La présente invention concerne l'utilisation thérapeutique d'oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl, dans les traitements de leucémies caractérisées par la présence du chromosome Philadelphie.

Plus particulièrement, l'invention concerne le traitement ex vivo de cellules de patients atteints de leucémie myéloïde chronique (LMC) par le traitement avec des oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl.

La leucémie myéloïde chronique est une maladie hématologique maligne de la cellule souche hématopoïétique, caractérisée par une phase initiale chronique qui progresse invariablement vers une crise blastique. Pendant la phase chronique, la proportion des cellules myéloïdes, aussi bien matures qu'immatures, augmente comme résultat de l'expansion clonale de progéniteurs myéloïdes. La présence de cellules totalement différenciées indique que l'hématopoïèse associée à la phase chronique conserve encore certaines propriétés de différenciation. Par contre, à la phase de transformation aigϋe, les cellules leucémiques bloquées au stade blastique ne sont plus capables d'arriver à la différenciation terminale.

La LMC est associée à une anomalie génétique spécifique, appelée chromosome Philadelphie. Il a par ailleurs été montré qu'il peut persister un contingent de cellules hématopoïétiques normales (ne contenant pas de chromosome Philadelphie), plus facile à mettre en évidence au stade initial de la maladie (Coulomel et al., N. Eng. J. Med., 1983, 308: 1493; Barnett et al., Bone Marrow Transplant., 1989, 4: 345; Verfaillie et al., Blood, 1992, 79: 1003). Le chromosome Philadelphie se caractérise au niveau moléculaire par la translocation du proto-oncogène c-abl du chromosome 9, sur le gène bcr du chromosome 22. Cette translocation provoque la formation d'un gène hybride bcr-abl qui peut être exprimé.

Le proto-oncogène c-abl couvre au moins 230kb sur la bande 9q34. Il contient 11 exons, le premier présentant deux formes différentes, la et lb. Deux messages c-abl sont donc transcrits, différant par leur extrémité 5'. Si l'exon la est utilisé, PARNm a une longueur de 6kb et comprend les exons lb puis 2 à 11. Les deux protéines synthétisées diffèrent de par leur extrémité N terminale (Shtivelman et al., Oeil, 1986, 47: 277; Bernards et al., Mol Cell Biol, 1987, 7: 3231; Fainstein et al, Oncogène, 1989, 4: 1481).

Le gène bcr est situé sur la bande 22ql l. La coupure se produit sur un petit segment de 5,8kb de ce gène, qui comporte, au total, environ 130kb (Heisterkamp et al., Nature, 1985, 315:9758).

La fusion des deux gènes bcr et c-abl, conduit à la formation d'un ARNm de 8,5kb, composé d'une extrémité 5' provenant du gène bcr et d'une extrémité 3' provenant du gène c-abl. La protéine résultante, de poids moléculaire 210kDa, a une activité tyrosine kinase accrue, par rapport à l'activité tyrosine kinase normale, de poids moléculaire 145kDa, codée par le gène c-abl (Konopka et al., Cell, 1984, 37: 1035; Kloetzer et al., Virology, 1985, 140: 230; Konopka et al., Proc Natl Acad Sci, 1985, 82: 1810).

Deux translocations différentes peuvent avoir lieu, provoquant les deux principaux types de jonction bcr-abl connus. La première juxtapose l'exon 2 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl ; elle a reçu les noms de "L- 6" ou "b2a2". La deuxième juxtapose l'exon 3 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl ; elle a été appelée "K-28" ou ^u b3a2". L'exon 3 du gène bcr code pour 25 acides aminés qui sont présents ou absents de la protéine résultante, selon le type de jonction. L'une de ces jonctions, ou les deux, sont détectées chez les patients atteints de LMC et présentant le chromosome Philadelphie (Shtivelman et al., Blook, 1986, 69: 971). Environ la moitié des patients présentent la jonction b2a2, tandis que l'autre moitié présente la jonction b3a2.

Chez les patients atteints de leucémie lymphoïde aigϋe (ALL), une troisième translocation a été mise en évidence. Elle juxtapose l'exon 1 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl, et a donc reçu le nom de "bla2" (Fanstein et al., Nature, 1987, 330: 386). Environ 50 % des patients atteints de ALL présentent la jonction bla2 ; 25 % la jonction b2a2 et 25 % la jonction b3a2. Ces trois différentes jonctions peuvent être identifiées

grâce à la technique de polymérisation en chaîne (PCR) suivie d'hybridation avec des sondes spécifiques de chaque jonction (Kawasaki et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 5698).

Du point de vue clinique, la LMC progresse invariablement de la phase chronique vers la crise blastique. La première période se caractérise par l'augmentation des cellules myéloïdes matures et immatures, dans la moelle osseuse et le sang (Koeffler et al., N Engl J Med, 1981, 304: 201). Cette augmentation ne serait pas due à la prolifération ni à la maturation plus rapide des cellules tumorales, mais plutôt, à la prolifération des cellules souches myéloïdes, dans la moelle osseuse et dans le sang. La crise, ensuite, se caractérise par un arrêt de différenciation des cellules leucémiques, qui acquièrent pendant cette phase, un phénotype "blastique". Le début de la crise blastique marque la limite des possibilités thérapeutiques et la survie est, généralement, inférieure à quatre mois. Les premiers traitements de la LMC en phase chronique utilisaient des agents alkylants, comme le busulfan, ou des inhibiteurs de synthèse de l'ADN, comme l'hydroxyurée. Bien que ces substances contrôlent efficacement la granulopoïèse excessive constatée dans les cas de LMC, elles ne sont guère spécifiques, inhibant la synthèse d'ADN aussi bien dans les cellules normales que dans les cellules leucémiques.

Des efforts visant à éliminer le clone leucémique par irradiation de la rate ou par splénectomie associés à une chimiothérapie intensive, ont eu pour résultat l'élimination temporaire des cellules présentant le chromosome Philadelphie chez un tiers des patients, mais n'ont pas réussi à enrayer le cours de la maladie.

Depuis 1985, l'interféron alpha est couramment utilisé avec une efficacité indéniable, au moins pour retarder la survenue de la phase aigϋe.

La transplantation de moelle osseuse allogénique permet à 40 % des patients traités durant la phase chronique, de survivre au-delà de cinq ans en rémission complète (Bergshell, J Cancer Res. Clin. Oncol., 1990, 116: 104), et probablement d'être guéris. La transplantation s'effectue après un traitement intensif, associant en règle générale une chimiothérapie lourde et une irradiation corporelle totale qui visent à éliminer les cellules leucémiques. Elles ne peut cependant être appliquée qu'aux malades ayant un membre de sa fratrie HLA identique, ce qui ne représente qu'une faible proportion de malades.

La transplantation de cellules hématopoïétiques autologues est de plus en plus utilisée en particulier chez les patients n'ayant pas de donneur HLA identique. A cet effet, les cellules de la moelle osseuse sont prélevées, éventuellement "purgées" des cellules leucémiques grâce à des agents chimiques, puis, réintroduites chez le patient, qui a subi une chimiothérapie lourde, avec ou sans une irradiation totale. Même avec cette méthode, la transformation aiguë survient inéluctablement.

Les cellules sanguines ont leur origine dans la moelle osseuse, siège, chez l'adulte de cellules "souches" hématopoïétiques. Les cellules "souches" hématopoïétiques sont des cellules indifférenciées, multipotentes, qui, selon le facteur de régulation avec lequel elles seront en contact, se différencieront en globules rouges, blancs ou plaquette. Les cellules hématopoïétiques sont une sous-population ^' de cellules mononucléées, elle-même hétérogène dans sa composition. Les cellules hématopoïétiques sont plus ou moins engagées dans le processus de différenciation, et peuvent être distinguées les unes des autres par leur capacité fonctionnelle in vitro, et par l'expression d'antigènes à leur surface. Certains de ces antigènes sont exprimés par plusieurs populations de cellules ; d'autres sont spécifiques d'une lignée hématopoïétique donnée.

L'antigène CD34 est une protéine d'environ 115kDa, dont le gène se situe sur le chromosome l( lq) et qui est exprimée par les progéniteurs hématopoïétiques, myéloïdes et lymphoïdes. Son rôle n'est pas encore clairement élucidé, mais sa présence a été détectée sur 1 à 4 % des cellules mononucléées de moelle osseuse normale, et sur les cellules leucémiques, de 30 à 60 % des leucémies aiguës et de toutes les LMC.

Les oligonucléotides antisens sont de courtes molécules synthétiques d'ADN, d'ARN ou mixtes, de séquence complémentaire à une séquence cible appartenant à un gène, à un pré-ARN messager ou à un ARN messager. Ils s'hybrident à la séquence dont ils sont complémentaires et peuvent ainsi bloquer l'expression du gène, du pré-ARN messager ou de l'ARN messager portant cette séquence.

Le terme "oligonucléotide" est utilisé de façon générale pour désiger un polynucléotide de 2 à 100, et plus généralement de 5 à 50, nucléotides en série ribo- désoxyribo- ou mixte.

Les oligonucléotides antisens sont synthétisés par voie chimique et peuvent comporter des modifications altérant le squelette même de la molécule ou des groupements réactifs additionnels, localisés à leurs extrémités. Ces modifications ont pour but soit d'augmenter leur résistance à la dégradation nucléolytique, soit de favoriser leurs interactions avec leurs cibles, soit de permettre des réactions de dégradation ou de modification spécifiques des cibles, ARN ou ADN, soit d'accroître leur pénétration à l'intérieur des cellules.

L'hybridation entre un oligonucléotide antisens et un ARNm cible peut bloquer l'expression de façon stérique, c'est-à-dire en créant une barrière physique interdisant la fixation et la progression de complexes protéiques nécessaires à la traduction, à la maturation, à la stabilisation ou au transport de l'ARNm, ou bien de façon pseudo-catalytique, en créant un substrat pour la RNase H, enzyme présent dans toutes les cellules eucaryotes et qui dégrade spécifiquement l'ARN lorsqu'il est hybride à de l'ADN (Markus-Sekura et al., Nucleic Acids Res, 1987, 15: 5749; Gagnor et al., Nucleic Acids Res, 1987, 15: 10419; Jessus et al., Gène, 1989, 72: 311). Par ailleurs, les oligonucléotides antisens peuvent comporter des groupements réactifs capables de produire directement des dommages irréversibles dans la molécule d'ARN cible.

Les oligonucléotides antisens, sont donc des agents pharmacologiques potentiels, puissants et spécifiques, permettant d'inhiber l'expression de messagers codant pour des produits exerçant des effets pathogènes. Une méthode pour traiter les leucémies caractérisées par la présence du chromosome Philadelphie a été proposée.

Il a déjà été proposé dans WO 92/22303 d'effectuer un traitement ex vivo de cette forme de leucémie en traitant les cellules mononucléées totales prélevées en phase aigϋe à l'aide d'oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl.

La présente invention a pour objet une méthode de traitement ex vivo de cellules tumorales de patients atteints de LMC, caractérisée en ce que :

a) on sélectionne des cellules exprimant un antigène CD34 parmi les cellules mononucléées totales de patients atteints de LMC en phase chronique, et b) on traite les cellules CD34+ sélectionnées, avec un oligonucléotide antisens complémentaire de la jonction bcr-abl, de sorte que l'expression de gène bcr-abl soit réprimée.

De préférence, les cellules du patient sont des cellules du sang ou de la moelle osseuse. En effet, le but est de pouvoir purger par les oligonucléotides les cellules hématopoïétiques des sujets LMC afin de pouvoir leur pratiquer une autogreffe. Celle-ci se pratique, soit à partir de la moelle, soit à partir de cellules du sang récupérées par cytaphérèse.

La méthode selon l'invention permet en effet, l'élimination des cellules tumorales parmi les cellules traitées lesquelles peuvent ensuite être réinjectées au patient dont elles proviennent de façon autologue. Auparavant, on contrôle que l'expression du gène bcr-abl a été réprimée et qu'il ne reste plus de progéniteur de cellules leucémiques.

La présente invention permet l'élimination de cellules tumorales parmi les cellules mononucléées totales prélevées chez les patients atteints de LMC en phase chronique, par administration ex vivo des oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl, aux cellules exprimant l'antigène CD34 et présélectionnées à partir des cellules mononucléées totales du patient.

On entend par oligonucléotide antisens complémentaire de la jonction bcr-abl, un oligonucléotide d'ADN ou ARN complémentaire de l'ARNm de ladite jonction.

L'avantage de la méthode selon l'invention repose sur la combinaison de trois opérations :

1. Le prélèvement des cellules mononucléées totales en phase chronique et, 2. La sélection des cellules exprimant l'antigène CD34 des malades

LMC en phase chronique et,

3) L'application des oligonucléotides antisens. L'efficacité des oligonucléotides antisens est plus évidente sur les cellules CD34+ que sur les cellules non purifiées.

En prélevant les cellules mononucléées totales en phase chronique plutôt qu'en phase aiguë, il est possible d'obtenir l'élimination des cellules tumorales parmi les cellules traitées à réinjecter, ce qui est capital pour l'efficacité du traitement. En effet, en phase aiguë il existe des désordres génétiques supplémentaires qui ne sont pas traités par le procédé de l'invention.

En sélectionnant les cellules CD34+ des LMC, les cellules CD34 normales sont également purifiées. Or parmi ces dernières se trouvent les cellules souches hématopoïétiques, qui sont les seules à pouvoir reconstituer l'hématopoïese chez l'homme. Les techniques de greffe actuelles montrent l'efficacité de la greffe (rapidité de prise) à partir des cellules CD34 purifiées.

D'autre part, les cellules tumorales non CD34+ ont un faible pouvoir d'autorenouvellement, elles s'éliminent de façon naturelle comme toute cellule différenciée.

Enfin, chez les malades atteints de LMC, la proportion de cellules tumorales est plus importante parmi les cellules CD34+ que parmi les cellules totales, de sorte qu'il est possible en ne traitant que les cellules CD34+ de tuer toutes les cellules tumorales par un traitement avec un oligonucléotide antisens sans utiliser des doses toxiques d'oligonucléotides risquant de tuer les cellules saines.

Comme première étape, un diagnostic établissant la présence du chromosome Philadelphie chez le patient, doit être rendu. Ceci peut être fait en utilisant une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques, spécifiques du gène hybride bcr-abl, ou par l'amplification spécifique de ce gène grâce à la PCR inverse (RT-PCR, Kawasaki et al., Proc NatI Acad Sci, 1988, 85: 5698).

Ensuite, la séquence autour de la jonction bcr-abl doit être déterminée. Pour cela, des cellules leucémiques présentant le chromosome Philadelphie sont prélevées dans le sang ou dans la moelle osseuse du patient. A ce stade, une centrifugation sur Ficoll-Hypaque peut éliminer les cellules non mononucléées. L'ARN contenant le gène hybride bcr-abl est extrait, pour analyse par transcription inverse, amplification et séquençage. La jonction b2a2 est amplifiée par des amorces spécifiques de l'exon 2 du gène bcr et de l'exon 2 du gène c-abl. La jonction b3a2 est

amplifiée par des amorces spécifiques de l'exon 3 du gène bcr et de l'exon

2 du gène c-abl (Shtivelman et al., Cell, 1986, 47: 277; Fainstein et al.,

Nature, 1987, 330: 386). Le séquençage peut être fait directement ou après clonage sur un vecteur approprié. Des oligonucléotides antisens dont la séquence est complémentaire à

100 % de celle de la jonction bcr-abl trouvée chez le patient, sont préparés.

La longueur de 1 Oligonucléotide est de préférence comprise entre

12 et 24 nucléotides, plus particulièrement encore de 18 à 22. Des séquences de moins de 12 nucléotides seraient moins spécifiques de la région visée. Des séquences de plus de 24 nucléotides pourraient être moins efficaces en raison d'une pénétration plus difficile à l'intérieur de la cellule.

Lorsque l'oligonucléotide antisens est dirigé contre la jonction bcr- abl de type b2a2 ou L6, il comporte de façon avantageuse la séquence 18- mère :

5' GAAGGGCXXCXXCCXXAX 3' avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. Cette séquence est complémentaire de la translocation du chromosome Philadelphie associé à des patients atteints de LMC, et qui juxtapose l'exon 2 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl.

Plus particulièrement, il peut comporter de préférence la séquence 20-mère :

5' XGAAGGGCXXCXXCCXXAXX 3' ou la séquence 22-mère : 5' CXGAAGGGCXXCXXCCXXAXXG 3' avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN.

Lorsque l'oligonucléotide antisens est dirigé contre la jonction bcr- abl de type b3a2 ou K28, il comporte de façon avantageuse la séquence 18- mère : 5' GAAGGGCXXXXGAACXCX3' avec X = T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN. Cette séquence est complémentaire de la translocation du chromosome Philadelphie associé à des patients atteints de LMC, et qui juxtapose l'exon 3 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl.

Plus particulièrement, il peut comporter de préférence la séquence 20-mère :

5' XGAAGGGCXXXXGAACXCXG 3' ou la séquence 22-mère : 5' CXGAAGGGCXXXXGAACXCXGC 3 ^» avec X « T ou U selon qu'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN.

Une fois la séquence définie, les oligonucléotides antisens peuvent être synthétisés par des méthodes chimiques connues à cet effet.

Les composés cités ci-dessus dirigés contre les translocations b2a2 ou b3a2 du chromosome Philadelphie associées à des patients atteints de LMC, peuvent être encadrés en 3' et/ou 5' de 1 à 15 nucléotides supplémentaires.

Dans une application antisens de préférence la séquence oligonucléotidique est une séquence d'ADN car les duplexes ADN/ARN sont substrats de la RNase H.

Les liens internucléotidiques des oligonucléotides peuvent être du type naturel, c'est-à-dire, du type phosphodiester ou de type modifié. On cite notamment les oligonucléotides du type, dit phosphorothioate ou methylphosphonate. Toutefois, on préfère selon l'invention quand les séquences oligonucléotidiques sont de type naturel à lien internucléotidique de type phosphodiester ou de type phosphorothioate, car elles présentent la toxicité la plus réduite.

Les composés selon l'invention peuvent être associés à tout composé favorisant leur pénétration cellulaire.

Différents nucléotides peuvent rentrer dans la formulation d'oligonucléotides. les oligonucléotides faisant l'objet de la présente invention sont composés par une séquence de bases nucléotidiques comportant notamment de l'adenine (A), de la guanine (G), de la cytosine (C), de la thymine (T) et de l'uracile (U), reliées entre elles par des liaisons internucléotidiques, notamment naturelles c'est-à-dire phosphodiesters.

Les oligonucléotides selon l'invention peuvent également comporter des nucléotides rares (Inosine, I, ou ri par exemple) ou des nucléotides modifiés, soit en série désoxyribo- soit en série ribo-.

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Les oligonucléotides selon l'invention peuvent également comporter à l'extrémité 5' ou aux deux extrémités 3' et 5' en même temps, des séquences nucléotidiques supplémentaires, dont la nature et la longueur permettront l'apparition des structures en agrafe ou semi- agrafe dans la séquence finale de la molécule oligonucléotidique. Ces séquences nucléotidiques supplémentaires pourront être de deux types : soit elles présenteront elles-mêmes une structure secondaire en semi- agrafe qui sera transmise aux séquences oligonucléotidiques dont elles seront les nouvelles extrémités ; soit elles ne présenteront pas d'emblée ce type de structure secondaire mais les bases nucléotidiques constituant l'une ou l'autre de leurs extrémités seront capables d'aller s'apparier avec des nucléotides situés au sein des séquences auxquelles elles seront ajoutées, conférant ainsi à la séquence finale une structure en agrafe ou en semi-agrafe. Font également partie de cette invention, des oligonucléotides fermés, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'une ou plusieurs séquence(s) d'oligonucléotides monocaténaires dont les extrémités sont reliées entre elles par des liens covalents, nucléotidiques ou non- nucléotidiques, pour former au moins partiellement une structure monocaténaire fermée.

Les oligonucléotides selon l'invention peuvent aussi comporter des nucléotides réactifs, capables d'établir des liens avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide, ou, dans une autre application, des liens intra-moléculaires au sein même de l'oligonucléotide.

Ainsi, les oligonucléotides selon l'invention peuvent porter des groupements réactifs greffés sur les nucléotides, comme par exemple des groupements psoralènes, ou d'autres agents de pontage ou agents intercalants pouvant réagir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide. Dans un cas particulièrement intéressant, des groupements réactifs greffés sur certains des nucléotides de l'oligonucléotide pourront induire la formation d'un pontage intramoléculaire au sein même de la molécule.

L'oligonucléotide pourra comporter des liaisons internes produites par des agents réactifs appartenant ou n'appartenant pas à la structure de la molécule elle-même.

Font également partie de l'invention des oligonucléotides dits chimériques, constitués par l'assemblage covalent de fragments nucléotidiques et non-nucléotidiques.

Font également partie de l'invention des oligonucléotides antisens couplés à des molécules permettant d'accroître leur pénétration intra¬ cellulaire en stabilisant la structure oligonucléotidique, et en particulier des groupements lipophiles, des polypeptides ou des protéines.

Des formulations galéniques adéquates peuvent être établies afin d'optimiser la délivrance de ces molécules aux cellules CD34+ cibles. Ainsi, par exemple, les oligonucléotides anτisens pourront être encapsulés dans des liposomes, des nonaparticules, des particules LDL, ou dans tout autre type de microsphère permettant une conservation adéquate, et favorisant le ciblage. Les molécules oligonucléotidiques peuvent également être associées à des agents surfactants cationiques. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre en référence aux Figures 1 à 4.

La Figure 1 représente un fragment de 60 nucléotides de la séquence de l'ARN messager centré sur la jonction bcr-abl associée à des patients atteints de LMC qui présentent une jonction de type L6 ou b2a2, juxtaposant l'exon 2 du gène bcr et l'exon 2 du gène abl. La flèche indique la position de la jonction bcr-abl : la séquence dérivée du gène bcr se trouve en amont de la jonction, tandis que la séquence dérivée du gène abl se trouve en aval de la jonction. La séquence soulignée correspond à la cible des oligonucléotides antisens anti-b2a2 (Figure 3).

La Figure 2 représente un fragment de 60 nucléotides de la séquence de l'ARN messager centré sur la jonction bcr-abl associée à des patients atteints de LMC qui présentent une jonction de type K-28 ou b3a2, juxtaposant l'exon 3 du gène bcr et l'exon 2 du gène abl. La flèche indique la position de la jonction bcr-abl : la séquence dérivée du gène bcr se trouve en amont de la jonction, tandis que la séquence dérivée du gène abl se trouve en aval de la jonction. La séquence soulignée correspond à la cible des oligonucléotides antisens anti-b3a2 (Figure 3).

La Figure 3 représente des oligonucléotides utilisés dans les tests d'inhibition de la prolifération clonale des progéniteurs myéloïdes. L'oligonucléotide antisens GT-1 est complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 (Figure 1 ). L'oligonucléotide antisens GT-2 est complémentaire de la jonction bcr-abl de type b3a2 (Figure 2). L'oligonucléotide contrôle GT-3 correspond à la séquence complémentaire à GT-1 ; l'oligonucléotide contrôle GT-4 correspond à la séquence complémentaire à GT-2.

La Figure 4 montre l'effet des oligonucléotides antisens et sens (Figure 3) sur la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques après 14 jours d'incubation continue des cellules CD34+ provenant de moelle osseuse normale ou de patients atteints de LMC de type b2a2 ou b3a2 en phase chronique. La concentration des oligonucléotides dans le milieu semi solide d'incubation était de 20 μM. Les résultats correspondent à la moyenne de triplicats de deux moelles normales, traitées chacune avec les oligonucléotides correspondant à la jonction b2a2 (antisens GT-1 et contrôle GT-3), et à la jonction b3a2 (antisens GT-2 et contrôle GT-4). Dans les cas de moelles provenant des patients atteints de LMC, les expériences ont été réalisées deux fois en triplicat sur chaque type de LMC, avec les oligonucléotides spécifiques de chaque LMC : antisens GT-1 et contrôle GT- 3, pour la jonction b2a2 (Figure 3) et antisens GT-2 et contrôle GT-4, pour la jonction b3a2.

Les exemples de réalisation de l'invention qui suivent concernent l'inhibition de l'expansion clonale des progéniteurs myéloïdes dans les cas de LMC en phase chronique par traitement avec des oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl, appliqués exclusivement sur des cellules exprimant l'antigène CD34, pré-sélectionnées à partir des cellules mononucléées totales de la moelle osseuse.

Les propriétés antiprolifératives des oligonucléotides antisens complémentaires de la jonction bcr-abl de type b2a2 (Figure 1) ou b3a2 (Figure 2), présentes dans les chromosomes Philadelphie associés à des patients atteints de LMC, ont été établies dans des Essais clonogéniques sur milieu semi-solide.

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La LMC en phase chronique se distingue par une augmentation de la production de cellules myéloïdes matures, morphologiquement normales, due à un autorenouvellement non régulé du compartiment des cellules souches pluripotents. Le résultat est une expansion du compartiment des progéniteurs multipotents (CFU-GEMM) et différenciés (CFU-GM) dans la moelle, la rate, et le sang. C'est ainsi que la culture des progéniteurs hématopoïétiques de type CFU-GM peut être considérée comme un moyen d'étudier la prolifération et différenciation des cellules progénitrices LMC. L'efficacité des oligonucléotides antisens anti-bcr-abl pour inhiber la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques des patients atteints de LMC, a été comparée dans des essais clonogéniques de CFU-GM à partir des cellules mononucléées totales ou CD34+.

Les cellules mononucléées du sang des patients (normales ou LMC) ont été prélevées, après consentement, et purifiées par centrifugation sur gradient de Ficoll. Dans les cas des patients LMC, le prélèvement a été effectué lors de la phase chronique de la maladie. Parmi les cellules mononucléées ainsi obtenues, celles exprimant l'antigène CD34 ont été sélectionnées par immuno-absorption sur une colonne Ceprate (CellPro, France SARL). Les cellules mononucléées médullaires ou sanguines sont obtenues après cnetrifugation du prélèvement de moelle ou du sang sur un gradient de densité, puis incubées avec un anticorps monoclonal anti- CD34 biotinylé. Les cellules sont ensuite déposées sur une colonne d'avidine. Les cellules CD34+ reconnues par les anticorps biotinylés sont retenues sur les billes d'avidine. Après lavage de la colonne, les cellules CD34+ absorbées sont détachées de la colonne par addition d'avidine et récoltées. Sur un échantillon, la pureté en cellules CD34+ est vérifiée par analyse en cytométrie de flux (Profile II, Coultronics) après marquage des cellules avec un anticorps ami CD34 (My-10, Becton-Dikinson). Les cellules mononucléées totales (2 x 105 cellules/ml) ou CD34+

(2 x 103 cellules/ml), sont mises en culture en triplicats en milieu semi solide contenant 30 % de sérum de veau fœtal (Methocult H4230, Terry Fox

Lab, Vancouver), en présence de facteurs stimulants (Hemostim H2300,

Terry Fox Lab, Vancouver) et d'erythropoïétine (lU/ml; Boehringer).

Les oligonucléotides, antisens ou contrôles (Figure 3), sont ajoutés en incubation continue au temps 0 de la culture. Les oligonucléotides sont inclus dans le milieu semi solide (methylcellulose) à une concentration de 20 μM Le décompte du nombre de colonies granulo-macrophagiques se fait sur un microscope inversé après 14 jours de culture dans un incubateur à 37 ^, C avec 5 96 de CO ₂ .

Exemple 1 : Effet des oligonucléotides antisens sur des cellules mononucléées de moelles normales.

L'effet des oligonucléotides antisens dirigés contre les deux types de jonction bcr-abl a été testé sur des cellules mononucléées non- leucémiques en incubation continue, et comparé à leurs contrôles "sens" respectifs, ainsi qu'à un témoin sans oligonucléotides. Les oligonucléotides utilisés sont décrits dans la Figure 3. Les oligonucléotides antisens utilisés étaient ceux complémentaires à la séquence b2a2 et à la séquence b3a2.

Ajoutés à des cellules mononucléées totales de moelle normale, les oligonucléotides sens GT-3 et GT-4, ou antisens GT-1 et GT-2 (Figure 3), ont inhibé de manière non spécifique la pousse des progéniteurs granulo- macrophagiques de 60±10 % (résultats non montrés).

L'effet de l'incubation des cellules mononucléées CD34+ avec les oligonucléotides sens GT-3 et GT-4 et antisens GT-1 et GT-2 (Figure 3), a été étudié sur deux échantillons de moelle normale. L'inhibition de la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques par les oligonucléotides antisens GT-1 ou GT-2 a été de 40 %, les contrôles sens GT-3 et GT-4 inhibant de 10 % dans les mêmes conditions (Figure 4).

L'inhibition spécifique des oligonucléotides antisens GT-1 et GT-2 sur des cellules CD34+ provenant des moelles normales, pourrait indiquer la sensibilité aux oligonucléotides antisens des ARN messagers normaux bcr et/ou abl, transcrits à partir des gènes non transloqués.

Exemnle 2 : Effet des oligonucléotides antisens sur des cellules mononucléées de patients atteints de LMC

Ajoutés en incubation continue à des cellules mononucléées totales du sang de sujets atteints de LMC b2a2 ou b3a2, les oligonucléotides sens ou antisens (Figure 3) n'ont pas modifié la pousse des progéniteurs granulo- macrophagiques (résultats non montrés). Ajoutés en incubation continue à des cellules mononucléées CD34+ prélevées sur des sujets atteints de LMC, les oligonucléotides antisens dirigés contre la jonction b2a2 ont inhibé spécifiquement de 38 % la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques (Figure 4). Dans le cas du patient présentant une LMC de type b3a2, les oligonucléotides antisens correspondants ont inhibé spécifiquement de 70 96 la pousse des progéniteurs granulo-macrophagiques.

Il a donc été constaté que les oligonucléotides antisens phosphorodiesters contenant les séquences complémentaires aux séquences b2a2 ou b3a2 des translocations caractéristiques du chromosome Philadelphie sont capables d'inhiber la pousse des progéniteurs myéloïdes à partir des cellules mononucléées CD34+ des sujets ayant une LMC.

La présente invention concerne donc le traitement ex vivo des cellules mononucléées CD34+ provenant des patients atteints de LMC en phase chronique, avec des oligonucléotides antisens spécifiques de la jonction bcr-abl présente dans ces patients (b2a2 ou b3a2). Une fois que les cellules CD34+ ont été traitées par l'oligonucléotide antisens de séquence appropriée, il reste à contrôler que l'expression du gène bcr-abl a été réprimée, et qu'il ne reste plus de progéniteurs de cellules leucémiques. Ceci se fait par quantification de l'expression du gène bcr- abl par PCR inverse et par vérification de la disparition de colonies leucémiques dans des tests de clonogénicité (Réf. : Metcalf, D., Nicolas, NA, Blood, 1992, 79:2861).

Les opérations ultérieures consistent à réinjecter les cellules ainsi traitées, parmi lesquelles on a éliminé les cellules leucémiques, grâce au procédé selon l'invention. Cette réinjection se fait éventuellement après que le patient ait subi une chimiothérapie lourde avec ou sans irradiation corporelle totale.

En pratique, l'utilisation d'oligonucléotides antisens dans la LMC pourra servir à éliminer la maladie résiduelle chez les patients en rémission partielle, par transfusion de cellules autologues ainsi purgées.

IDENTIFICATEUR DE SEQUENCE Cl) INFORMATIONS GENERALES : i) DEPOSANT:

CA) NOM : GENSET

00 RUE : 1 Rue Robert et Sonia Delaunay

CO VILLE : PARIS

CD) ETAT OU PROVINCE :

CE) PAYS : FRANCE

CF) CODE POSTAL : 75011

CG) TELEPHONE : 43565900

CH) TELEFAX : 43562625

Cϋ) TITRE DE L'INVENTION : "METHODE DE TRAITEMENT EX VIVO DE CELLULES TUMORALES DE PATIENTS ATTEINTS DE LMC"

Ci i) NOMBRE DE SEQUENCES : 14

Civ) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR :

CA) TYPE DE SUPPORT : DISQUETTE

CB) ORDINATEUR : MAC INTOSH

CO SYSTEME D'EXPLOITATION :MAC OS - SYSTEME 7 CD) LOGICIEL : WORD PERFECT VERSION 2.0.

C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N ^* : 1 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 18 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 1 :

GAAGGGCTTC TTCCTTAT 18

C3) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 2 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 18 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 2 :

GAAGGGCUUC UUCCUUAU 18

C4) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 3 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 20 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cϋ) TYPE DE MOLECULE : ADN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 3 :

TGAAGGGCTT CTTCCTTATT 20

C5) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 4 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 20 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 4 :

UGAAGGGCUU CUUCCUUAUU 20

C6) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 5 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 22 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 5 :

CTGAAGGGCT TCTTCCTTAT TG 22

C7) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 6 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 22 nucléotides

CC) NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° : 6 :

CUGAAGGGCU UCUUCCUUAU UG 22

C8) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 7 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 18 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b3a2 ou K28

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N* : 7 :

GAAGGGCTTT TGAACTCT 18

C9) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 8 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 18 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b3a2 ou K28

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 8 :

GAAGGGCUUU UGAACUCU 18

C10) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 9 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 20 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 9 :

TGAAGGGCTT TTGAACTCTG 20

Cil) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 10 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 20 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 10 :

UGAAGGGCUU UUGAACUCUG 20

C12) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 11 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 22 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ADN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémenta re de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 11 :

CTGAAGGGCT TTTGAACTCT GC 22

C13) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 12 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 22 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : séquence complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 12 :

CUGAAGGGCU UUUGAACUCU GC 22

C14) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N ^* : 13 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 60 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN messager

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : ARN messager centré sur la jonction bcr-abl de type b2a2 ou L6 de patients atteints de LMC.

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 13 :

ACAGCAUUCC GCUGACCAUC AAUAAGGAAG AAGCCCUUCA GCGGCCAGUA GCAUCUGACU 60

C15) INFORMATIONS POUR LA SEQUENCE N° : 14 :

Ci) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :

CA) TYPE : oligonucléotide

CB) LONGUEUR : 100 nucléotides CO NOMBRE DE BRINS : 1

Cii) TYPE DE MOLECULE : ARN messager

Ciii) HYPOTHETIQUE : NON

Civ) ANTI-SENS : OUI

Cv) AUTRES RENSEIGNEMENTS : ARN messager centré sur la jonction bcr-abl de type b3a2 ou K28 de patients atteints de LMC .

Cvi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N ^* : 14 :

ACUCAGCCAC UGGAUUUAAG CAGAGUUCAA AAGCCCUUCA GCGGCCAGUA CGAUCUGACU 60