Unerwünschtes Pilzwachstum, das in der Landwirtschaft jedes Jahr zu beträchtlichen Schäden führt, kann durch die Verwendung von Fungiziden kontrolliert werden Die Ansprüche an Fungi- zide sind dabei hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, Kosten und vor allem ihrer Umweltverträglichkeit stetig angestiegen. Es existiert deshalb ein Bedarf an neuen Substanzen bzw. Substanzklassen, die zu leistungsfähigen und umweltverträglichen neuen Fungiziden entwickelt werden können. Im Allgemeinen ist es üblich, in Gewächshaustests nach solchen neuen Leitstrukturen zu suchen.

Solche Tests sind jedoch arbeitsintensiv und teuer. Die Anzahl der Substanzen, die im Gewächs- haus getestet werden können, ist entsprechend begrenzt. Eine Alternative zu solchen Tests ist die Verwendung von sogenannten Hochdurchsatzverfahren (HTS = high throughput screening). Dabei werden in einem automatisierten Verfahren eine große Anzahl von Einzelsubstanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf Zellen, individuelle Genprodukte oder Gene getestet. Wird für bestimmte Substanzen eine Wirkung nachgewiesen, so können diese in herkömmlichen Screeningverfahren untersucht und gegebenenfalls weiter entwickelt werden.

Vorteilhafte Angriffspunkte für Fungizide werden oft in essentiellen Biosynthesewegen gesucht.

Ideale Fungizide sind weiterhin solche Stoffe, die Genprodukte hemmen, die eine entscheidende Bedeutung bei der Ausprägung der Pathogenität eines Pilzes haben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, einen geeigneten neuen Angriffspunkt für potentielle fungizide Wirkstoffe zu identifizieren und zugänglich zu machen, und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Identifizierung von Modulatoren dieses Angriffspunkts ermög- licht, die dann als Fungizide verwendet werden können.

Pyruvatkinase (EC No. 2.7. 1.40), im Folgenden auch mit PK abgekürzt, ist das letzte Enzym in der Glykolyse, dem wichtigsten Abbauweg von Glucose in eukaryontischen Zellen. Synonyme für die Pyruvatkinase sind auch die Bezeichnungen Phosphoenolpyruvatkinase, Phosphoenol-Transphos- phorylase oder Pyruvat-2-0-phosphotransferase. Die PK bewirkt die Umwandlung von Phos- phoenolpyruvat und ADP in Pyruvat und ATP. Die enzymatische Aktivität der PK kann also schematisch wir folgt dargestellt werden : Phosphoenolpyruvat + ADP + H+ <=> Pyruvat + ATP.

Dies ist die zweite der ATP-bildenden Reaktionen (neben der Phosphoglycerat Kinase-Reaktion) in der Glykolyse. Die Reaktion kann in zwei Hälften unterteilt werden (Muirhead et al., 1986).

Zunächst wird das Phosphat von Phosphoenolpyruvat unter Bildung eines Pyruvat-enolations (stabilisiert durch ein Mg2+ Ion) direkt auf ADP übertragen. Anschließend wird das Pyruvatenolat protoniert und isomerisiert zum Pyruvat. Diese Isomerisierung zur Ketoform erfolgt praktisch quantitativ und stellt die Antriebskraft für die Reaktion dar.

Die PK stellt einen wichtigen Regulierungspunkt im Stoffwechsel einer Zelle dar, da sie für den glykolytischen Stoffwechsel hochaktiv, bei aktiver Gluconeogenese jedoch inaktiv sein muss, um nicht neugebildetes Phosphoenolpyruvat in einem Leerlaufzyklus wieder abzubauen. Die Kinetik und Regulation der PK ist gut untersucht (zusammengefasst z. B. in Muirhead, 1987 und Boles, 1997). In Säugern gibt es vier verschiedene PK Isoenzyme (L, R, Ml und M2), die sich in ihren kinetischen Eigenschaften unterscheiden. Die M2, L und R-Formen werden allosterisch reguliert : Fructose-1, 6-bisphosphate, Phosphoenolpyruvat, ADP, K+-und NH4-Ionen wirken aktivierend, Zitronensäure und ATP reprimierend. Das Mi-Enzym ist nicht allosterisch reguliert. S. cerevisiae verfügt nur über ein PK Isoenzym, das in seinen regulatorischen Eigenschaften der M2 Isoform aus Säugern ähnelt.

Gene für die Pyruvatkinase wurden aus verschiedenen Organismen kloniert, darunter auch aus den Pilzen Neurospora crassa (TrEMBL Accession No. EAA30602), Trichoderma reesei (Swissprot Accession No. P31865), Emericella nidulans (Swissprot Accession No. P22360), Aspergillus niger (Swissprot Accession No. Q122669), Aspergillus oryzae (TrEMBL Accession No. Q9HGY6), Kluyveromyces lactis (TrEMBL Accession No. Q875M9), Yarrowia lipolytica (Swissprot Accession No. P30614), Schizosaccharomyces pombe (Swissprot Accession No. Q10208), Agaricus bisporus (Swissprot Accession No. 094122) sowie aus Saecharomyces cerevisiae (PYKI, Swissprot Accession No. P00549 und PYK2, Swissprot Accession No. P52489). Die Sequenzähnlichkeiten sind innerhalb der eukaryontischen Klassen signifikant. Auch in DNA- Sequenzen einiger pflanzenpathogener Pilze, die aus verschiedenen Sequenzierprojekten stammen, wurden Pyruvate Kinase Gene aufgrund von Sequenzähnlichkeiten annotiert, z. B. für Magnaporthe grisea (Locus No. MG08063. 1, Zugang : http ://www- genome. wi. mit. edu/annotation/fungi/magnaporthe/geneindex. html) oder für Botrytis cinerea, Blumeria grarninis, Mycosphaerella gramifaicola oder Phytophthora infestans (Sequenzen BfCon [1384], Bg [0304], mgall26f, PiCon [0026], Zugang : http ://cogeme. ex. ac. uk/search. html).

In der medizinischen Forschung wurde bereits die Bedeutung der Pyruvatkinase erforscht. Tumor- zellen enthalten im Gegensatz zu den meisten anderen Geweben hauptsächlich das M2-Isozym der PK (zusammengefasst in Mazurek und Eigenbrodt, 2003). Daher wird die PK als möglicher

Ansatzpunkt für die Bekämpfung von Tumoren angesehen (WO 01/96535 A2, US 2001/0046997 Al, WO 02/095063 Al). Es sind auch Inhibitoren der Pyruvatkinase bekannt geworden, die als Pharmazeutika gegen verschiedene Krankheiten wie Krebs oder Alzheimer verwendet werden können (US 2001/0046997 A1). Eine mögliche Rolle der Pyruvatkinase als Angriffspunkt von fungiziden Wirkstoffen wurde dagegen noch nicht untersucht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es nun, neue Angriffspunkte von Fungiziden in Pilzen, insbesondere in phytopathogenen Pilzen, zu identifizieren und ein Verfahren zugänglich zu machen, in denen Inhibitoren eines solchen Angriffspunktes bzw. Polypeptids identifiziert und auf ihre fungiziden Eigenschaften hin geprüft werden können. Die Aufgabe wurde gelöst, indem die Pyruvatkinase als ein Angriffspunkt für fungizide Wirkstoffe identifiziert wurde, die für Pyruvatkinase kodierende Nukleinsäure aus einem phytopathogenen Pilz, Ustilago maydis, isoliert, das davon kodierte Polypeptid gewonnen und ein Verfahren zur Verfügung gestellt wurde, mit dem Inhibitoren dieses Enzyms bestimmt werden können. Die mit diesem Verfahren identifizierten Inhibitoren können its vivo gegen Pilze eingesetzt werden.

Beschreibung der Abbildungen Abbildung 1 : Schematische Darstellung der von der Pyruvatkinase katalysierten Reaktion.

Die Pyruvatkinase katalysiert die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und ADP zu Pyruvat und ATP.

Abbildung 2 : Sequenz-Alignment zur Darstellung der Homologie zwischen Pyruvatkinasen aus verschiedenen Pilzen. Besonders homologe Bereiche (Konsensussequenz) sind schwarz unterlegt dargestellt.

Abbildung 3 : Graphische Darstellung der Kinetik der NADPH-Abnahme in einem ge- koppelten Aktivitätstest für die Pyruvatkinase. Die Reaktion der Pyruvatkinase wurde mit der Reaktion der Lactatdehydrogenase gekoppelt. Es wurden in Testansätzen von 200 Ill pro Well verschiedene LDH-Konzentrationen verwen- det. Bei Verwendung von 1U LDH zeigt sich die Abnahme der NADH- Konzentration besonders deutlich.

Abbildung 4 : Graphische Darstellung der Abnahme der Aktivität der Pyruvatkinase bei Anwesenheit eines Inhibitors. Der Reaktionsverlauf ist für Ansätze mit unter- schiedlichen Konzentrationen der Verbindung 1 und für die Positiv-und Negativkontrolle dargestellt.

SEQ ID NO : 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Pyruvatkinase aus Ustilago maydis.

SEQ ID NO : 2 Aminosäuresequenz der Pyruvatkinase aus Ustilago maydis.

Definitionen Unter dem Begriff"Homologie"bzw. "Identität"soll die Anzahl der übereinstimmenden Amino- säuren (Identität) mit anderen Proteinen, ausgedrückt in Prozent verstanden werden. Bevorzugt wird die Identität durch Vergleiche einer gegebenen Sequenz zu anderen Proteinen mit Hilfe von Computerprogrammen ermittelt. Weisen Sequenzen, die miteinander verglichen werden, unter- schiedliche Längen auf, ist die Identität so zu ermitteln, dass die Anzahl an Aminosäuren, welche die kürzere Sequenz mit der längeren Sequenz gemeinsam hat, den prozentualen Anteil der Identität bestimmt. Die Identität kann standardmäßig mittels bekannten und der Öffentlichkeit zur Verfügung stehenden Computerprogrammen wie z. B. ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680) ermittelt werden. ClustalW wird z. B. öffentich zur Verfügung gestellt von Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg. DE) und Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg. DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany. ClustalW kann ebenfalls von verschiedenen Internetseiten, u. a. beim IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, B. P. 163,67404 Illkirch <BR> <BR> Cedex, France ; ftp ://ftp-igbmc. u-strasbg. fr/pub/) und beim EBI (ftp : //ftp. ebi. ac. uk/pub/software/) sowie bei allen gespiegelten Internetseiten des EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK), heruntergeladen werden. Wenn das ClustalW Computerprogramm der Version 1.8 benutzt wird, um die Identität zwischen z. B. einem gegebenen Referenzprotein und anderen Proteinen zu bestimmen, sind folgende Parameter einzustellen : KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WINDOW=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0. 05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS (OFF), NOPGAP, NOHGAP. Eine Möglichkeit zum Auffinden von ähnlichen Sequenzen ist die Durchführung von Sequenzdatenbankrecherchen. Hierbei wird eine oder werden mehrere Sequenzen als sogenannte Abfrage ("query") vorgegeben. Diese Abfragesequenz wird dann mittels statistischen Computerprogrammen mit Sequenzen, die in den ausgewählten Datenbanken enthalten sind, verglichen. Solche Datenbankabfragen ("blast searches") sind dem Fachmann be- kannt und können bei verschiedenen Anbietern durchgeführt werden. Wird eine solche Daten- bankabfrage z. B. beim NCBI (National Center for Biotechnology Information, http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/) durchgeführt, so sollen die Standardeinstellungen, die für die jeweilige Vergleichsanfrage vorgegeben sind, benutzt werden. Für Proteinsequenzvergleiche ("blastp") sind dieses folgende Einstellungen : Limit entrez = nicht aktiviert ; Filter = low complexity aktiviert ; Expect value = 10 ; word size = 3 ; Matrix = BLOSUM62 ; Gap costs : Existence = 11, Extension = 1. Als Ergebnis einer solchen Abfrage werden neben anderen Para- metern auch der Anteil an Identität zwischen der Abfragesequenz und den in den Datenbanken aufgefundenen ähnlichen Sequenzen dargestellt. Unter einem erfindungsgemäßen Protein sollen

daher im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung solche Proteine verstanden werden, die bei der Verwendung mindestens einer der vorstehend beschriebenen Methoden zur Identitätsbe- stimmung eine Identität von mindestens 70 % aufweisen, bevorzugt von mindestens 75 %, besonders bevorzugt von mindestens 80 %, weiter bevorzugt von mindestens 85 %, und insbesondere von mindestens 90 %.

Der Ausdruck"hybridisieren"oder"Hybridisierung", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vorgang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können z. B. ausgehend von der hierin ge- nannten oder ableitbaren Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen phyto- pathogenen Pilzen als Ustilago maydis isoliert werden, welche für Pyruvatkinasen kodieren, welche dieselben oder ähnliche Eigenschaften einer der erfindungsgemäße Pyruvatkinase auf- weisen.

Hybridisierungsbedingungen werden nach folgender Formel näherungsweise berechnet : <BR> <BR> Schmelztemperatur Tm = 81, 5°C + 16,6 {log [c (Na+)]} + 0,41 (% G + C) - (500/n) (Lottspeich, F.,<BR> Zorbas H. (Hrsg. ). (1998). Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin).

Dabei ist c die Konzentration und n die Länge des hybridisierenden Sequenzabschnitts in Basenpaaren. Für eine Sequenz >100 bp entfällt der Ausdruck 500/n. Mit höchster Stringenz wird bei einer Temperatur 5-15°C unterhalb Tm und einer Ionenstärke von 15 mM Na+ (entspricht 0.1 x SSC) gewaschen. Wird eine RNA-Probe zur Hybridisierung verwendet, so ist der Schmelzpunkt um 10-15°C höher. 20 x SSC-Puffer setzt sich wie folgt zusammen : 1,5 M NaCI, 150 mM Natriumcitrat, pH 7.

Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben : Hybridisierungslösung : DIG Easy Hyb (Roche, ZZ) Hybridisierungstemperatur : 42°C bis 70°C, bevorzugt bei 42-65°C (DNA-DNA) oder 50°C (DNA-RNA). Im vorliegenden Fall besonders geeignete stringente Temperaturen für die Hybridisierung liegen zwischen 50 und 65°C, wobei eine Temperatur von 65°C eine insbesondere geeignete stringente Temperatur darstellt.

1. Waschschritt : 2 x SSC, 0, 1 % SDS 2 x 5 min bei Raumtemperatur ; 2. Waschschritt : 1 x SSC, 0,1 % SDS 2 x 15 min bei 50°C ; bevorzugt 0,5 x SSC, 0,1 % SDS 2 x 15 min bei 65°C ; besonders bevorzugt 0,2 x SSC, 2 x 15 min bei 68°C.

Der Ausdruck"vollständige Pyruvatkinase"wie er hierin verwendet wird, beschreibt eine Pyruvat- kinase, die von einer vollständigen kodierenden Region einer Transkriptionseinheit kodiert wird,

umfassend ein ATG-Startcodon und umfassend alle informationstragenden Exonbereiche des im Herkunftsorganismus vorliegenden, für eine Pyruvatkinase kodierenden Gens, sowie die für eine korrekte Termination der Transkription nötigen Signale.

Der Ausdruck"enzymatische"oder"biologische Aktivität einer Pyruvatkinase"wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit eines Polypeptids, die vorstehend beschriebene Reaktion, d. h. die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat und ADP in Pyruvat und ATP zu katalysieren.

Der Ausdruck"aktives Fragment"wie er hierin verwendet wird, beschreibt nicht mehr vollständige Nukleinsäuren kodierend für Pyruvatkinase, die aber noch für Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer Pyruvatkinase kodieren, und die eine für die Pyruvatkinase charakteristische Reaktion wie vorne beschrieben katalysieren können. Solche Fragmente sind kürzer als die oben beschriebenen vollständigen, für die Pyruvatkinase kodierenden Nukleinsäuren. Dabei können sowohl an den 3'-und/oder 5'-Enden der Sequenz Nukleinsäuren entfernt worden sein, es können aber auch Teile der Sequenz deletiert, d. h. entfernt worden sein, die die biologische Aktivität der Pyruvatkinase nicht entscheidend beeinträchtigen. Eine geringere oder gegebenenfalls auch eine erhöhte Aktivität, die aber noch die Charakterisierung bzw. Verwendung des resultierenden Pyruvatkinase Fragments gestattet, wird dabei als ausreichend im Sinne des hier verwendeten Ausdrucks verstanden. Der Ausdruck"aktives Fragment"kann sich ebenso auf die Aminosäure- sequenz der Pyruvatkinase beziehen und gilt dann analog den obigen Ausführungen für solche Polypeptide, die im Vergleich zur oben definierten vollständigen Sequenz bestimmte Teile nicht mehr enthalten, wobei die biologische Aktivität des Enzyms jedoch nicht entscheidend beein- trächtigt ist. Die Fragmente können dabei verschiedene Länge besitzen.

Die Begriffe"Pyruvatkinase-Hemmtest"oder"Hemmtest"wie sie hierin verwendet werden, be- ziehen sich auf ein Verfahren bzw. einen Test, der es gestattet, die Inhibition der enzymatischen Aktivität eines Polypeptids mit der Aktivität einer Pyruvatkinase durch eine oder mehrere chemische Verbindungen ("Kandidaten-"oder"Testverbindung (en) ") zu erkennen, wodurch die chemische Verbindung als Inhibitor der Pyruvatkinase identifiziert werden kann.

Der Ausdruck"Gen", wie er hierin verwendet wird, ist die Bezeichnung für einen Abschnitt aus dem Genom einer Zelle, der für die Synthese einer Polypeptid-Kette verantwortlich ist. <BR> <BR> <P>Der Ausdruck"Fungizid"bzw. "fungizid"wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf chemische Verbindungen, die zur Bekämpfung von human-, tier-und pflanzenpathogenen Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen Pilzen geeignet sind. Solche pflanzenpathogene Pilze werden nachfolgenden genannt, wobei die Aufzählung nicht abschließend ist :

Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes und Deuteromycetes, z. B.

Pythium-Arten, wie beispielsweise Pythium ultimum, Phytophthora-Arten, wie beispielsweise PhytopAthora infestans, Pseudoperonospora-Arten, wie beispielsweise Pseudoperonospora humuli oder Pseudoperonospora cubensis, Plasmopara-Arten, wie beispielsweise Plasmopara viticola, Bremia-Arten, wie beispielsweise Bremia lactucae, Peronospora-Arten, wie beispielsweise Peronospora pisi oder P. brassicae, Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe graminis, Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sphaerotheca fuliginea, Podosphaera-Arten, wie beispielsweise Podosphaera leucotricha, Venturia-Arten, wie beispielsweise Ve7zturia inaequalis, Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise Pyrenophora teres oder P. graminea (Konidienform : Drechslera, Syn : Helminthosporium), Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus sativus (Konidienform : Drechslera, Syn : Helminthosporium), Uromyces-Arten, wie beispielsweise Uromyces appendiculatus, Puccinia-Arten, wie beispielsweise Puccinia recondita, Sclerotinia-Arten, wie beispielsweise Sclerotinia sclerotiorum, Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tilletia caries ; Ustilago-Arten, wie beispielsweise Ustilago nuda oder Ustilago avenae, Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii, Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oryzae, Fusarium-Arten, wie beispielsweise Fusarium culmorum, Botrytis-Arten, Septoria-Arten, wie beispielsweise Septoria nodorum, Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise Leptosphaeria nodorum, Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora canescens, Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae oder Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella herpotrichoides.

Von besonderem Interesse sind z. B. auch Magrzaporthe grisea, Cochliobulus heterostrophus, Nectria hematococca und Phytophtora species.

Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Pyruvatkinasen aus pflanzen- pathogenen Pilzen gefunden werden, können aber auch mit Pyruvatkinase aus humanpathogenen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vor- kommenden Pyruvatkinasen nicht immer gleich stark sein muss.

Gegenstand der vorliegenden Erfindungen ist deshalb auch die Verwendung von Inhibitoren der Pyruvatkinase zum Herstellen von Mitteln zur Behandlung von durch humanpathogene Pilze hervorgerufenen Erkrankungen.

Dabei sind die folgenden humanpathogenen Pilze von besonderem Interesse, die die nachfolgend genannten Krankheitsbilder hervorrufen können :

Dermatophyten, wie z. B. Trichophyton spec., Microsporum spec., Epidermophyton floccosum oder Keratomyces ajelloi, die z. B. Fußmykosen (Tinea pedis) hervorrufen, Hefen, wie z. B. Candida albicans, die Soor-Ösophagitis und Dermatitis hervorruft, Candida glabrata, Candida krusei oder Cryptococcus neoformans, die z. B. pulmonale Cryptococcose und auch Torulose hervorrufen können, Schimmelpilze, wie z. B. Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, die z. B. bronchopulmonale Aspergillose oder Pilzsepsis hervorrufen, Mucor spec., Absidia spec., oder Rhizopus spec., die z. B.

Zygomykosen (intravasale Mykosen) hervorrufen, Rhinosporidium seeberi, der z. B. chronische granulomatöse Pharyngitis und Tracheitis hervorruft, Madurella myzetomatis, der z. B. subkutane Myzetome hervorruft, Histoplasma capsulatum, der z. B. retikuloendotheliale Zytomykose und M.

Darling hervorruft, Coccidioides immitis, der z. B. pulmonale Coccidioidomykose und Sepsis her- vorruft, Paracoccidioides brasiliensis, der z. B. brasilianische Blastomykose hervorruft, Blastomyces dermatitidis, der z. B. Gilchrist-Krankheit und nordamerikanische Blastomykose hervorruft, Loboa lobai, der z. B. Keloid-Blastomykose und Lobo's Krankheit hervorruft, und Sporothrix schenckii, der z. B. Sporotrichose (granulomatöse Hautmykose) hervorruft.

Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe einer aus einem bestimmten Pilz, hier aus Ustilago maydis, gewonnenen Pyruvatkinase gefunden werden, können also auch mit Pyruvatkinase aus anderen zahlreichen Pilzspezies, gerade auch mit pflanzenpathogenen Pilzen interagieren, wobei die Inter- aktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Pyruvatkinase nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die beobachtete Selektivität der an diesem Enzym wirksamen Substanzen.

Der Ausdruck"homologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck"heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert.

Der Ausdruck"Kompetitor"wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Eigenschaft der Verbindungen, mit anderen, gegebenenfalls zu identifizierenden Verbindungen um die Bindung an der Pyruvatkinase zu kompetitieren und diese vom Enzym zu verdrängen bzw. von dieser ver- drängt zu werden.

Der Ausdruck"Inhibitor"bzw."spezifischer Inhibitor", wie er hierin gebraucht wird, bezeichnet eine Substanz, die direkt eine enzymatische Aktivität der Pyruvatkinase inhibiert. Ein solcher

Inhibitor ist vorzugsweise"spezifisch", d. h die Hemmung der PK wird eine niedrigere Konzen- tration des Inhibitors benötigt als für eine andere, davon unabhängige Wirkung. Vorzugsweise ist die Konzentration zweifach niedriger, insbesondere bevorzugt fünffach niedriger und ganz be- sonders bevorzugt zumindest zehnfach oder 20fach niedriger als die Konzentration einer Ver- bindung, die zum Hervorrufen eines unspezifischen Effekts benötigt wird.

Der Ausdruck"Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt einen Oberbegriff für Inhibitoren und Aktivatoren dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden bzw. die deren Aktivität beein- flussen. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Anti- körper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktionelle Mimetika davon. Bevorzugt handelt es sich beim Ausdruck"Modulator", wie er hierin verwendet wird, jedoch um solche Moleküle, die nicht die natürlichen Substrate bzw. Liganden darstellen.

Beschreibung der Erfindung In der vorliegenden Erfindung wird zum ersten Mal die vollständige Sequenz einer Pyruvatkinase aus dem pflanzenpathogenen Pilz Ustilago maydis zur Verfügung gestellt, die die weitere Erforschung von Pyruvatkinasen insbesondere aus pflanzenpathogenen Pilzen und damit die Er- schließung eines neuen Zielproteins für die Identifizierung neuer fungizider Wirkstoffe ermöglicht.

Trotz der umfangreichen Forschung an der Pyruvatkinase war bislang unbekannt, dass die Pyruvat- kinase in Pilzen ein Zielprotein (ein so genanntes"Target") fungizid wirksamer Substanzen sein kann. Damit wird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass die Pyruvatkinase ein insbesondere für Pilze wichtiges Enzym darstellt und deshalb in besonderem Maße dazu geeignet ist, als Zielprotein für die Suche nach weiteren und verbesserten fungizid wirksamen Wirkstoffen verwendet zu werden.

Inhibitoren der Pyruvatkinase mit einer fungiziden Wirkung wurden bisher nicht beschrieben. Es gibt bislang auch keinen Hinweis darauf, dass die Pyruvatkinase in pflanzenpathogenen oder auch human-oder tierpathogenen Pilzen durch Wirkstoffe beeinflusst, z. B. inhibiert werden kann, und ob die Bekämpfung von Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen Pilzen, in vivo mit einem die Pyruvatkinase modulierenden Wirkstoff möglich ist. Die Pyruvatkinase wurde damit als Ziel- protein für Fungizide bislang noch nicht beschrieben. Es sind keine Wirkstoffe bekannt, die eine fungizide Wirkung aufweisen und deren Wirkort die Pyruvatkinase ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte nun gezeigt werden, dass die Pyruvatkinase bei pflanzenpathogenen Pilzen ein Angriffspunkt oder"Target"für fungizide Wirkstoffe sein kann, die Inhibition der Pyruvatkinase also zur Schädigung oder zum Absterben des Pilzes führen könnte.

Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass das Enzym Pyruvatkinase zum Identifizieren von Modulatoren bzw. Inhibitoren seiner enzymatischen Aktivität in Testverfahren verwendet werden kann, was bei verschiedenen theoretisch interessanten Targets, die z. B. auch bereits als essentiell für einen Organismus bekannt sind, nicht selbstverständlich ist. Schließlich konnte auch gezeigt werden, dass Inhibitoren der Pyruvatkinase, die in solchen Verfahren identifiziert werden konnten, als Fungizide eingesetzt werden können.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren entwickelt, das geeignet ist, die Aktivität der Pyruvatkinase sowie die Hemmung dieser Aktivität in einem so genannten Hemmtest zu bestimmen, auf diese Weise Inhibitoren des Enzyms z. B. in HTS-und UHTS-Verfahren zu identifizieren. Die mit Hilfe dieses erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Verbindungen wurden in in vivo Tests an Pilzen geprüft.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde so gefunden, dass die Pyruvtakinase auch ira vivo durch Wirkstoffe inhibiert werden und ein mit diesen Wirkstoffen behandelter pilzlicher Organismus durch die Behandlung mit diesen Wirkstoffen geschädigt und abgetötet werden kann.

Die Inhibitoren einer pilzlichen Pyruvatkinase können also als Fungizide insbesondere im Pflan- zenschutz oder auch als Antimykotika in Pharmaindikationen verwendet werden. In der vorlie- genden Erfindung wird beispielsweise gezeigt, dass die Hemmung der Pyruvatkinase mit einer in einem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen zum Absterben oder zu einer Wachstumshemmung der behandelten Pilze in synthetischen Medien bzw. auf der Pflanze führt.

Pyruvatkinasen können aus verschiedenen pflanzenpathogenen oder auch aus human-oder tier- pathogenen Pilzen gewonnen werden, z. B. wie in der vorliegenden Erfindung gezeigt aus dem pflanzenpathogenen Pilz U. maydis. Zur Herstellung der Pyruvatkinase aus Pilzen kann das Gen z. B. rekombinant in Escherichia coli exprimiert und aus E. coli Zellen eine Enzympräparation her- gestellt werden. Bevorzugt werden Pyruvatkinasen aus pflanzenpathogenen Pilzen verwendet, um im Pflanzenschutz einsetzbare Fungizide zu identifizieren. Ist das Ziel die Identifizierung von Fungiziden bzw. Antimycotika, die in Pharmaindikationen verwendet werden sollen, empfiehlt sich der Einsatz von Pyruvatkinasen aus human-bzw. tierpathogenen Pilzen.

So wurde für die Expression der Pyruvatkinase aus U. maydis der zugehörige ORF mittels PCR nach dem Fachmann bekannten Methoden über ausgewählte Primer amplifiziert. Nach der Amplifizierung des Pyruvatkinase-Gens aus genomischer DNA von Ustilago maydis mittels PCR,

nachfolgender Restriktion und Ligation mit dem Vektor pET-21b (+) von Novagen (C-terminale Fusion mit dem His-Tag) erfolgte die Transformation in E. coli DH5a MAX Efficiency Competent Cells (Gibco). (Anschließend erfolgte die Transformation und Expression des Polypeptids in E. coli AD494 (DE3) Comp. Cells von Novagen (Beispiel 1). Das für die Pyruvatkinase kodierende Gen aus Ustilago maydis besitzt eine Größe von 1587 jbp und es enthält kein Intron. Das Gen kodiert für ein Polypeptid von 528 Aminosäuren Länge mit einem Molekulargewicht von 39000 Dalton (Abbildung 2).

In der vorliegenden Erfindung wird damit auch eine vollständige genomische Sequenz eines pflanzenpathogenen Pilzes kodierend für eine Pyruvatkinase zur Verfügung gestellt, und deren Verwendung bzw. die Verwendung des davon kodierten Polypeptids zur Identifizierung von Inhibitoren des Enzyms beschrieben.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die für ein Polypeptid mit der enzy- matischen Funktion einer Pyruvatkinase kodierende Nukleinsäure aus dem Pilz Ustilago maydis gemäß SEQ ID NO : 1.

Pyruvatkinasen teilen sich homologe Bereiche (siehe Abbildung 2). Typisch für Pyruvatkinasen ist ein konservierte Region, die einen Lysinrest umfasst, der wahrscheinlich als Säure/Base-Kata- lysator bei der Umsetzung von Pyruvat zu Phosphonenolypruvat fungiert. Die konservierte Region umfasst ebenfalls einen Glutaminsäurerest, der an der Bindung des Magnesiumions beteiligt ist.

Diese beiden Aminosäurereste sind ebenso wie ihre Sequenzumgebung ein für Pyruvatkinasen charakteristisches Sequenzmerkmal. Dieses für Pyruvatkinasen typische Sequenzmotiv kann in Form eines Prosite-Motivs wiedergegeben werden (Hofmann et al., 1999). Es kann wie folgt dargestellt werden : [LIVAC]-x-[LIVM] (2)-[SAPCV]-K-[LIV]-E-[NKRST]-x-[DEQHS]- [GSTA]-[LIVM], wobei der Rest K für Lysin im aktiven Zentrum steht und der Rest E für das an der Bindung des Magnesiumions beteiligte Glutamin.

Vorzugsweise werden Pyruvatkinasen mit dem Sequenzmotiv [IV]-x- [IV]-I- [SPACV]-K- [IV]-E- [NS]-x- [EQ]-G- [LIVM] |verwendet. Das Motiv ist in Abbildung 2 erkennbar.

PROSITE ermöglicht Polypeptiden eine Funktion zuzuordnen und somit Pyruvatkinasen als solche zu erkennen. Bei der Darstellung des Prosite Motivs wird der"Ein-Buchstaben-Code"verwendet.

Das Symbol"x"steht für eine Position, an der jede Aminosäure akzeptiert wird. Eine variable Position, an der verschiedene bestimmte Aminosäuren akzeptiert werden, wird in eckigen Klammern"[...]"dargestellt, wobei die an dieser Position möglichen Aminosäuren aufgezählt werden. Aminosäuren, die an einer bestimmten Position nicht akzeptiert werden, stehen dagegen in geschweiften Klammern"{...}". Ein Gedankenstrich"-"trennt die einzelnen Elemente bzw. <BR> <BR> <P>Positionen des Motivs. Wiederholt sich eine bestimmte Position, z. B. "x", mehrfach hinterein- ander, kann dies durch Angabe der Zahl der Wiederholungen in einer nachfolgenden Klammer dargestellt werden, z. B. "x (3) ", was für"x-x-x"steht.

Ein Prosite Motiv stellt also letztlich die Komponenten einer Konsensussequenz dar, sowie Abstände zwischen den beteiligten Aminosäuren und ist damit typisch für eine bestimmte Enzym- klasse. Anhand dieses Motivs können auf Basis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren weitere Polypeptide aus pflanzenpathogenen Pilzen indentifiziert bzw. zugeordnet werden, die zur selben Klasse wie das erfindungsgemäße Polypeptid gehören und deshalb auch in erfindungsgemäßer Weise verwendet werden können.

Im Falle der Pyruvatkinase aus U. maydis liegt dieses Motiv ebenso vor wie bei Neurospora crassa, Trichoderma reesei, Emericella nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, <BR> <BR> Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharornyces pombe, Agaricus bisporus, S. cerevisiae und Pytophthora infestans (vgl. Abbildung 2).

Das oben genannte Prosite Motiv bzw. die spezifische Konsensussequenz sind typisch für die erfindungsgemäßen Polypeptide, die anhand dieser Konsensussequenzen strukturell definiert werden können und damit auch eindeutig identifizierbar sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb auch Polypeptide aus pflanzenpathogenen Pilzen mit der biologischen Aktivität einer Pyruvatkinase, die das vorstehend genannte Prosite Motiv [LIVAC]-x-[LIVM] (2)-[SAPCV]-K-[LIV]-E-[NKRST]-x-[DEQHS]- [GSTA]-[L1VM] um- fassen. Bevorzugt werden dabei jene Polypeptide, die das Prosite Motiv [IV]-x-[IV]-I-[SPACV]-K- [IV]-E- [NS]-x- [EQ]-G- [LIVM] umfassen.

Aufgrund der Homologien, die bei speziesspezifischen Nukleinsäuren kodierend für Pyruvat- kinasen vorliegen, können auch Pyruvatkinasen aus anderen pflanzenpathogenen Pilzen identi- fiziert und verwendet werden, um die oben gestellte Aufgabe zu lösen, d. h. sie können ebenfalls zum. Identifizieren von Inhibitoren einer Pyruvatkinase verwendet werden, welche wiederum als Fungizide im Pflanzenschutz verwendet werden können. Es ist jedoch auch denkbar einen anderen Pilz, der nicht pflanzenpathogen ist, bzw. dessen Pyruvatkinase oder die dafür kodierende Sequenz zu verwenden, um fungizid wirkende Inhibitoren der Pyruvatkinase zu identifizieren. Aufgrund der

hier angegebenen Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 und eventuell davon abgeleiteten Primern sowie gegebenenfalls unter Zuhilfenahme des vorstehend gezeigten Prosite Motivs ist es dem Fachmann möglich, z. B. mittels PCR weitere für Pyruvatkinasen kodierende Nukleinsäuren aus anderen (pflanzenpathogenen) Pilzen zu erhalten und zu identifizieren. Solche Nukleinsäuren und deren Verwendung in Verfahren zum Identifizieren von fungiziden Wirkstoffen werden als von der vor- liegenden Erfindung umfasst betrachtet.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sowie gemäß den vorstehend beschrie- benen Verfahren erhaltene Sequenzen aus anderen pflanzenpathogenen Pilzen können weitere für eine Pyruvatkinase kodierende Nukleinsäuresequenzen aus anderen Pilzen identifiziert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung von Nukleinsäuren aus pflanzenpathogenen Pilzen, die für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Pyruvat- kinase kodieren, insbesondere Polypeptide, die das vorstehend beschriebene Motiv umfassen, zum Identifizieren von Inhibitoren pilzlicher Pyruvatkinasen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die für die Pyruvatkinase aus Ustilago maydis kodierende Nukleinsäure mit der SEQ ID NO : 1 sowie die für die Polypeptide gemäß SEQ ID NO : 2 oder aktive Fragmente davon kodierenden Nukleinsäuren.

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, und insbesondere cDNAs.

Besonders bevorzugt umfassen die in erfindungsgemäßer Weise einsetzbaren Nukleinsäuren eine Sequenz aus pflanzenpathogenen Pilzen kodierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Pyruvatkinase ausgewählt aus a) einer Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1, b) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2 umfasst, c) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches das Motiv [LIVAC]-x- [LIVM] (2) -<BR> [SAPCV]-K-[LIV]-E-[NKRST]-x-[DEQHS]- [GSTA]-[LIVM] umfasst, d) Sequenzen, welche an die unter a) und b) definierten Sequenzen bei einer Hybridisierungs- temperatur von 42-65°C hybridisieren, und

e) Sequenzen, welche eine zumindest 80 % ige, bevorzugt zumindest 85 % ige und besonders bevorzugt eine zumindest 90 % ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen.

Wie bereits vorstehend ausgeführt, ist die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Pyruvatkinase aus Ustilago maydis beschränkt. In analoger und dem Fachmann bekannter Weise können auch aus anderen Pilzen, vorzugsweise aus pflanzenpathogenen Pilzen, Polypeptide mit der Aktivität einer Pyruvatkinase gewonnen werden, die dann z. B. in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können. Bevorzugt wird die Pyruvatkinase aus Ustilago maydis verwendet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine erfindungs- gemäße Nukleinsäure und einen homologen oder heterologen Promotor umfassen.

Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro-oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promo- toren sind der 35S Promotor des Blumenkohlmosaikvirus für pflanzliche Zellen, der Promotor der Alkoholdehydrogenase für Hefezellen, die T3-, T7-oder SP6-Promotoren für prokaryotische Zellen oder zellfreie Systeme. Promotoren, die zur Expression der UMP/CMP-Kinasen in gram- negativen Bakterienstämmen ebenfalls geeignet sind, sind beispielsweise der cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lacIq-, T5-, gal-, trc-, ara-, 1-PR-oder l-PL-Promotor. Zur Expression in Hefestämmen können außerdem die Promotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, AOX1 und GAP genutzt werden. Für Insektenzellen sind beispielsweise der Polyhedrin-Promotor sowie der plO-Promotor (Luckow, V. A. and Summers, M. D. (1988) Bio/Techn. 6,47-55) einsetzbar.

Bevorzugt sollten pilzliche Expressionssysteme wie z. B. das Pichia pastoris-System verwendet werden, wobei hier die Transkription durch den Methanol induzierbaren AOX-Promotor ange- trieben wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nuklein- säure, eine erfindungsgemäße regulatorische Region oder ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.

Bevorzugte Vektoren sind z. B. die kommerziell erhältlichen Fusions-und Expressionsvektoren pGEX (Pharmacia Biotech Inc), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A, die pTrc-Vektoren (Amann et al., (1988), Gene 69 : 301-315), der "pKK233-2n (CLONTECH, Palo Alto, Californien) und die"pET"-und"pBADH-Vektor-Serien

von Stratagene, La Jolla. Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYep Secl (Baldari et al. (1987), Embo J. 6 : 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982), Cell 30 : 933- 943), pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene 54 : 113-123), and pYES-Derivate, pGAPZ-Derivate, pPICZ-Derivate, die Vektoren des Pichia Expression Kit' (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), die p4XXprom. Vektorserie (Mumberg et al., 1995) sowie pSPOlAT-Vektoren (Fa. Life Technologies) für bakterielle Zellen, oder Gateway Vektoren (Fa. Life Technologies) für ver- schiedene Expressionssysteme in bakteriellen Zellen, Pflanzen, P. pastors, S. cerevisiae oder Insektenzellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.

Der Ausdruck"Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natür- licherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.

Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Zellen von Saecharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Insekten, Pflanzen, Froschoozyten und Zelllinien von Säugern.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer Pyruvatkinase, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden.

Bevorzugt umfassen die in erfindungsgemäßer Weise verwendbaren Polypeptide eine Amino- säuresequenz aus pflanzenpathogenen Pilzen ausgewählt aus (a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 2, (b) Sequenzen, welche eine zumindest 70 % ige, bevorzugt eine zumindest 80 % ige, besonders bevorzugt eine 90 % ige und insbesondere bevorzugt eine 95 % ige Identität mit der unter a) definierten Sequenz haben, <BR> <BR> (c) den unter b) angegebenen Sequenzen, welche das Prosite Motiv [LIVAC]-x- [LIVM] (2) - [SAPCV]-K- [LIV]-E- [NKRST]-x- [DEQHS]- [GSTA]- [LIVM] umfassen, und (d) Fragmenten der unter a) bis c) angegebenen Sequenzen, welche die gleiche biologische Aktivität aufweisen wie die unter a) definierte Sequenz.

Der Ausdruck"Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden,

als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise am Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino-und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylie- rungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma- Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoy- lierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in der Form"reifer"Proteine oder als Teile größerer Proteine, z. B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs-oder"Leader"- Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen. Die erfindungsgemäßen Proteine können ebenfalls so vorliegen, wie sie natürlicherweise in ihrem Herkunftsorganismus vorliegen, aus dem sie zum Beispiel direkt gewonnen werden können. In den erfindungsgemäßen Verfahren können ebenso aktive Fragmente einer Pyruvatkinase eingesetzt werden, solange sie die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Polypeptids bzw. deren Inhibition durch eine Kandidatenverbindung ermöglichen.

Die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polypeptide können im Vergleich zu den entsprechenden Regionen von natürlich vorkommenden Pyruvatkinasen Deletionen oder Amino- säuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch die biologische Aktivität einer vollständigen Pyruvatkinase zeigen. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konser- vativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Amino- säure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird : 1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste : Ala, Ser, Thr, Pro und Gly ; 2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide : Asp, Asn, Glu und Gln ; 3. Polare, positiv geladene Reste : His, Arg und Lys ; 4. Große aliphatische, nicht-polare Reste : Met, Leu, Ile, Val und Cys ; und 5. Aromatische Reste : Phe, Tyr und Trp.

Ein mögliches Reinigungsverfahren der Pyruvatkinase basiert auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z. B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen-oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie oder Affinitätschromatographie (vgl. Beispiel 2).

Ein schnelles Verfahren zum Isolieren von Pyruvatkinase, die von Wirtszellen synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise ein MBP-Tag oder ein His-Tag sein (vgl. Beispiel 2). Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsge- mäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Amino- säuren, wie Arginin-und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Ver- wendung von Oligonukleotiden angewendet werden.

Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren wiederum auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z. B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen-oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie und Affini- tätschromatographie.

Die Ausdrücke"Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.

Das Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden mit der Aktivität einer Pyruvatkinase, wie z. B. der Pyruvatkinase aus U. maydis, ist damit gekennzeichnet durch (a) das Kultivieren einer Wirtszelle enthaltend zumindest eine exprimierbare Nukleinsäure- sequenz kodierend für ein Polypeptid aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer Pyruvatkinase unter Bedingungen, die die Expression dieser Nukleinsäure gewährleisten, oder

(b) das Exprimieren einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer Pyruvatkinase in einem in vitro-System, und (c) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in vitro- System.

Die so erhaltenen Zellen enthaltend das erfindungsgemäße Polypeptid oder das so erhaltene gereinigte Polypeptid sind geeignet, in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren bzw.

Inhibitoren der Pyruvatkinase verwendet zu werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Polypeptiden aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen, welche zumindest eine biologische Aktivität einer Pyruvatkinase ausüben, in Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, wobei die Inhibitoren der Pyruvatkinase als Fungizide verwendet werden können. Besonders bevorzugt wird die Pyruvat- kinase aus Ustilago maydis verwendet.

Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe einer Pyruvatkinase aus einer bestimmten Pilzspezies gefunden werden, können auch mit Pyruvatkinase aus anderen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Pyruvatkinase nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die Selektivität wirksamer Substanzen. Die Nutzung der Wirkstoffe, die mit einer spezifischen Pyruvatkinase gefunden wurden, als Fungizid auch bei anderen Pilzen kann darauf zurückgeführt werden, dass sich Pyruvatkinasen aus verschiedenen Pilzspezies sehr nahe stehen und in größeren Bereichen eine ausgeprägte Homologie zeigen. So wird an Abbildung 2 deutlich, dass eine solche Homologie über beträchtliche Sequenzabschnitte hinweg zwischen allen betrachteten Pilzen besteht und damit die Wirkung der z. B. mit Hilfe der Pyruvatkinase aus U. maydis gefundenen Substanzen nicht notwendigerweise auf U. maydis beschränkt bleibt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden durch Testen von potentiellen Inhibitoren bzw. Modulatoren der enzymatischen Aktivität der Pyruvatkinase ("Kandidatenverbindung"oder"Testverbindung") in einem Pyruvatkinase- Hemmtest.

Verfahren, die geeignet sind, Modulatoren, insbesondere Inhibitoren bzw. Antagonisten der erfindungsgemäßen Polypeptide zu identifizieren, beruhen in aller Regel auf der Bestimmung der Aktivität bzw. der biologischen Funktionalität des Polypeptids. Dazu kommen prinzipiell sowohl auf ganzen Zellen beruhende Verfahren (in vivo Verfahren) in Frage, wie auch Verfahren, die auf

der Verwendung des aus den Zellen isolierten Polypeptids beruhen, das in gereinigter oder teilweise gereinigter Form oder auch als Rohextrakt vorliegen kann. Diese zellfreien in vitro Verfahren können ebenso wie in vivo Verfahren im Labormaßstab, in bevorzugter Weise aber auch in HTS oder UHTS Verfahren genutzt werden. Im Anschluss an die in vivo oder in vitro Identifizierung von Modulatoren des Polypeptids können Tests an Pilzkulturen durchgeführt werden, um die fungizide Wirksamkeit der gefundenen Verbindungen zu prüfen.

Viele Testsysteme, die die Prüfung von Verbindungen und natürlichen Extrakten zum Ziel haben, sind bevorzugt auf hohe Durchsatzzahlen ausgerichtet, um die Zahl der untersuchten Substanzen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zellfreiem Arbeiten beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein. Sie sind geeignet für eine erste Prüfung, die in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluss einer Substanz auf das Zielprotein zu detektieren. Ist eine solche erste Prüfung erfolgt und eine oder mehrere Verbindungen, Extrakte etc. gefunden, kann die Wirkung solcher Verbindungen im Labor noch gezielter untersucht werden. So kann in einem ersten Schritt die Inhibierung oder Aktivierung des erfindungsgemäßen Polypeptids in vitro noch einmal geprüft werden, um im Anschluss daran die Wirksamkeit der Verbindung am Zielorganismus, hier einem oder mehreren pflanzenpathogenen Pilzen, zu testen.

Die Verbindung kann dann gegebenenfalls als Ausgangspunkt für die weitere Suche und Ent- wicklung von fungiziden Verbindungen verwendet werden, die auf der ursprünglichen Struktur basieren, jedoch z. B. hinsichtlich Wirksamkeit, Toxizität oder Selektivität optimiert sind.

Um Modulatoren aufzufinden, kann z. B. ein synthetischer Reaktionsmix (z. B. Produkte der in vitro Transkription) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran, ein Kompartiment oder irgendeine andere Präparation, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthält, zusammen mit einem gegebenenfalls markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu hemmen, wird z. B. erkennbar an einer verringerten Bindung des gegebenenfalls markierten Liganden oder an einer verringerten Umsetzung des gegebenenfalls markierten Substrates. Moleküle, die die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide hemmen, sind gute Antagonisten bzw. Inhibitoren.

Die Detektion der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide kann durch ein so genanntes Reportersystem verbessert werden. Reportersysteme in dieser Hinsicht umfassen, sind aber nicht beschränkt auf colorimetrisch oder fluorimetrisch nachweisbare Substrate, die in ein Produkt umgewandelt werden oder ein Reportergen, das auf Veränderungen der Aktivität oder der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide anspricht oder andere bekannte Bindungstests.

Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat-oder Liganden-Mimetikum zusammen- bringt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst können markiert werden, z. B. fluorimetrisch oder colorimetrisch, so dass man die Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden gebunden sind oder die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann. Ebenso kann jedoch die Bindung mittels des gegebenenfalls markierten Substrats, Liganden bzw. Substratanalogen verfolgt werden. Auf diese Weise lässt sich die Effektivität eines Antagonisten ermessen.

Effekte wie Zelltoxizität werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme überprüfen dabei sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann durch konzentrationsabhängige Testreihen überprüft werden. Kontrollansätze ohne Testsubstanzen bzw. ohne Enzym können zur Bewertung der Effekte herangezogen werden.

Eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Inhibitoren des erfindungsgemäßen Polypeptides beruht auf so genannten in vivo oder cell-based Verfahren, die im Prinzip auf den folgenden Schritten basieren : (1) Herstellen von transgenen Organismen, die nach Transformation mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in der Lage sind, eine UMP/CMP-Kinase zu exprimieren, (2) Aufbringen einer Testverbindung auf den Organismus aus Schritt (1) und zur Kontrolle auf einen analogen, nicht transformierten Organismus, (3) Bestimmen des Wachstums oder der Überlebens- fähigkeit des transgenen und eines nicht-transformierten Organismus nach dem Aufbringen der Testverbindung aus Schritt (2), und (4) Selektion von Testverbindungen, die im Vergleich mit dem Wachstum des transgenen Organismus ein vermindertes Wachstum, eine verminderte Über- lebensfähigkeit und/oder verminderte Pathogenität des nicht transgenen Organismus bewirken.

Unter einem analogen, nicht transformierten Organismus ist ein Organismus zu verstehen, der als Ausgangsorganismus in Schritt (1) verwendet wurde. Die Transformation kann mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure selbst erfolgen. Als Organismen, die mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. Vektor transformiert werden, eignen sich bevorzugt Pilze, besonders bevorzugt die eingangs erwähnten phytopathogenen Pilze.

Durch die anhand der vorliegenden Erfindung verfügbaren, für eine erfindungsgemäße Pyruvat- kinase kodierende Nukleinsäuren enthaltenden Wirtszellen, wird auch die Entwicklung von Testsystemen, die auf Zellen basieren, zur Identifizierung von Substanzen ermöglicht, die die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide modulieren.

Vorzugsweise handelt es sich bei den zu identifizierenden Modulatoren um kleine organisch- chemische Verbindungen.

Ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität einer Pyruvatkinase aus Pilzen moduliert und die, gegebenenfalls in einer geeigneten Formulierung, als Fungizid im Pflanzenschutz verwendet werden kann, besteht bevorzugt darin, dass man a) ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder eine Wirtszelle enthaltend dieses Polypeptid mit einer chemischen Verbindung oder mit einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, b) die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids bei Abwesenheit einer chemischen Verbindung mit der Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids bei Anwesenheit einer chemischen Verbindung oder eines Gemisches von chemischen Verbindungen vergleicht, und c) die chemische Verbindung auswählt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids spezifisch moduliert, und gegebenenfalls d) die fungizide Wirkung der ausgewählten Verbindung in vivo prüft.

Besonders bevorzugt wird dabei diejenige Verbindung bestimmt, die die Aktivität des erfindungs- gemäßen Polypeptids spezifisch inhibiert. Der Begriff"Aktivität", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Tatsache genutzt, dass das bei der Reaktion der Pyruvatkinase entstehende Pyruvat von der Lactat Dehydrogenase (LDH) unter Verbrauch von NADH zu Lactat umgesetzt wird. Dabei entsteht auch NAD+. Die Reaktion kann schematisch folgendermaßen dargestellt werden : PK Phosphoenolpyruvat + ADP + H+--> Pyruvat + ATP LDH Pyruvat + NADH + H"- Lactat+NAD Das bei der Reaktion der LDH verbrauchte Cosubstrat NADH besitzt bei 340nm ein Extinktions- maximum. Man lässt die Reaktion ablaufen und verfolgt die Abnahme der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit (kinetische Messung). So kann die enzymatische Aktivität der Pyruvat-

kinase verfolgt werden, indem man die Abnahme von NADH durch Absorptionsmessung bei 340 mn verfolgt. Eine geringere bzw. inhibierte Aktivität der Pyruvatkinase wird dadurch erkannt, dass die NADH Konzentration (photospektrometrisch bestimmt) lansamer bzw. gar nicht abnimmt. Bei Hemmung der Pyruvatkinase wird weniger oder gar kein Pyruvat gebildet, daher läuft auch die LDH-Reaktion in geringerem Maße ab und es wird weniger oder kein NADH verbraucht.

Da auch eine Hemmung der LDH zu einer verringerten NADH Abnahme führen würde, müssen in dem oben beschriebenen Test gefundene Inhibitoren auf eine etwaige Inhibierung der LDH hin überprüft werden.

Die Messung kann auch in für HTS-oder UHTS-Assays gängigeren Formaten erfolgen, z. B. in Mikrotiterplatten, in denen z. B. ein Gesamtvolumen von 5 bis 50 ul pro Ansatz bzw. pro Well vorgelegt wird und die einzelnen Komponenten in einer der vorstehend angegebenen Endkon- zentrationen vorliegen. Dabei wird die zu testende, potentiell die Aktivität des Enzyms inhibie- rende oder aktivierende Verbindung (Kandidatenmolekül) z. B. in einer geeigneten Konzentration in Testpuffer enthaltend ATP, Phosphoenolpyruvat, und NADH sowie das Hilfsenzym Lactat- dehydrogenase vorgelegt. Dann wird das erfindungsgemäße Polypeptid im oben genannten Testpuffer zugegeben und die Reaktion damit gestartet. Der Ansatz wird dann z. B. bis zu 30 Minuten bei einer geeigneten Temperatur inkubiert und die Abnahme der NADH-Konzentration gemessen.

Eine weitere Messung erfolgt in einem entsprechenden Ansatz, jedoch ohne Zugabe eines Kandidatenmoleküls und ohne Zugabe eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Negativkontrolle).

Eine weitere Messung erfolgt wiederum bei Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, jedoch bei Anwesenheit des erfindungsgemäßen Polypeptids (Positivkontrolle). Negativ-und Positivkontrolle ergeben damit die Vergleichswerte zu den Ansätzen bei Anwesenheit eines Kandidatenmoleküls.

Um optimale Bedingungen für ein Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren der Pyruvatkinase bzw. zur Bestimmung der Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu ermitteln, kann es vorteilhaft sein, den jeweiligen KM-Wert des verwendeten erfindungsgemäßen Polypeptids zu be- stimmen. Dieser gibt Aufschluss über die bevorzugt zu verwendende Konzentration des bzw. der Substrate. Im Fall der Pyruvatkinase aus U. inaydis konnte ein KM von 0,1 mM für Phos- phoenolpyruvat und ein KM von 0,22 mM für ADP bestimmt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnten auf diese Weise Inhibitoren der Pyruvatkinase identifiziert werden. In Tabelle I werden beispielhaft Verbindungen gezeigt, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren als Inhibitoren der Pyruvatkinase identifiziert werden konnten. Damit wird gezeigt, dass es möglich ist mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgreich Inhibitoren der Pyruvatkinase zu identifizieren.

Tabelle 1 Beispiel Verbindung pI50 PO ive 0 1 H3c. o/o/\. 58 0 H3C HO O HO F /L/ H, C 0 han hic pro zu 0 1 o CH3 N CH3 HO 0 HOO \ F F OU OH Ort F ozon s 4 5, 0 0 H, C N'°

Die Verbindungen 1 und 2 sind bekannte Cyclopentabenzofuran-Derivate, die im Zusammenhang mit der Therapie von NF-xB abhängigen Krankheiten beschrieben wurden (WO 00/08007 A2).

Synthesewege zur Herstellung der Verbindungen 3 und 4 sind in Beispiel 8 beschrieben.

Die gefundenen Inhibitoren der Pyruvatkinase bewirken keine messbare Hemmung der als Hilfsenzym verwendeten Lactat Dehydrogenase.

Es versteht sich von selbst, dass neben den genannten Verfahren zur Bestimmung der enzyma- tischen Aktivität einer Pyruvatkinase bzw. der Inhibition dieser Aktivität und zum Identifizieren von Fungiziden auch andere, z. B. bereits bekannte, Verfahren bzw. Hemmtests verwendet werden können, solange diese Verfahren es gestatten, die Aktivität einer Pyruvatkinase zu bestimmen und eine Inhibition dieser Aktivität durch eine Kandidatenverbindung zu erkennen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch gefunden, dass die mit Hilfe eines erfin- dungsgemäßen Verfahrens identifizierten Inhibitoren einer erfindungsgemäßen Pyruvatkinase geeignet sind, in einer geeigneten Formulierung Pilze zu schädigen oder zu töten.

Um ED5o-Werte zu bestimmen, können z. B. in die Kavitäten von Mikrotiterplatten eine Lösung des zu prüfenden Wirkstoffs pipettiert werden. Nachdem das Lösungsmittel abgedarnpft ist, wird zu jeder Kavität Medium hinzugefügt. Das Medium wird vorher mit einer geeigneten Konzentration von Sporen bzw. Mycel des zu prüfenden Pilzes versetzt. Die resultierenden Konzentrationen des Wirkstoffes betragen z. B. 0,1, 1, 10 und 100 ppm.

Die Platten werden anschließend auf einem Schüttler bei einer Temperatur von 22°C inkubiert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes Wachstum feststellbar ist.

Die Auswertung erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen kann die Wirkstoffdosis bestimmt werden, die zu einer 50 % igen Hemmung des Pilzwachstums gegenüber der unbehandelten Kontrolle führt (EDso). Die vor- liegende Erfindung bezieht sich daher ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der Pyruvatkinase aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen als Fungizide. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Fungizide, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert wurden.

In Tabelle II sind die Ergebnisse eines solchen Tests als EDso-Werte für in einem erfindungs- gemäßen Verfahren gefundene Verbindungen (vgl. Tab. 1) beispielhaft wiedergegeben. Die Verbindungen zeigen bei verschiedenen Pilzen eine fungizide Wirkung.

Tabelle II , Verbiii (lün, änis i$ P 1 Ustilago avenae 1, 2 1 Magnaportlae grisea 20, 2 1 Coriolus versicolor 0, 1 Ustilago avenae 1, 5 . Coriolus versicolor 17, 4

Es ist ebenso möglich die fungizide Wirkung der mit einem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Verbindungen am pflanzenpathogenen Pilz Phytophthora infestans zu prüfen.

Dazu vermischt man den zu prüfenden Wirkstoff mit einem Lösungsmittel und Emulgator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration. Zur Prüfung auf protek- tive Wirksamkeit der Verbindung werden junge Tomatenpflanzen mit der Wirkstoffzubereitung besprüht und 1 Tag nach der Behandlung mit einer Sporensuspension von Phytophthora infestans inokuliert. Die Pflanzen werden dann in eine Klimazelle verbracht und der Versuch nach einigen Tagen ausgewertet (Beispiel 7).

In Tabelle m sind die Ergebnisse eines solchen Tests in Form eines Wirkungsgrads (WG, prozentuale Wirkung) für eine gegebene, in einem erfindungsgemäßen Verfahren gefundene Verbindungen (vgl. Tab. I) beispielhaft wiedergegeben (vgl. Beispiel 7). Dabei bedeutet 0 % ein Wirkungsgrad, der demjenigen der Kontrolle entspricht, während ein Wirkungsgrad von 100 % bedeutet, dass kein Befall der Pflanze durch den Pilz beobachtet wird.

Tabelle m PhytopAthora infestans 70 PhytopAthora infestans 80 4 Phytophtlaora infestans 80 4 Phytophthora infestans 0 Anhand dieser Ergebnisse wird beispielhaft gezeigt, dass Inhibitoren der pilzlichen Pyruvatkinase eine fungizide Wirkung besitzen und als Fungizide eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der Pyruvatkinase aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen als Fungizide bzw. auf Verfahren zur

Kontrolle von unerwünschtem Pilzwachstum, die darauf beruhen, dass man einen Inhibitor einer pilzlichen Pyruvatkinase mit dem unerwünschten Pilz und/oder dessen Lebensraum in Kontakt bringt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Fungizide, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert wurden.

Verbindungen, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert werden, und die aufgrund der Inhibition der pilzlichen Pyruvatkinase eine fungizide Wirkung aufweisen, können somit zur Herstellung von fungiziden Mitteln verwendet werden.

Die identifzierten Wirkstoffe können in Abhängigkeit von ihren jeweiligen physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften in die üblichen Formulierungen überfiihrt werden, wie Lösungen, Emul- sionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole, Feinstverkapselungen in poly- meren Stoffen und in Hüllmassen für Saatgut, sowie ULV-Kalt-und Warmnebel-Formulierungen.

Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z. B. durch Vermischen der Wirkstoffe mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z. B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungs- mittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage : Aromaten, wie Xylol, Toluol oder Alkylnaphthaline, chlorierte Aromaten oder chlorierte aliphatische Kohlen- wasserstoffe, wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid, aliphatische Kohlenwasser- stoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, z. B. Erdölfraktionen, Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser. Mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig sind, z. B. Aerosol- Treibgase, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und Kohlendioxid. Als feste Trägerstoffe kommen in Frage : z. B. natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkurn, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate. Als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage : z. B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material wie Sägemehl, Kokosnussschalen, Maiskolben und Tabakstengel. Als Emulgier und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage : z. B. nichtionogene und anionische

Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäureester, Polyoxyethylen-Fettalkoholether, z. B. Alkylaryl- polyglycolether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate. Als Disper- giermittel kommen in Frage : z. B. Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.

Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthe- tische pulverige, körnige oder latexformige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, sowie natürliche Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine, und synthetische Phospholipide. Weitere Additive können mineralische und vegetabile Öle sein.

Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z. B. Eisenoxid, Titanoxid, Ferrocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo-und Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe, wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.

Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gewichtsprozent Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90 %.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können als solche oder in ihren Formulierungen auch in Mischung mit bekannten Fungiziden, Bakteriziden, Akariziden, Nematiziden oder Insektiziden verwendet werden, um so z. B. das Wirkungsspektrum zu verbreitern oder Resistenzentwicklungen vorzubeugen. In vielen Fällen erhält man dabei synergistische Effekte, d. h. die Wirksamkeit der Mischung ist größer als die Wirksamkeit der Einzelkomponenten.

Beim Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen als Fungizide können die Aufwandmengen je nach Applikation innerhalb größerer Bereiche variiert werden.

Erfindungsgemäß können alle Pflanzen und Pflanzenteile behandelt werden. Unter Pflanzen werden hierbei alle Pflanzen und Pflanzenpopulationen verstanden, wie erwünschte und uner- wünschte Wildpflanzen oder Kulturpflanzen (einschließlich natürlich vorkommender Kultur- pflanzen). Kulturpflanzen können Pflanzen sein, die durch konventionelle Züchtungs-und Opti- mierungsmethoden oder durch biotechnologische und gentechnologische Methoden oder Kombi- nationen dieser Methoden erhalten werden können, einschließlich der transgenen Pflanzen und einschließlich der durch Sortenschutzrechte schützbaren oder nicht schützbaren Pflanzensorten.

Unter Pflanzenteilen sollen alle oberirdischen und unterirdischen Teile und Organe der Pflanzen, wie Spross, Blatt, Blüte und Wurzel verstanden werden, wobei beispielhaft Blätter, Nadeln, Stengel, Stämme, Blüten, Fruchtkörper, Früchte und Samen sowie Wurzeln, Knollen und Rhizome aufgeführt werden. Zu den Pflanzenteilen gehört auch Erntegut sowie vegetatives und generatives Vermehrungsmaterial, beispielsweise Stecklinge, Knollen, Rhizome, Ableger und Samen.

Die erfindungsgemäße Behandlung der Pflanzen und Pflanzenteile mit den Wirkstoffen erfolgt direkt oder durch Einwirkung auf deren Umgebung, Lebensraum oder Lagerraum nach den üblichen Behandlungsmethoden, z. B. durch Tauchen, Sprühen, Verdampfen, Vernebeln, Streuen, Aufstreichen und bei Vermehrungsmaterial, insbesondere bei Samen, weiterhin durch ein-oder mehrschichtiges Umhüllen.

Die nachfolgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung und sind nicht limitierend auszulegen.

Beispiele Beispiel 1 Clonierung und Expression der Pyruvatkinase aus U. maydis Für die heterologe Expression des Pyruvatkinase-Gens wird das Gen mit genspezifischen Oligonucleotiden (forward primer : gcg ctg gcc cat atg atc tac get cet att gcc aag aca c ; reverse primer : g cca gca gct agc ggc cgc aac ctg agt gcc ctc gag ctt) mittels PCR amplifiziert. Das PCR Produkt wird nach Verdau mit den Restriktionsenzymen NdeI und NotI in den ebenso geschnittenen Expressionsvektor pET-21b (+) von Novagen kloniert. Das so entstandene Plasmid pEB017 kodiert somit für eine Pyruvatkinase mit einem C-terminalen His-Tag Zur Expression der PK wird das Plasmid pEB017 in E. coli AD494 (DE3) transformiert. Es wird eine Übernachtkultur (ÜNK) angesetzt, indem 25 ml LB-Ampicillin-Medium (c [Ampicillin] : 100 pg/ml) in einem 100m1 Erlenmeyerkölbchen mit etwas Zellmaterial (einzelne Kolonien) einer frisch gewachsenen Platte (< 1 Woche) inokuliert und diese bei 37°C und 200 rpm im Schüttelschrank über Nacht inkubiert werden.

Am nächsten Morgen werden 1000 ml LB-Ampicillin-Medium auf 5 1000ml-Erlenmeyerkolben zu je 200 ml aufgeteilt und diese mit je 3m1 der UNK angeimpft. Es folgt eine weitere Inkubation bei 37°C und 200 rpm bis die Kulturen eine optische Dichte von OD600 ~1 erreichen (ca. 3-4 h).

Dann werden zur Induktion zu je 200 ml Kultur 2 ml IPTG (Stammlösung 100 mM) gegeben (Endkonzentration : 1 mM) und die Kulturen über Nacht bei 18°C und 200-220 rpm weiterge- schüttelt.

Am nächsten Morgen werden die Kulturen auf 10 50mI-Falcon-Tubes verteilt und-20 min. bei 4000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Nach dem ersten Abzentifugieren wird der Überstand ver- worfen und der Rest der Kulturen erneut auf die Tubes verteilt, so dass pro Falcon-Tube ein 100 ml-Pellet resultiert. Nach dem Abzentrifugieren können die Pellets in flüssigem Stickstoff schock- und bei-85°C eingefroren werden.

Beispiel 2 Reinigung der Pyruvatkinase aus U. maydis Zellaufschluss Ein Zellpellet von 0,5 g wird mit 2,8 mL Lysispuffer, 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCI, 10 % Glycerin, 6 mM DTT, dem 1 mg/ml Lysozym und 30 ul Sigma Protease-Inhibitor P8849

zugegeben werden, versetzt. Die resuspendierten Pellets werden daraufhin 20 min. bei 30°C und -160 rpm geschüttelt (Verdau der Zellwand durch Lysozym). Anschließend werden die Zellsuspensionen auf 4 15mI-Falcon-Tubes aufgeteilt und mit dem Ultraschallstab (SONIFIER) für ca. 10 x-15 sec., unter Rühren im Eis-Wasserbad aufgeschlossen, bis die Suspension opal-durch- scheinend aussieht. Da die PK kältelabil ist, sollte die Probe nur für den Ultraschallaufschluss leicht gekühlt werden. Die so beschallte Zellsuspension wird auf 2 ml Eppendorftubes verteilt und 25 min bei 10 000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird dann auf 2 x 50 ml Falcontubes verteilt und zu jedem Tube 0,45 ml resuspendierte Ni-NTA Agarose pro ml Überstand gegeben. Das Gemisch wird nun < 60 min. bei Raumtemperatur inkubiert.

Chromatographie Es werden Fritten in leere PD10-Säulen eingesetzt, auf ihre Dichtheit bzw. Durchlässigkeit mit Wasser oder Lysispuffer geprüft und in den Tropfständer gehängt. Auf die Fritten wird vorsichtig das Ni-NTA-Enzym-Gemisch aufgetragen (zu gleichen Teilen) und der Durchfluss aufgefangen.

Danach wird mit hnidazolkonzentrationen von 5 und 10 mM in Lysispuffer (s. o. ) gewaschen bzw. mit Imidazolkonzentrationen von 100 mM eluiert. Anschließend wird eine Proteinbestimmung nach BioRad und ein Aktivitätstest der PK-haltigen Elutions-Fraktionen durchgeführt, sowie alle Proben per SDS-PAGE überprüft. Nach Überprüfen der Aktivität werden Fraktionen mit ausreichender Aktivität gepoolt und mit Hilfe der Millipore Ultrafree-15 Zentrifugiereinheiten, Porengröße 30kDa, entsalzt bzw. eingeengt.

Einengen/Entsalzen (Dialyse des Imidazols Nach Kontrolle der Aktivität werden die Elutions-Fraktionen (100 mM Imidazol) gepoolt und mit Lagerungspuffer (50 mM MES, pH 6,2, 10% Glycerin, 100 mM KC1, 15 mM MgS04, 6 mM Phosphoenolpyruvat, 6 mM DTT) zum Umpuffern auf insg. 70 ml aufgefüllt. Die so aufgefüllte Enzymlösung wird auf 6 Millipore Ultrafreel5-Filter/30kDa verteilt und 30 min. bei 2000 x g und 20°C zentrifugiert. Letztlich sind ca. 0,25 ml eingeengte Enzymlösung verblieben, die vereinigt und mit frischem Lagerungspuffer, reinem Glycerin und BSA so aufgefüllt werden, dass die Enzymlösung eine Endkonzentration von 50 % Glycerin, 20 llg/ml BSA und eine Enzymkonzentration von ca. 0,42 mg/ml hat.

Von dieser Lösung werden 1,5 ml Aliquots abgefüllt und bei-85°C eingefroren.

Beispiel 3 Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Pyruvatkinase durch Kopplung der Reaktion mit der Reaktion der Lactatdehydrogenase

Die in Beispiel 2 beschriebene Enzympräparation wird aufgetaut und in Verdünnungspuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KGI ; 15 mM MgS04 ; 30 % (v/v) Glycerin ; 0,6 mM Phosphoenolpyruvat ; 6 mM DTT ; 20 g/ml BSA) je nach Aktivität der Enzympräparation auf 0,5- 2 ug/ml Proteinkonzentration verdünnt. Diese Enzymlösung wird bei Raumtemperatur gelagert. In den Kavitäten einer 96-Loch Mikrotiterplatte werden 20 ul 5% (v/v) DMSO in Testpuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04) vorgelegt, 40 gl der Enzymlösung hinzugegeben und die Reaktion durch Zugabe von 140 1ll Substratmix (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04 ; 0,36 mM ADP ; 0,25 mM Phosphoenolpyruvat ; 0,36 mM NADH ; 1,43 mM Fructose-1,6- bisphosphat und verschiedene Konzentrationen Lactatdehydrogenase ; auf Eis gelagert) gestartet.

Die Konzentrationen der LDH im Substratmix wurden so gewählt, dass sich im kompletten Versuchsansatz (200 1ll) 0,2 ; 1 ; 5 und 10 U LDH befanden (entsprechend Endkonzentrationen von 1, 5,25 und 50 U LDH/ml) ergaben. Die Mikrotiterplatte wird bei Raumtemperatur inkubiert. Man misst die Abnahme der optischen Dichte bei 340 nm über 15-30 Minuten.

Beispiel 4 Identifizierung von Modulatoren der Pyruvatkinase in einem Hemmtest Der Hemmtest zum Auffinden von Modulatoren wird in 384-Loch Mikrotiterplatten durchgeführt.

Das Volumen der Ansätze beträgt 50, ul.

Die in Beispiel 2 beschriebene Enzympräparation wird aufgetaut und in Verdünnungspuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04 ; 30 % (v/v) Glycerin ; 0,6 mM Phos- phoenolpyruvat ; 6 mM DTT ; 20 llg/ml BSA) je nach Aktivität der Enzympräparation auf 0,5-2 gg7m1 Proteinkonzentration verdünnt. Diese Enzymlösung wird bei Raumtemperatur gelagert. In den Kavitäten einer 384-Loch Mikrotiterplatte werden 5 ul der zu prüfenden Substanzen in 5% (v/v) DMSO in Testpuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04) vorgelegt. Die Konzentration der Substanzen wird so bemessen, dass die Endkonzentration zwischen 2 uM und 10 jiM beträgt. Es werden 10 ul der Enzymlösung hinzugegeben und die Reaktion durch Zugabe von 35 ul Substratmix (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KCI ; 15 mM MgS04 ; 0,36 mM ADP ; 0,25 mM Phosphoenolpyruvat ; 0,36 mM NADH ; 1,43 mM Fructose-1, 6-bisphosphat und 7,1 U LDH/ml ; auf Eis gelagert) gestartet. Die Mikrotiterplatte wird bei Raumtemperatur inkubiert. Man misst die Abnahme der optischen Dichte bei 340 nm über 15-30 Minuten.

Als Negativkontrolle dient eine Messung, bei der keine zu prüfende Substanz, sondern 5 ul 0,5 % DMSO in Testpuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04) vorgelegt wird und keine Enzymlösung, sondern reiner Verdünnungspuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KCI ; 15 mM MgS04 ; 30 % (v/v) Glycerin ; 0,6 mM Phosphoenolpyruvat ; 6 mM DTT ; 20 llg/ml BSA) ohne

Pyruvatkinase zugegeben wird. Ansonsten wird dieser Ansatz wie die Ansätze mit zu prüfenden Substanzen behandelt.

Als Positivkontrolle dient eine Messung, bei der keine zu prüfende Substanz, sondern 5 Ill 0, 5 % DMSO in Testpuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04) vorgelegt wird und die gleiche Enzymlösung wie in den Ansätzen mit zu prüfenden Substanzen zugegeben wird. Auch dieser Ansatz wird wie die Ansätze mit zu prüfenden Substanzen behandelt.

Negativ-und Positivkontrolle ergeben die Vegleichswerte zu den Ansätzen mit zu prüfenden Substanzen.

Test auf Modulation der LDH Substanzen, die in dem beschriebenen Test eine Erhöhung oder Erniedrigung der Enzymaktivität bewirkt haben, werden in einem zweiten Test auf die Modulation der LDH hin überprüft : In diesem Test wird die Pyruvatkinase aus der ersten Lösung weggelassen und Phosphoenol- pyruvat durch Pyruvat ersetzt. Das Pyruvat wird ausschließlich in der ersten Lösung zugegeben, da hier bei Anwesenheit von Pyruvat im Substratmix die Reaktion bereits im Substratmix abliefe.

Anstelle der in Beispiel 2 beschriebenen Enzymlösung wird eine entsprechende Lösung ohne Pyruvatkinase mit 1,5 mM Pyruvat hergestellt (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04 ; 30 % (v/v) Glycerin ; 1,5 mM Pyruvat ; 6 mM DTT ; 20 gg/ml BSA). Diese Lösung wird bei Raumtemperatur gelagert. In den Kavitäten einer 384-Loch Mikrotiterplatte werden 5, ul der zu prüfenden Substanzen in 5% (v/v) DMSO in Testpuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04) vorgelegt. Die Konzentration der Substanzen wird so bemessen, dass die End- konzentration zwischen 2 uM und 10 uM beträgt. Es werden 10 ul der Pyruvatlösung hinzu- gegeben und die Reaktion durch Zugabe von 35 ul Substratmix für LDH Messung (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04 ; 0,36 mM ADP ; 0,36 mM NADH ; 1,43 mM Fructose-1, 6- bisphosphat und 4 U LDH/ml ; auf Eis gelagert) gestartet. Die Mikrotiterplatte wird bei Raum- temperatur inkubiert. Man misst die Abnahme der optischen Dichte bei 340 nm über 15-30 Minuten.

Als Negativkontrolle dient eine Messung, bei der keine zu prüfende Substanz, sondern 5 ul 0,5 % DMSO in Testpuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04) vorgelegt wird und aus dem Substratmix für die LDH Messung das Enzym weggelassen wird. Ansonsten wird dieser Ansatz wie die Ansätze mit zu prüfenden Substanzen behandelt.

Als Positivkontrolle dient eine Messung, bei der keine zu prüfende Substanz, sondern 5 Ill 0,5 % DMSO in Testpuffer (50 mM MES, pH 6,2 ; 100 mM KC1 ; 15 mM MgS04) vorgelegt wird und die gleichen Lösungen wie in den Ansätzen mit zu prüfenden Substanzen zugegeben werden. Auch dieser Ansatz wird wie die Ansätze mit zu prüfenden Substanzen behandelt.

Negativ-und Positivkontrolle ergeben die Vergleichswerte zu den Ansätzen mit zu prüfenden Substanzen.

Beispiel 6 Nachweis der fungiziden Wirkung der identifizierten Inhibitoren der Pyruvatkinase in Mikrotiterplatten In die Kavitäten von Mikrotiterplatten werden eine methanolische Lösung des anhand eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Wirkstoffs (Bsp. 3), versetzt mit einem Emulgator, pipettiert. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft ist, werden je Kavität 200 lil Potatoe-Dextrose- Medium hinzugefügt. Das Medium wird vorher mit geeigneten Konzentrationen von Sporen bzw.

Mycelen des zu prüfenden Pilzes versetzt.

Die resultierenden Konzentrationen des Wirkstoffs beträgt 0, 1, 1, 10 und 100 ppm. Die resul- tierende Konzentration des Emulgators beträgt 300 ppm.

Die Platten werden anschließend auf einem Schüttler bei einer Temperatur von 22°C inkubiert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes Wachstum feststellbar ist. Die Auswertung erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen wird die Wirkstoffdosis, die zu einer 50 % igen Hemmung des Pilzwachstums gegenüber der unbehandelten Kontrolle führt (EDso), berechnet.

Beispiel 7 Nachweis der fungiziden Wirkung der identifizierten Inhibitoren der Pyruvatkinase im Gewächshaus (Phytophthora-Test, protektiv) Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit 49 Gewichtsteilen N, N-Dimethylformamid (Lösungsmittel) und 1 Gewichtsteil Alkylarylpoly- glykolether (Emulgator) und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration (siehe Tab. W).

Zur Prüfung auf protektive Wirksamkeit der identifizierten Verbindungen werden junge Tomatenpflanzen mit der Wirkstoffzubereitung in der angegebenen Aufwandmenge besprüht. 1 Tag

nach der Behandlung werden die Pflanzen mit einer Sporensuspension von Phytophthora infestans inokuliert und bleiben dann für 24h bei 100% rel. Feuchte und 20°C. Anschließend werden die Pflanzen in einer Klimäzelle bei ca. 96% relativer Luftfeuchtigkeit und einer Temperatur von ca.

20°C aufgestellt.

7 Tage nach der Inokulation erfolgt die Auswertung. Dabei bedeutet 0 % ein Wirkungsgrad, der demjenigen der Kontrolle entspricht, während ein Wirkungsgrad von 100 % bedeutet, daß kein Befall beobachtet wird.

Beispiel 8 Soweit nicht anderes angegeben ist, handelt es sich bei allen quantitativen Angaben um Gewichtsprozent. Die Retentionszeit ist in Minuten angegeben und wurde mittels HPLC mit einer RC-Säule (Eurospher 100, C18, ID 4 mm) und mittels UV-Absorption bestimmt. Eluent : 0,1% Acetonitril/Wasser (0 min = 10% Acetonitril ; 13 min = 80% Acetonitril ; 15 min= 80% Acetonitril ; 17 min = 10 % Acetonitril).

Herstellung von Verbindung 3 gemäß Tabelle 1 Die Synthese der Verbindung 3 kann nach folgendem Reaktionsschema erfolgen : O O a b 0 CH3 up up 0- up Br CH3 Wang-Resin 05 Cl 0 9 / d O O c CH3 O J O up ICH3 H C-- up H 0 F3C e Verbindung 3 Schritt a : Man lässt 1,2 g Wang Polystyrene Festphasenlinker «, Wang resin"; Rapp-Polymere, Tübingen ; 1,08 mmol/g) in DMF quellen. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und eine Lösung von 360 mg Bromessigsäure (Säurereagenz) in 8 ml Dimethylformamid wird zugegeben. Man schüttelt bei

Raumtemperatur für 15 Minuten und setzt der Lösung dann 345 lil Pyridin und 543 mg 2,6- Dichlorbenzylchlorid zu. Man schüttelt für 2 h bei Raumtemperatur. Danach wird abgesaugt und der Festphasenlinker wird mit DMF gewaschen. Es werden weitere 360 mg Bromessigsäure in 8 ml DMF zugegeben und die Mischung für 15 Minuten geschüttelt. Es folgt die Zugabe von 345 RI Pyridin und 543 mg 2, 6-Dichlorbenzylchlorid. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt.

Der Festphasenlinker wird schließlich mit DMF, Methanol und Dichlormethan gewaschen.

Schritt Man lässt den Festphasenlinker aus Schritt (a) in Dimethylsulfoxid (DMSO) quellen. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und mit einer Lösung von 1,5 g 1, 1-Dimethoxypropan-2-amin in 8,5 ml DMSO behandelt und über Nacht geschüttelt. Der Festphasenlinker wird mit DMF, Methanol, Tetrahydrofuran (tif) und Dichlormethan gewaschen.

Schritt c : 70 mg des Festphasenlinker aus Schritt (b) lässt man in DMF quellen. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und es wird eine Lösung von 138 mg (2E)-3- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) acrylsäure in 0,865 ml DMF und eine Lösung von 118 mg Diisopropylcarbodiimid in 0, 21 ml DMF zugegeben. Man rührt für 3 h bei Raumtemperatur, saugt das Lösungsmittel ab und wäscht mit DMF. Es wird ein weiteres Mal eine Lösung von 138 mg (2E)-3- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) acrylsäure in 0,865 ml DMF und eine Lösung von 118 mg Diisopropylcarbodiimid in 0,21 ml DMF zugegeben und für 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird abgesaugt und der Festphasenlinker mit Methanol/THF, THF unf Dichlormethan gewaschen.

Schritt d : Eine Lösung von 173 mg N-Hydroxy-1- [3- (trifluormethyl) phenyl] propan-2-amin hydrochlorid in 1, 2 ml Ethanol/Toluol (2 : 10) wird zum Festphasenlinker aus Schritt (c) gegeben. Man rührt für 6 h bei 70°C und lässt danach auf Raumtemperatur abkühlen. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und der Festphasenlinker mit THF/Methanol/Wasser, THF und Dichlormethan gewaschen.

Schritt e : Der Festphasenlinker aus Schritt (d) wird in 1 ml Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1 : 1) für 1 h gerührt, abfiltriert und das Filtrat unter Vakuum eingeengt. Man erhält 18 mg der Verbindung 3. MS (ESI) : 507 [M+Hl. Retentionszeit (HPLC) : Rt= 8,8. Herstellung von Verbindung 4 gemäß Tabelle I Die Synthese der Verbindung 4 kann nach folgendem Reaktionsschema erfolgen :

0 zur O O N a p O N ON Ö Go Fmoc-Pro-Wang-Resin 0 O O - %-N Ö 0--. /f"T° Ö O ou \ O N 0 O v e ~/~ Verbindung4 N / Schritt (a) : 4,2 g eines mit Fmoc-L-Prolin beladenen Wang Festphasenlinkers (Rapp-Polymere Tübingen ; 0,75 mmol/g) lässt man in DMF quellen. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und der Festphasenlinker wird für 5 min. mit 32 ml einer Piperidin Lösung (20% Piperidin in DMF) behandelt. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und weitere 32 ml der Piperidin Lösung hinzugegeben. Man rührt für 30 min. bei Raumtemperatur, saugt das Lösungsmittel ab und wäscht mit DMF. Dann wird eine Lösung von 4,4 g Bromessigsäure in 50 ml DMF und eine Lösung von 5,2 g Diisopropylcarbodiimid in 6 ml DMF zugegeben. Man lässt bei Raumtemperatur für 2 h rühren, saugt das Lösungsmittel ab und wäscht mit DMF. Danach gibt man noch einmal eine Lösung von 4,4 g Bromessigsäure in 50 ml DMF und eine Lösung von 5,2 g Diisopropylcarbodiimid in 6 ml DMF zu. Man lässt wieder bei Raumtemperatur für 2 h rühren, saugt das Lösungsmittel ab und wäscht mit DMF.

Schritt

Man lässt den Festphasenlinker aus Schritt (a) in DMSO quellen. Das Lösungsmittel wird abgesaugt, eine Lösung von 7,1 g l, lDimethoxypropan-2-amin in 30 ml DMSO zugegeben und über Nacht geschüttelt. Man wäscht danach mit DMF, Methanol, THF und Dichlormethan.

Schritt c : 70 mg des Festphasenlinkers aus Schritt (b) lässt man in DMF quellen. Nachdem man das Lösungsmittel abgesaugt hat, wird eine Lösung von 98 mg (2E)-3- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) acrylsäure in 0, 865 ml DMF und eine Lösung von 84 mg Diisopropylcarbodiimid in 0,21 ml DMF zugegeben.

Man rührt für 3 h bei Raumtemperatur, saugt das Lösungsmittel ab und wäscht mit DMF. Man gibt ein weiteres Mal eine Lösung von 98 mg (2E)-3- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) acrylsäure in 0,865 ml DMF und eine Lösung von 84 mg Diisopropylcarbodiimid in 0,21 ml DMF zu und rührt bei Raumtemperatur für 3 h. Danach wird abgesaugt und der Festphasenlinker mit Methanol/THF, THF unf Dichlormethan gewaschen.

Schritt d : Eine Lösung von 77 mg N-Hydroxy-l-phenylmethanamin hydrochlorid in 1,2 ml Ethanol/Toluol (2 : 10) wird zum Festphasenlinker aus Schritt (c) gegeben. Man rührt für 6 h bei 70°C und lässt danach auf Raumtemperatur abkühlen. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und der Festphasenlinker mit THF/Methanol/Wasser, THF und Dichlormethan gewaschen.

Schritt (e) : Der Festphasenlinker aus Schritt (d) wird in 1 ml Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1 : 1) für 1 h gerührt, abfiltriert und das Filtrat unter Vakuum eingeengt. Man erhält 17 mg der Verbindung 4. MS (ESI) : 508 [M+H]. Retentionszeit (HPLC) : Rt= 8,6.

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