PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DE GLUTEN EN ALIMENTOS, PROCESADOS Y NO PROCESADOS POR CALOR, COMPATIBLE CON ELISA, COMPOSICIÓN Y KITS QUE COMPRENDEN DICHA COMPOSICIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona, en general, con el análisis de alimentos para enfermos celiacos, y, en particular, se refiere a un procedimiento para la extracción de gluten en alimentos, compatible con un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA), a composiciones adecuadas para la puesta en práctica de dicho procedimiento, a kits que comprenden dichas composiciones y a un método para la cuantificación por ELISA del gluten presente en un alimento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Enfermedad Celiaca (EC) es una enfermedad caracterizada por una intolerancia a las prolaminas del gluten de trigo, cebada, centeno y avena, que provoca cambios en el intestino que conllevan a una malabsorción.

E1 gluten. comprende una mezcla compleja de proteínas y, mientras no se conozca el componente o componentes tóxicos del gluten causantes de la EC, la solución provisional consiste en la eliminación de todos los componentes del gluten en la dieta de estos enfermos. De hecho, el único tratamiento realmente eficaz para los pacientes celiacos consiste en seguir una dieta estrictamente libre de gluten.

Por este motivo, resulta esencial la cuantificación precisa del contenido en gluten de los alimentos destinados a ser ingeridos por los enfermos celiacos.

Sin embargo, la medida fiable del contenido en gluten de los alimentos ha sido una de las asignaturas pendientes en los últimos años. Actualmente el gluten se determina por métodos. epítopo-dependientes, tipo ELISA, que emplean anticuerpos monoclonales o policlonales. Un ELISA útil para

cuantificar el gluten contenido en alimentos lo describen L.

Sorell et al., en el artículo titulado AAn innovative sandwich ELISA system based on an antibody cocktail for gluten analysis", publicado en FEBS letters, 439,46-50 (1988).

El protocolo rutinario de análisis de gluten en alimentos para celiacos, tanto procesados por calor como no procesados por calor, consiste en una extracción del gluten con una solución acuosa de etanol al 60% (60% etanol/agua) seguido de su cuantificación por ELISA.

Uno de los grandes problemas relacionados con la analítica del gluten en alimentos radica en que una gran parte de los alimentos para celiacos son procesados durante su elaboración a elevadas temperaturas (150-220°C). Debido a este tratamiento térmico, la mayoría de las fracciones tóxicas del gluten (a-, 3-y y-gliadinas) se desnaturalizan y se hacen insolubles por lo que no pueden ser extraídas con 60% etanol/agua. Como consecuencia de ello, el contenido en gluten de estos alimentos procesados por calor, independientemente del ELISA utilizado, no resulta fiable.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se enfrenta con el problema de desarrollar un procedimiento para la extracción cuantitativa del gluten contenido en alimentos, compatible con los ELISA actualmente existentes para la cuantificación de gluten en alimentos.

La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que el empleo de una composición que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y un agente disociante en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8, antes de extraer el gluten con una solución acuosa de etanol al 60%, solubiliza las fracciones tóxicas del gluten, lo que permite analizar cuantitativamente el gluten contenido en alimentos.

El rendimiento de extracción de gluten en alimentos alcanzado mediante el procedimiento desarrollado por esta invención es muy superior al obtenido mediante el sistema convencional de extracción de gluten basado únicamente en el empleo de 60% etanol/agua, tal como se muestra en las Tablas 1 y 2 (véanse los Ejemplos 1 y 3). Asimismo, la recuperación de gluten tanto en alimentos procesados por calor como en alimentos no procesados por calor es prácticamente cuantitativa, tal como se pone de manifiesto en la Figura 1 (véase el Ejemplo 2).

Un objeto de esta invención lo constituye un procedimiento para la extracción de gluten en alimentos, compatible con ELISA, que comprende efectuar la extracción del gluten con una solución acuosa de etanol en presencia de una composición que contiene un agente reductor de grupos disulfuro y un agente disociante en un tampón con un pH comprendido entre 7 y 8.

Un objeto adicional de esta invención lo constituye dicha composición útil para la puesta en práctica de dicho procedimiento de extracción de gluten en alimentos.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para la cuantificación por ELISA del gluten presente en una muestra de un alimento que comprende la extracción previa del gluten contenido en dicha muestra mediante el procedimiento de extracción de gluten previamente mencionado.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un kit que comprende dicha composición útil para la puesta en práctica de dicho procedimiento de extracción de gluten en alimentos, o sus componentes por separado. Dicho kit puede ser utilizado para extraer el gluten contenido en un alimento como paso previo a la cuantificación por ELISA del gluten contenido en un alimento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama de barras que representa el porcentaje de recuperación de gluten tanto en panes procesados a distintas temperaturas como en la harina con la que se han fabricado dichos panes, extraído mediante el procedimiento de extracción de gluten proporcionado por esta invención [INVENCIÓN] o mediante un método de referencia [60% ETANOL] (véase el Ejemplo 2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona una composición, en adelante composición de la invención, que comprende un agente reductor de grupos disulfuro y un agente disociante, en un tampón de pH comprendido entre 7 y 8.

El agente reductor de grupos disulfuro puede ser cualquier compuesto capaz de reducir grupos disulfuro, por ejemplo, 2-mercaptoetanol (2-ME), ditiotreitol, etc., y sus mezclas. La concentración del agente reductor de grupos disulfuro en la composición de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otras cosas, del agente reductor de grupos disulfuro en cuestión.

El agente disociante puede ser cualquier compuesto con la capacidad de abrir la conformación de las proteínas haciendo más accesible determinadas zonas de la cadena polipeptídica a reactivos externos y anticuerpos, por ejemplo, hidrocloruro de guanidina, urea, etc., y sus mezclas. La concentración del agente disociante en la composición de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otras cosas, del agente disociante en cuestión. En una realización particular, el agente disociante es hidrocloruro de guanidina, y la concentración de dicho compuesto en la composición de la invención está comprendida entre 1 y 6 M. Análogamente, en otra realización particular, el agente disociante es urea y la concentración de dicho compuesto en la composición de la

invención está comprendida entre 1 y 5 M.

El tampón puede ser cualquier disolución reguladora del pH de una disolución que tampone a un valor de pH comprendido entre 7 y 8, por ejemplo, solución salina con fosfatos (PBS) con un pH comprendido entre 7 y 8, Tris con un pH comprendido entre 7 y 8, etc.

En una realización particular de la composición de la invención, el agente reductor de grupos disulfuro es el 2-ME, el agente disociante es el hidrocloruro de guanidina, y el tampón es PBS con un pH comprendido entre 7 y 8.

La composición de la invención es útil como"cóctel"de extracción de gluten en alimentos, tanto procesados por calor como no procesados por calor. Ha resultado sorprendente comprobar que el empleo de la composición de la invención en la extracción de gluten (que contiene un agente reductor de grupos disulfuro y un agente disociante en un tampón con un pH determinado) no afecta adversamente a la cuantificación por ELISA del gluten contenido en un alimento.

La invención también proporciona un procedimiento para la extracción de gluten en una muestra de un alimento, en adelante procedimiento de la invención, que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra con una solución acuosa de etanol en presencia de la composición de la invención.

De forma más concreta, el procedimiento de la invención, que comprende extraer el gluten con una solución acuosa de etanol y separar el sobrenadante que contiene el gluten extraído, se caracteriza porque antes de la extracción con dicha solución acuosa de etanol, la muestra a ensayar se mezcla con la composición de la invención, se incuba a una temperatura comprendida entre 37°C y 50°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 60 minutos, y se enfría hasta temperatura ambiente.

La concentración de etanol en la solución acuosa de etanol puede variar dentro de un amplio intervalo. En una realización particular, dicha solución acuosa de etanol tiene

un contenido en etanol comprendido entre el 50% y el 70%.

La muestra de alimento a ensayar se prepara por los métodos convencionales, que incluyen, en su caso, la molienda de la muestra, y se deposita en un recipiente apropiado, por ejemplo, un tubo de propileno. A continuación, se añade la composición de la invención, se cierra el recipiente y la mezcla resultante se agita. Ventajosamente, el recipiente que contiene dicha mezcla se sella, por ejemplo, con papel parafilm, con el fin de evitar la evaporación de dicha mezcla por acción del calor. En una realización particular, la incubación de la muestra con la composición de la invención se efectúa a una temperatura de 50°C durante 40 minutos.

Finalizada la incubación, la mezcla resultante se deja enfriar hasta temperatura ambiente (entre 15°C y 25°C). A continuación, se añade una solución acuosa de etanol, tal como una solución acuosa de etanol al 60%, a dicha mezcla y se incuba a una temperatura y durante un periodo de tiempo apropiado, por ejemplo, a temperatura ambiente durante 1 hora, con agitación. Posteriormente, la mezcla de reacción se centrifuga, se retira el sobrenadante (que contiene el gluten extraído) y, finalmente, se cuantifica el contenido en gluten mediante un ELISA del tipo habitualmente utilizado en la cuantificación de gluten en alimentos.

Mediante el procedimiento de la invención se solubiliza 'prácticamente la totalidad de las fracciones tóxicas del gluten contenido en alimentos, tanto procesados por calor como no procesados por calor. Aunque no se desea estar vinculado por ninguna teoría, se cree que la composición de la invención actúa abriendo la conformación de las proteínas constituyentes del gluten, en particular, de la fracción tóxica del mismo, y, como consecuencia de ello, se favorece su solubilidad en el medio de extracción. Efectivamente, durante el procesamiento térmico de los alimentos, las fracciones del gluten (las a-, p-, y y-gliadinas) se desnaturalizan, se rompen los puentes disulfuro y,

consecuentemente, se forman agregados insolubles que no pueden ser extraídos con 60% etanol/agua. El efecto combinado de los componentes de la composición de la invención hace que (i) el agregado insoluble pueda ser extraído con una solución acuosa de etanol (50-705s etanol/agua) y cuantificado por ELISA y (ii) que aumente la conformación de las moléculas de gluten quedando los determinantes antigénicos más expuestos a los anticuerpos, lo que provoca un aumento en la señal de ELISA.

No se conocen procedimientos de extracción cuantitativa de gluten en alimentos compatibles con los ELISA disponibles para su cuantificación. Ha resultado sorprendente comprobar que el empleo de un agente reductor de puentes disulfuro, tal como 2-ME, en combinación con un agente disociante, tal como hidrocloruro de guanidina, permite extraer cuantitativamente (véase el Ejemplo 2) el gluten contenido tanto en alimentos procesados por calor como en alimentos no tratados con calor, sin afectar adversamente a su cuantificación por ELISA. Los resultados mostrados en la Figura 1 (Ejemplo 2) indican claramente que el procedimiento de la invención constituye una herramienta muy apropiada previa a la cuantificación por ELISA del gluten en alimentos para celiacos procesados y no procesados por calor.

El procedimiento de la invención, parece constituir, por 'tanto, un procedimiento general de extracción de gluten de alimentos, especialmente destinados a los enfermos celiacos, tanto procesados por calor como no procesados por calor, que solubiliza las fracciones tóxicas del gluten permitiendo analizar cuantitativamente el gluten en este tipo de alimentos.

La invención también proporciona un método para la cuantificación por ELISA del gluten presente en una muestra de un alimento que comprende extraer el gluten contenido en dicha muestra mediante el procedimiento de la invención y, a continuación, cuantificar por ELISA el gluten previamente

extraído.

La invención también proporciona un kit que comprende la composición de la invención, o los componentes de dicha composición parcialmente mezclados o separados. Este kit puede ser utilizado para extraer el gluten contenido en una muestra de un alimento, tanto procesado por calor como no procesado por calor, o bien, para extraer el gluten como paso previo a su cuantificación por ELISA con el fin de determinar el contenido en gluten de la muestra de alimento ensayada. El kit puede contener, además, el resto de reactivos necesarios para la extracción del gluten, es decir, la solución acuosa de etanol o bien sus componentes por separado, y/o los reactivos necesarios para la realización de un ELISA para cuantificar el gluten contenido en un alimento, mezclados total o parcialmente entre sí o separados.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.

EJEMPLO 1 Recuperación de gluten en alimentos procesados con calor Se realizó este ensayo para comparar la eficacia del procedimiento proporcionado por esta invención en la extracción de gluten en alimentos procesados por calor, a Diferentes temperaturas, frente a la del método utilizado habitualmente (Método de referencia).

1. 1 Materiales Para la realización de este ejemplo se utilizaron los siguientes alimentos : A) Alimentos sometidos a temperaturas elevadas durante el proceso de elaboración (180-220°C) : A. 1)"sin gluten"pero contaminados de gluten (es decir, alimentos donde se declara que no contienen gluten

pero que, en realidad sí contienen gluten); A. 2) alimentos que contienen gluten; y A. 3) alimentos"sin gluten"no contaminados de gluten (es decir, alimentos que no contienen gluten y se utilizan como controles).

B) Alimentos sometidos a temperaturas intermedias (110°C aproximadamente) : almidones contaminados con gluten.

1.2 Método de referencia El método de referencia es el método utilizado actualmente en la extracción de gluten utilizando una solución acuosa de etanol al 60%.

Para la realización de este método se pesan 0,125 g de la muestra de alimento molida y se depositan en un tubo de propileno de 10 ml. A continuación, se añaden 5 ml de solución 60% etanol y la mezcla de reacción se incuba durante 1 hora, a temperatura ambiente, en un agitador rotatorio [Modelo LABINCO BV (posición 2-3)]. Finalizada la incubación, las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 3.500 rpm (2.500 g), a temperatura ambiente (Centrífuga 5810 Eppendorf), y el sobrenadante se pasa a unos tubos de propileno limpios de 10 ml y, a continuación, se analizan mediante un ELISA basado en un único anticuerpo monoclonal 1. 15, utilizado como captura conjugado a peroxidasa de rábano picante [este ELISA es similar al descrito por L. Sorell et al., FEBS Letters, 439,46-50 (1988) excepto que, en este caso, el sandwich del ELISA está basado en un único anticuerpo monoclonal R5, utilizado como captura y conjugado a peroxidasa de rábano picante; este ELISA permite cuantificar el gluten de trigo, cebada y centeno con una sensibilidad de detección de 1,5 ppm].

La solución acuosa de etanol al 60% se prepara mezclando, por ejemplo en una probeta, 300 ml de etanol (Scharlau Nv 121) y 200 ml de agua milli-Q (resistividad 18

MQcm) y se guarda en frasco de vidrio.

1.3 Procedimiento de la invención E1 procedimiento de la invención consiste en efectuar la extracción de gluten utilizando una solución acuosa de etanol al 60% en presencia de un agente reductor y de un agente disociante y en presencia de un tampón de pH 7-8.

Para la realización de este procedimiento se pesan 0,125 g de la muestra de alimento molida y se depositan en un tubo de propileno de 10 ml. A continuación, se añaden 1,25 ml de una composición (cóctel de extracción) constituida por 2-ME 250 mM, hidrocloruro de guanidina 2 M y 0, lx PBS. Los tubos se cierran con el tapón de rosca/presión y se sellan con papel parafilm para evitar la evaporación por el calor. La mezcla de reacción se mezcla en un vortex y se incuba en una estufa a 50°C durante 40 minutos. Finalizada la incubación, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta temperatura ambiente, y se añaden 3,75 ml de una solución acuosa al 80% de etanol a la mezcla de reacción y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador rotatorio [Modelo LABINCO BV (posición 2-3)]. Posteriormente, las muestras se centrifugan durante 10 minutos a 3.500 rpm (2.500 g) a temperatura ambiente (Centrífuga 5810 Eppendorf) y el sobrenadante se pasa a tubos de propileno limpios de 10 ml de propileno y, a continuación, se analizan por ELISA.

La solución acuosa de etanol al 80% se prepara mezclando, por ejemplo en una probeta, 400 ml de etanol (Scharlau Nv 121) y 100 ml de agua milli-Q (resistividad 18 MQcm) y se guarda en frasco de vidrio.

La composición o cóctel de extracción, constituida por 2-ME 250 mM, hidrocloruro de guanidina 2 M y 0, lx PBS, se prepara, por ejemplo, pesando 3,8 g de hidrocloruro de guanidina Mr 95,53 (Fluka 50940) y añadiendo 15-18 ml de una solución de PBS (O, lx). A continuación se añaden 349 ul de 2- ME 14,29 M (Sigma M-6250), se enrasa hasta 20 ml con solución

PBS (O, lx) y se mezcla hasta disolución total.

La solución de PBS 0, lx se puede preparar diluyendo 1 : 100 una solución de PBS lOx. Para ello, se añade 1 ml de PBS lOx en una probeta y se enrasa hasta 100 ml con agua milli-Q (resistividad 18 MQcm). La solución resultante debe tener un pH comprendido entre 7 y 8. La solución de PBS lOx se puede preparar mezclando y disolviendo 80 g de NaCl, 2 g de KC1,14,4 g de Na2HPO4 y 2,4 g de KH, P04 en 900-950 ml de agua destilada, en un vaso de precipitado de 1 1 con agitación magnética y enrasando la solución resultante con agua destilada hasta 1.000 ml en un matraz aforado. La solución obtenida se almacena a temperatura ambiente.

1.4 Resultados La Tabla 1 muestra los valores de ELISA de 23 muestras de alimentos ("sin gluten"pero contaminados de gluten, alimentos que contienen gluten, y almidones contaminados con gluten) que han sido tratados a temperaturas elevadas, y 3 controles de alimentos"sin gluten"no contaminados de gluten.

En dicha Tabla 1 puede apreciarse claramente, en las 23 muestras ensayadas, un aumento en el porcentaje de gluten extraído con el procedimiento de la invención. E1 incremento del valor oscila entre aproximadamente un 30% y 'aproximadamente un 173% en la mayoría de los alimentos excepto en los 3 controles. E1 porcentaje medio del incremento del valor del gluten en estos alimentos es de un 70,4%.

Tabla 1 Análisis de gluten en alimentos procesados con calor extraídos con 60% etanol y con el cóctel de extracción Muestra 60% Cóctel de % Etanol Extracción Aumento 4064 1, 5 4, 1 173, 3 4062 9,2 9,5 3,3 "Sin gluten"4011 3,9 6,2 59,0 contaminadas 1143 4,1 10,3 151,2 3177 3,9 7,9 102,6 3181 4,1 9,2 124,4 220°C 3569 13,9 25,5 83,5 3576 8,4 21,3 153,6 "gluten"3577 15,4 20,7 34,4 3578 3,1 4,2 35,5 3579 7,6 7,9 3,9 3619 8, 6 11, 2 30, 2 3624 14,5 18,8 29,7 3683 3,6 7,9 119,4 3817 7,8 14,0 79,5 2162 4,0 6,9 72,5 110°C"Almidones"4146 2,0 3,7 85,0<BR> ') "gluten"2159 6,5 9,4 44,6 2160 5,0 6,9 38,0 2161 3,0 4,1 36,7 3592 8,2 14, 2 73,2 2195 6,3 10,2 61,9 2163 4,3 5,8 34,9 3515 <0, 15 <0, 15 0, 0 220°C"Sin gluten"3428 <0,15 <0,15 0,0 3511 <0,15 <0,15 0,0 70,4

EJEMPLO 2 Recuperación cuantitativa de gluten en alimentos procesados con calor Este ensayo pone de manifiesto la recuperación cuantitativa de gluten, obtenida mediante el procedimiento proporcionado por esta invención, en alimentos procesados con calor, a diferentes temperaturas, frente a la recuperación no cuantitativa de gluten obtenida utilizando el método de extracción habitual con etanol 60% (Método de referencia).

2.1 Materiales Para la realización de este ejemplo se utilizaron : 1) panes elaborados a temperaturas diferentes : 20°C, 60°C, 70°C, 90°C, 115°C, 150°C y 220°C ; y 2) la harina con la que se elaboraron dichos panes.

2.2 Método de referencia El método de referencia es el método utilizado actualmente en la extracción de gluten utilizando una solución acuosa de etanol al 60% [véase el Ejemplo 1.2].

2.3 Procedimiento de la invención El procedimiento de la invención consiste en efectuar la extracción de gluten utilizando una solución acuosa de etanol al 60% en presencia de un agente reductor y de un agente disociante y en presencia de un tampón de pH 7-8 [véase el Ejemplo 1.3].

2.4 Resultados Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 1, que representa el porcentaje de la recuperación de gluten en panes procesados a distintas temperaturas y en la harina con

la que se han fabricado dichos panes, y extraído mediante el método de referencia o mediante el procedimiento de la invención. En el eje de abscisas se representan las temperaturas del procesamiento del pan y en ordenadas se representa el porcentaje de recuperación de gluten, considerando el porcentaje recuperado en la harina utilizada para fabricar dichos panes como el 100%. En dicha Figura 1 se pone de manifiesto claramente la recuperación cuantitativa de gluten en los panes procesados a diferentes temperaturas (prácticamente del 100% a cualquier temperatura de procesado del pan) mediante el empleo del procedimiento de la invención frente a la recuperación no cuantitativa obtenida utilizando el método de referencia (60% etanol), observándose en este caso una reducción continua y progresiva del gluten recuperado (la recuperación de gluten disminuye proporcionalmente a medida que aumenta la temperatura de procesado del pan).

EJEMPLO 3 Recuperación de gluten en alimentos no tratados con calor Se realizó este ensayo para comparar la eficacia del procedimiento proporcionado por esta invención en la extracción de gluten en alimentos no tratados con calor, frente a la del método utilizado habitualmente (Método de referencia) 3.1 Materiales Para la realización de este ejemplo se utilizaron 7 muestras de harina de trigo (Tr) y 1 de centeno (Cn) sin tratar con calor (véase la Tabla 2).

3.2 Método de referencia E1 método de referencia es el método utilizado actualmente en la extracción de gluten utilizando una solución acuosa de etanol al 60% [véase el Ejemplo 1.2].

3.3 Procedimiento de la invención E1 procedimiento de la invención consiste en efectuar la extracción de gluten utilizando una solución acuosa de etanol al 60% en presencia de un agente reductor y de un agente disociante y en presencia de un tampón de pH 7-8 [véase el Ejemplo 1.3].

3.4 Resultados La Tabla 2 muestra los valores de ELISA de 8 muestras de alimentos no tratados con calor. En dicha Tabla 2 puede apreciarse claramente, en las 8 muestras ensayadas, un aumento en el porcentaje de gluten extraído con el procedimiento de la invención. E1 incremento del valor oscila entre aproximadamente un 12% y aproximadamente un 47% en todos los alimentos incluidos los controles. El porcentaje medio del incremento del valor del gluten en estos alimentos es de un 27,3%.

Tabla 2 Análisis de gluten en alimentos no tratados con calor extraídos con 60% etanol y con el cóctel de extracción Muestra 60% Cóctel de % Etanol Extracción Aumento Tr I 5,6 8,2 46,4 Tr II 3,2 3,6 12,5 Tr III 5,6 8,1 44,6 Tr IV 5, 2 6,1 17,3 Tr V 4,3 5,1 18,6 Tr VI 8,1 9,5 17,3 Tr VII 1,4 1,8 28,6 Cn I 7,3 9,7 32,9 27, 3