La présente invention concerne un dispositif d'évaluation de l'activité coagulante sanguine d'un échantillon biologique, jetable après usage unique, et les procédés de mise en oeuvre de ce dispositif. On entend par "activité coagulante sanguine", la capacité qu'ont certains facteurs sanguins et tissulaires d'agir de concert dans le but de former une substance polymérisée et colmatante appelée caillot de fibrine.

Les évaluations de l'activité coagulante sanguine se font, en général, en mesurant le temps nécessaire à la formation du caillot de fibrine lorsque l'on met une dose de sang ou de plasma dans des conditions particulières.

L'évaluation la plus courante est celle appelée temps de prothrombine (TP) encore nommée taux de prothrombine ou temps de Quick (TQ.) dont l'utilisation principale est la surveillance des patients recevant un médicament anticoagulant comme par exemple l'acénocoumarol, la fluindione, la warfarine. Chez ces patients, il est important de contrôler périodiquement que la dose administrée est suffisante pour prévenir la formation récurrente de caillots (thrombose) mais aussi pas trop élevée pour prévenir des phénomènes de saignements spontanés. Le temps de prothrombine fournit des informations permettant un meilleur contrôle de la dose d'anticoagulant administrée.

D'autres évaluations de l'activité coagulante sanguine existent comme par exemple le temps de céphaline activé (TCA), le dosage du fîbrinogène, le temps de thrombine (TT), le thrombotest

d'OWREN.

Chacune de ces évaluations de l'activité coagulante sanguine •rend compte de la contribution d'un ou plusieurs facteurs à l'activité coagulante sanguine. En ce qui concerne le taux de prothrombine par exemple, celui-ci rend compte de la contribution à l'activité coagulante des facteurs dont la synthèse est inhibée par les anticoagulants du type warfarine.

Plusieurs solutions ont été proposées pour mesurer le temps de formation du caillot lors de la détermination du temps de prothrombine. Toutes ont pour point commun d'utiliser de la thromboplastine comme réactif déclenchant la formation du caillot. Les différences entre les méthodes se situent dans les moyens mis en oeuvre pour détecter la formation du caillot de fibrine. Les différences portent aussi sur l'instrumentation utilisée et sur la nature du réactif utilisé.

Classiquement, on effectue le temps de prothrombine (TP) en mettant en contact une dose de plasma avec une dose de thromboplastine calcique liquide. La thromboplastine liquide, ne se conservant que quelques heures à quelques jours, est reconstituée avant l'emploi en ajoutant une solution aqueuse à de la thromboplastine lyophilisée. L'évaluation du temps de prothrombine (TP), comme toutes les autres évaluations de l'activité coagulante sanguine, se fait à une température constante de 37° Celsius. L'échantillon sanguin est prélevé sur un anticoagulant captant le calcium de l'échantillon (citrate). Ensuite, l'échantillon est centrifugé afin de séparer les globules rouges du plasma. Puis, on pipette une quantité non négligeable de plasma (généralement 0,1 ml) que l'on dépose dans un godet placé à 37° Celsius et on ajoute une quantité précise (généralement 0,2 ml) . de réactif déclenchant la formation du caillot, tout en assurant par agitation ou par un autre procédé, le mélange entre le plasma et le réactif déclenchant la coagulation.

Les méthodes classiques souffrent d'au moins un des inconvénients suivants : le test doit être effectué par un personnel entraîné; les réactifs utilisés ne sont pas stables longtemps une fois régénérés; il y a des difficultés de bien standardiser les méthodes; les

méthodes nécessitent l'utilisation d'une source de courant électrique, d'une thermostatisation ou d'une mesure de température, d'un chronomètre, d'un champ magnétique, d'un photomètre.

Le but de l'invention est de proposer une méthode simple et facile d'utilisation pour évaluer un ou plusieurs facteurs contribuant à l'activité coagulante sanguine.

Un autre but de l'invention est de proposer une méthode ne nécessitant pas la préparation de la solution contenant le réactif déclenchant l'activité coagulante sanguine. Un autre but de l'invention est de proposer une méthode minimisant les problèmes d'instabilité des réactifs nécessaires à l'évaluation de l'activité coagulante sanguine.

Un autre but de l'invention est de proposer une méthode qui permet un mélange intime de l'échantillon à évaluer et des réactifs nécessaires à l'évaluation de l'activité coagulante sanguine.

Un autre but de l'invention est de fournir un dispositif permettant la mesure de l'activité coagulante sanguine sur sang total sans qu'il soit nécessaire de séparer le plasma ou le sérum des globules rouges. Un autre but de l'invention est de fournir un dispositif permettant la mesure de l'activité coagulante sanguine sans qu'il soit nécessaire de thermostater le dispositif ou d'effectuer une mesure de température.

Un autre but de l'invention est de fournir un dispositif permettant la mesure de l'activité coagulante sanguine sans qu'il soit nécessaire d'utiliser une source de courant électrique.

Un autre but de l'invention est de fournir un dispositif permettant la mesure de l'activité coagulante sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un photomètre. Un autre but de l'invention est de fournir un dispositif permettant la mesure de l'activité coagulante sanguine et qui soit entièrement jetable après usage unique. Ces objectifs ainsi que d'autres décrits ci-après ont été atteints par la réalisation de dispositifs et procédés dont les caractéristiques suivent. Selon l'objet de l'invention, le dispositif comporte un élément

qui contient tous les facteurs contribuant à l'activité coagulante sanguine qu'explore le test, cet élément est le témoin d'une activité •coagulante sanguine normale, c'est-à-dire sans déficit de facteurs que l'on explore par le test, et un autre élément qui sert à évaluer le ou les facteurs contribuant à l'activité coagulante sanguine dans l'échantillon à tester.

Le dispositif conforme à l'invention, pour évaluer l'activité coagulante d'un échantillon biologique, est caractérisé essentiellement par le fait qu'il est entièrement jetable après usage unique et qu'il est constitué d'un support solide comprenant : un puits ayant un volume suffisant pour recevoir l'échantillon à tester, au fond duquel sont ménagées deux ouvertures en contact intime avec respectivement un support de migration de test et un support de migration témoin, lesquels permettent l'écoulement d'un fluide en leur sein sur une distance qui est fonction de la viscosité du fluide; un curseur, à fenêtre ou entièrement transparent, coulissant sur le support muni d'un repère et d'une graduation pour évaluer la distance parcourue par le fluide sur les supports de migration.

Le support de migration de test du dispositif de l'invention comporte au moins une zone d'imprégnation d'un réactif déclenchant la coagulation.

Le support de migration témoin comporte une zone imprégnée de facteurs nécessaires à l'activité coagulante sanguine et une zone imprégnée d'un réactif déclenchant la coagulation. Le support de migration de test peut comporter en plus une zone d'imprégnation d'une substance inerte vis-à-vis de l'activité coagulante sanguine, qui en contact avec l'échantillon, ajuste la viscosité du fluide de telle sorte qu'à la sortie de cette zone, elle soit identique à la viscosité du fluide à la sortie de la zone du support témoin imprégné de facteurs nécessaires à l'activité coagulante.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, avant ou après la zone d'imprégnation d'un réactif déclenchant la coagulation du support de test, et avant ou après la zone imprégnée d'un réactif déclenchant la coagulation du support témoin, est prévue une zone imprégnée d'un substrat de l'activité coagulante.

On peut citer à titre de substrat de l'activité coagulante le fibrinogène, d'origine humaine ou animale.

Par réactif déclenchant la coagulation, on entend le ou les facteur(s) ne faisant pas partie de ceux que l'on explore par le test mais qui sont nécessaires à l'activité coagulante qu'explore le test. La composition du réactif est ainsi différente selon le facteur exploré.

Par facteurs nécessaires à la coagulation, on entend le ou les facteur(s) qui suffisent à eux seuls à produire une activité coagulante en présence du réactif déclenchant la coagulation. L'invention sera encore illustrée de façon plus détaillée par la description qui suit à la lumière des figures 1 à 7 en annexe.

La figure 1 est une vue de dessus d'un dispositif typique de mesure de l'activité coagulante sanguine selon l'invention.

La figure 2 est une vue de dessus d'un dispositif de mesure tel que présenté sur la figure 1, indiquant la silhouette en pointillés, où le curseur mobile présent sur la figure 1 a été retiré.

La figure 3 est une vue en coupe d'un dispositif de mesure tel que présenté sur la figure 2.

La figure 4 est une vue en coupe d'un second dispositif typique de mesure de l'activité coagulante sanguine selon l'invention.

La figure 5 est une vue en coupe d'un troisième dispositif de mesure de l'activité coagulante sanguine selon l'invention.

La figure 6 est une vue de dessus d'un dispositif de mesure bidirectionnel selon l'invention. La figure 7 est une vue de dessus d'un dispositif de mesure bidirectionnel tel que présenté sur la figure 6 où le curseur présent sur la figure 6 a été retiré.

La figure 8 est une vue de dessus d'une autre réalisation du dispositif de mesure de l'activité coagulante sanguine selon l'invention dans laquelle le curseur, analogue à celui de la figue 1, a été retiré.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dispositif peut comporter un puits 1 divisé en deux compartiments la et lb au fond desquels il y a respectivement l'ouverture 2a en regard du support de migration 3 a et l'ouverture 2b en regard du support de migration 3b.

Selon un autre mode de réalisation, le dispositif de l'invention peut être tapissé d'une membrane tampon absorbante 14 par .dessus laquelle est apposé un filtre amovible 16.

Une autre forme de dispositif conforme à l'invention et illustré aux figures 6 et 7 est constituée d'un support 170 comprenant un puits 100, apte à recevoir l'échantillon à tester, au fond duquel est ménagée une ouverture 120 en contact intime avec un support de migration 110 en deux parties disposées de part et d'autre du puits 100, permettant l'écoulement d'un fluide sur chaque portion du support de migration 110 sur une distance qui est fonction de la viscosité du fluide; un curseur 172 à fenêtre ou entièrement transparent, coulissant sur le support 170 muni d'un repère 192 et d'une graduation 174 pour évaluer les distances parcourues par le fluide sur chaque portion du support de migration 110. Une partie du support de migration 110 comporte au moins une zone 130 imprégnée d'un réactif déclenchant la coagulation et éventuellement une zone 160 d'imprégnation d'une substance inerte vis-à-vis de l'activité coagulante sanguine qui, en contact avec l'échantillon, ajuste la viscosité du fluide de telle sorte, qu'à la sortie de cette zone 160, elle soit identique à celle du fluide à la sortie de la zone 150 . L'autre partie du support de migration 110 comporte une zone 150 d'imprégnation de facteurs nécessaires à l'activité coagulante sanguine et une zone 140 d'imprégnation d'un réactif déclenchant la coagulation. Parmi les substances pouvant être utilisées dans la zone 8 du support de migration 3a ou dans la zone 160 du support de migration 110 de l'un des dispositifs définis ci-dessus, on peut citer par exemple les substances protéïques telles que l'albumine; le dextran, les polyéthylèneglycols; le saccharose. Les supports de migration 3a, 3b et 110 se présentent sous forme de bandes, de tiges ou de tubes. Les supports sous forme de bandes sont particulièrement préférés.

Si l'on se reporte aux figures 1, 2 et 3, on voit un puits 1 au fond duquel sont ménagées deux ouvertures 2a et 2b; l'ouverture 2a se trouve en regard d'un support de migration 3a et l'ouverture 2b se

trouve en regard d'un support de migration 3b. L'ensemble est disposé sur un support 4; un curseur 5 à fenêtre ou entièrement transparent permettant de voir les supports de migration, muni d'un repère 6 et d'une graduation 7, coulisse sur le support 4. Le puits 1 présente un volume suffisant pour recevoir l'échantillon à analyser et la surface entourant l'ouverture peut être courbe et s'étendre vers le bas. Les ouvertures 2a et 2b sont serties respectivement dans les supports de migration 3 a et 3b afin d'assurer l'étanchéité lors de l'écoulement du fluide. Le support de migration 3a est imprégné dans la zone 9 d'un réactif déclenchant la coagulation et peut être imprégnée dans une zone 8 d'une substance inerte vis-à-vis de l'activité coagulante sanguine comme indiqué ci-dessus. Le support de migration 3b est imprégné dans la zone 10 de facteurs nécessaires à l'activité coagulante sanguine et dans la zone 11 d'un réactif déclenchant la coagulation.

Dans ce mode de réalisation, un échantillon de sang par exemple, est déposé dans le puits 1 où il s'écoule par les ouvertures 2a et 2b. Par l'ouverture 2a, l'échantillon peut se mélanger intimement à la substance éventuellement présente en zone 8 puis migre en zone 9 où il se mélange au réactif déclenchant l'activité coagulante sanguine.

Dans la zone 9, un caillot de fibrine se forme, ce qui a pour effet d'arrêter la migration du fluide dans le support de migration 3 a d'autant plus rapidement que le caillot s'est formé. La distance de migration est reliable à l'activité coagulante de l'échantillon. Par l'ouverture 2b, l'échantillon se mélange intimement aux facteurs de la coagulation de la zone 10, ce qui permet d'avoir en sortie de zone 10 un fluide ayant une activité coagulante normale; c'est-à-dire une activité coagulante qui correspond à celle d'un échantillon biologique où il n'y a pas de déficit en facteur exploré par le test. Cette activité sert de référence interne au dispositif selon l'invention. En sortie de zone 10, le fluide rencontre la substance présente dans la zone 11; un caillot de fibrine se forme, ce qui entraîne un arrêt de migration du fluide présent dans la zone 11. Lorsque les migrations des fluides ont cessé en zone 9 et 11, on déplace le curseur 5 de sorte à amener le repère 6 à l'extrémité du front de migration du fluide présent dans le

support de migration 3b, puis on lit sur la graduation 7 en vis-à-vis du front de migration du fluide présent dans le support de migration 3 a, la •valeur de l'activité coagulante sanguine correspondant à l'échantillon biologique testé. Dans le mode de réalisation présenté sur la figure 4, on voit un puits 1 divisé en deux compartiments la et lb au fond desquels il y a respectivement l'ouverture 2a en regard du support de migration 3 a et l'ouverture 2b en regard du support de migration 3b. Certains facteurs nécessaires à l'évaluation correcte de l'activité coagulante sanguine peuvent se trouver indifféremment dans les compartiments la et lb et dans les supports de migration 3a et 3b. Dans ce mode de réalisation, qui est une variante de celui présenté sur la figure 3, on dépose une partie de l'échantillon à analyser dans le compartiment la et une autre partie de l'échantillon dans le compartiment lb. Grâce aux deux compartiments, les échantillons rencontrent des substances nécessaires à l'évaluation de l'activité coagulante sanguine dans les compartiments la et lb et dans les supports de migration 3a et 3b, sans qu'il y ait de mélange entre le fluide présent en la et le fluide présent en lb. Dans le mode de réalisation de la figure 5, le fond du puits 1 est tapissé d'une membrane tampon absorbante 14 par dessus laquelle est apposée un filtre amovible 16. Le filtre amovible 16 retient sélectivement les globules rouges et laisse passer le plasma ou le sérum en quantité suffisante pour évaluer l'activité coagulante sanguine. Au fond du puits 1 se trouvent les ouvertures 2a et 2b respectivement en regard des supports de migration 3a et 3b.

Dans ce mode de réalisation, on dépose une quantité de sang dans le puits 1 au-dessus du filtre 16; on attend un temps suffisant que les globules rouges soient séparés puis on retire le filtre 16 et on ajoute dans le puits 1, par dessus la membrane tampon 14, une quantité déterminée de solution contenant un marqueur comme par exemple des particules colorées en suspension colloïdale. Ces particules sont suffisamment fines pour traverser la membrane 14 et migrer par les ouvertures 2a et 2b dans les supports de migration 3 a et 3b. Le mélange fluide-particules rencontre les substances présentes en zones

8 et 10 puis gagne les zones 9 et 11 où il rencontre les réactifs déclenchant la coagulation. Lorsque les caillots de fibrine sont formés dans les zones 9 et 11, les fluides s'arrêtent de migrer. La lecture des fronts de migration grâce au curseur 5 est facilitée par la coloration des fluides par le marqueur qui est pris en masse par les caillots de fibrine.

Dans le mode de réalisation présenté sur les figures 6 et 7, on y voit un support 170, fabriqué en matériau résistant à l'humidité, tel que le plastique, sur lequel est déposé sur une partie de la surface, un support de migration 110 en matière hydrophile, ou rendu hydrophile, présentant un volume et une porosité suffisante pour assurer une bonne migration des fluides. Un puits 100 apte à recevoir l'échantillon à analyser est en rapport avec le support de migration 110 par l'ouverture 120. Le support de migration 110 est imprégné de plusieurs réactifs : dans une zone 160, il peut y avoir une substance inerte vis-à- vis de l'activité coagulante sanguine telle qu'indiquée ci-dessus; dans la zone 150, il y a des facteurs nécessaires à l'activité coagulante et de même nature que ceux que l'on veut évaluer dans l'échantillon à tester. Les zones 130 et 140 contiennent chacune un réactif déclenchant l'activité coagulante sanguine.

Dans ce mode de réalisation, un échantillon, par exemple, du sang total, est introduit directement dans le puits 100; l'échantillon pénètre par l'ouverture 120 dans le support de migration 110 puis migre en bidirectionnel. Le fluide arrête de migrer dans la zone 130 lorsque le caillot de fibrine est formé. Dans la zone 150, l'échantillon se mélange intimement aux substances présentes puis il migre vers la zone 140 où il se mélange au réactif déclenchant la coagulation. Le fluide arrête de migrer lorsque le caillot de fibrine est formé.

Pour évaluer l'activité coagulante dans l'échantillon à tester, on déplace le repère 192 du curseur 172, où une fenêtre est ménagée, en vis-à-vis du front de migration du fluide présent dans la zone 140 puis on lit le motif de la zone 180 en vis-à-vis du front de migration du fluide et l'on reporte le repère 192 sur le même motif présent en zone 190. Enfin, on lit sur la graduation 174 la valeur de l'activité de l'échantillon à tester.

Dans le mode de réalisation de la figure 8, les supports de migration 3a et 3b comportent des zones 8, 10, 9 et 11 comme dans les ^• réalisations précédemment décrites, mais les zones 9 et 11 sont raccourcies pour ménager dans les supports de migration des zones 20 et 21 qui sont imprégnées de fibrinogène. Ces zones 8, 9, 10, 11, 20 et

21 sont en fait réalisées par des portions de support distinctes qui sont juxtaposées.

Selon la présente invention, les supports de migration des différents types de dispositifs d'évaluation sont fabriquées dans un certain nombre de matières qui englobent, sans y être limitées, les matières cellulosiques comme par exemple le papier WHATMAN E T 31, la nitrocellulose; les matières plastiques comme le polypropylène, les polyéthylènes comme par exemple les polyéthylènes de haut poids moléculaire, les polysulfones, les fluorures de polyvinylidène, les polyuréthanes, les nylons, la mélamine; les matières minérales comme les fibres de verre. Tous ces matériaux présentent un diamètre moyen de pores allant de 0,45 à 130 μm et de préférence de 20 à 60 μm. La porosité de la bande de migration peut être contrôlée et l'on connaît bien dans l'art antérieur les procédés à utiliser pour obtenir un gradient de porosité d'une extrémité à l'autre du support de matière poreuse.

En ce qui concerne le filtre 16 amovible destiné à retenir des particules comme par exemple les globules rouges de l'échantillon à évaluer, il est constitué de matières qui englobent, sans y être limitées, les fibres de verre, un mélange de fibres de verre avec des matières plastiques et/ou des matières cellulosiques.

Le puits 1 capable de recevoir l'échantillon dont on veut évaluer l'activité coagulante, est de préférence en matière plastique imperméable aux liquides. Les matières plastiques sont particulièrement utiles et commodes à employer mais on peut également utiliser du papier traité par des substances hydrophobes ou bien du métal.

La membrane absorbante 14 est fabriquée dans un certain nombre de matières poreuses capables d'absorber un volume suffisant d'échantillon après un passage à travers le filtre 16. Les matériaux

dont est composée la membrane 14 englobent, sans y être limités, les matières cellulosiques comme par exemple le papier WHATMAN CHR l , •les matières plastiques comme par exemple les polyéthylènes de haut poids moléculaire, le polypropylène, les polyuréthanes, la mélamine et présentent un diamètre moyen de pores compris dans l'intervalle de

0,45 à 130 μm.

Tout l'ensemble puits, filtre amovible, membrane absorbante et supports de migration, est fixé sur un support en matériau solide 4 ou 170 qui constitue le support du dispositif et assure son intégrité. Ce support peut être fabriqué à partir d'une feuille de verre, de matière plastique ou en carton de papier traité, que l'on découpe aux dimensions appropriées, pour y faire tenir tout le dispositif d'évaluation de l'activité coagulante, tout en assurant une certaine commodité d'emploi pour l'utilisateur du dispositif d'évaluation. Le curseur 5 ou 172 du dispositif, est fabriqué dans des matières de même nature que celles du support autour duquel il coulisse.

En ce qui concerne la configuration générale, il est avantageux que les supports de migration présentent une faible épaisseur et un volume mort réduit au minimum, de sorte que le volume d'échantillon utilisé soit petit. L'utilisation de matériaux de migration sous forme de bandes au lieu de tiges ou de tubes est avantageuse car elle permet de traiter uniformément la matière puis de la découper aux dimensions appropriées. En ménageant des ouvertures calibrées et en faisant un contact étanche entre le puits et le support de migration, on obtient un débit de fluide constant en sortie du puits dans les supports de migration. En travaillant avec des supports de migration à gradient de porosité, on évite la perte de charge due à la tortuosité et aux frottements qui siègent au niveau des supports de migration et on assure ainsi un débit de fluide constant. En incorporant un filtre à globules rouges dans le dispositif, on peut évaluer l'activité coagulante sanguine sur plasma sans pour cela centrifuger et décanter l'échantillon; ce qui constitue un avantage lorsque la présence des globules rouges interfère avec les facteurs de l'activité coagulante que

l'on désire évaluer.

Le fait d'incorporer au dispositif un étalon interne est un des •avantages majeurs du test et l'on sait dans l'art antérieur qu'une évaluation d'activité coagulante sanguine rigoureuse doit se faire par rapport à un étalon. En outre, le fait d'évaluer dans les même conditions les activités coagulantes sanguines du patient et de l'étalon permet de s'affranchir de la viscosité qui peut varier d'un échantillon à l'autre ainsi que de la température qui peut varier d'une évaluation à une autre. Toutefois, lorsqu'on prévoit une thermorégulation du dispositif, le support témoin n'est pas nécessaire.

Les dispositifs conformes à l'invention sont entièrement jetables après usage unique.

En ce qui concerne les réactifs incorporés dans les matériaux de migration, dans tous les cas, ces réactifs sont séchés, lyophilisés ou liés par liaison covalente sur ou dans les matériaux du dispositif d'essai afin de pouvoir être reconstitués à la suite du contact avec un fluide. D'autres réactifs auxiliaires utiles pour favoriser la formation du caillot de fibrine et sa mise en évidence et par conséquent pour augmenter la sensibilité du dispositif d'essai, peuvent également être ajoutés aux réactifs précédents dans les matériaux de migration. Ces réactifs auxiliaires englobent sans y être limités, des tampons, des détergents, des anticoagulants, des colorants, des particules d'un diamètre approprié pour pénétrer librement dans les pores du matériau de migration, des protéines.

Parmi les protéines, on peut citer, outre le fibrinogène, des anticorps dirigés contre les inhibiteurs de l'activité coagulante, par exemple les anticorps dirigés contre la protéine C, les anticorps dirigés contre la thrombomoduline, les anticorps dirigés contre la protéine S, les anticorps dirigés contre le plasminogène, les anticorps dirigés conte l'inhibiteur plasmatique du facteur tissulaire (TFPI).

Certains réactifs auxiliaires peuvent occuper indifféremment le fond des puits ou les supports de migration dans les différents dispositifs selon l'invention. Le ou les supports de migration peuvent être constitués de

portions de support juxtaposés, collés ou se chevauchant pour assurer la migration des échantillons. Les portions de support peuvent porter •le(s) réactif(s) choisis pour les différentes zones que les échantillons traversent en migrant. On peut utiliser la présente invention aussi bien avec un échantillon de sang total qu'avec un échantillon de sang dilué dans une solution isotonique ou un échantillon de plasma. Lorsque l'on travaille sur un échantillon de plasma, il peut être nécessaire de visualiser le cheminement des fluides dans les bandes de migration, afin de rendre les lectures des distances parcourues aisées pour l'utilisateur. Pour cela, on peut utiliser un marqueur qui accompagne les fluides jusqu'aux fronts de migration.

Ce marqueur peut être ajouté au préalable à l'échantillon de plasma avant de déposer ce dernier dans le puits échantillon ou bien ce marqueur peut imprégner une partie des supports de migration.

Les marqueurs utilisés sont choisis préférentiellement parmi les colorants, les particules de latex, des colorants contenus dans des micro vésicules comme par exemple les liposomes, les particules de cajbone, celles-ci étant en suspension colloïdales, les particules de polystyrène ou de silice. Il est apparu avantageux d'utiliser des particules de carbone en tant que marqueur car outre l'effet qu'elles ont sur la mise en évidence du trajet des fluides, elles arment le caillot dans le support de migration et favorisent donc sa formation et sa mise en évidence. Lorsque l'on utilise un colorant affin pour les protéines, il est avantageux d'utiliser un marqueur très affin pour l'albumine comme par exemple la bilirubine.

Les exemples suivants servent à illustrer l'invention sans toutefois présenter un caractère limitatif.

EXEMPLES Exemple 1

•Préparation du dispositif évaluant le taux prothrombine (TP)

On découpe une plaque de polyéthylène de haut poids moléculaire du type INTERFLO® présentant un diamètre moyen de pores de 40 μm aux dimensions de 150 mm x 150 mm. La plaque est plongée dans de la thromboplastine calcique liquide jusqu'à ce que le front de migration atteigne 75% de la hauteur des bandes, on fait sécher à 30°C sous vide. La plaque est ensuite découpée en bandes de dimensions 150 mm x 1,5 mm. On prélève une bande de 150 mm x 1,5 mm sur laquelle on dépose dans la zone non imprégnée de thromboplastine, 5 μl d'une préparation de plasma humain non- déficient en facteurs de la coagulation dans du saccharose à 5% et contenant du déoxycholate de sodium et de l'azoture de sodium. Cette bande sert de bande témoin dans le dispositif d'évaluation de l'activité coagulante sanguine selon l'invention. Sur une plaque de matière plastique préalablement enduite d'adhésif du type 3M® on dépose une bande imprégnée uniquement de thromboplastine calcique de 150 mm x 1,5 mm et parallèlement une bande témoin telle que fabriquée ci-dessus. On dépose sur les bandes dans les zones non imprégnées de thromboplastine un puits échantillon et on assure l'étanchéité au niveau des orifices du fond du puits par thermosoudage à 130°C.

Exemple 2

On suit le même protocole que dans l'exemple 1 sauf que les réactifs déposés dans les bandes de migration sont lyophilisés comme suit.

Après imprégnation de chaque réactif, le plastique poreux est trempé dans de l'azote liquide puis déshydraté sous vide.

Exemple 3

On prépare le dispositif selon l'exemple 1. Quand on dépose une aliquote de sang total dans le puits échantillon; celui-ci migre dans les deux bandes. Les arrêts de migration sont nettement visibles

en moins de 5 minutes grâce à la coloration naturelle du sang contrastant avec le fond du support. En effet les globules rouges sont pris en masse dans le caillot de fibrine.

Exemple 4

On prépare le dispositif selon l'exemple 1. On prélève une quantité déterminée de plasma citrate que l'on mélange à une quantité déterminée d'une solution colloïdale de particule de carbone (10V/2V). On dépose une quantité du mélange (plasma-solution de particules) dans le puits échantillon. La migration des fluides est nettement visible grâce au contraste fourni par les particules de carbone qui sont emprisonnées dans le caillot de fibrine. La lecture s'effectue en moins de 5 minutes après dépôt de l'échantillon.

Exemple 5

Fabrication du dispositif d'évaluation du taux de prothrombine (T.P.) Préparation des bandes imprégnées de fibrinogène

On découpe une plaque de polyéthylène de haute densité (HDPE) de type POREX® de 0,5 mm d'épaisseur et présentant un diamètre moyen de pores de 90 μm, aux dimensions de 150 mm x 150 mm.

La plaque est immergée dans une solution de fibrinogène humain à 11 g/1 contenant du glucose à 50 g/1, du Triton X 100 à 0,1% et du tampon HEPES à 20 rnM/1. L'ensemble est mis sous agitation une nuit.

On retire la plaque et on fait sécher sous vide à 35°C pendant 12 heures.

La plaque est ensuite découpée en bande de 150 mm x 2,5 mm.

Préparation des bandes imprégnées de thromboplastine On découpe une plaque de polyéthylène de haute densité de type POREX® de 0,5 mm d'épaisseur et de diamètre moyen de pores de 30 μm aux dimensions de 150 mm x 20 mm. La plaque est incubée une nuit à 4°C dans une solution de

thromboplastine recombinante reconstituée dans des vésicules phospholopidiques et contenant du chlorure de calcium 20 mM/1, du lucose à 60 g/1 et de l'HEPES à 20 mM/1. La plaque est ensuite retirée et séchée à 35°C sous vide pendant 12 heures puis découpée aux dimensions 20 mm x 2,5 mm.

Préparation de bande imprégnée de (PPSB)

Du PPSB (extrait de plasma humain enrichi en prothrombine, proconvertine, facteur de Stuart, facteur anti- hémophilique B) en solution dans de l'HEPES 20 rrιM/1, du glucose

50 g/1 et du Triton X 100 à 0,1% est préparé.

Une plaque de polyéthylène de haute densité de type POREX® de 0,5 mm d'épaisseur, de diamètre moyen de pores de 35μm et de dimensions 150 mm x 10 mm est immergée dans la solution de PPSB préparée comme ci-dessus, pendant 12 heures à température ambiante sous agitation. La plaque est retirée, séchée à 35°C sous vide et découpée aux dimensions 10 mm x 2 mm.

Préparation du dispositif : On prend deux bandes de 150 mm x 2 mm imprégnées de fibrinogène que l'on dispose en parallèle sur un support en matière plastique rigide muni d'ergots qui permettent de coincer les bandes sans les coller sur le support rigide.

On prend deux bandes imprégnées de thromboplastine et on les dépose chacune sur le support de telle sorte que chacune d'entre elles chevauche légèrement une extrémité des bandes de fibrinogène.

On prend une bande imprégnée de PPSB de dimensions 10 mm x 2 mm que l'on dispose sur le support de telle sorte que la bande de PPSB chevauche l'extrémité d'une bande de thromboplastine. Par dessus l'ensemble on appose une autre plaque en matière plastique pourvue d'un puits à l'échantillon à deux compartiments, muni chacun d'un trou, et deux fenêtres en parallèle qui s'ouvrent sur toute la longueur des bandes de fibrinogène. Un curseur entièrement transparent et gradué de façon convenable coulisse sur le support en plastique.

Exemple 6

On Prépare le dispositif selon l'exemple 5. On prélève 50 μl de sang total au bout du doigt que l'on dilue dans 150 μl de solution aqueuse contenant du NaCl à 140 mM/1 et du citrate de sodium à

14 mM/1. Quand on dépose l'échantillon dilué de telle sorte à remplir les deux compartiments du puits; l'échantillon migre dans les deux bandes. Les arrêts de migration sont nettement visibles en moins de 15 minutes. La lecture du résultat s'effectue grâce au curseur mobile dont on place le repère en vis-à-vis du front de migration de la bande témoin puis on lit le résultat du test sur la graduation en vis-à-vis de la bande test.