Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD ⁺ /NADH und NADP ⁺ /NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (= Produktbildungsreaktionen) einer der beiden

Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form.

Stand der Technik

Enzymkatalysierte Redoxreaktionen werden in industriellen Prozessen beispielsweise in der Herstellung von chiralen Alkoholen, α-Aminosäuren und α-Hydroxysäuren verwendet. Die Mehrheit der Enzyme, die in industriellen Redoxreaktionen zum Einsatz kommen, verwendet Kofaktoren wie NADH oder NADPH. Unter den enzymatischen Redoxreaktionen sind jene besonders interessant, bei denen die Redox-Kofaktoren durch in situ Kofaktor- Regenerierungs Systeme wiederhergestellt werden. Der Grund dafür liegt darin, dass die Verwendung von nur katalytischen Mengen der teuren Kofaktoren (NAD(P) ⁺ /NAD(P)H) möglich ist. Die Erreichbarkeit von geeigneten Dehydrogenasen und anderen Enzymen hat zur Entwicklung diverser Kofaktor-Regenerierungssysteme geführt.

Die bis jetzt beschriebenen Regenerations Systeme könnte man klassifizieren als:

enzymgekoppelt, substratgekoppelt, in vivo (natürliche Kofaktor-Regenerierungssysteme in lebenden Organismen), photochemisch, chemisch oder elektro-enzymatisch. Das hier beschriebene Verfahren betrifft ein enzymgekoppeltes Regenerierungs System. Vorteile von enzymgekoppelten Systemen sind die hohe Selektivität, die Anwendbarkeit zur Herstellung verschiedener Produkte und die hohe Wiederverwendungsrate des Kofaktors (total turnover number, TTN).

Mitte der 1990er Jahre wurde ein erster industrieller Prozess unter Verwendung eines enzymgekoppelten Kofaktor-Regenerierungs Systems im Tonnen-Maßstab angewendet. In diesem Prozess wurde Formatdehydrogenase aus Candida boidinii eingesetzt. Die bisher bekannten industriellen Prozesse verwenden in der Regel ein Redoxenzym zur

Produktsynthese sowie ein weiteres Enzym zur Kofaktor-Regenerierung.

Davon zu unterscheiden sind Verfahren, bei denen zwei oder mehr an der Produktbildung beteiligte enzymatische Redoxreaktionen und zwei enzymatische Systeme zur Kofaktor- Regenerierung (zeitgleich oder sequentiell) in einem Reaktionsansatz ablaufen, ohne dass ein Zwischenprodukt isoliert wird. In letzter Zeit haben solche enzymatischen

Kaskadenreaktionen - hier als Ein-Topf-Reaktionen bezeichnet - signifikante

Aufmerksamkeit erregt da sie effektiv Betriebskosten, Betriebszeit und

Umweltauswirkungen reduzieren. Zusätzlich ermöglichen enzymatische Kaskaden von Redoxreaktionen Transformationen, die durch klassische chemische Verfahren nicht einfach umzusetzen sind.

Es ist allerdings eine Herausforderung, mehrere Reaktionen (Oxidation und Reduktion) in einer Ein-Topf-Reaktion mit paralleler Kofaktor-Regenerierung gleichzeitig durchzuführen, da oft sehr divergente Reaktionsbedingungen für die einzelnen Transformationen notwendig sind. Bis jetzt wurden nur sehr wenige Ein-Topf- Versuche umfassend Oxidations- und Reduktionsreaktionen mit zugehörigen Kofaktor-Regenerierungs Systemen durchgeführt.

In der Literatur (Advanced Synth. Catal., 2008, Volume 351, Issue 9, pl303-1311) wurde der Versuch einer Ein-Topf-Reaktion unter Verwendung von 7 a-

Hydroxysteroiddehydrogenase (HSDH), 7ß-HSDH und 12a-HSDH beschrieben. In dem Verfahren wurde eine sowohl regioselektive als auch stereoselektive Oxidation an den Positionen 7 und 12 von Cholsäure durchgeführt, gefolgt von einer regio- und

stereoselektiven Reduktion an Position 7. In dem Prozess wurde als Kofaktor- Regenerierungs System sowohl eine Laktatdehydrogenase (NAD ⁺ -abhängig) als auch eine Glukosedehydrogenase (NADP ⁺ -abhängig) verwendet. Als Kosubstrate wurden Pyruvat und Glukose verwendet. Obwohl dieses Verfahren ursprünglich auf einen echten Ein-Topf- Prozess abzielte, wurden letztendlich Oxidations- und Reduktionsreaktion getrennt ausgeführt. Dabei erfolgte die Aufteilung von oxidativen und reduktiven Schritten entweder in einem sogenannten„TeebeuteP'-Reaktor oder im Membranreaktor. Diese Aufteilung war notwendig, um aufgrund der niedrigen Kofaktor-Selektivität von NADPH- Glukosedehydrogenase die Produktion von Nebenprodukten zu vermeiden. In der Ein-Topf- Reaktion setzte die Glukosedehydrogenase NADP ⁺ aber teilweise auch NAD ⁺ um, was die Oxidation behinderte. In dem beschriebenen Prozess wurden nur 12,5 mM (-0,5%) des Substrats Cholsäure eingesetzt, was den Prozess ökonomisch uninteressant macht.

Es wurde weiterhin ein Versuch beschrieben, die Deracemisierung von Racematen sekundärer Alkohole über ein prochirales Keton als Zwischenprodukt unter Verwendung eines Ein-Topf-Systems durchzuführen (J. Am. Chem. Soc, 2008, Volume 130, pl3969- 13972). Die Deracemisierung von sekundären Alkoholen wurde über zwei

Alkoholdehydrogenasen (S- und R-spezifisch) mit unterschiedlicher Kofaktor-Spezifizität erreicht. In dem System wurde NADP durch NADPH Oxydase (Wasserestoffperoxyd produzierende) und NADH durch Formiatdehydrogenase regeneriert. Als Kosubstrate wurden Formiat und Sauerstoff verwendet. In dem System wurden 4 Enzyme ohne

Aufteilung von oxidativen und reduktiven Schritten eingesetzt. Ein Nachteil des Verfahren ist die sehr geringe Konzentration des eingesetzten Substrats von 0,2-0,5%, was für industrielle Zwecke nicht geeignet ist.

Ein weiteres Ein-Topf-System wurde in WO 2009/121785 A2 beschrieben. In dem

Verfahren wurde ein Stereoisomer eines optisch aktiven sekundären Alkohols zum Keton oxidiert und dann zum entsprechenden optischen Antipoden reduziert, wobei zwei

Alkoholdehydrogenasen mit entgegengesetzten Stereoselektivitäten und unterschiedlichen Kofaktor- Spezifitäten verwendet wurden. Die Kofaktoren wurde mittels eines sogenannten „Hydrid-Transfer-Systems" unter Verwendung nur eines zusätzlichen Enzyms regeneriert. Um die Kofaktoren zu regenerieren wurden verschiedene Enzyme wie z.B.

Formiatdehydrogenase, Glukosedehydrogenase, Lactatdehydrogenase verwendet. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Konzentration der verwendeten Substrate.

Der Nachteil der bis jetzt bekannten enzymatischen Ein-Topf-Verfahren mit Kofaktor- Regenerierungs Systemen ist insgesamt die sehr geringe Substratkonzentration, was für industrielle Prozesse unwirtschaftlich ist. Im Gegensatz dazu sind bereits viele einzelne enzymatische Redoxreaktionen bekannt, bei denen Kofaktor-Regenerierungs Systeme verwendet werden. Die Versuche wurden mit ganzen Mikroorganismen, Zell-Lysaten oder isolierten Enzymen mit gleichzeitiger

NAD(P)H- oder NAD(P) ⁺ -Regenerierung beschrieben. Bekannte enzymatische Kofaktor- Regenerierungs Systeme für einzelne Redoxreaktionen beinhalten beispielsweise

Formiatdehydrogenase für NADH (Formiat als Kosubstrat), Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas sp. für NADH (2-Propanol als Kosubstrat), Hydrogenase für NADH und NADPH (H ₂ als Kosubstrat), Glukose-6-phosphatdehydrogenase aus L. mes enter vieles für NADPH (Glukose-6-phosphat als Kosubstrat), Glukosedehydrogenase für NADH und NADPH (Glukose als Kosubstrat), NADH Oxydase für NADH (0 ₂ als Kosubstrat) und Phosphitdehydrogenase für NADH (Phosphit als Kosubstrat).

Ein Anwendungsbeispiel solcher einzelner Redoxreaktionen ist die Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen ausgehend von entsprechenden prochiralen Keto Verbindungen. In diesen Verfahren wird der Kofaktor mittels eines zusätzlichen Enzyms regeneriert. Diesen Verfahren ist gemeinsam, dass sie eine isolierte Reduktionreaktion darstellen und NAD(P)H regenerieren (siehe z.B. EP 1 152 054).

Enzymatische Verfahren unter Verwendung von Hydroxysteroiddehydrogenasen gekoppelt mit Kofaktor-Regenerierungs System, die bei höheren Substratkonzentrationen (ca. >1 ) ablaufen wurden beschrieben (EP 1 731 618; WO 2007/118644; Appl. Microbiol.

Biotechnol., 2011 Volume 90 pl27-135). In den Verfahren wurden die Kofaktoren

NAD(P)H oder NAD(P) mittels verschiedene Enzyme wie zum Beispiel

Laktatdehydro genäse (Pyruvat als Kosubstrat), Alkoholdehydrogenase aus T. brockii (Isopropanol als Kosubstrat), Alkoholdehydrogenase aus L. brevis, L. minor, Leuconostoc carnosum, T. ethanolicus, Clostridium beijerinckii regeneriert. Diese bekannten Verfahren beziehen sich jedoch lediglich auf die isolierten Einzelreaktionen zur Oxidation von

Hydroxy Verbindung oder zur Reduktion von Oxo Verbindung.

Ein Kofaktor-Regenerierungs System für NADH unter Verwendung von Malatdehydrogenase („Malatenzym") wurde bereits beschrieben (Can. J. Chem. Eng. 1992, Volume 70, p 306- 312). In der Publikation wurde es zur reduktiven Aminierung von Pyruvat durch Alanindehydrogenase verwendet. Das bei der Kofaktor-Regenerierung entstehende Pyruvat wurde anschließend in der produktbildenden Reaktion eingesetzt.

In der WO 2004/022764 ist ebenfalls beschrieben, NADH durch Malatdehydrogenase zu regenerieren. Anders als in der vorher beschriebenen Publikation wurde das bei der oxidativen Decarboxylierung von Malat entstehende Pyruvat nicht weiterverwendet.

Ein Beispiel einer enzymatischen Reduktion von D-Xylose zu Xylitol mit Kofaktor- Regenerierungs System wurde beschrieben (FEBS J., 2005, Volume 272, p 3816- 3827). Als Kofaktor-Regenerierungsenzym wurde eine NADPH-abhängige Mutante von

Phosphitdehydrogenase aus Pseudomonas sp. verwendet. Auch hierbei handelt es sich um eine Einzelreaktion zur Produktbildung.

Weitere Beispiele einer enzymatischen Herstellung von chiralen enantiomerenangereicherten organischen Verbindungen, wie zum Beispiel Alkoholen oder Aminosäuren wurden beschrieben (Organic Letters, 2003, Volume 5, p. 3649-3650; US 7,163,815; Biochem. Eng. J., 2008, Volume 39(2) p. 319-327; EP 1 285 962). In den Systemen wurde als Kofakor- Regenerierungsenzym eine NAD(P)H-abhängige Oxidase aus Lactobacillus brevis oder Lactobacillus sanfranciscensis verwendet. Bei den Versuchen handelt es sich auch um Einzelreaktionen zur Produktbildung.

In WO 2011/000693 wird eine 17beta-Hydroxysteroiddehydrogenase sowie ein Verfahren beschrieben, mit dem es möglich ist, Redoxreaktionen an Position 17 von 4-Androsten-3,17- dion durchzuführen. Hierbei handelt es sich wiederum um eine isolierte Reduktionsreaktion. Es entfallen bei den genannten einzeln ablaufenden Oxidations- oder Reduktionsreaktionen die Vorteile einer Ein-Topf-Reaktion, wie z.B. Wirtschaftlichkeit durch Zeit- und

Materialersparnis sowie besserer Umsatz durch enzymatische Kaskadenreaktionen.

Aufgabenstellung und Beschreibung des Verfahrens

Ziel der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Verfahrens zur Regenerierung der Redox-Kofaktoren NAD ⁺ /NADH und/oder, z.B. und, NADP ⁺ /NADPH, um damit zwei oder mehr enzymatisch katalysierte Redoxreaktionen in einem Reaktionsansatz

wirtschaftlich durchzuführen.

Diese Aufgabe wird gemäß vorliegender Erfindung in einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, dass ein Verfahren zur enzymatischen Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD ⁺ /NADH und/oder, z.B. und, NADP ⁺ /NADPH in einer Ein-Topf- Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form,

bereitgestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist dass

a) bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine

ursprüngliche oxidierte Form überführt, Sauerstoff oder eine Verbindung der allgemeinen Formel

worin Ri für eine geradkettige oder verzweigtkettige (Ci-C ₄ )-Alkylgruppe oder für (Ci-C ₄ )-Carboxyalkylgruppe steht, reduziert wird, und

b) bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine

ursprüngliche reduzierte Form überführt, ein (C ₄ -Cg)-Cycloalkanol oder eine

Verbindung der allgemeinen Formel

worin R ₂ und R ₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, (Q-C^-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (Ci-Cö^Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere C _Ö -C ₁₂ Aryl, Carboxyl, oder (Ci-C4)-Carboxyalkyl, insbesondere auch Cycloalkyl, z.B. C ₃ -Cg Cycloalkyl,

oxidiert wird. Ein Verfahren, das gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt wird, wird hierin auch als „Verfahren gemäß (nach) vorliegender Erfindung" bezeichnet.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung zur enzymatischen Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD ⁺ /NADH und/oder, z.B. und, NADP ⁺ /NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (=Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, zur Verfügung, dass dadurch gekennzeichnet, dass

a) bei zur Regenerierung des oxidierten Kofaktors eine Verbindung der allgemeinen Formel I reduziert wird,

wobei Ri für eine substituierte oder unsubstituierte Cl-C4-Alkylgruppe steht, und b) bei der Regenerierung des reduzierten Kofaktors eine Verbindung der allgemeinen

Formel II oxidiert wird,

wobei R ₂ und R ₃ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus

1) -H,

2) -(C ₁ -C _ö )-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigtkettig ist,

3) -(C ₁ -C _ö )-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigtkettig ist und

gegebenenfalls bis zu drei Doppelbindungen enthält,

4) -Cycloalkyl, insbesondere C ₃ -Cg Cycloalkyl,

5) -Aryl, insbesondere C ₆ -C ₁₂ Aryl,

6) -(C ₁ -C ₄ )-Carboxyalkyl, falls es sich bei Verbindung I um Pyruvat handelt,

gegebenenfalls auch Carboxyl. In einem weiteren Aspekt sind in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung R ₂ und R ₃ unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, (C ₁ -C _ö )-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (C ₁ -C _ö )-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere C ₆ -C ₁₂ Aryl, Carboxyl, oder (C ₁ -C ₄ )-Carboxyalkyl.

Gegenüber dem Stand der Technik stellt ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eine wesentliche Verbesserung von Verfahren dar, bei denen Verbindungen sowohl enzymatisch oxidiert als auch reduziert werden, da es damit ermöglicht wird, die nötigen Oxidations- und Reduktionsreaktionen sowie die zugehörigen Reaktionen zur Kofaktor-Regenerierung in einem Reaktionsansatz ablaufen zu lassen und gleichzeitig wesentlich höhere

Substratkonzentrationen einzusetzen als dies im Stand der Technik der Fall ist.

In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung werden die Kofaktoren NADH und NADPH eingesetzt. Dabei bezeichnet NAD ⁺ die oxidierte Form und NADH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotid während NADP ⁺ die oxidierte Form und NADPH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat bezeichnen.

Als„Oxidationsreaktion(en)" und„Reduktionsreaktion(en)" werden hier diejenigen enzymkatalysierten Redoxreaktionen bezeichnet, die nicht Teil der Kofaktor-Regenerierung sind und in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung an der Bildung des Produkts beteiligt sind.„Oxidationsreaktion(en)" und„Reduktionsreaktion(en)" sind unter dem Begriff„Produktbildungsreaktionen" zusammengefasst. Die Produktbildungsreaktionen in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung beinhalten jeweils mindestens eine

Oxidationsreaktion sowie mindestens eine Reduktionsreaktion.

Wird NAD ⁺ als Kofaktor für die Oxidationsreaktion(en) verwendet so ist NADPH der Kofaktor für die Reduktionsreaktion(en). Wird NADP ⁺ als Kofaktor für die

Oxidationsreaktion(en) verwendet so ist NADH der Kofaktor für die

Reduktionsreaktion(en) . In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können Oxidationsreaktion(en) und Reduktionsreaktion(en) entweder zeitlich parallel oder zeitlich nacheinander, bevorzugt zeitlich parallel im selben Reaktionsansatz durchgeführt werden.

Als Substrate werden hier diejenigen Verbindungen bezeichnet, die mit dem Ziel der Produktbildung eingesetzt werden. Als Kosubstrate werden hier diejenigen Verbindungen bezeichnet, die bei der Kofaktor-Regenerierung umgesetzt werden.

In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können sowohl ein Substrat, als auch mehrere Substrate eingesetzt werden. Dabei können Reduktions- und/oder

Oxidationsreaktion(en) sowohl am selben Substrat (Molekülgrundgerüst), als auch an verschiedenen Substraten, bevorzugt am selben Substrat, erfolgen. Weiterhin können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung Reduktions- und/oder Oxidationsreaktion an derselben oder an verschiedenen funktionellen Gruppen stattfinden.

Ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eignet sich für eine Vielzahl von Reaktionen, beispielsweise zur Konfigurationsumkehr stereoisomerer Hydroxyverbindungen mittels Oxidation zum entsprechenden Keton und darauffolgender Reduktion zur entgegengesetzt stereospezifischen Hydroxy Verbindung.

Unter„Ein-Topf-Reaktion" wird hier ein Verfahren bezeichnet, bei dem zwei oder mehr an der Produktbildung beteiligte enzymatische Redoxreaktionen und zwei enzymatische Systeme zur Kofaktor-Regenerierung in einem Reaktionsansatz ablaufen, ohne dass ein Zwischenprodukt isoliert wird.

Die Nennung einer Säure oder des Salzes einer Säure schließt hier den jeweils nicht genannten Begriff ein. Ebenfalls schließt die Nennung von Säuren, insbesondere

Gallensäuren, hier alle davon abgeleiteten Ester mit ein. Weiter sind hier (partiell) mit Schutzgruppen versehene Verbindungen bei der Nennung der zugrundeliegenden Substanzen mit eingeschlossen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass Oxidationsreaktion und

Reduktionsreaktion zeitlich parallel ablaufen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sowohl Oxidationsreaktion als auch Reduktionsreaktion am selben Molekülgrundgerüst stattfinden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel I (2- Oxosäure) Pyruvat (Kosubstrat) eingesetzt wird, welches mittels einer Laktatdehydrogenase zu Laktat reduziert wird, das heisst, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form überführt mittels einer

Laktatdehydrogenase Pyruvat zu Laktat reduziert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel II

(sekundärer Alkohol) 2-Propanol (Isopropylalkohol, IPA) (Kosubstrat) eingesetzt wird, welches mittels einer Alkoholdehydrogenase zu Aceton oxidiert wird, das heisst, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt mittels einer Alkoholdehydrogenase 2-Propanol zu Aceton oxidiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass Sauerstoff eingesetzt wird, welcher mittels einer NADH Oxidase reduziert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als sekundärer Alkohol Malat

(Kosubstrat) eingesetzt wird, welches mittels einer Oxalacetat-decarboylierenden

Malatdehydro genäse („Malatenzym") zu Pyruvat und C0 ₂ oxidiert wird, z.B. dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt mittels einer Malatdehydrogenase Malat zu Pyruvat und C0 ₂ oxidiert wird.

Das entstehende Pyruvat wird bei dieser Ausführungsform in einer weiteren Redoxreaktion umgesetzt, die nicht zur Produktbildung dient, sondern die zweite Kofaktor- Regenerierungsreaktion darstellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es eingesetzt wird zur Durchführung von jeweils mindestens einer Oxidationsreaktion und mindestens einer Reduktionsreaktion im selben Reaktionsansatz an Verbindungen der allgemeinen Formel

worin

R4 Wasserstoff, eine Methyl gruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe,

R5 Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder eine Methyl gruppe,

R ₆ Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe,

R ₇ Wasserstoff, -COR ₁₃ , worin R ₁₃ eine unsubstituierte oder mit einer Hydroxygruppe substituierte C ₁ -C4-Alkylgruppe ist, oder eine substituierte, insbesondere mit einer

Hydroxygruppe, oder unsubstituierte C C ₄ Carboxyalkylgruppe,

oder R ₆ und R ₇ zusammen eine Oxogruppe bedeuten,

R8 Wasserstoff, eine Methyl gruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe,

R9 Wasserstoff, eine Methyl gruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe,

Rio Wasserstoff, eine Methyl gruppe oder ein Halogen,

Rn Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder Halogen, und

R ₁₂ Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder eine Methyl gruppe bedeuten, wobei das Strukturelement

einen Benzolring oder einen Ring mit 6 Kohlenstoffatomen und 0, 1 oder 2 C-C- Doppelbindungen bedeutet;

wobei bevorzugt das Substrat/die Substrate für die an der Produktbildung beteiligte(n) Reduktionsreaktion(en) in einer Konzentration von <5 (w/v) im Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen .

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Umwandlung von Dehydroepiandrosteron (DHEA)

erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es zur enzymatischen Epimerisierung der Hydroxysteroidverbindung 3 ,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure (Chenodeoxycholsäure, CDC) der Formel

durch Oxidation zu Ketolithocholsäure (KLC) der Formel

und nachfolgende Reduktion zur stereoisomeren Hydroxyverbindung 3a,7ß-Dihydroxy-5ß- cholansäure (Ursodeoxycholsäure) der Formel

mittels zweier entgegengesetzt stereospezifischer Hydroxysteroiddehydrogenasen erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatischen Epimerisierung von 3a,7a,12a-Trihydroxy-5ß-cholansäure (Cholsäure) der Formel

entweder

A) durch Oxidatio -Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure (12-oxo-CDC) der Formel

die weiter umgesetzt wird zur 3a-Hydroxy-7,12-dioxo-5ß-cholansäure (12oxo-KLC) der Formel

oder

B) durch Oxidation zu 3a,12a-Dihydroxy-7-oxo-5ß-cholansäure der Formel

Formel

gefolgt von enzymatischer Oxidation zur 3a-Hydroxy-7,12-dioxo-5ß-cholansäure (12oxo-KLC) der Formel XI, und nachfolgende Reduktion zur stereoisomeren

Hydroxyverbindung 3a,7ß-Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure (12-Keto- Ursodeoxycholsäure) der Formel XII,

oder

C) durch Oxidation zu 3a,12a-Dihydroxy-7-oxo-5ß-cholansäure der Formel XIII, gefolgt von enzymatischer Reduktion zur 3a,7ß,12a-Triydroxy-5ß-cholansäure der Formel

und nachfolgende Oxidation zur stereoisomeren Hydroxyverbindung 3 ,7ß-Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure (12-Keto-Ursodeoxycholsäure) der Formel XII;

oder

in irgendeiner Kombination aus A), B) und/oder C;

z.B. mittels dreier stereospezifischer Hydroxysteroiddehydrogenasen; wobei 2 der drei stereospezifischer Hydroxysteroiddehydrogenasen entgegengesetzt spezifisch sind;

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass ein C ₅ - oder C ₆ -Zucker als Substrat eingesetzt wird, z.B. dass das Verfahren zur Isomerisierung von C5- oder C _ö -Zuckern eingesetzt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass eine Isomerisierung von Glukose durch Reduktion zu Sorbitol und Oxidation zu Fruktose erfolgt, z.B. dass das Verfahren eingesetzt wird zur Isomerisierung von Glukose durch Reduktion zu Sorbitol und nachfolgende Oxidation zu Fruktose.

Ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt in einem wässrigen System durchgeführt, wobei es möglich ist, dass das Substrat für Oxidations- und

Reduktionsreaktion zum Teil ungelöst in Form einer Suspension und/oder als zweite flüssige Phase vorliegt.

In einer besonderen Ausführungsform ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat/die Substrate für die an der Produktbildung beteiligte(n) Oxidationsreaktion(en) in einer Konzentration von mindestens 5% (w/v) und mehr, bevorzugt 7% (w/v) und mehr, insbesondere bevorzugt 9% (w/v) und mehr im

Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen, z.B. 5% (w/v) bis 20% (w/v), wie 5% (w/v) bis 15% (w/v), z.B. 5% (w/v) bis 12% (w/v), wie 5% (w/v) bis 10% (w/v).

In einer besonderen Ausführungsform ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass bei den Produktbildungsreaktionen insgesamt ein Umsatz von >70%, insbesondere >90% erreicht wird.

In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann dem wässrigen System ein Puffer zugesetzt werden. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Kaliumphosphat, Tris-HCl und Glycin mit einem pH- Wert von 5 bis 10, vorzugsweise von 6 bis 9. Weiters, oder alternativ können dem System Ionen zur Stabilisierung der Enzyme, wie zum Beispiel Mg ²⁺ oder sonstige Zusätze, wie zum Beispiel Glycerin zugesetzt werden. Die Konzentration der zugesetzten Kofaktoren NAD(P) ⁺ und NAD(P)H beträgt in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung üblicherweise zwischen 0,001 mM und 10 mM, vorzugsweise zwischen 0,01 mM und 1 mM. Abhängig von den verwendeten Enzymen kann das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung bei einer Temperatur von 10°C bis 70°C, vorzugsweise von 20°C bis 45°C durchgeführt werden.

Unter Hydroxysteroiddehydrogenasen (HSDH) versteht man solche Enzyme, die die Oxidation von Hydroxygruppen zu den entsprechenden Ketogruppen oder umgekehrt die Reduktion von Ketogruppen zu den entsprechenden Hydroxygruppen am Steroidgerüst katalysieren.

Geeignete Hydroxysteroiddehydrogenasen, die für Redoxreaktionen an Hydroxysteroiden eingesetzt werden können, sind zum Beispiel 3a-HSDH, 3ß-HSDH, 7a-HSDH, 7ß-HSDH oder 17ß-HSDH.

Geeignete Enzyme mit 7a-HSDH- Aktivität sind zum Beispiel erhältlich aus Clostridien (Clostridium absonum, Clostridium sordelii), Escherichia coli oder Bacteroides fragilis.

Geeignete Enzyme mit 7 ß-HSDH- Aktivität sind zum Beispiel erhältlich aus Ruminococcus sp. oder Clostridium absonum.

Geeignete Laktatdehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Oryctolagus cuniculus. Geeignete Alkoholdehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Lactobacillus kefir.

Eine geeignete Xylosereduktase ist zum Beispiel erhältlich aus Candida tropicalis.

Geeignete Sorbitoldehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Schafsleber, Bacillus subtilis oder Malus domestica.

Geeignete NADH Oxidasen sind zum Beispiel erhältlich aus Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutans, Clostridium aminovalericum. Enzyme werden in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt als in E. coli rekombinant überexprimierte Proteine verwendet, wobei weiterhin bevorzugt die

entsprechenden Zell-Lysate ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden. Die Enzym- Einheit 1 U entspricht dabei derjenigen Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 μιηοΐ Substrat pro min umzusetzen.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu

Ursodeoxycholsäure über das Zwischenprodukt 3a-Hydroxy-7oxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Pyruvat.

Fig. 2 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu

Ursodeoxycholsäure über das Zwischenprodukt 3a-Hydroxy-7oxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von Malat und Pyruvat.

Fig. 3 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu

Ursodeoxycholsäure über das Zwischenprodukt 3a-Hydroxy-7oxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Sauerstoff.

Fig. 4 zeigt das Reaktionsschema der Isomerisierung von Glukose zu Fruktose mit Kofaktor- Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Pyruvat.

Fig. 5 zeigt das Reaktionsschema der Isomerisierung von Glukose zu Fruktose mit Kofaktor- Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Sauerstoff.

Fig. 6 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Cholsäure zu 3 ,7ß-Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure über die Zwischenprodukte 3a,7a-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure und 3a-Hydroxy-7,12-dioxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Pyruvat. Fig. 7 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Cholsäure zu 3a,7ß-Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure über die Zwischenprodukte 3a,7a-Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure und 3a-Hydroxy-7,12-dioxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Sauerstoff.

Fig. 8 und Fig. 9 zeigen Reaktionsschemata der Epimerisierung von Cholsäure zu 3a,7ß- Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure über die Zwischenprodukten 3a,7a-Dihydroxy- 12-oxo- 5ß-cholansäure und 3a-Hydroxy-7, 12-dioxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol, Pyruvat und Sauerstoff.

Fig. 10 zeigt die möglichen Reaktionswege der Epimerisierung von Cholsäure zu 3a,7ß- Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure über verschiedene Zwischenprodukten mit Kofaktor- Regenerierungssystemen. Um NAD ⁺ wiederherzustellen wurden abwechselnd

Laktatdehydro genäse (Pyruvat als Substrat) und NADH Oxidase (Sauerstoff als Substrat) eingesetzt. Um NADPH zu regenerieren wurde Alkoholdehydrogenase (Isopropanol als Substrat) eingesetzt.

Fig. 11 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure über das Zwischenprodukt 3a-Hydroxy-7oxo-5ß-cholansäure (7- Ketolithocholsäure = 7K-LCA = KLC) mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und 2-Pentanol (jeweils Alkoholdehydrogenase) sowie Pyruvat (Laktat- Dehydrogenase) und Sauerstoff (NADH-Oxidase).

In den Abbildungen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

BsSDH = Sorbitol-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis

CA = 3a,7a,12a-Trihydroxy-5ß-cholansäure

7ß-CA 3a,7ß, 12a,-Trihydroxy-5ß-cholansäure

Caoxo Clostridium aminovalericum NADH Oxidase

CDC 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure

CDCA 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure CtXR Candida tropicalis Xylosereduktase

7a-HSDH = 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase

7ß-HSDH 7ß-Hydroxysteroid dehydrogenase

12a-HSDH = 12a-Hydroxysteroiddehydrogenase

KLC = 3a-Hydroxy-7-oxo- 5ß-cholansäure

7K-LCA = 3a-Hydroxy-7-oxo- 5ß-cholansäure

LacDH = Laktatdehydrogenase NAD(H)-abhängig

LkADH = Lactobacülus kefir Alkoholdehydrogenase NADP(H)-abhängi:

Lmoxid = Leuconostoc mesenteroides NADH-Oxidase

MalDH = E. coli Malatdehydrogenase NADP(H) -abhängig

7oxo-CA = 3a, 12 a-Dihydroxy-7-oxo-5ß-cholansäure

12oxo-CDC = 3a,7a-Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure

12oxo-KLC = 3a-Hydroxy-7 , 12-dioxo-5 ß-cholansäure

12oxo-UDC = 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure

SISDH = Schafsleber-Sorbitoldehydrogenase

SmOxo = Streptococcus mutans NADH Oxidase

UDC = 3a,7ß-Dihydroxy-5ß-cholansäure

UDCA = 3a,7ß-Dihydroxy-5ß-cholansäure

In den nachfolgenden Beispielen sind alle Tempreaturangaben in Grad Celsius (°C). Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

EtOAc Ethylacetat

h Stunde(n)

IPA Isopropylalkohol (2-Propanol)

MeOH Methanol

Rt Raumtemperatur Beispiel 1

Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems

Ein 0,5 ml- Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 12 U der rekombinanten 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der rekombinanten 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 0,5 mM NAD ⁺ und 0,3 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden 6 U rekombinante Laktatdehydrogenase und 350 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 6 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2.4% IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung Ursodeoxycholsäure zu verschieben. Es werden 1,6% (w/v) IPA nach 6 h, 2,4% (w/v) IPA nach 16 h, 3,9% (w/v) IPA nach 24 h und 0,8% (w/v) IPA nach 40 h nachdosiert. Außerdem werden nach 24 h 20 μΐ 4-Methyl-2-pentanol zugegeben. Nach 46 h werden 200 μΐ 2-Pentanol, sowie 1,6% (w/v) IPA zugegeben. Nach 48 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung >97%.

Beispiel 2

Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase- und Malatdehydrogenase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems

Ein 0,5 ml- Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 20 U der rekombinanten 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 20 U der rekombinanten 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 1 mM NAD ⁺ und 1 mM NADPH.

Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden 10 U der Laktatdehydrogenase (Sigma-Aldrich) und zum Start der Reaktion 16,5 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 20 U der rekombinanten Malatdehydrogenase aus Escherichia coli und 320 mM Natrium-Malat eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um ein Entweichen des entstehenden C0 ₂ zu ermöglichen. Es wurden 20 U 7a-HSDH sowie 10 U Laktatdehydrogenase nach 16 h und 40 h nachdosiert. Es wurden 10 U 7ß-HSDH nach 20 h, 24 h, 44 h und 48 h nachdosiert. Weiterhin wurden 10 U Malatdehydro genäse nach 40 h nachdosiert. Nach 72 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung ca. 90%.

Beispiel 3

Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines NADH Oxidase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems

Ein 0,5 ml- Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 12 U der rekombinanten 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 7,5 U der rekombinanten 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 1 mM NAD ⁺ und 1 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden 20 U der rekombinanten NADH-Oxidase aus Clostridium aminovalericum eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 5 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2 % IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 6) bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung Ursodeoxycholsäure zu verschieben. Es werden 2% IPA nach 18 h, 22 h, 26 h und 41 h sowie 5% IPA nach 41 h und 48 h nachdosiert. Nach 24 h werden 20 U NADH-Oxidase und nach 41 h 7,5 U 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase sowie 5 U Alkoholdehydrogenase nachdosiert. Nach 48 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung ca. 95-98%.

Beispiel 4

Aufarbeitung und Analytik der Gallensäuren

Nach Beendigung von Reaktionen, wie sie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben sind, wird das Reaktionsgemisch mit EtOAc extrahiert. Das Lösungsmittel wird anschließend mittels Abdampfens entfernt. Der Abdampfrückstand wird in einer Mischung von MeOH:Acetonitril:Natriumphosphatpuffer pH = 3, 0,78 g/1 (40:30:37) gelöst und die Umsetzung der Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure wird mittels HPLC verfolgt. Dabei wird eine Reversed- Phase-Trennsäule (ZORBAX ^® Eclipse ^® XDB C18, Fluss 0,8 ml/min) und ein Lichtbrechungsdetektor (RID), Agilent 1260 Infinity ^® , beide von Agilent Technologies Inc., benutzt.

Beispiel 5

Umsatz von Glucose zu Fructose durch eine Xylosereduktase und eine

Sorbitoldehydrogenase unter der Verwendung einer Alkoholdehydrogenase zum Recycling des NADPH und einer Laktatdehydrogenase zum Recycling des NAD ⁺

Ein 0,5 ml Ansatz enthält 50 mg/ml Glucose und 6 U/ml der rekombinanten Xylosereduktase aus Candida tropicalis (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) und 0,1 mM NADP ⁺ . Zur Regeneration des Kofaktors werden 7% (v/v) IPA und und 6 U/ml der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3)) zugefügt. Die Enzyme werden in Form von Zelllysat eingesetzt. Die Reaktion findet für 24 h bei 40° C und pH = 9 (50 mM Tris HCl-Puffer) unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) in einem offenem System statt. Das offene System führt zur Entfernung des Acetons, was die Reaktion in Richtung Sorbitol-Bildung treibt. Im offenen System verdampfen Wasser und IPA ebenfalls, sodass diese nach 6 h und 21 h nachdosiert werden. Dabei wird jeweils wieder ein Gesamtvolumen von 0,5 ml, sowie eine IPA-Konzentration von 7% (v/v) eingestellt. Nach 24 h wird das Reaktionsgefäß bei 60°C unter Vakuum inkubiert, um die Enzyme zu deaktivieren und die organischen Lösungsmittel zu verdampfen. Nach dem Abkühlen auf Rt werden die rekombinante Sorbitoldehydrogenase aus Bacillus subtilis (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3) in einer Endkonzentration von 5 U/ml, ZnCl ₂ in einer Endkonzentration von 1 mM und NAD ⁺ in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugefügt. Zur Kofaktor-Regenerierung werden 5 U/ml (Endkonzentration) Laktat-Dehydrogenase aus Kaninchenmuskel (Sigma Aldrich) und 300 mM Pyruvat eingesetzt. Der Ansatz wird auf 0,5 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Reaktion findet für weitere 24 h bei 40°C unter

kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) im geschlossenem System statt. Es wird ein Umsatz der D-Glucose zu D-Fructose von >90 erreicht. Beispiel 6

Umsatz der Glucose zu Fructose durch eine Xylosereduktase und eine Sorbitoldehydrogenase unter der Verwendung einer Alkoholdehydrogenase zum Recycling des NADPH und einer Oxidase zum Recycling des NAD ⁺

Ein 0,5 ml Ansatz enthält 50 mg/ml Glucose, 6 U/ml der rekombinanten Xylosereduktase aus Candida tropicalis (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3) und 0,1 mM NADP ⁺ . Zur Regeneration des Kofaktors werden 7% (v/v) IPA und die rekombinante

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3) zugefügt. Die Enzyme werden in Form von Zelllysat eingesetzt. Die Reaktion findet für 24 h bei 40°C und pH = 8 (50 mM Tris-HCl-Puffer) unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) in einem offenem System statt. Das offene System führt zur Entfernung des Acetons, was die Reaktion Richtung Sorbitol-Bildung treibt. Im offenen System verdampfen Wasser und IPA ebenfalls, sodass diese nach 6 h und 21 h nachdosiert werden. Dabei wird jeweils wieder ein Gessamtvolumen von 0,5 ml und eine IPA-Konzentration von 7% (v/v) eingestellt.

Nach 24 h wird das Reaktionsgefäß bei 60°C unter Vakuum inkubiert, um die Enzyme zu deaktivieren und IPA, sowie entstandenes Aceton zu verdampfen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden die rekombinante Sorbitoldehydrogenase aus Bacillus subtilis (überexprimiert in E.coli BL21 (DE3) in einer Endkonzentration von 5 U/ml, CaCl ₂ in einer Endkonzentration von 1 mM und eine Mischung aus NAD ⁺ und NADH in einer

Endkonzentration von 0,1 mM zugefügt. Zur Kofaktor-Regenerierung werden 10 U/ml (Endkonzentration) der NADH-Oxidase aus Leuconostoc mesenteroides überexprimiert in E.coli BL21 (DE3) eingesetzt. Die Enzyme werden in Form von Zelllysat eingesetzt.Der Ansatz wird auf 0,5 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Reaktion findet für 24 h bei 40°C unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) im offenen System statt, um genügend

Sauerstoffversorgung für die NADH-Oxidase aus der Luft zu gewährleisten. Im offenen System bei 40°C verdampft Wasser. Es wird daher nach 6 h und 21 h mit Wasser auf 0,5 ml aufgefüllt. Es wird ein Umsatz der D-Glucose zu D-Fructose von ca. 98% erreicht.

Beispiel 7

Aufarbeitung und Analytik der Zucker Der Ansatz wird für 10 min bei 65°C inkubiert um die Enzyme zu deaktivieren und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wird dann über einen 0,2 μΜ PVDF Filter filtriert und mittels Ligand-Exchange-HPLC analysiert (Agilent Technologies Inc.). Aufgetrennt werden Zucker und Polyole dabei über eine Blei-Säule von Showa Denko K.K. (Shodex ^® Sugar SP0810) mit einem Fluss von 0,5 ml/min Wasser (VWR International GmbH, HPLC Grade) bei 80°C. Die Detektion erfolgt mittels Lichtbrechungsdetektor (RID, Agilent 1260 Infinity ^® , Agilent Technologies Inc.). Es wird ein Inlinefilter von Agilent Technologies Inc., sowie als Vorsäulen eine Anionen- Austauscher-Säule (Shodex ^® Axpak-WAG), eine

Reversed-Phase Säule (Shodex ^® Asahipak ^® ODP-50 6E) und eine Zucker- Vorsäule

(SUGAR SP-G) von Showa Denko K.K. verwendet.

Beispiel 8

Biokonversion von Cholsäure zu 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure durch 12a- Hydroxysteroiddehydrogenase, 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems

Ein 0,5 ml- Ansatz enthält 25 mg Cholsäure, 12,5 U der rekombinanten 12a- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Eggertella lenta oder Lysinibacillus sphaericus, 16 U der rekombinanten 7 -Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der

rekombinanten 7 ß-Hydroxysteroiddehydro genäse aus Ruminococcus torques sowie 1 mM NAD ⁺ und 1 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden 12,5 U der

rekombinanten Laktatdehydrogenase aus Oryctolagus cuniculus (Muskel Isoform) und 200 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 5 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2 % IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 7.8) bei 25 °C unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure zu verschieben. Es werden 2% IPA nach 18 h, und 24 h nachdosiert. Nach 48 h sind 61 % der eingesetzten Cholsäure zu 3a,7a-dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure umgesetzt. Beispiel 9

Biokonversion von Cholsäure zu 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure durch 12a- Hydroxysteroiddehydrogenase, 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase-, NADH-Oxidase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems

Ein 0,5 ml- Ansatz enthält 25 mg Cholsäure, 12,5 U der rekombinanten 12a- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Eggertella lenta oder Lysinibacillus sphaericus, 16 U der rekombinanten 7 -Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der

rekombinanten 7 ß-Hydroxysteroiddehydro genäse aus Ruminococcus torques sowie 1 mM NAD ⁺ und 1 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD+ werden 5 U der rekombinanten NADH-Oxidase aus Leuconostoc mesenteroides und 12,5 U der rekombinanten

Laktatdehydrogenase aus Oryctolagus cuniculus (Muskel Isoform) und 200 mM Natrium- Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 5 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2 % IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 7.8) bei 25 °C unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure zu verschieben. Es werden 2 % IPA (w/v) nach 18 h, und 24 h nachdosiert. Nach 48 h sind 70% der eingesetzten Cholsäure zu 3α,7α- Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure umgesetzt.

Beispiel 10

Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems. Vorteil der Zugabe von Manganchlorid (MnCl ₂ )

Ein 0,5 ml- Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 12 U der rekombinanten 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der rekombinanten 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 0,5 mM NAD ⁺ und 0,3 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden 6 U rekombinante Laktatdehydrogenase und 350 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 6 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2,4% IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) mit 5 mM MnCl ₂ bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung Ursodeoxycholsäure zu verschieben. Es werden 1,6% (w/v) IPA nach 6 h, 2,4% (w/v) IPA nach 16 h und 3,9% (w/v) IPA nach 24 h nachdosiert. Nach 36 h werden 200 μΐ 2-Pentanol sowie 3 %(w/v) IPA zugegeben und nach 48 h werden 100 μΐ 2-Pentanol und 4 % (w/v) IPA nachdosiert. Nach 64 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung >99%. Es beträgt insbesondere der Anteil von Chenodeoxycholsäure ca. 0,3 %. Bei einem

Kontrollansatz ohne Zugabe von MnCl ₂ liegt der Anteil von Chenodeoxycholsäure bei ca. 2 % und der Anteil von Ursodeoxycholsäure bei ca. 97,5 % (jeweils Mittelwerte aus 5 Experimenten).

Beispiel 11

Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems sowie eines kombinierten Laktatdehydrogenase- und NADH- Oxidase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems

Ein 0,5 ml- Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 12 U der rekombinanten 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der rekombinanten 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 0,5 mM NAD ⁺ und 0,3 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden 6 U rekombinante Laktatdehydrogenase und 350 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden zusätzlich 9 U der rekombinanten NADH Oxidase aus Leuconostoc mesenteroides sowie 6 U der rekombinanten NADH Oxidase aus Clostridium aminovalericum eingesetzt. Für die

Regenerierung von NADPH werden 6 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2,4% IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung Ursodeoxycholsäure zu verschieben. Es werden 1,6% (w/v) IPA nach 6 h, 2,4% (w/v) IPA nach 16 h und 3,9% (w/v) IPA nach 24 h nachdosiert. Nach 36 h werden 200 μΐ 2-Pentanol sowie 3 % (w/v) IPA zugegeben und nach 48 h werden 100 μΐ 2-Pentanol und 4% (w/v) IPA nachdosiert. Nach 64 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung >99%. Es beträgt insbesondere der Anteil von Chenodeoxycholsäure ca. 0,2 %. Bei einem Kontrollansatz ohne Zugabe von NADH-Oxidase liegt der Anteil von Chenodeoxycholsäure bei ca. 2 % und der Anteil von Ursodeoxycholsäure bei ca. 97,5 % (gleicher Kontrollansatz wie für Beispiel 11; jeweils Mittelwerte aus 5 Experimenten).

Beispiel 12

Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems sowie eines kombinierten Laktatdehydrogenase- und NADH- Oxidase-abhängigen Kofaktor- Regenerierungssystems. Additiver Effekt von 2- Pentanol und 2-Propanol

Ein 50 ml- Ansatz enthält 5 g Chenodeoxycholsäure, 24 U/ml der rekombinanten 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 12 U/ml der rekombinanten 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 0,5 mM NAD ⁺ und 0,3 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden 12 U/ml rekombinante

Laktatdehydrogenase und 350 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Zur Regenerierung von NAD ⁺ werden zusätzlich 18 U/ml der rekombinanten NADH Oxidase aus Leuconostoc mes · enter vieles sowie 12 U/ml der rekombinanten NADH Oxidase aus Clostridium aminovalericum eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 12 U/ml der rekombinanten Alkoholdehydro genäse aus Lactobacillus kefir und anfänglich 1,5 % IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) mit 5 mM MnCl ₂ bei 25°C durchgeführt. In einem 3-Halskolben wird mit einem KPG-Rührer bei ca. 100 rpm gerührt. Eine Entfernung des bei der Reaktion entstehenden Acetons wird durch einen Luftstrom von ca. 400-600 ml/min durch das Reaktionsgefäß gewährleistet. Da ebenfalls 2-Propanol verdampft, sind Nachdosierungen notwendig. Diese betragen im Beispiel 0,75 ml (1,5 h), 0,75 ml (3 h), 0,5 ml (4 h), 0,75 ml (6 h), 0,75 ml (8 h), 0,5 ml (11 h), 0,5 ml (14 h), 0,5 ml (17 h), 0,5 ml (21 h), 1 ml (23 h), 2,5 ml (25 h), 4 ml (29 h). Nach ca. 30 h werden 20 ml 2-Pentanol sowie 2 ml 2-Propanol zugegeben. Nach 46 h Gesamt-Reaktionszeit beträgt der Anteil von 7-Ketolithocholsäure ca. 1 % (bezogen auf die Summe von Chenodeoxycholsäure, Ursodeoxycholsäure und 7-Ketolithocholsäure). Es wird nun weiter 2-Propanol zugegeben: 3 ml (46 h), 4 ml (52 h), 4 ml (54 h) sowie zusätzlich 10 ml 2-Pentanol. Nach 72 h Gesamt-Reaktionszeit kann der Anteil von 7- Ketolithocholsäure auf weniger als 0,2 % gesenkt werden. Der Anteil von

Ursodeoxycholsäure beträgt >99 %.

Beispiel 13

Aufarbeitung und Analytik der Gallensäuren

Nach Beendigung von Reaktionen, wie sie in den Beispielen 8 bis 12 beschrieben sind, können die in den Proben enthaltenen Gallensäuren mittels einer Methode wie sie in Beispiel 4 beschrieben ist analysiert werden.