[0001] 本发明涉及动物免疫细胞培养技术领域， 更具体的说， 涉及到一种自体 CIK细 胞高效扩增方法。

背景技术

[0002] 在常规的自体 CIK细胞培养过程中， 需要使用大量动物源性血清如胎牛血清、 新牛血清、 小牛血清等， 以细胞培养过程中必不可少的营养物质。 如今， 大部 分实验室仍然还在用动物源性血清来培养细胞 ， 但是随着血源的减少以及血清 价格的不断上涨， 以及来自动物保护组织的压力， 动物源性血清的使用日益受 到限制， 另外， 动物源性血清中的复杂成分会对所培养细胞照 成较多的不确定 性影响， 不能准确放映出需要的生物学特性。

技术问题

[0003] 本发明所要解决的技术问题在于： 提供一种自体 CIK细胞高效扩增方法， 解决 现有 CIK细胞扩增方法中动物源性血清会给免疫反应 带来不确定性影响的缺陷。 问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 本发明解决上述问题的技术方案为： 提供一种自体 CIK细胞高效扩增方法， 包 括如下步骤：

[0005] S100、 外周血单个核细胞的分离： 从患者血液中分离外周血单个核细胞， 悬浮 备用；

[0006] S200、 血小板聚集释放物的制备： 分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬， 获 得重悬血小板； 向所述重悬血小板中加入 80〜150 mol/L的二磷酸腺苷， 培养箱 孵育培养 2〜4小吋， 1800〜200(^离心20〜25 1^^ 收获上清成分， 直接作为含 有血小板聚集释放物的溶液使用， 或者冻干处理即得所述血小板聚集释放物；

[0007] S300、 自体 CIK细胞的培养： 将所述外周血单个核细胞小心铺入培养瓶中培 养 ， 培养吋补加 5%〜20<¾的含有所述血小板聚集释放物的无� �清培养基， 并添加 细胞因子进行诱导， 直至收获所述自体 CIK细胞。

[0008] 在本发明提供的自体 CIK细胞高效扩增方法中， 所述步骤 S100中还包括：

[0009] S101、 准备全血： 抽取肿瘤患者静脉血， 加入抗凝剂成抗凝全血备用；

[0010] S102、 外周血单个核细胞与自体血浆的分离： 使用血细胞分离机或者淋巴细胞 分离液将外周血单个核细胞从自体血浆中分离 ， 获得的外周血单个核细胞粗品

[0011] S103、 外周血单个核细胞的处理： 将所述外周血单个核细胞粗品用生理盐水或 无血清培养基洗涤两次， 20。C下 500g离心 3〜7分钟， 再用适量无血清培养基重悬

， 得到外周血单个核细胞， 备用。

[0012] 在本发明提供的自体 CIK细胞高效扩增方法中， 所述步骤 S200中使用的所述磷 酸盐缓冲液为含 Ca 2+、 Mg 2+的磷酸盐缓冲液。

[0013] 在本发明提供的自体 CIK细胞高效扩增方法中， 所述血小板聚集释放物中血小 板衍生生长因子、 转化生长因子、 类胰岛素生长因子、 表皮生长因子的含量均 大于 150 ng/g。

[0014] 在本发明提供的自体 CIK细胞高效扩增方法中， 所述步骤 S200中所述 "分离获得 血小板"的方法包括：

[0015] 取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆， 将其小心铺层到血小板分离液的上层；

800〜 1200g离心 20〜25 min， 吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。

[0016] 在本发明提供的自体 CIK细胞高效扩增方法中， 所述血小板分离液由聚蔗糖、 泛影酸、 去离子水配制而成， 密度为 1.060 g/L， 渗透压为 280 mosm/L， 0.22μηι 滤器过滤除菌后即得。

[0017] 在本发明提供的自体 CIK细胞高效扩增方法中， 所述步骤 S300中还包括：

[0018] S301、 调整细胞浓度： 用无血清培养液调整外周血单个核细胞的细胞 浓度至 lx

10 ⁶ 〜2xl0 ⁶ 个 /ml， 混合均匀后小心铺入培养瓶中；

[0019] S302、 预培养： 向培养瓶中加入 600U/m！〜 1400U/ml的 IFN-Y、 质量份数 0.5<¾〜

2%血小板聚集释放物， 培养 241！〜 48 h后；

[0020] S303、 连续培养： 补加 600U/m！〜 1400U/ml的 IL2、 600U/ml〜1400U/ml的 ILla

、 60 ng/ml〜150ng/ml的 anti-CD3后继续培养， 隔天取样计数， 补充含质量份数 0.5<¾〜 2%血小板聚集释放物的新鲜无血清培养基， 将细胞的培养密度调整至 1x10 ⁶ 〜2 xlO ⁶ 个 /ml， 直至收获所述自体 CIK细胞。

[0021] 在本发明提供的自体 CIK细胞高效扩增方法中， 所述步骤 S303中"补充含质量份 数 0.5%〜2%血小板聚集释放物的新鲜无血清培养基 "吋， 所述新鲜无血清培养基 中还含有质量份数 1%〜2%人血清白蛋白、 0.05%〜0.2<¾重组人转铁蛋白或柠檬 酸铁、 。，(^^〜(^^植物血凝素。

发明的有益效果

有益效果

[0022] 实施本发明， 具有如下有益效果： 在 CIK细胞扩增过程中使用血小板聚集释放 物替代常用的动物源性血清， 还可以添加人血清白蛋白等已知成分的营养物 质 促进 CIK细胞快速增殖， 避免了异种添加物给 CIK细胞带来的不确定性和危险性 ， 另外， 还可以明显提高 CIK细胞的增殖速度、 表型、 体外杀伤性能等。

对附图的简要说明

附图说明

[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案 ， 下面将对实施例中所需要使用 的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以 根据这些附图获得其他的附图。

[0024] 图 1为本发明自体 CIK细胞高效扩增方法较佳实施例的流程图；

[0025] 图 2 (a) 为实施例 1中培养的 CIK细胞的倒置显微镜观察图；

[0026] 图 2 (b) 为实施例 2中培养的 CIK细胞的倒置显微镜观察图；

[0027] 图 2 (c) 为实施例 3中培养的 CIK细胞的倒置显微镜观察结果图；

[0028] 图 2 (d) 为对比实施例 1中培养的 CIK细胞的倒置显微镜观察图；

[0029] 图 2 (e) 为对比实施例 2中培养的 CIK细胞的倒置显微镜观察图。

本发明的实施方式 [0030] 下面将结合本发明实施例中的附图， 对现有技术和本发明实施例中的技术方案 进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施 例， 都属于本发明保护的范围。

[0031] 在常规的 CIK细胞培养、 扩增过程中， 仍然大量的使用动物源性血清， 如胎牛 血清、 新牛血清、 小牛血清等， 但是血源的减少、 复杂成分带来的不确定性影 响， 越来越限制动物源性血清的使用， 更特别的是， 动物源性血清中复杂的抗 原活性物质对于 CIK细胞培养容易照成很多不确定性干扰， 有可能无法反应出特 异性刺激物的作用、 引起其他未知的免疫反应， 对实验研究或者实际应用中要 想排査出此种干扰或者影响需要付出较大的工 作量， 阻碍工作进度甚至照成工 作无法继续幵展。

[0032] 本发明的主要创新点在于， 在 CIK细胞培养过程中使用血小板聚集释放物替代 动物源性血清， 血小板聚集释放物物血小板聚集释放物中含有 促进 CIK细胞生长 的微量低分子营养物质和各种生长因子， 不仅利于大量收获 CIK细胞， 而且避免 了异种添加物的不确定性和危险性， 培养的 CIK细胞从细胞增殖、 表型、 体外杀 伤等方面都明显优于胎牛血清培养基和无血清 培养基。

[0033] 图 1示出了本发明自体 CIK细胞高效扩增方法较佳实施例的流程， 如图 1所示， 包括如下步骤：

[0034] S100、 外周血单个核细胞的分离： 从患者血液中分离外周血单个核细胞， 悬浮 备用； 外周血单个核细胞 （PBMCs) 进行孵育培养后， 将根据生长情况变为悬 浮细胞与贴壁细胞， 悬浮细胞经过诱导获得 CIK细胞 （cytokine-induced killer, 多种细胞因子诱导的杀伤细胞） 。

[0035] S200、 血小板聚集释放物的制备： 分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬， 获 得重悬血小板； 向所述重悬血小板中加入 80〜150 mol/L的二磷酸腺苷， 培养箱 孵育培养 2〜4小吋， 1800〜200(^离心20〜25 1^^ 收获上清成分， 直接作为含 有血小板聚集释放物的溶液使用， 或者冻干处理即得所述血小板聚集释放物。

[0036] S300、 自体 CIK细胞的培养： 将所述外周血单个核细胞小心铺入培养瓶中培 养 ， 培养吋补加 5%〜20<¾的含有所述血小板聚集释放物的无� �清培养基， 并添加 细胞因子进行诱导， 直至收获所述自体 CIK细胞。 本步骤中主要使用血小板聚集 释放物替代常规方法中的动物源性血清， 充分利用血小板聚集释放物物中含有 的微量低分子营养物质和各种生长因子， 促进淋巴细胞的生长并提高其体外杀 伤性能。

[0037] 在本发明的另一较佳实施例中， 除包括上述步骤外， 步骤 S100中还包括： [0038] S101、 准备全血： 抽取肿瘤患者静脉血， 加入抗凝剂成抗凝全血备用。 现场抽 取以制备抗凝全血， 或者直接冷藏的抗凝全血， 冷藏过程对结果影响不显著。

[0039] S102、 外周血单个核细胞与自体血浆的分离： 使用血细胞分离机或者淋巴细胞 分离液将外周血单个核细胞从自体血浆中分离 ， 获得的外周血单个核细胞粗品 。 血细胞分离机可以直接获取外周血单个核细胞 粗品， 使用淋巴细胞分离液来 分离外周血单个核细胞则会因为淋巴细胞分离 液的厂家不同而略有差异， 大体 过程为： 在离心管中加入三分之一左右的人外周血淋巴 细胞分离液， 将肿瘤患 者抗凝全血小心铺到淋巴细胞分离液的上层， 离心 （例如， 20°C， 800g离心 20分 钟） 后用巴氏吸管或移液器小心吸取 PBMCs层， 获得的外周血单个核细胞粗品

[0040] S103、 外周血单个核细胞的处理： 将外周血单个核细胞粗品用生理盐水或无血 清培养基洗涤两次， 20°C下 500g离心 3〜7分钟， 再用适量无血清培养基重悬， 得 到外周血单个核细胞， 备用。

[0041] 在本发明的另一较佳实施例中， 步骤 S200中血小板聚集释放物物的制备方法包 括有分离血小板之后的孵育培养， 具体包括：

[0042] 分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬， 获得重悬血小板， 磷酸盐缓冲液有 2 种， 一种没有钙、 镁离子， 另一种含有钙、 镁离子， 本发明优选的使用含 Ca 2+ 、 Mg 2+的磷酸盐缓冲液可以更好的促进血小板孵育� ��养， 促进释放血小板中的 细胞因子。 向重悬血小板中加入 80〜150

μηιοΙ/L的二磷酸腺苷， 培养箱孵育培养 2〜4小吋， 培养温度 37°C。 孵育培养过程 中血小板聚集并释放血小板中的细胞因子， 提高血小板聚集释放物物对于淋巴 细胞的促生长能力。 孵育培养完成后在 1800〜2000g离心 20〜25 min， 去除血小 板膜、 纤维蛋白、 细胞碎片等， 收获上清成分。 特别需要说明的是， 该上清成 分可以直接作为含有血小板聚集释放物物的溶 液使用， 也可以经过冻干处理后 得到血小板聚集释放物物。

[0043] 在本发明的另一较佳实施例中， 步骤 S200中分离并获得血小板的方法为密度离 心分离， 具体包括：

[0044] 取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆， 将其小心铺层到血小板分离液的上层； 800〜1200g离心 20〜25 min， 吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。 血 小板分离液主要由聚蔗糖、 泛影酸、 去离子水配制而成， 密度为 1.060 g/L， 渗透 压为 280 m _OS m/L， 0.22μηι滤器过滤除菌后即得。 通过密度离心分离可去除血浆 中航的红细胞、 白细胞及绝大部分血浆成分， 获得纯度很高的血小板。 当然， 上述分离并获得血小板的方法只是示例性而非 限制性， 现有技术中分离并获得 血小板的方法也可用于本发明中， 只要能够获得的血小板纯度足够、 血小板保 持完整不破裂。

[0045] 在本发明的另一较佳实施例中， 步骤 S300中还包括：

[0046] S301、 调整细胞浓度： 用无血清培养液调整外周血单个核细胞的细胞 浓度至 lx 10 ⁶ 〜2xl0 ⁶ 个 /ml， 混合均匀后小心铺入培养瓶中；

[0047] S302、 预培养： 向培养瓶中加入 600U/m！〜 1400U/ml的 IFN-Y、 质量份数 0.5<¾〜

2%血小板聚集释放物， 培养 241！〜 48 h后； 使用 CO ₂ 培养箱进行上述中预培养， 培养条件可以选择 37°C， C0 ₂ 浓度 5%。

[0048] S303、 连续培养： 补加 600U/m！〜 1400U/ml的 IL2 (白细胞介素 -2) 、 600U/ml 〜1400U/ml的 ILla (白细胞介素 -la) 、 60 ng/ml〜150ng/ml的 anti-CD3 (CD3单 克隆抗体） 后继续培养， 隔天取样计数， 补充含质量份数 0.5%〜2%血小板聚集 释放物的新鲜无血清培养基， 将细胞的培养密度调整至 1><10 6〜2><10 6个/ ₁ ^， 直 至收获所述自体 CIK细胞。 此步骤中补充含质量份数 0.5%〜2%血小板聚集释放 物的新鲜无血清培养基以补充细胞合成所需营 养物质， 但是数量不宜频繁， 该 新鲜无血清培养基中还含有质量份数 1%〜2%人血清白蛋白、 0.05%〜0.2<¾重组 人转铁蛋白或柠檬酸铁、 0.05<¾〜0.1<¾植物血凝素。 血小板裂解物富含维持淋巴 细胞指数生长的生长因子、 基础培养基中没有或量很少的营养物、 以及主要的 低分子营养物， 配合易于被淋巴细胞利用的人血清白蛋白、 重组人转铁蛋白或 柠檬酸铁， 可以完全替代动物源性血清作为淋巴细胞培养 的营养物质， 另外， 植物血凝素 （PHA) 能促使淋巴细胞转化为淋巴母细胞， 继而分裂增殖， 释放 淋巴因子， 并能大幅提高淋巴细胞的杀伤作用。

[0049] 实施例 1

[0050] 外周血单个核细胞的分离：

[0051] 使用血细胞分离机或者淋巴细胞分离液将外周 血单个核细胞从自体血浆中分离 ， 获得的外周血单个核细胞粗品； 将外周血单个核细胞粗品用生理盐水洗涤两 次， 20°C下 500g离心 3分钟， 再用适量无血清培养基重悬， 得到外周血单个核细 胞， 备用。

[0052] 血小板聚集释放物的制备：

[0053] 将聚蔗糖和泛影酸融入去离子水中， 调整密度为 1.060g/L， 渗透压为 280mosm/ L， 0.22μηι滤器过滤除菌， 备用。 取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆， 将其小 心铺层到血小板分离液的上层； 800g离心 25 min， 吸取淋巴细胞分离液和血浆 之间的血小板层；

[0054] 分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬， 获得重悬血小板， 向重悬血小板中加 入 80 mol/L的二磷酸腺苷， 培养箱孵育培养 4小吋， 1800g离心 25 min， 收获上 清成分， 直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用， 或者冻干处理即得血小 板聚集释放物。

[0055] 自体 CIK细胞的培养：

[0056] 用无血清培养液调整外周血单个核细胞的细胞 浓度至 1x10 6个 /ml， 混合均匀后 小心铺入培养瓶中；

[0057] 向培养瓶中加入 600U/ml的 IFN-Y、 质量份数 0.5%血小板聚集释放物， 培养 24h 后；

[0058] 补加 1400U/ml的 IL2、 600U/ml的 ILla、 60 ng/ml的 anti-CD3后继续培养， 隔天 取样计数， 补充含质量份数 2%血小板聚集释放物的新鲜无血清培养基， 将细胞 的培养密度调整至 1x10 ⁶ 个 /ml， 直至收获自体 CIK细胞。

[0059]

[0060] 实施例 2 [0061] 外周血单个核细胞的分离：

[0062] 使用血细胞分离机或者淋巴细胞分离液将外周 血单个核细胞从自体血浆中分离 ， 获得的外周血单个核细胞粗品； 将外周血单个核细胞粗品用无血清培养基洗 涤两次， 20°C下 500g离心 7分钟， 再用适量无血清培养基重悬， 得到外周血单个 核细胞， 备用。

[0063] 血小板聚集释放物的制备：

[0064] 将聚蔗糖和泛影酸融入去离子水中， 调整密度为 1.060g/L， 渗透压为 280mosm/ L， 0.22μηι滤器过滤除菌， 备用。 取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆， 将其小 心铺层到血小板分离液的上层； 1200g离心 20 min， 吸取淋巴细胞分离液和血浆 之间的血小板层；

[0065] 分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬， 获得重悬血小板， 向重悬血小板中加 入 150 mol/L的二磷酸腺苷， 培养箱孵育培养 2小吋， 2000g离心 20 min， 收获上 清成分， 直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用， 或者冻干处理即得血小 板聚集释放物。

[0066] 自体 CIK细胞的培养：

[0067] 用无血清培养液调整外周血单个核细胞的细胞 浓度至 2x10 6个 /ml， 混合均匀后 小心铺入培养瓶中；

[0068] 向培养瓶中加入 1400U/ml的 IFN-Y、 质量份数 2%血小板聚集释放物， 培养 48 h 后；

[0069] 补加 600U/ml的 IL2、 1400U/ml的 ILla、 150ng/ml的 anti-CD3后继续培养， 隔天 取样计数， 补充含质量份数 0.5%血小板聚集释放物、 2%人血清白蛋白、 0.2%重 组人转铁蛋白、 0.05%植物血凝素的新鲜无血清培养基， 将细胞的培养密度调整 至 2x10 ⁶ 个 /ml， 直至收获自体 CIK细胞。

[0070] 实施例 3

[0071] 外周血单个核细胞的分离：

[0072] 使用血细胞分离机或者淋巴细胞分离液将外周 血单个核细胞从自体血浆中分离 ， 获得的外周血单个核细胞粗品； 将外周血单个核细胞粗品用生理盐水或无血 清培养基洗涤两次， 20°C下 500g离心 4分钟， 再用适量无血清培养基重悬， 得到 外周血单个核细胞， 备用。

[0073] 血小板聚集释放物的制备：

[0074] 将聚蔗糖和泛影酸融入去离子水中， 调整密度为 1.060g/L， 渗透压为 280mosm/ L， 0.22μηι滤器过滤除菌， 备用。 取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆， 将其小 心铺层到血小板分离液的上层； lOOOg离心 22 min， 吸取淋巴细胞分离液和血浆 之间的血小板层；

[0075] 分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬， 获得重悬血小板， 向重悬血小板中加 入 ΙΟΟ μηιοΙ/L的二磷酸腺苷， 培养箱孵育培养 3小吋， lOOOg离心 23 min， 收获上 清成分， 直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用， 或者冻干处理即得血小 板聚集释放物。

[0076] 自体 CIK细胞的培养：

[0077] 用无血清培养液调整外周血单个核细胞的细胞 浓度至 1.5x10 ⁶ 个 /ml， 混合均匀 后小心铺入培养瓶中；

[0078] 向培养瓶中加入 900U/ml的 IFN-Y、 质量份数 1%血小板聚集释放物， 培养 36 h后

[0079] 补加 1000U/ml的 IL2、 900U/ml的 ILla、 100ng/ml的 anti-CD3后继续培养， 隔天 取样计数， 补充含质量份数 0.7%血小板聚集释放物、 1%人血清白蛋白、 0.05% 柠檬酸铁、 0.1%植物血凝素的新鲜无血清培养基， 将细胞的培养密度调整至 2x1 0 ⁶ 个 /ml， 直至收获自体 CIK细胞。

[0080] 效果验证

[0081] 对比实施例 1中采用含 10%胎牛血清 1640、 对比实施例 2中采用 AIM-V无血清培 养基用于 CIK细胞的培养， 培养条件与实施例 1-3完全相同。

[0082] 1细胞增殖情况

[0083] 在培养条件完全相同的情况下， 经过 14天的培养， 使用台盼蓝染色检测或细胞 计数仪： 标准为活细胞在 80%以上。

[0084] 图 2示出了培养的 CIK细胞的倒置显微镜观察图， 图 2 (a) 〜图 2 (e) 分别示出 了实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2所培养的 CIK细胞 ， 对比可知， 使用本发明培养方法培养出的 CIK细胞从表面形态上观察就明显优 于对比实施例。

[0085] 实验计数结果包括总细胞数、 CD8+、 细胞存活率。

[0086] 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中总细胞数分别为 1.

03x10 ¹⁰ 、 1.12x10 ¹⁰ 、 1.21x10 ¹⁰ 、 0.89x10 ¹⁰ 、 0.80x10 ¹⁰ ；

[0087] 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中 CD8+分别为 0.73 χ10 ¹⁰ 、 0.84x10 ¹⁰ 、 0.97x10 ¹⁰ 、 0.50x10 ¹⁰ 、 0.51x10 ¹⁰ ;

[0088] 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中细胞存活率分别 为 98.4<¾、 97.5%、 99.5% 95.1% ^ 92.7<¾。

[0089] 对比实验计数结果可知， 使用本发明培养方法培养出的 CIK细胞， 在总细胞数

、 CD8+、 细胞存活率上都明显优于对比实施例。

[0090] 2流式细胞仪检测细胞表面 CD8+,CD3+, CD8+IFN- _Y +等分子的表达。

[0091] 检测对象包括 CD8+、 CD3+、 CD8+IFN-y+、 CD107a。

[0092] 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中 CD8+分别为 70.6 %、 75.2%、 80.5%、 56.4%、 64.2%；

[0093] 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中 CD3+分别为 90.5 %、 92.1%. 92.4%、 90.2% 88.2%；

[0094] 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中 CD8+IFN-Y+分别 为 45.6%、 55.2%、 43.8%、 21.4%、 19.3%；

[0095] 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中 CD107a分别为 20.

1%、 17.2% 15.3<¾、 8.2% 9.3<¾。

[0096] 对比可知， 使用本发明培养方法培养出的 CIK细胞， 在细胞表面分子的表达上 都明显优于对比实施例。

[0097] 3细胞杀伤实验： 以 DC-CIK细胞为效应细胞， 以肿瘤细胞 (可为原代肿瘤细胞 或肿瘤细胞株)为靶细胞， 将效应细胞与靶细胞按 10:1、 20:1、 30:1 (E:T为两者数 目比)的比例加入 96孔 U型板中， 每孔含靶细胞 1x10 ⁴ 个， 终体积为 200ml， 设 3 个复孔。 培养 4h后， 离心吸取培养上清， 用乳酸脱氢酶 (LDH)试剂盒检测效应 细胞对靶细胞的杀伤率， 同吋设置空白对照， 靶细胞对照， 效应细胞对照。 每 孔数值减去空白孔对照， 求出复孔的平均值。 按照下面公式计算效应细胞的细 胞毒活性， 以杀伤率 （<¾) 表示：

[0098] 杀伤率 =靶细胞对照值- (实验孔值 -效应细胞对照值） /靶细胞对照值 χ100%。

[0099] 按照此方法分别检测实施例 1〜3配置的完全培养基、 对比实施例 1〜2中的培养 基获得的自体肿瘤特异性细胞对肝癌细胞系 HEPG2以及 B细胞白血病 K562的杀 伤率。 实验重复 6次， 取平均值。

[0100] 实验结果包括 E:T=10:1、 E:T=20:1、 E:T=30:1三种情形下肝癌 HEPG2与白血病

K562为靶细胞的细胞杀伤实验结果。

[0101] 当 E:T=10:1吋， 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中 肝癌 HEPG2的杀伤结果分别为 35.4<¾、 30.5%、 35.7%、 30.7%、 25.6%； 实施例 1

、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例中白血病 K562的杀伤结果分别为 28.2%、 35.1

%、 40.0%、 28.5%、 26.5%；

[0102] 当 E:T=20:1吋， 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中 肝癌 HEPG2的杀伤结果分别为 51.5<¾、 46.4% ^ 52.5% ^ 45.7% ^ 40.5%； 实施例 1

、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例中白血病 K562的杀伤结果分别为 52.4%、 55.8

%、 60.4%、 38.2% 40.5%；

[0103] 当 E:T=30:1吋， 实施例 1、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例 1、 对比实施例 2中 肝癌 HEPG2的杀伤结果分别为 68.2<¾、 72.5% ^ 80.1%^ 60.1%^ 55.8%； 实施例 1

、 实施例 2、 实施例 3、 对比实施例中白血病 K562的杀伤结果分别为 72.5%、 78.6

%、 81.2%. 57.5%、 65.0<¾。

[0104] 4收获细胞前， 取少量培养物进行细菌、 真菌培养， 并检测支原体、 衣原体， 及内毒素 (标准： 病原学检测阴性， 内毒素 <5 Eu)。

[0105] 检测得知本发明实施例 1〜3和对比实施例中各项指标都不超标。