification par PCR en Temps Réel, en mettant en œuvre des sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement de chacune desdites séquences spécifiques de dites bactéries et séquence spécifiq ue d'un gène humain présent dans tout prélèvement biologique contenant des cellules humaines, dans l'échantillon à tester.

La technique de PCR en temps réel, consiste en une PCR classique en utilisant des amorces de séquence directe et inverse, et comprend une détection du produit amplifié basée sur la mesure d'émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de gènes amplifiés avec une sonde dite « d'hydrolyse ». Pour cela, ladite sonde est marquée par un émetteur de fluorescence ou fluorophore en 5' et un agent bloquant l'émission de fluorescence en 3'. Cet agent bloquant absorbe la fluorescence émise lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont proches. Lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont séparés, l'émission de fluorescence n'est plus absorbée par l'agent bloquant. Lors de son passage, la Taq polymérase entraîne une hydrolyse de la sonde et donc une libération des nucléotides et du fluorophore en solution. L'émission de fluorescence sera donc proportionnelle au nombre d'amplifiat. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser une sonde hybridée sur l'ADN à copier, cette hydrolyse permettant l'émission de fluorescence, laquelle permet une quantification. Au cours de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introduisant dans le mélange réactionnel deux amorces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux autres amorces et sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec des fluorophores différents.

On entend par "séquence spécifique de ladite archaea", une séquence du génome de ladite archaea qu'on ne retrouve dans aucun autre génome d'organisme vivant. On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5' 3'.

Plus particulièrement, on réalise des réactions d'amplification et de quantification d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, comprenant une séquence spécifique de l'albumine humaine.

Plus particulièrement encore, ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii comprend ou est comprise dans un des fragments suivants :

- le fragment des positions 334632 à 334687 du gène ARN 16S ribosomal de référence GenBank NC_009515.1.

- le fragment des positions 1734995 à 1735069 du gène mcrA de la protéine methyl-coenzyme M reductase alpha subunit de 157 acides aminés et de 16,942 Da de référence GenBank AAW80308.1.

- le fragment des positions 876305 à 876370 du gène rpo de la protéine RNA polymerase subunit B de M. smithii de 186 acides aminés et de 20,836 Da de référence GenBank ABYV02000000.

Plus particulièrement, ladite séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend le fragment des positions 16283- 16423 de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine de référence Genebank M 12523.1.

Plus particulièrement, à l'étape b), on met en œuvre les étapes suivantes dans lesquelles : b. l) on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, et b.2) on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique à l'aide d'une sonde d'hydrolyse comprenant une séquence spécifique de ladite séquence spécifique de Methanobrevibacter smithii et encadrée par les séquences des dites amorces.

Plus particulièrement, on réalise des réactions de co-amplification et de quantification en mettant en œuvre deux jeux d'amorces et sondes d'hydrolyse spécifiques respectivement d'une part de ladite séquence spécifique de l'archaea Methanobrevibacter smithii, et d'autre part d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, de préférence une séquence spécifique de l'albumine humaine, et ladite séquence spécifique de l'ADN humain comprenant une séquence de dite sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme dites amorces dans une réaction d'amplification du type PCR de ladite séquence spécifique de l'ADN humain.

Plus particulièrement encore, on détermine la présence d'u ne vaginose bactérienne si, dans l'ADN extrait d'un échantillon de sécrétion vaginale de patiente, les 2 conditions a) et b) suivantes sont respectées : a) la concentration Ca en fragment d'ADN de l'albumine humaine est supérieure ou égale à 10 ¹ copies/ml, et b) la concentration Cm en dit fragment d'ADN spécifique de Methanobrevibacter smithii est supérieure ou égale à 10 ¹ copies/mL.

Plus particulièrement, ladite séquence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii est choisie parmi les séquences suivantes incluant des séquences sondes (soulignées) encadrées par des séquences amorces (en gras) ou leurs séquences reverses et complémentaires pour les amorces anti-sens:

- pour la séquence 16S ARNr:

SEQ.ID. n°2 = 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTCCCGTCAGAATCGTTCC

AGTCAGCTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3' (cette séquence SEQ.ID. n°2 a été décrite dans l'article de Dridi B, . PLoS One 4(9) :e7063) ;

- pour la séquence du gène mcrA\

SEQ.ID. n°3 =

5’- GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGGARGCACCKAACAMCATGGACACWGTCCG TAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3' (cette séquence SEQ.ID. n°3 a été décrite dans l'article de Vianna Oral Microbiology and Immunology, 24(5), pp. 417-422).

- pour la séquence rpoB :

SEQ.ID. n°4 =

5'- AAGGGATTTGCACCCAACACATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG

GACCACAGTTAGGACCCTCTGG-3' (cette séquence SEQ. ID. n°4 a été décrite dans l'article de Dridi B, PLoS One 4:e7063).

Dans l'écriture de ces séquences, la spécificité large de certaines enzymes ou encore la dégénérescence du code génétiq ue implique qu'on doit indiquer quelquefois dans les séquences des lettres correspondant à plusieurs bases azotées différentes pour le même nucléotide présent à une position. Dans le cas dans notre séquence mcrk : R correspond à une purine soit A soit G; K (kéto) correspond à G ou T ; M correspond à A ou C et W (weak) correspond à A ou T. Avantageusement encore, on réalise des réactions d'amplification et de quantification en mettant en œuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hydrolyse spécifiques de ladite archaea Methanobrevibacter smithii, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, telle que une séquence spécifique de l'albumine humaine, et ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme amorce dans une réaction d'amplification du type PCR desdites séquences spécifiques.

On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter et de la quantifier de façon spécifique grâce à la mesure de l'accroissement de la fluorescence liée de la réaction de PCR.

La sonde permet de détecter l'ADN spécifique amplifié et de le quantifier.

On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymérase amplifiera dans la réaction de PCR. Plus particulièrement, ladite séquence de l'exon 12 du gène de l'albumine humaine spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester comprend la séquence du listage de séquence suivante ou la séquence complémentaire:

SEQ.ID.n°l = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATCATCGTTTAAGAG T AAT ATT G C AAAACCT GTC AT G CCCAC AC AAAT CTCTCCCTG G CATTGTTGTCTTT GCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCTCCCATGAGTTT-3'

Plus particulièrement encore, on met en œuvre les jeux d'amorces et de sondes choisis le cas échéant parmi les séquences suivantes du listage de séquence annexé à la présente description, ou respectivement leurs séquences complémentaires : - pour le gène 16S ARNr :

Amorce 5': SEQ.ID.n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3'

Amorce 3': SEQ.ID.n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3'

Sonde: SEQ.ID.n°7 = 5'- CCGT CAG AAT CGTT CCAGT CAG -3' - pour le gène mcrA :

Amorce 5': SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3'

Amorce 3': SEQ.ID. n°9 = 5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3'

Sonde: SEQ.ID. n°10 = 5'- ARGCACCKAACAMCATGGACACWGT-3'

- pour le gène rpoB : Amorce 5': SEQ.ID. n°ll = 5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3'

Amorce 3': SEQ.ID. n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'

Sonde: SEQ.ID. n°13 = 5'- ATTTGGTAAGATTTGTCCGAATG-3'

- pour l'albumine humaine :

Amorce 5': SEQ.ID. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'

Amorce 3': SEQ.ID. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3'

Sonde: SEQ.ID. n°16 = 5'-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3'

La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile pour la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic d'une vaginose selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins :

- des réactifs permettant l'extraction de l'ADN total contenu dans un échantillon d'origine vaginale, ainsi que

- un jeu d'amorces spécifiques d'au moins une sequence d'ADN spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii et de préférence, au moins une sonde spécifique de la dite sequence spécifique de ladite archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii, et

- des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type PCR. Plus particulièrement, une trousse de diagnostic selon l'invention comprend :

- au moins un jeu d'amorces et de sondes de séquences choisies parmi les 3 jeux de séquences SEQ.ID. n°5 à 7, SEQ. ID. n°8 à 10 et SEQ.ID. n°l 1 à l3, et

- au moins un jeu d'amorces et de sonde de séquences SEQ. ID. n°14 à 16.

Les séquences SEQ. ID. N°1 à 16 décrites ci-dessus sont spécifiées dans le listage de séquences annexé à la présente description.

A la position correspondant à un nucléotide K, M, R, W ou T dans les séquences SEQ. ID. N° 3, 8 et 10, on trouve, dans les séquences cibles complémentaires, des nucléotides variables comme défini ci-dessus.

Les oligonucléotides de séquences SEQ. ID. N°3, 8 et 10, sont donc mis en œuvre, en fait, sous forme de mélanges équimolaires d'oligonucléotides de séquences différentes, lesdits oligonucléotides de séquences différentes répondant pour chaque séquence SEQ. ID. N°3 8 et 10 aux diverses définitions possibles des séquences respectivement N°3 8 et 10, à savoir :

- un mélange équimolaire de 32 séquences différentes pour SEQ. ID. N°3 pour lesquelles M (présent deux fois) est A ou C à chaque fois, R est A ou G, K est G ou T et W est A ou T,

- un mélange équimolaire de 2 séquences différentes pour SEQ. ID. N°8 pour lesquelles M est A ou C,

- un mélange équimolaire de 16 séquences différentes pour SEQ. ID. N°10 pour lesquelles M est A ou C, R est A ou G, K est G ou T et W est A ou T.

Ces mélanges équimolaires d'oligonucléotides sont obtenus en mettant en œuvre, lors de la synthèse oligonucléotidique, des mélanges équimolaires des différents nucléotides concernés. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de l'exemple de réalisation en référence au listage de séquence et aux figures suivantes, dans lesquelles : - les figures IA à IC représentent les détections par électrophorèse sur gel d'agarose des produits d'amplification PCR du gène 16S ARNr de Methanobrevibacter smithii (figures IA et IB) et du gène mcrA de Methanobrevibacter smithii (figure IC) dans des échantillons vaginaux, en présence de témoins négatifs, selon un procédé d'extraction simplifié de l'ADN selon la présente invention de l'exemple 1, et les figures 2A et 2B, représentent les détections par électrophorèse sur gel d'agarose des produits de PCR du gène 16S ARN ribosomal de Methanobrevibacter smithii (figure 2A) et du gène mcrA de Methanobrevibacter smithii (figure 2B) dans des échantillons vaginaux, en présence de témoins négatifs, selon un procédé d'extraction standard de l'ADN selon la présente invention de l'exemple 2.

EXEMPLE 1. Extraction rapide de l'ADN de Methanobrevibacter smithii pour amplification PCR standard à partir de prélèvements vaginaux. Dans cet exemple, l'extraction d'ADN a été faite à partir d'une suspension de Methanobrevibacter smithii calibrée à 10 ² unités formant colonies (colony-forming-units,CFUs) suivant le protocole ci-dessous.

Une première étape de sonication a été faite pendant 30 minutes en utilisant le sonicateur à ultrason Branson 2510 (Branson, Rungis, France) puissance 4, à 50 % du cycle actif , suivi d'une deuxième étape de lyse enzymatique de la paroi de Methanobrevibacter smithii et de la purification d'ADN en utilisant la carte V 1.066069118 Qiagen DNA bacteria contenue dans l'appareil Qiagen EZ1 XL et le kit Qiagen EZ1® DNA Tissue en suivant les instructions du fournisseur (Qiagen, Les Ulis, France). Dans cet exemple, une portion du gène ribosomal 16S de Methanobrevibacter smithii a été amplifiée par PCR standard à partir de prélèvements vaginaux en utilisant une méthode simplifiée d'extraction de l'ADN total, telle qu'explicité dans cet exemple.

Les réactions en chaîne de Polymérase (PCR) ont été réalisées dans un thermocycleur automatique PTC-200 (MJ Research, Waltham, MA, USA) incluant 50 pL de MIX (mélange) de PCR comportant : 25 pL de réactif d'amplification « amplitaq gold » (Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France) ; 17 pL d'eau distillée RNAse free (Sigma Aldrich, Saint- Quentin-Fallavier, France) ; amorce sens ( amorce 5')20 pM 1,5 pL ; Amorce Reverse 20 pM 1,5 pL et 5 pL d'ADN extrait. Le programme PCR dépend des amorces utilisées. Pour l'amplification du gène 16S RNA archaea le programme comprend : une 1ère étape de 95° C pendant 15 minutes ; 3 étapes de 40 cycles 95°C pendant 30 secondes, 57°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 minute ; et une dernière étape 72 °C pendant 5 minutes. Pour le gène mcrA archaea méthanogènes, le programme comprend : une 1ère étape de 95° C pendant 15 minutes ; 03 étapes de 40 cycles 95°C pendant 1 minute, 57°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 minute ; et une dernière étape 72 °C PENDANT 5 minutes. Les produits de PCR sont par la suite migrés sur un gel d'agarose 1,5 % (BIO-RAD, Marnes-la-Coquette, France) pendant 20 minutes à 135 volt. Pour confirmer qu'il s'agit bien de Methanobrevibacter smithii, un séquençage des amplifiats est réalisé comme suit : les réactions de séquençage sont effectuées en utilisant le kit de séquençage « BigDye Terminator vl.l « selon les instructions du fabricant (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tous les produits PCR ont été séquencés dans les deux directions, en utilisant les mêmes amorces que celles utilisées pour les PCR, dans un thermocycleur automatique PTC-200 (MJ Research, Waltham, MA, USA) avec une étape initiale de dénaturation de 1 min à 96°C suivie de 25 cycles de 10 secondes à 96°C, 5 secondes à 50°C et de 3 minutes à 60°C. Les produits séquencés ont été purifiés à l'aide des plaques Millipore MultiScreen à 96 puits (Merck, Molsheim, France) contenant 5% de Sephadex G-50 (Sigma-Aldrich, L'isle d'Abeau Chesnes, France). Les séquences sont par la suite analysées sur un analyseur génétique ABI PRISM 31309 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Après que tous les produits de la PCR ont été séquencés à l'aide du logiciel ChromasPro rhttp://technelvsium .com.au/wp/chromaspro/ ^' ) les différents fragments sont assemblés et comparés aux séquences disponibles dans la base de données GenBank en utilisant le programme BLAST en ligne du NCBI. Les résultats montrent que l'ADN ainsi extrait est de qualité suffisante pour permettre de détecter M. smithii par PCR.

La figure IA présente une électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% dans lequel on a fait migrer les produits d'amplification par PCR standard de cinq échantillons El à E5 positifs pour la présence de Methanobrevibacter smithii montrant une bande au poids moléculaire attendu de 700 paires de bases, en présence de témoin négatif qui est resté négatif. La colonne de droite notée « M. taille » correspond au marqueur de poids moléculaire. Ensuite, pour mesurer la sensibilité de ce nouveau protocole d'extraction d'ADN, les inventeurs ont testé ce protocole sur différentes concentrations de Methanobrevibacter smithii (de 10 ¹ à 10 ⁶ CFU/mL. Les figures IB et IC présentent deux gels d'agarose à 1,5% dans lesquels on a fait migrer les produits d'amplification de différentes concentrations de l'ADN de Methanobrevibacter smithii par PCR standard. Les amplifiais obtenus montrent une bande au poids moléculaire attendu de 700 paires de bases pour le produit d'amplification du gène ribosomal 16S ARN et une bande au poids moléculaire attendu de 560 paires de bases pour le produit d'amplification du gène mcrk, en présence de témoin négatif qui est resté négatif. La colonne de droite notée « M. taille » correspond au marqueur de poids moléculaire. Sur la Figure IB, on montre la révélation des produits de PCR ciblant le gène ribosomal 16S ARN de Methanobrevibacter smithii par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies n° 1 à 6 correspondent à 10 ¹ - 10 ⁶ CFUs de Methanobrevibacter smithii ; T- : Témoin négatif ; et MT : marqueur de taille. Sur la Figure IC, on montre la révélation des produits de PCR ciblant le gène mcrk de Methanobrevibacter smithii par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies n° 1 à 6 correspondent à 10 ¹ - 10 ⁶ CFUs de Methanobrevibacter smithii ; T- : Témoin négatif ; et MT : marqueur de taille.

Exemple 2 : essais comparatifs d'extraction d'ADN

M. smithii possède une paroi cellulaire extrêmement solide qui est médiocrement lysée par les protocoles d'extraction d'ADN utilisés en routine diagnostique expliquant l'échec de détection moléculaire de M . smithii en routine. Il convient de mettre en œuvre des protocoles alternatifs de lyse de la paroi cellulaire de M. smithii tels que l'un des deux protocoles respectivement présentés dans les essais comparatifs suivants.

Trois méthodes d'extraction d'ADNs de méthanogènes ont été testées sur 10 suspensions de Methanobrevibacter smithii à 10 ³ UFC et sur 10 échantillons de selles humaines. Les 3 méthodes ont été réalisées comme suit :

Méthode 1 : Le protocole automatisé implique l'extraction de l'ADN à l'aide de l'extracteur EZ1 Advanced XL avec la carte Qiagen ADN V 1.066069118 et suivant les indications du kit de tissu ADN EZ1® (Qiagen, Courtaboeuf, France) décrit par le fabricant.

Méthode 2 : le protocole d'extraction d'ADN manuelle utilise le kit «NucleoSpin Tissue Mini Kit» (Macherey-Nagel, Hoerdt, France) suivant les étapes suivantes : 0,3 g de poudre de verre (B106 mm, Sigma, Saint- Quentin Fallavier, France) sont ajoutés à 250 pL d'échantillon suivi d'une lyse mécanique dans un appareil FastPrep BIO 101 (Qbiogene, Strasbourg, France) pendant 2 min à vitesse 6,5. Ensuite, 200 pL de tampon de lyse et 20 pL de protéinase K (20 mg/mL) sont ajoutés aux échantillons qui sont par la suite incubés pendant 12 heures à 56°C. Après 12 heures d'incubation, vient une autre lyse mécanique à vitesse 6,5 pendant 2 minutes. Le lysat récupéré est traité selon les recommandations du fabriquant. L'ADN est élué dans 100 pL de tampon d'élution puis stocké à - 20°C. Méthode 3 : Une première étape de sonication a été faite pendant 30 minutes en utilisant le sonicateur à ultrason Branson 2510 (Branson, Rungis, France) puissance 4, à 50 % du cycle actif, suivi d'une deuxième étape en utilisant le protocole automatisé : extracteur ADN EZ1 avec la carte V 1.066069118 Qiagen DNA bacteria et le kit Qiagen EZ1® DNA (Qiagen, Courtaboeuf, France).

Les 3 méthodes ont été comparées selon les concentrations d'ADN présentent dans les échantillons, mesurées en utilisant le dosage en nanodrop 2000 ThermoSCIENTIFIC et une PCR quantitative ciblant 16S RNAr M. smithii.

RESULTAT

Tableau 1 concentrations d'ADN M. smithii obtenues avec les 3 méthodes mesurées avec le NANODROP 2000

Concentrations d'ADN ng/pL

N° échantillon Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3

1 5 22 19

2 10 32 36

3 12 31 47

4 13 26 33

5 9 28 46

6 6 25 23

7 8 27 35

8 15 42 22

9 12 28 48

10 13 33 32

Moyenne

10,3 29,4 34,1

. (ng/jiiL) _.

Tableau 2 : résultats qPCR M. smithii obtenus avec les 3 méthodes sur les suspensions de M. smithii.

résultats obtenus avec qPCR (Ct) sur suspension de M.smithii

N° échantillon Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3

1 0 32,56 30,45

2 0 32.08 30.07

3 39.56 30.54 28.45

4 37,56 30,65 31,65 5 0 29,09 27,86

6 0 29.57 32.65

7 0 31 54 29.76

8 37,09 33.43 33.65

9 0 30.43 28.76

10 0 30.45 30.02

moyenne (et) 31,034 30,32

Tableau 3 : résultats qPCR M. smithii obtenus avec les 3 méthodes sur les échantillons de selles.

résultats obtenus avec qPCR (Ct) sur

échantillons de selles

N° échantillon Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3

1 0 39,65 37,05

2 0 34,9 34.56

3 0 38,87 37.45

4 0 39,56 39,89

5 0 37,78 33. 12

6 0 40,65 38.45

7 42,65 38,76 37.56

> 42

moyenne (et) 27,17 25,80

Interprétation : La méthode 3 combinant une lyse mécanique par sonication suivi d'une lyse enzymatique est celle qui apporte le meilleur rendement d'extraction, la méthode 2 avec deux méthodes de lyse mécanique est une méthode intermédiaire et la méthode 1 avec une seule lyse enzymatqiue ne peut pas être valablement utilisée.

EXEMPLE 3. Détection de séquences spécifiques de Methanobrevibacter smithii dans des prélèvements vaginaux de patientes par amplification et séquençage.

Un total de 77 des femmes enceintes, suivies pour leur grossesse, ont été recrutées à l'hôpital de La Conception à Marseille. Un consentement éclairé est la condition nécessaire à l'inclusion. Les prélèvements ont été réalisés au niveau du cul de sac vaginal postérieur sous spéculum stérile non lubrifié et sans antiseptique. Quatre prélèvements sont réalisés pour chaque femme : deux prélèvements par écouvillon coton sur tube sec (Copan innovation®, Brescia, Italie) et deux prélèvements par cytobrosse (Scrinet® 5,5 mm, laboratoire C.C. D. international, Paris, France). Un écouvillon coton standard est utilisé pour l'état frais et la culture bactérienne. Un second est placé dans un milieu de transport spécifique (RI Urée-Arginine LYO 2, BioMérieux SA, Marcy l'Etoile, France) pour la recherche des Mycoplasmes génitaux ( M . hominis et M. urealyticum ). Une cytobrosse est utilisée pour l'étalement sur lame et coloration de Gram. Une seconde pour l'extraction de l'ADN aux fins d'amplification moléculaire est transportée dans 500 pL de milieu de transport MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Elle est congelée à -80°C dés son arrivée au laboratoire jusqu'à son utilisation. Après analyses microbiologiques appropriées telles que précédemment décrites dans le brevet WO 2008/062136], 15 patientes ont été diagnostiquées avec une vaginose bactérienne selon les critères rappelés dans ce brevet et 62 patientes ont été diagnostiquées sans vaginose bactérienne.

La détection moléculaire de séquences spécifiques de l'archaea méthanogène M. smithii a été réalisée par PCR standard après une extraction de l'ADN selon un protocole standard . En pratique, le protocole d'extraction d'ADN utilise le kit « NucleoSpin Tissue Mini Kit » (Macherey- Nagel, Hoerdt, France) modifié de la façon suivante : 0,3g de poudre de verre (B106 mm, Sigma, Saint-Quentin Fa 11 a vie r, France) sont ajoutés à 250 pL d'échantillon suivi d'une lyse mécanique dans un appareil FastPrep BIO 101 (Qbiogene, Strasbourg, France) pendant 2 min à vitesse 6,5. Ensuite, 200 pL de tampon de lyse et 20 pL de protéinase K (20 mg/mL) sont ajoutés aux échantillons qui sont par la suite incubés pendant 12 heures à 56°C. Après 12 heures d'incubation, vient une autre lyse mécanique à vitesse 6,5 pendant 2 minutes. Le lysat récupéré est traité selon les recommandations du fabriquant. L'ADN est élué dans 100 pL de tampon d'élution puis stocké à - 20°C. L'analyse des données de la littérature, et des séquences déposées dans le site « GenBank »

(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/Genbank/GenbankSearch. html) permet de prendre connaissance des séquences disponibles pour chacun des microorganismes cibles. La spécificité des amorces, et des fragments des séquences cibles de chacun des microorganismes choisis sont testées pour leur spécificité sur le site Internet NBCI fhttp : //WWW. ncbi. nlm. nih.aov/BLAST/ ^' )·

Les inventeurs ont sélectionné des cibles sur l'archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii. Les cibles retenues sont localisées sur la séquence du gène codant pour l'ARN ribosomal 16S, sur le gène mcrA et sur le gène rpoB. Une séquence située dans l'exon 12 du gène de l'albumine humaine est choisie afin d'attester de la présence et de la quantité d'ADN dans l'échantillon testé. Pour Methanobrevibacter smithii et l'albumine humaine une sonde, un couple amorce sens et anti-sens sont choisies sur les séquences cibles précédemment définies en utilisant le programme Primer 3® (http://frodo.wi. mit edu/primer3/primer3_code . html). Les amorces sont décrites ci- après. Chaque amorce est analysée sur le site Internet N BCI (http://WWW. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/) pour s'assurer de leur spécificité in si/ico.

Pour le gène 16S ARNr :

Amorce 5' : SEQ.ID. n°5 = 5'- CCGGGTATCTAATCCGGTTC -3'

Amorce 3' : SEQ.ID. n°6 = 5'- CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA -3' - Pour le gène mcrA :

Amorce 5' :SEQ.ID. n°8 = 5'-GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG- 3'

Amorce 3' :SEQ.ID. n°9 = 5'- CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA -3'.

Pour le gène rpoB :

Amorce 5' :SEQ.ID. n°l l = 5'-AAGGGATTTGCACCCAACAC- 3'

Amorce 3' : SEQ.ID. n°12= 5'- GACCACAGTTAGGACCCTCTGG -3'

Pour l'albumine humaine : Amorce 5': SEQ.ID. n°14 = 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'

Amorce 3':SEQ.ID. n°15 = 3'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3'

Afin de tester la spécificité des amorces et du protocole de PCR, l'ADN extrait de souches bactériennes de référence représentatives de la flore de la cavité vaginale selon la liste suivante : Bacteroides nordii, Propionibacterium avidum, Clostridum irregular, Clostridum massiiioamazoniensis, Clostridum butyricum, Clostridum beijerinckii, Bacteroides thetaiotaomicron, Propionibacterium acnés, Finegoidia magna, Bacteroides fragiiis, Staphyiococcus au reus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coii, Klebsiella oxytoca, Streptococcus agaiactiae, Serratia marcescens, Enterococcus faecaiis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mitis, Staphyiococcus epidermidis, Morganeiia morganii, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae,Bacillus circula ns, Neisseria meninigitidis, Streptococcus pneumoniae, Staphyiococcus hominis, Acinetobacter baumanii, Haemophiius infiuenzae a servi à faire des PCR pour confirmer la spécificité des amorces utilisées.

Tous les témoins négatifs testés sont négatifs en PCR. Sur les 77 échantillons analysés, 62 échantillons qui correspondent à des prélèvements à partir de flore vaginale normale sont négatifs en PCR et 15 échantillons qui correspondent à des prélèvements de vaginose sont positifs en PCR. Les PCR sont suivies d'un séquençage des amplifiats. L'analyse des séquences obtenues a montré une identité de 100% avec le fragment homologue du gène 16S ARN ribosomal de référence de Methanobrevibacter smithii strain NVD (accession NCBI : LT223565) confirmant que seule cette archaea méthanogène a été retrouvée dans les échantillons vaginaux prélevés chez des femmes enceintes diagnostiquées avec une vaginose bactérienne (Figure 2A, Figure 2B et Tableau 1). En effet, il y a actuellement 15 archaea méthanogènes listées au tableau A ci-après détectées chez l'homme dont 7 espèces (en gras dans le tableau A) sont cultivées. Il était donc nécessaire d'utiliser une méthode de séquençage permettant d'identifier sans ambigüité que, parmi ces 15 espèces, seule l'archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii était détectée.

Tableau A.

Sur la figure 2A, on montre la révélation des produ its de PCR 16S ARN ribosomal archaea (échantillons de vaginose) par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies E.V1 à E.V11 : échantillons de vaginose ; T- : Témoin négatif ; et MT : marqueur de taille.

Sur la figure 2B, on montre la révélation des produits de PCR ciblant le gène mcrA méthanogène (échantillons de vaginose) par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5 %. Les voies E. l à E.12 : échantillons de vaginose ; T- : Témoin négatif ; et MT : marqueur de taille.

Tableau 1. Détection de la présence de M. smithii par PCR standard ciblant les gènes 16S rARN et mcrA pour 77 échantillons. FN = Flore normale ; VB= Vaginose bactérienne.

EXEMPLE 4. Détection de Methanobrevibacter smithii dans des prélèvements vaginaux de patientes par amplification et détection par sonde par PCR en temps-réel. Dans cet exemple, la même collection de prélèvements vaginaux testés dans l'exemple 3, a été testée pour la présence de Methanobrevibacter smithii par PCR temps-réel ciblant les gènes 16S A R N r , mer A et rpoB.

La détection moléculaire de l'archaea méthanogène Methanobrevibacter smithii a été réalisée par PCR temps réel après une extraction de l'ADN selon un protocole tel que décrit dans l'exemple 3 avec les amorces et sondes suivantes.

Après extraction d'ADN, un ensemble de réactions en chaîne polymérase à temps réel ont été réalisées comme suit. Un mix de 20 pL (mélange réactionnel) a été préparé avec 10 pL de mix (Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, France) ; de l'eau distillée (Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France), une sonde 5 pM ; une amorce sens (amorce 5') 20 pM 0,5 pL ; une amorce anti-sens (amorce 3') 20 pM 0,5 pL, de l'uracile dna glycosylase 0,5 pL et 5 pL d'ADN extrait. Les réactions de PCR sont réalisées dans l'appareil Stratagene MX3000P (BIO- RAD, Marnes-la-Coquette, France) suivant le programme suivant : 50°C à 2 minutes, 95°C pendant 5 minutes, 02 étapes à 39 cycles (95°C pendant

5 secondes et 60°C pendant 30 secondes). Tous les témoins négatifs testés sont négatifs en PCR réel. Sur les 77 échantillons analysés, 62 échantillons qui correspondent à des prélèvements à partir de flore vaginale normale sont négatifs en PCR temps réel (Ct > 39) et 15 échantillons qui correspondent à des prélèvements de vaginose sont positifs en PCR temps réel (Ct < 39)

(Tableau 2). Le « CT », mesure le nombre de cycles qui fournit un résultat positif, plus le CT est petit plus la quantité d'ADN amplifiée est grande.

Tableau 2. Détection de la présence de M. smithii par PCR temps réel ciblant le gène ribosomal 16S ARN pour 77 échantillons. FN = Flore normale ; VB= Vaginose bactérienne. N/A= Non amplifié (Ct > 39), Ct= Cycle seuil.

Les résultats selon la présente invention démontrent que la détection de Methanobrevibacter smithii est parfaitement discriminante pour le diagnostic de vaginose bactérienne.

L'originalité de la présente invention est de pouvoir proposer pour la première fois un outil simple pour le diagnostic de la VB basé sur la détection moléculaire de Methanobrevibacter smithii.

Par ailleurs, la spécificité de la détection moléculaire ici décrite conduit à comprendre que la détection d'un ou de plusieurs antigènes spécifiques de M. smithii par toute méthode appropriée; ainsi que la détection de la présence de méthane dans la cavité vaginale ou à partir d'un prélèvement de la cavité vaginale par toute méthode appropriée constituent aussi des méthodes de diagnostic de la vaginose bactérienne, pourrait constituer un test diagnostic monopléxé et non-quantitatif de la présence de M. smithii dans un prélèvement de la cavité vaginale entrant dans le champ de la présente invention, en particulier une méthode de détection d'un ou plusieurs antigènes spécifiques de M. smithii notamment par immunodétection à l'aide d'anticorps spécifiques ou méthode colorimétrique.

On comprend également que cette méthode diagnostique de la VB permet le suivi pour l'évaluation la prise en charge thérapeutique de la VB durant la grossesse.

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