Les bactéries du genre Corynebacteriuen sont des bactéries apparaissant sous forme de bacilles Gram positifs irréguliers, de croissance aérobie, non sporulés et non partiellement acido-alcoolo résistants. On reconnaît actuellement presque 60 espèces et 2 sous espèces. Ces bactéries sont caractérisées par la présence dans la paroi d'acide meso-diaminopimélique et d'acides mycoliques à courte chaîne (22 à 36 atomes de carbone) [Collins MD, J Gen Microbiol. (1982) 128 : 129-149]. Seules 2 espèces, C. amyucolatum et C. kroppezastedtii, ne possèdent pas d'acides mycoliques [Collins MD.

FEMS Microbiol Let. (1988) 49 : 349-352]. La paroi des corynébactéries comporte aussi de l'arabinose et du galactose mais leur mise en évidence n'est pas recommandée en pratique usuelle pour l'identification. Les principaux acides gras de paroi des Corynébactéries sont l'acide palmitique (C16 : 0), l'acide oléique (C18 : 1w9c) et l'acide stéarique (C18 : 0) qui sont retrouvés chez toutes les corynébactéries. De plus, de l'acide tuberculostéarique peut être observée chez certaines espèces comme C. urealyticum et C. confusum [Bernard KA. J Clin Microbiol (1991) 29 : 83-89 ; Funke G, Int J Syst Bacteriol. (1998) 4 : 1291-1296]. Le G + C % est compris entre 46% (C. k ? tsheri) et 76% (C. auris) [Funke GA, Clin Microbial Rev (1997) 10 : 125-159], montrant l'importante diversité génétique du genre. L'étude de la séquence du gène de l'ARN 16S ribosomique a permis d'améliorer la taxonomie et l'identification des corynébactéries qui sont mal identifiées par les techniques phénotypiques usuelles, notamment pour les laboratoires non équipés de chromatographes

et d'un arsenal exhaustif de tests [Pascual C, Int J Syst Bacteriol (1995) 45 : 724-728 ; Ruimy R, Int J Syst Bacteriol (1995) 45 : 740-746].

Malheureusement le gène de l'ARN 16S ribosomique présente quelques inconvénients dont le principal est son manque de polymorphisme. Les séquences de certaines Corynebactéries étant très proches (voir tableau 3 et figure 2 ci-après), il y a nécessité de déterminer la séquence complète du gène 16S ARNr si l'on désire pouvoir identifier une espèce. Cela impose de séquencer la totalité du gène qui fait environ 1600 paires de bases. La conséquence pratique est que le séquençage doit s'appuyer sur un minimum de 6 réactions de séquence en plus de la réaction d'amplification pour avoir un résultat exact.

Il existe donc toujours une demande d'un outil d'identification moléculaire des bactéries des espèces du genre CozynebactrizJg utilisable en routine au laboratoire de bactériologie, avec notamment un gène suffisamment polymorphique tel que la réalisation d'une séquence courte (moins de 500 paires de bases) avec seulement 1 réaction d'amplification et 2 réactions de séquence soit identifiante, c'est-à-dire amplifiable et séquençable par l'utilisation d'un seul jeu d'amorces.

Les inventeurs ont démontré selon la présente invention, que le gène rpoB constitue un marqueur génétique permettant la détection et l'identification spécifique de la bactérie de chaque espèce du genre Corynebacterium et, en particulier, les 58 espèces suivantes : Corytiebacteriiinï accolens, Corynebacterium aftermentans, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Cotynebacteriu9jz camporealensis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynbacterium diphtheriae, Corynebacterium durum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium gluconolyticum, Corynebacterium glutamicum, Cooynebactefizm imitans, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii,

Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lipophiloflavum. Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium minutissmum, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium sjzycetoides, Cognebactei-iiitn phocae, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium psueodtuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singulare, Corynebacterium strias Corynebacterium sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium ulcerans, <BR> <BR> <BR> <BR> ri ynebacterium variab-lis, Coryizebactei vitaerminis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium testudinoris, Rhodococcus equi, Tusicella otitidis, ainsi que deux sous-espèces de C. aferwentans et deux souches différentes de Rhodococcus equii.

Plus particulièrement, la présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques spécifiques de chaque espèce du genre Corynebacterium ou apparentée citée ci-dessus dont la séquence nucléotidique est tirée du gène s ; toB des dites bactéries.

Selon Lazcano et al. [J. Mol. Evol. (1988) 27 : 365-376], les ARN polymérases sont divisées en deux groupes selon leur origine, l'un constitué par les ARN polymérases virales ARN-ou ADN-dépendantes, et l'autre constitué par les ARN polymérases ADN-dépendantes d'origine eucaryote ou procaryotes (archaébactéries et eubactéries). Les ARN polymérases ADN-dépendantes eubactériennes sont caractérisées par une constitution multimérique simple et conservée notée « core enzyme », représentée par αßß', ou « holoenzyme » représentée par αßß'# [Yura and Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13 : 59-97]. De nombreux travaux ont mis en évidence le rôle fonctionnel, au sein du complexe enzymatique multimérique, de la sous-unité P de l'ARN polymérase eubactérienne. Les ARN polymérases archaébactérienne et eucaryote présentent, pour leur part, une structure plus complexe pouvant atteindre une dizaine, voire une

trentaine de sous-unités [Pühlet et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86 : 4569-4573].

Les gènes qui codent les différentes sous-unités 0 (ßß'cy de l'ARN polymérase ADN-dépendante chez les eubactéries, respectivement les gènes spool, rpoB, ipoc et rpoD, sont classés en différents groupes comprenant les gènes codant pour des protéines constitutives des sous- unités ribosomiques ou pour des enzymes impliqués dans la réplication et la réparation du génome [Yura and Yshihma, Ann. Rev. Genet. (1979) 13 : 59-97]. Certains auteurs ont montré que les séquences des gènes rpoB et fpoC pouvaient être utilisées afin de construire des arbres phylogénétiques [Rowland et al. Biochem. Soc. Trans. (1992) 21 : 40S] permettant de séparer les différents embranchements et sous-embranchements parmi les règnes du vivant.

Avant d'exposer plus en détail l'invention, différents termes, utilisés dans la description et les revendications, sont définis ci-après : -par « acide nucléique extrait de bactéries » on entend soit l'acide nucléique total, soit l'ADN génomique, soit les ARN messagers, soit encore l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse des ARN messagers ; - un « fragment nucléotidique » ou un « oligonucléotide » sont deux termes synonymes désignant un enchaînement de motifs nucléotidiques caractérisé par une séquence informationnelle des acides nucléiques naturels (ou éventuellement modifiés) et susceptibles de s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels, avec un fragment nucléotidique complémentaire ou sensiblement complémentaire, dans des conditions prédéterminées de stringence stricte. L'enchaînement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure différente de celle des acides nucléiques naturels. Un fragment nucléotidique (ou oligonucléotide) peut contenir par exemple jusqu'à 100 motifs nucléotidiques. Il contient généralement au moins 10, de préférence de 18 à 35, motifs nucléotidiques et peut être

obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique, - un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée choisie parmi l'adénine (A), la guanine (G), l'uracile (U), la cytosine (C), la thymine (T) ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs précédents ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosirie, qui peut s'hydrider avec toute base A, T, U, C ou G, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide [Nielsen PE et al., Science (1991) 254 : 1497-1500], soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple par remplacement par des esters choisis notamment parmi les diphosphates, les alkylphosphonates et les phosphorothioates, - par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de s'associer par des liaisons hydrogène stables et spécifiques, pour former un double brin. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la « stringence », c'est à dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est fonction notamment de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépend notamment des sondes utilisées. Toutes ces données

sont bien connues et les conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminées dans chaque cas par des expériences de routine. En général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1 M.

- une « sonde » est un fragment nucléotidique possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise soit dans un ARN messager, soit dans un ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN messager, produit de transcription ; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie, - une « sonde de capture » est une sonde immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un solide. Des exemples de supports comprennent les plaques de microtitration et les puces à ADN, - une « sonde de détection » est une sonde marquée au moyen d'un agent marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, les enzymes, en particulier les enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogéne, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), les composés chimiques chromophores, les composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, les analogues des bases nucléotidiques et les ligands tels que la biotine, - une « sonde d'espèce » est une sonde permettant l'identification spécifique de l'espèce d'une bactérie, - une « amorce » est une sonde comprenant par exemple 10 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour les réactions d'amplification enzyrnatique,

- par « réaction d'amplification » on entend une réaction de polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR, initiée par des oligonucléotides amorces et utilisant une ADN polymérase.

- par « réaction de séquençage », on entend l'obtention de la séquence d'un fragment d'acide nucléique ou d'un gène complet par un procédé de polymérisation abortive à partir d'amorces oligonucléotidique s et utilisant lesdits didésoxynucléotides (Sanger F, Coulson AR (1975), J. Mol. Biol. 94 : 441) ou par hybridations multiples avec des sonde s multiples fixées sur support solide telles qu'utilisées dans les puces ADN par exemple.

Les inventeurs ont déterminé les séquences complètes ou quasi- complètes des gènes rpoB de 55 espèces de bactéries du genre Corynebacterium, d'une sous espèce et de 2 bactéries apparentée s phylogénétiquement proche dont une pour 2 souches différentes (R. equii) à savoir les espèces : Cotynebacteriiim accolens, Cor il Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium bovis, Cosynebacterium call ? « nae Corynebacterium camporealensis Corynebacteriug capitovis, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium durum, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium imitans, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lipophiloflavum, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium psuedotuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singulare, Corynebacterium striatum, Corynebacterium sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium

ulcerans Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium variabilis, Corynebacterium vitaeruminis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium spheniscorum, Cotynebactezium aurimucosum, Corynebacterium testudinoris, Rhdococcus equi, Turicella otitidis Pour arriver à déterminer lesdites séquences complètes, les inventeurs ont pu, après un grand nombre d'essais infructueux, déterminer 47 amorces qui leur ont permis, à partir des seules séquences rpoB de Corynébactéries disponibles sur GENBANK, à savoir C. glutamieunz et C. efficiens d'une part et d'autre part des séquences rpoB de bactéries proches telles que celle de Amycolatopsis mediterranei et Mycobacterium smegmatis, obtenir la séquence rpoB complète ou quasi-complète desdites espèces de bactéries Corynebacterium.

La présente invention a donc pour objet de préférence un gène complet rpoB ou fragment de gène quasi-complet rpoB qui comprend et, plus particulièrement, qui consiste en une dite séquence SEQ ID n°61 à 75 et 77 à 116 d'une bactérie du genre Cosynebacterium ou apparentée, choisie parmi les espèces : Corynebacterium accolens, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium ammoniagens, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium argentoratense Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium durum, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium freneyi, Cosynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium imitans, Corynebacterium jeikeium Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lipophilflavum, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium psuedodiphtheriticum, Corynebacterium psuedotuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singulare, Corynebacterium striatum,

Cotynebacteriiim sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium variabilis, Corynebacterium vitaeruminis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium testudinoris, Rhodococcus equi Turicella otitidis.

La présente invention a également pour objet les séquences des gènes rpoB et fragments de gènes ipob complets ou quasi-complets provenant de différentes souches et/ou sous-espèces d'une même espèce, présentant des taux de similitude d'au moins 98% par rapport à ceux des séquences SEQ ID n°61 à 75 et 77 à 116.

La séquence complète du gène rpoB peut être utilisée pour identifier la bactérie, pas seulement à titre de sonde et/ou par l'étude de sa séquence primaire, mais aussi, par l'étude des structures secondaire et tertiaire de l'ARN messager provenant de la transcription de la séquence complète d'ADN.

Dans ces gènes ipob de Cory) ? ebacterium, les inventeurs ont mis en évidence des séquences consensus SEQ. ID. n°l et 2 suivantes, dénommées ci-après amorces C2700F et C3130R, lesdites séquences SEQ ID n°1 et 2 étant des séquences consensuelles entre toutes les bactéries du genre Corynebacterium, c'est-à-dire permettant d'amplifier la même portion du gène rpob de toutes lesdites bactéries Cosynebactesiue SEQ ID n°l (C2700F) : 5'-CGWATGAACATYGGBCAGGT-3', et SEQ ID n°2 (C3130R) : 5'-TCCATYTCRCCRAARCGCTG-3', dans lesquelles, W représente A ou T, Y représente C ou T, B représente C, G ou T et R représente A ou G.

La présente invention fournit donc des oligonucléotides caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence d'au moins 8, de préférence au moins 12, de préférence encore de 18 à 35 motifs nucléotidiques, dont au moins 8, de préférence au moins 12, de préférence encore au moins 18

motifs nucléotidiques consécutifs inclus dans l'une des séquences SEQ ID n°l et 2 suivantes : - SEQ ID n°l : 5'-CGWATGAACATYGGBCAGGT-3', et - SEQ ID n°2 : 5'-TCCATYTCRCCRAARCGCTG-3'.

Dans lesquelles : W représente A ou T, Y représente C ou T, B représente C, G ou T et R représente A ou G.

Pour être utilisés à titre d'amorces consensuelles, ces oligonucléotides de séquences SEQ ID n°l et 2 sont mis en oeuvre en fait sous forme de mélanges équimolaires d'oligonucléotides de séquences différentes et, plus particulièrement, respectivement de 12 (2ex3) ou 16 (2 4) dits oligonucléotides de séquences différentes d'au moins 8, de préférence au moins 12, de préférence encore au moins 18 nucléotides consécutifs inclus dans les séquences respectivement SEQ ID n°l et SEQ ID n°2.

Ces mélanges équimolaires d'oligonucléotides sont obtenus en mettant en oeuvre des mélanges équimolaires des différents nucléotides concernés respectivement A et T pour W, C et T pour Y, C, G et T pour B et A et G pour R, lors de la synthèse oligonucléotidique.

A la position correspondant à un nucléotide W, Y, B ou R dans les séquences SEQ ID n° 1 et 2, on trouve dans les séquences cibles complémentaires des nucléotides variables en fonction de l'espèce de la bactérie considérée, mais tous les autres nucléotides sont conservés dans toutes les espèces des bactéries du genre Coiyrebacter. Les mélanges d'oligonucléotides, répondant aux nucléotides de définition des séquences SEQ ID n° 1 et 2, peuvent donc s'hybrider avec les différentes séquences complémentaires cibles incluses dans les gènes rpoB de toutes les espèces de bactéries du genre Corynebacterium et, plus particulièrement, les 58 espèces citées ci-dessus. La capacité de ces amorces à amplifier le gène rpoB de bactéries phylogénétiquement proche laisse penser que ces

amorces seront efficaces pour l'identification d'espèces de Corynébactéries qui seront décrites dans le futur.

La présente invention a donc également pour objet un mélange d'oligonucléotides caractérisé en ce qu'il comprend un mélange équimolaire d'oligonucléotides, de séquences différentes comprenant au moins 12, de préférence au moins 18 motifs nucléotidiques consécutifs inclus dans l'une des séquences SEQ. ID. n° 1 et 2, ou les oligonucléotides de séquences inverses ou séquences complémentaires.

Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un mélange d'oligonucléotides, caractérisé en ce qu'il comprend consiste en un mélange équimolaire de 12 oligonucléotides de séquences différentes consistant dans la séquence SEQ. ID. n°l ou des oligonucléotides de séquences inverses ou séquences complémentaires.

De même, plus particulièrement, la présente invention a pour objet un mélange d'oligonucléotides, caractérisé en ce qu'il consiste en un mélange équimolaire de 16 oligonucléotides de séquences différentes consistant dans la séquence SEQ. ID. n°2 ou des oligonucléotides de séquences inverses ou séquences complémentaires.

En outre, les séquences consensus SEQ ID n°l et SEQ ID n°2, ainsi définies, encadrent des séquences hyper variables dont la séquence est spécifique pour chaque espèce des bactéries du genre CorynebacteriTrna. Les oligonucléotides de séquences encadrées par les SEQ ID n°l et 2 peuvent donc être utilisés à titre de sonde d'espèce des bactéries du genre Cosyrzebactez n.

De plus, lesdites séquences hyper variables spécifiques encadrées par les séquences SEQ ID n°l et 2, représentent un fragment du gène ipob d'une longueur d'environ 400 pb avec moins de 96% de similitude entre les différentes espèces (voir tableau 3 ci-après), de sorte qu'elles constituent la plus courte séquence spécifique cible, à tout le moins connue, pour identifier spécifiquement chaque espèce de la bactérie du genre

Cooynebacterium, plus précisément pour les 60 espèces mentionnées ci- dessus.

Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence des séquences spécifiques d'espèces pour chacune des 58 espèces de bactéries citées ci- dessus, correspondant aux séquences SEQ ID n°3 à 60, encadrées par les séquences consensus SEQ ID n°l et 2.

Un autre objet de la présente invention est donc un fragment de gène rpob d'une bactérie du genre Corynebacterium choisie parmi les 58 espèces : Corynebactesiurn accolens, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium <BR> <BR> <BR> animoniagenes, Cotynebacteriuyn anccolatum, CoCnebacteri*um ar ratense, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium bovis, Cozynebacteriuzn callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium durum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium imitans, Corynebacterium jeikeium, Cosyzzebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lipophiloflavum, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium prpinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singulare, Corynebacterium striatum, Corynebacterium sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium variabilis, Corynebacterium vitaeruminis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium testudinoris, Rhodococcus equi, Turicella otitidis caractérisé en ce que sa séquence consiste en une séquence choisie parmi les séquences telles que décrites dans les séquences SED ID n° 3 à 60, les séquences inverses, les séquences complémentaires.

Plus particulièrement, un autre objet de la présente invention est également un fragment de gène ipob d'une bactérie du genre Corynebacterium choisie parmi les 56 espèces : Corynebacterium accolens, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium ammoniagens, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium argentoratens, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebactei-iiim capitovis, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Cosynebacterium cystitidis, Corynbacterium durum, Corynebacterium effieicnes, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium imitans, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lipophiloflaviim, Corynebacterium macginleyi Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mycetoides, Coryraebacterium phocae, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium simulans, Corynebacterium sinigulare, Corynebacterium striatum, Corynebacterium sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium Ivatiabilis Corynebacterium vitaeruminis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium testudinoris, Rhodococciis eqiti, Turicella otitidis, caractérisé en ce que sa séquence consiste en une séquence choisie parmi les séquences telles que décrites dans les séquences SED ID n° 3 à 60, exceptées les séquences SEQ ID n°18 et 26, les séquences inverses, les séquences complémentaires.

La présente invention a également pour objet des fragments de gène rpoB provenant de différentes souches et/ou différentes espèces d'une même espèce que celle des séquences SEQ ID n°3 à 60 mais présentant des taux de similitude d'au moins 98% avec lesdites séquences SEQ ID n°3 à 60, et séquences inverses et séquences complémentaires.

La présente invention a également pour objet des oligonucléotides comprenant une séquence spécifique d'une bactérie du genre Corynebacterium ou apparentée, de préférence d'au moins 20, de préférence au moins 50, plus particulièrement de 50 à 60 nucléotides consécutifs inclus dans l'une des séquences SEQ ID n°3 à 60, les séquences présentant un taux de similitude d'au moins 98% de similitude avec lesdites séquences SEQ ID n°3 à 60, et les séquences inverses et séquences complémentaires.

Les séquences consensus SEQ ID n°l et 2 peuvent être utilisées in vitro à titre d'amorces d'amplification ou de réaction de séquençage dans des procédés de détection de bactérie du genre Corynebacteriitni par identification moléculaire.

Plus précisément, la présente invention fournit un procédé de détection in vitro par identification moléculaire d'une bactérie de l'une des espèces du genre Corynebacterirsnm ou apparentée caractérisé en ce qu'on utilise : - le gène ipob complet ou quasi-complet de ladite bactérie selon l'invention, comprenant une dite séquence SEQ ID n°61 à 116, exceptées la séquence SEQ ID n°76, ou de préférence consistant en une dite séquence SEQ ID n°61 à 116, exceptées la séquence SEQ ID n°76, les séquences présentant au moins 98% de similitude avec les séquences SEQ ID n°61 à 116, exceptées la séquence SEQ ID n°76, les séquences inverses ou les séquences complémentaires, utile notamment à titre de sonde d'espèce d'une dite bactérie, et/ou - un fragment de gène rpoB d'une dite bactérie selon l'invention, comprenant une dite séquence SEQ ID n°3 à 60, exceptées les séquences SEQ ID n°18 et 26, les séquences présentant au moins 98% de similitude avec les séquences SEQ ID n°3 à 60, exceptées les séquences SEQ ID n°18 et 26, les séquences inverses ou les séquences complémentaires ou, de préférence, un fragment de gène rpoB consistant en une dite séquence SEQ ID n°3 à 60, utile notamment à titre de sonde d'espèce d'une dite bactérie, et/ou

- un oligonucléotide de séquence spécifique d'une espèce de ladite bactérie de séquence incluse dans l'une des séquences SEQ ID n°3 à 60, les séquences présentant au moins 98% de similitude avec lesdites séquences SEQ ID n°3 à 60 et les séquences inverses et séquences complémentaires, utile notamment à titre de sonde d'espèce d'une dite bactérie, et/ou -un oligonucléotide ou mélange équimolaire d'oligonucléotides selon l'invention, comprenant une séquence d'au moins 12, de préférence 18 à 35 motifs nucléotidiques, dont au moins 12, de préférence 18 nucléotides consécutifs inclus dans l'une des séquences SEQ ID n° 1 et 2 ou les séquences inverses ou séquences complémentaires, ou de préférence consistant dans l'une desdites séquences SEQ ID n°l et 2, utile notamment à titre d'amorce d'amplification d'un fragment de gène ipob d'une dite bactérie.

Dans un mode de réalisation d'un procédé de détection d'une bactérie du genre Cosynebacterium ou apparentée d'une espèce spécifique, on réalise les étapes dans lesquelles : 1-on met en contact des amorces d'amplification comprenant desdits mélanges d'oligonucléotides selon l'invention avec un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Coiynebacteriilin ou apparentée, et avec : - comme amorce 5', un mélange d'oligonucléotides choisis parmi les oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans la séquence SEQ. ID. n° 1, de préférence consistant dans ladite séquence SEQ ID n°l complète ou les séquences complémentaires, et - comme amorce 3', un mélange d'oligonucléotides comprenant des séquences incluses dans l'une des la séquence SEQ. ID. n° 2, de préférence consistant dans ladite séquence SED ID n°2 complète ou respectivement une séquence complémentaire.

2-on réalise une amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation enzymatique et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification, et on détermine ainsi la présence l'absence de ladite bactérie dans l'échantillon si un produit d'amplification n'est pas apparu.

De préférence, dans un procédé selon l'invention, on utilise : -- comme amorce 5' : un mélange équimolaire de 12 oligonucléotides de séquences différentes SEQ ID n°1 ou de séquences complémentaires, et - comme amorce 3' : un mélange équimolaire de 16 oligonucléotides de séquences différentes SEQ ID n°2 ou respectivement de séquences complémentaires.

Avantageusement, on cherche à détecter spécifiquement une espèce donnée d'une bactérie du groupe Corynebacterium choisie parmi les espèces : Corynebacterium accolens, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium argentoratense, Cosynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium bovis, Cof) callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium durum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium imitans, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lipophiloflavum, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium semina/e Corynebacterium simulans, Corynebacterium <BR> <BR> <BR> <BR> siii, giilai, e, Cor 7 stindsvallense, Cozynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium

ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium variabilis, Corynebacterium vitaeruminis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium testudinoris, Rhodococcus equi, Tuzicella otitidis et à l'étape 2, on détecte la présence d'une dite espèce par hybridation d'une sonde d'espèce comprenant un fragment de gène rpoB ou oligonucléotide spécifique d'une dite espèce selon l'invention.

Dans un autre mode de réalisation d'un procédé de détection d'une bactérie selon l'invention, on cherche à détecter spécifiquement une espèce donnée d'une bactérie du groupe Corynebacterium ou apparentée, choisie parmi les 58 espèces : Corynebacterium accolens, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium durum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium imitans, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium <BR> <BR> <BR> <BR> , giniejli, Cotynebacteriiim mastitidis,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Corynebacteriutn matruchotii Cotyyaebacterium minutissimum Cozynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singulare, Corynebacterium striatum, Corynebacterium sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium ulcerans Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium variabilis, Corynebacterium vitaeruminis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium spheniscorum, Cosynebacteriuri aurimucosum, Corynebacterium testudinoris, Rhodococcus equi, Tuticella otitidis et on réalise les étapes dans lesquelles :

1-on met en contact un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie, avec au moins une sonde d'espèce consistant dans un fragment de gène ipob ou oligonucléotide spécifique d'une espèce de ladite bactérie selon l'invention, de préférence un fragment consistant respectivement dans l'une desdites séquences SEQ. ID. n° 3 à 60, les séquences inverses et séquences complémentaires, et 2-on détermine la formation ou l'absence d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et les acides nucléiques de l'échantillon, et on détermine ainsi la présence de ladite espèce de bactérie Corynebacteßium ou apparentée dans l'échantillon s'il y a formation d'un complexe d'hybridation.

Dans une variante de réalisation d'un procédé de détection d'une bactérie Corynebacterium selon l'invention, on cherche à détecter une espèce donnée d'une bactérie du genre Corynebacterium ou apparentée, choisie parmi les 58 espèces : Corynebacterium accolens Cozynebactezium afermentans Corynebacterixim ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium durum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium imitans, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lipophiloflavum, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilosutn) Corynebactesium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium renale, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singular Cotytiebacteriiim striatum Corynebacterium sundsvallense,

Cosynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium variabilis, Corynebacterium vitaeruminis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium testudinoris, Rhodococcus equi, Tusicella otitidis et, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Cosynebacterium : on réalise les étapes dans lesquelles : a) on réalise une réaction de séquençage d'un fragment du gène rpoB amplifié d'une dite bactérie donnée à l'aide des amorces nucléotidiques consistant dans desdits mélanges d'oligonucléotides selon l'invention, comprenant des séquences incluses dans les séquences SEQ. ID. n°l comme amorce 5'et SEQ. ID. n° 2 comme amorce 3', ou de préférence des oligonucléotides consistant dans lesdites séquences SEQ. ID. n° 1 et 2, ou lesdites séquences complémentaires, et b) on détermine la présence ou l'absence de l'espèce donnée de ladite bactérie en comparant la séquence dudit fragment obtenu avec la séquence du gène complet rpoB de ladite bactérie ou la séquence d'un fragment du gène rpoB de ladite bactérie comprenant respectivement lesdites séquences n° 3 à 60 et séquences complémentaires, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si la séquence du fragment obtenue est identique à la séquence connue du gène ou du fragment de gène ipob de ladite bactérie.

De préférence, dans ce mode de réalisation du procédé de détection selon l'invention : - à l'étape a) on réalise les étapes comprenant : 1-une première amplification de l'acide nucléique dudit échantillon avec un couple d'amorces 5'et 3'choisi parmi desdits mélanges d'oligonucléotides selon l'invention, comprenant respectivement des séquences incluses dans les séquences SEQ. ID. n°1 et SEQ. ID. n° 2, ou de préférence consistant dans lesdites séquences SEQ. ID. n°1 et 2, ou les

séquences complémentaires, et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification, et 2-une réaction de séquençage des amplifiats déterminés à l'étape 1 avec les amorces 5'et 3'consistant dans desdits mélanges d'oligonucléotides comprenant des séquences incluses dans les séquences SEQ. ID. n°l et respectivement SEQ. ID. n°2, ou leurs séquences complémentaires, ou de préférence des oligonucléotides consistant dans lesdites séquences SEQ. ID. n°l et 2 ou leurs séquences complémentaires, et à l'étape b), on compare les séquences obtenues avec respectivement l'une des séquences SEQ. ID. n°3 à 60 ou leurs séquences complémentaires Les séquences SEQ ID n°l à 60 peuvent être préparées par génie génétique et/ou par synthèse automatique ou synthèse chimique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier.

Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées, à des fins de diagnostic, comme mentionné précédemment, par la détermination de la formation ou de l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre la sonde et un acide nucléique cible dans un échantillon, selon toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre, dites « DOT-BLOT » [Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], les techniques de transfert d'ADN dites « SOUTHERN BLOT » [Southern E. M., J. Mol. Biol. (1975) 98 : 503], les techniques de transfert d'ARN dites « NORTHERN BLOT », ou les techniques dites « sandwich », en particulier avec une sonde de capture et/ou une sonde de détection, lesdites sondes étant capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide nucléique cible, et l'une au moins desdites sondes (généralement la sonde de détection) étant capable de s'hybrider avec une région de la cible qui est spécifique de l'espèce, étant entendu que la sonde de capture et al sonde de détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes.

L'acide nucléique à détecter (cible) peut être de l'ADN ou de l'ARN (le premier obtenu après amplification par PCR). Dans le cas de la détection d'une cible de type acide nucléique double brin, il convient de procéder à la dénaturation de ce dernier avant la mise en oeuvre du procédé de détection. L'acide nucléique cible peut être obtenu par extraction selon les méthodes connues des acides nucléiques d'un échantillon à examiner. La dénaturation d'un acide nucléique double brin peut être effectuée par les méthodes connues de dénaturation chimique, physique ou enzymatique, et en particulier par chauffage à une température appropriée, supérieure à 80°C.

Pour mettre en oeuvre les techniques d'hybridation précitées, et en particulier les techniques « sandwich », une sonde de l'invention, appelée sonde de capture est immobilisée sur un support solide, et une autre sonde de l'invention, appelée sonde de détection, est marquée avec un agent marqueur. Les exemples de support et d'agent marqueur sont tels que définis précédemment.

De manière avantageuse, une sonde d'espèce est immobilisée sur un support solide, et une autre sonde d'espèce est marquée par un agent marqueur.

Une autre application d'un dit mélange d'oligonucléotides de l'invention est son utilisation comme amorce nucléotidique comprenant un oligonucléotide monocaténaire choisi parmi les oligonucléotides ayant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques incluses dans l'une des séquences SEQ ID n° 1 à 2, qui est utilisable dans la synthèse d'un acide nucléique en présence d'une polymérase par un procédé connu en soi, notamment dans des méthodes d'amplification utilisant une telle synthèse en présence d'une polymérase (PCR, RT-PCR, etc. ). En particulier, une amorce de l'invention peut être utilisée pour la transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN messager de bactérie d'une espèce du genre Coryiiebacteriiim pour obtenir une séquence d'ADN complémentaire correspondante. Une telle transcription inverse peut constituer le premier

stade de la technique RT-PCR, le stade suivant étant l'amplification par PCR de l'ADN complémentaire obtenu. On peut également utiliser les amorces de l'invention pour l'amplification spécifique par réaction de polymérisation en chaîne de la séquence totale de l'ADN du gène rpoB d'une espèce du genre Corynebacterium.

Selon un cas particulier, ladite amorce comprenant un oligonucléotide de l'invention comprend en outre la séquence sens ou anti- sens d'un promoteur reconnu par une ARN polymérase (promoteurs T7, T3, SP6 par exemple [Studier FW, BA Moffatt (1986) J. Mol. Biol.

189 : 113] : de telles amorces sont utilisables dans des procédés d'amplification d'acide nucléique faisant intervenir une étape de transcription, tels que, par exemple, les techniques NASBA ou 3SR [Van Gemen B. et al. Abstract MA 1091, 7''International Conference on AIDS (1991) Florence, Italy].

Un autre objet de l'invention est une amorce nucléotidique comprenant un mélange d'oligonucléotides monocaténaires choisis parmi les oligonucléotides ayant des séquences comprenant l'une des séquences SEQ ID n°l et 2 ou de préférence, consistant dans l'une des séquences SEQ. ID. n°l et 2 qui est utilisable pour le séquençage total ou partiel du gène rpoB d'une quelconque espèce du genre Corynebacteriuxn.

Le séquençage du gène ipob partiel ou complet chez toute bactérie du genre Cotynebacteriz¢m permet l'identification de toute bactérie Corynebacterium par analyse bio-informatique de cette séquence et la reconnaissance de nouvelles espèces de bactéries Corynebacterium inconnues.

De préférence, dans une utilisation comme amorce ou pour le séquençage des gènes rpoB, on utilise des dits mélanges d'oligonucléotides de séquence SEQ ID n°1 et 2.

La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile dans un procédé selon l'invention comprenant au moins un dit fragment de gène ipob ou oligonucléotide selon l'invention, comprenant

une séquence comprise dans l'une des séquences SEQ. ID. n°3 à 60 et/ou un oligonucléotide ou dit mélange d'oligonucléotides équimolaires selon l'invention, comprenant des séquences incluses dans les séquences SEQ. ID. n°1 et 2, et les oligonucléotides et fragments de gènes spoB de séquences inverses et séquences complémentaires, tels que définis ci-dessus.

Dans la présente description, on entend par"séquence inverse et séquence complémentaire"les séquences suivantes : - la séquence inverse de ladite séquence, - la séquence complémentaire de ladite séquence, et - la séquence complémentaire de la séquence inverse de ladite séquence.

Comme mentionné dans les définitions, un oligonucléotide ou fragment d'acide nucléique selon l'invention peut être sous forme d'un acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'un acide ribonucléique (ARN) pour lesquels dans ce cas T est remplacé par U.

Enfin, un dernier objet de l'invention est une sonde de thérapie génique pour traiter les infections provoquées par une souche appartenant à une espèce du genre Coyyazebacterinm, ladite sonde comprenant un oligonucléotide tel que défini précédemment. Cette sonde de thérapie génique, capable de s'hybrider sur l'ARN messager et/ou sur l'ADN génique desdites bactéries, peut bloquer les phénomènes de traduction et/ou transcription et/ou de réplication.

Le principe des méthodes de thérapie génique est connu et repose notamment sur l'utilisation d'une sonde correspondant à un brin anti-sens : la formation d'un hybride entre la sonde et le brin sens est capable de perturber au moins l'une des étapes du décryptage de l'information génétique. Les sondes de thérapie génique sont donc utilisables comme médicaments antibactériens, permettant de lutter contre les infections causées par les bactéries des espèces du genre Cotyiiebactei-iiim.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention paraîtront et l'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exposé ci-après qui concernent les expériences effectuées et résultats obtenus dans le but de réaliser l'invention et qui sont donnés à titre purement illustratif.

Le tableau 1, ci-après, reprend la liste des espèces de corynebacterium pour lesquelles des séquences spoB ont été déterminées, les souches mentionnées proviennent de la Collection de l'Institut Pasteur (CIP) ou de la Culture collection of the University of Gôteborg (CCUG), les séquences SEQ ID n° 1 à 120 sont décrites dans le listage de séquences annexé à la description.

Dans le tableau 2, sont listées les différentes amorces utilisées pour l'amplification et le séquençage des gènes tpoB. Les positions indiquées le sont relativement à la séquence du gène rpoB de la bactérie Coryiiebacteriiini diphteriae.

Dans le tableau 2, lorsque l'on présente des séquences comprenant des nucléotides W, H, Y, V, R, B, M, K, S ou D, ceux-ci ont les significations connues de l'homme de l'art et, de manière également conventionnelle, ces amorces sont en fait utilisées sous forme de mélange équimolaire d'oligonucléotides de séquences différentes à l'emplacement des dits nucléotides comme expliqué ci-dessus.

Le tableau 3 présente des comparaisons de similitudes des séquences des gènes 16S ARNr et rpoB entre les deux sous-espèces C. afferznentans et entre les 11 couples d'espèces considérées comme proches pour lesquelles les similitudes entre séquences de gènes 16S ARNr sont supérieures ou égales à 98, 5%, avec comparaison statistique des moyennes de similitude obtenues.

Les figures 1 et 2 sont des représentations graphiques du taux de variabilité ("range site variability" : RSV (axe des Y)) des séquences des gènes rpob (figure 1) et respectivement 16S ARNr (figure 2) des différentes espèces du genre Cotnebaetes m étudiées par fenêtres de 50 nucléotides

(axe des X). La région hyper variable, bordée par les régions conservées, utilisée pour l'identification d'espèce à l'aide des amorces C2700F et C3130R, a été encadrée.

La figure 3 est un dendogramme représentant les relations phylogénétiques des différentes espèces de Corynebacterium par la méthode du"neighbour-joining". L'arbre a été construit par l'alignement des séquences du gène rpoB. Les valeurs d'échantillonnage de"bootstrap" (probabilité d'exactitude des noeuds en pourcentage) calculées sur une base d'un échantillon de 1000 arbres, sont indiquées à chaque noeud.

La figure 4 est un dendogramme représentant les relations phylogénétiques des différentes espèces de Coyyyiebacterium par la méthode du"neighbour-joining". L'arbre a été construit par l'alignement des séquences du gène de l'ARN 16S ribosomique. Les valeurs de"bootstrap" (probabilité d'exactitude des noeuds en pourcentage) calculées sur une base d'un échantillon de 1000 arbres sont indiquées à chaque noeud.

1-Matériels et méthodes 1. 1- Souches bactériennes Les souches bactériennes utilisées sont listées dans le tableau 1.

Toutes les souches ont été cultivées sur géloses Columbia 5% de sang de mouton et ont été incubée 24 à 72 h entre 30 °C et 37 °C sous 5% de COo.

1. 2- amplification et séquençage du gène rpob La séquences du gène rpob de Cotynebacteriiim existante et des espèces les plus proches, ont été alignées afin de produire une séquence consensus.

Les séquences choisies étaient celles de Corynebacterium glutamicum Amycolatopsis mediterranei et Mycobacterium.smegmatis (Genebank access numbers NC_003450, AF242549 et MSU24494 respectively). La séquence consensus a permis de déterminer les amorces utilisées ensuite pour les PCR, la technique de genome walking (17) et pour le séquençage. Certaines

amorces ont été déterminées ultérieurement à l'analyse des résultats obtenus. Les amorces sont présentées au tableau 2.

L'ADN bactérien a été extrait de suspensions des souches par QIAamp blood kit (Qiagen, Hilden, Germany) selon les recommandations du fabricant. Tous les mélanges réactionnels de PCR comportaient 2.5 X 10-2 U de polymerase Taq par u. l, IX tampon Taq, 1. 8 mM MgCl2 (Gibco BRL, Life Technologies, Cergy Pontoise, France), 200 uM de dATP, dCTP, dTTP et dGTP (Boehringer Manheim GmbH, Hilden, Germany), et 0. 2 uM de chaque amorce (Eurogentec, Seraing, Belgium). Les mélanges réactionnels de PCR ont été soumis à 35 cycles de dénaturation à 94°C pendant 30 s, une hybridation des amorces pendant 30 s, et une extension à 72°C pendant 2 min. Chaque programme d'amplification débutait par une étape de dénaturation à 95°C pendant 2 min. et terminait par une étape d'élongation à 72°C pendant 10 min. La détermination de la séquence des extrémités des gènes été réalisée par l'utilisation du Universal GenomeWalker Kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Brièvement, l'ADN génique était digéré par Eco RV, Dra I, Pvu II, Stii 1 et Sca I. Les fragments d'ADN été liés avec le GenomeWalker adaptor, La PCR été réalisée en incorporant l'amorce"adaptor primer"fournie par le fabricant et les amorces spécifiques. Pour l'amplification, 1.5 U d'enzyme ELONGASE (Boehringer Manheim) été utilisée avec 10 pmol de chaque amorce, 20 mM de chaque dNTP, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.6 mM MgCl2 et 5 pl d'ADN digéré pour un volume final de 50 al. Les amplicons ont été purifiés à l'aide du"QlAquick spin PCR purification kit" (Qiagen).

Les réactions de séquence ont été réalisées à l'aide des réactifs du séquenceur ABI Prism 3100 ADN séquencer (dRhod. Terminator RR Mix, Perkin Elmer Applied Biosystems).

1. 3-Détermination des séquences partielles discriminantes dans les gènes 16S ARNr et zpoB Afin de détecter les portions de séquence avec une haute variabilité entourées de régions conservées, on a utilisé le programme SVARAP (for

Séquence VARiability Analysis Program, Hypertext link"Téléchargement" at the URL : http ://ifr48. free. fr/recherche/jeu cadre/jeu rickettsie. html).

Une fois cette analyse faite, les zones les plus polymorphiques du gène spot ont été déterminées et des amorces universelles, choisies dans les zones bordantes conservées, ont été désignées après différents essais infructueux. Les conditions de PCR qui incorporaient les amorces universelles (C2700F-C3130R, tableau 2) étaient les mêmes que précédemment mentionnées. Ces amorces ont été utilisées pour l'amplification et le séquençage d'une zone hyper variable pour toutes les souches étudiées.

1. 4- Analyse des séquences B Les fragments de séquences des gènes rpoB obtenus dans cette étude, ont été analysées à l'aide de"Sequence Analysis Software" (Applied Biosystems), et les séquences partielles ont été combinées en une seule séquence consensus à l'aide du"Sequence Assembler Software" (Applied Biosystems). Tous les numéros d'accès des souches sont listés dans le tableau 1. Les alignements multiples et les pourcentages de similitude entres les gènes des différentes espèces ont été réalisés par CLUSTAL W (18) sur le serveur EMBL-EBI (http : //www. ebi. ac. uk/clustalw/). Des arbres phylogéniques ont été réalisés à partir des séquences par 3 méthodes :"neighbor-joining","maximum parsimony"et"maximum likelihood" (4). Les"bootstraps"ont été réalisées pour évaluer la solidité des noeuds en utilisant SEQBOOT dans le logiciel PHYLIP.

2-RESULTATS 2. 1-Séquences ipoB des espèces de Cotynebacteriiim.

La quasi-totalité des séquences des gènes rpoB ont été déterminées pour l'ensemble des souches. Les séquences rpoB étaient plus polymorphiques que celles de l'ARN 16S ribosomique. Ce polymorphisme est plus particulièrement net pour les espèces mal différenciées par le 16S ADNr (tableau 3), parce que parmi les 11 couples d'espèces avec une

similitude en 16S ARNr allant de 98. 5% à 99.7%, la similitude en rpoB va de 84.9 à 96.6%. Les moyennes de similitude observées au sein des 11 couples sont significativement différentes entre le 16S ARNr et le rpoB. Ce plus haut polymorphisme est aussi mis en évidence par calcul du taux de variabilité (RSV : range site variability) (figures 1 et 2). RSV > 10 est constaté pour 44/67 en rpoB contre 5/27 en 16S ARNr (test de Fishert, p < 0.001). RSV > 20 est constaté pour 13/67 en rpoB et 0/27 en 16S ARNr (test de Fishert, p = 0. 008). La similitude des 2 sous-espèces de C. afermentans est de 98. 2%, ainsi 1.6% au dessus de la plus haute similitude observée entre 2 espèces.

2. 2- Analyse phylogénique.

Basée sur l'analyse des séquences du gène rpoB, l'analyse phylogénique utilisant les méthodes"neighbour-joining","parsimony"et "maximum-likelihood"montre une même organisation pour les 4 groupes supportés par de hautes valeurs de"bootstrap" (figures 3 et 4). Seul, le groupe 4 était visible par l'utilisation du gène 16S ARNr. Les valeurs de "bootstar"p obtenues en rpoB sont toujours plus hautes que celles obtenues en 16D ARNr. Des valeurs > à 95% sont observées pour 14/55 des noeuds en 16S ARNr alors qu'elles sont 24/55 en rpoB (test de Fishert, p = 0. 004). Pour certaines espèces, comme C. testudinoris, C. renale C. seminale ou C. glucuronolytycum, la position phylogénique est plus difficile à préciser. La position réelle de T. otidis dans un genre séparé de celui des CoryaaebacteriuJn, n'est pas certaine. L'étude du gène rpoB confirme que le genre RhodococcUS est différent du genre Corynebacterium et que C. hoagii est bien équivalent à R. equii (http ://www. bacterio. cict. fr/c/corynebacterium. html).

2. 3- Identification des souches A l'aide du programme SVARAP software, 4 zones hyper variables ont été détectées (figure 1). Ces zones sont comprises entre les positions 1- 450,800-1100, 1400-1750, et 2750-3200. Plusieurs tentatives pour fournir

des amorces universelles dans le but d'amplifier les 3 premières zones, sont restées sans succès. Il a été possible de fournir une paire d'amorces consensus (C2700F-C3130R) qui a permis l'amplification réussie de la zu zone (positions 2750-3200) dans toutes les espèces du genre Coryiiebacteriiim ainsi que Rhodococc. s eqtri et Tasricella otitidis. Le fragment amplifié a une taille de 434 à 452 pb en fonction de l'espèce. De façon intéressante, cette région est la plus variable (figure 1). Les similitudes observées dans cette portion de yoB sont aussi significativement plus basses que celles observées en 16S RNA puisqu'elles sont comprises entre 87. 9% et 95.9% (tableau 3). La similitude des 2 sous-espèces de C. afernieiztans est de 96.6% soit 0.7% plus haut que la similitude entre deux espèces.

2. 4- Discussion La description de nouvelles espèces est actuellement basée sur les résultats de l'hybridation ADN-ADN et sur la description de caractères phénotypiques, actuellement nommée classification polyphasique (7,19).

Cependant, l'hybridation est une technique compliquée, chère, techniquement complexe et qui demande beaucoup de travail. L'absence ou la rareté de caractères reproductibles limite la caractérisation phénotypique et donc l'identification phénotypique des laboratoire de microbiologie clinique en routine. Le développement de l'amplification/séquençage de gènes, surtout celui de l'ARN 16S ribosomique a simplifié la taxonomie et l'identification de nombreuses espèces bactériennes, surtout celles ayant peu de caractères phénotypiques distinguables. Cependant, comme pour Cozynebacteriug la séquence du 16S rDNA n'est pas assez variable pour l'étude phylogénique basée sur de hautes valeurs de"bootstrap" (figure 1) ou pour permettre une identification basée sur la détermination d'une courte séquence. Les résultats, basés sur les séquences rpoB de ces bactéries, confirment que ce gène est significativement plus variable que le 16S RNA et il est proposé de l'utiliser à la place du 16S ARNr pour l'étude phylogénique des Cosynehacteriuw. Les noeuds à branchement profond sont supportés par de hautes valeurs de"bootstrap"et permettent la mise en évidence de 4 groupes (figure 3). Même parmi les groupes mal résolus,

quelques groupes de bactéries sont bien identifiés, comme celui contenant C. diphteriae, C. Pseudotuberculosis, C. ulcerans et C. kutscheri.

Dans le tableau 3, les 11 couples de Corynebacterium avec la plus haute similitude en 16S ARNr, montrent que la séquence complète doit être déterminée pour assurer une identification certaine. Les amorces universelles fournies selon l'invention, permettent l'amplification et le séquençage de fragments de rpob de 434 à 452 bp suffisamment polymorphiques pour permettre l'identification de toutes les espèces du genre Corynebartesium. La plus haute similitude observée entre 2 espèces différentes est de 95. 9% alors qu'elle est de 99. 7% en 16S ARNr par l'utilisation d'une séquence presque 4 fois plus longue (tableau 3). De plus, les 2 sous-espèces de C. afernieiitaiis ont une similitude en ipob partiel de 96. 6%, soit 0. 7% au dessus de la similitude entre 2 espèces différentes.

Cette différence est de 0. 1% pour le 16S ARNr complet, rendant impossible la différentiation entre 2 espèces proches ou 2 sous-espèces.

Cette différence est même plus grande (1. 6%) quand la séquence rpoB complète est considérée. Les seuils de taux de similitude (cut off) peuvent être définis, pour la définition d'une espèce et d'une sous-espèce dans le genre Corynebacterium basée sur la séquence complète de rpoB, comme étant respectivement inférieur à 96% et supérieur à 98%, à savoir que l'on définit de façon fiable, deux espèces différentes si le taux de similitude est inférieur à 96% et deux espèces identiques si le taux de similitude est supérieur à 98%. Ces seuils sont comparables à ceux observés pour les genres Bartonella, Afipia et Bosea (12,9).

Tableau 1<BR> Genbank Séquence rpoB complète Séquence rpoB partielle<BR> 16S ARNr SEQ ID Taille de la SEQ ID Taille de la<BR> n° séquence (pb) n° séquence (pb)<BR> Corynebacterium accolens CIP 104783T AJ439346 61 3282 3 446<BR> Corynebacterium afermentans CIP 103499T X 82054 62 3347 4 446<BR> subspecies. afermentans<BR> Corynebacterium afermentans CIP 103500T X 82055 118 3178 117 446<BR> lipophilum<BR> Corynebacterium ammoniagenes CIP 101283T X 82056 63 3349 5 446<BR> Corynebacterium amycolatum CIP 103452T X 82057 64 3435 6 434<BR> Corynebacterium argentoratense CIP 104296T X 83955 65 3349 7 446<BR> Corynebacterium aurimucosum CCUG 47449T AJ30920766 3330 8 446<BR> Corynebacterium auris CIP 104632T X 81873 67 3357 9 446<BR> Corynebacterium auriscanis CIP 106629T AJ243820 68 3346 10 452<BR> Corynebacterium bovis CIP 5480T X 82051 69 3450 11 452<BR> Corynebacterium callunae CIP 104277T X 82053 70 3340 12 446<BR> Corynebacterium camporealensis CIP 105508T Y09569 71 3340 13 446<BR> Corynebacterium capitovis CIP 106739T AJ297402 72 3350 14 446<BR> Corynebacterium confusum CIP 105403T Y15886 73 3356 15 446 Genbank Séquence rpoB complète Séquence rpoB partielle<BR> 16S ARNr SEQ ID Taille de la SEQ ID Taille de la<BR> n° séquence (pb) n° séquence (pb)<BR> Corynebacterium coyleae CIP 104919T X 96497 74 3314 16 446<BR> Corynebacterium cystitidis CIP 103424T X 82058 75 3340 17 446<BR> Corynebacterium diphtheriae CIP 100721T X 82059 76 3477 18 446<BR> Corynebacterium durum CIP 105490T Z97069 77 3340 19 446<BR> Corynebacterium efficiens YS-314 AB055963 - 3480 20 446<BR> Corynebacterium falsenii CIP 105466T Y13024 78 3330 21 452<BR> Corynebacterium felinum CIP 106740T AJ401282 79 3334 22 446<BR> Corynebacterium flavescens CIP 69.5T X 82060 80 3303 23 446<BR> Corynebacterium freneyi CIP 106767T AJ292762 81 3345 24 434<BR> Corynebacterium glucuronolyticum CIP 104577T X 86688 82 3328 25 434<BR> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 X80629 - 3480 26 446<BR> Corynebacterium imitans CIP 105130T Y09044 83 3333 27 446<BR> Corynebacterium jeikeium CIP 103337T X 82062 84 3463 28 452<BR> Corynebacterium kroppenstedtii CIP 105744T Y10077 85 3349 29 452<BR> Corynebacterium kutscheri CIP 103423T X 82063 86 3168 30 446<BR> Corynebacterium lipophiloflavum CIP 105127T Y09045 87 3340 31 446<BR> Corynebacterium macginleyi CIP 104099T X 80499 88 3173 32 446 Genbank Séquence rpoB complète Séquence rpoB partielle<BR> 16S ARNr SEQ ID Taille de la SEQ ID Taille de la<BR> n° séquence (pb) n° séquence (pb)<BR> Corynebacterium mastitidis CIP 105509T Y09806 89 3174 33 446<BR> Corynebacterium matruchotii CIP 81.82T X 82065 90 3338 34 446<BR> Corynebacterium minutissimum CIP 100652T X 84679 91 3358 35 446<BR> Corynebacterium mucifaciens CIP 105129T Y11200 92 3330 36 446<BR> Corynebacterium mycetoides CIP 55.51T X 82066 93 3332 37 446<BR> Corynebacterium phocae CIP 105741T Y10076 94 3180 38 446<BR> Corynebacterium pilosum CIP 103422T X84246 95 3296 39 446<BR> Corynebacterium propinquum CIP 103792T X 81917 96 3179 40 446<BR> Corynebacterium CIP 103420T X 81918 97 3477 41 446<BR> pseudodiphtheriticum<BR> Corynebacterium pseudotuberculosis CIP 102968T X 81916 98 3447 42 446<BR> Corynebacterium renale CIP 103421T X 81909 99 3442 43 446<BR> Corynebacterium riegelii CIP 105310T Y14651 100 3180 44 446<BR> Corynebacterium seminale CIP 104297T X 84375 101 3153 45 434<BR> Corynebacterium simulans CIP 106488T AJ012837 102 3176 46 446<BR> Corynebacterium singulare CIP 105491T Y10999 103 3180 47 446<BR> Corynebacterium spheniscorum CCUG 45512T AJ429234 104 3283 48 446 Genbank Séquence rpoB complète Séquence rpoB partielle<BR> 16S ARNr SEQ ID Taille de la SEQ ID Taille de la<BR> n° séquence (pb) n° séquence (pb)<BR> Corynebacterium striatum CIP 81.15 T X 81910 105 3346 49 446<BR> Corynebacterium sundsvallense CIP 105936T Y09655 106 3359 50 446<BR> Corynebacterium terpenotabidum CIP 105927T AB004730 107 3286 51 452<BR> Corynebacterinm testudinoris CCUG 41823T AJ295841 108 3320 52 446<BR> Corynebacterium thomssenii CIP 105597T AF010474 109 3352 53 446<BR> Corynebacterium ulcerans CIP 106504T X 81911 110 3176 54 446<BR> Corynebacterium urealyticum CIP 103524T X 81913 111 3172 55 452<BR> Corynebacterium variabile CIP 102112T AJ222815 112 3343 56 452<BR> Corynebacterium vitaeruminis CIP 827T X 84680 !! 113 3296 57 446<BR> Corynebacterium xerosis CIP 10063T X 81914 114 3447 58 434<BR> Rhodococcus equi (anciennement CIP 81.17T X 82052 115 3357 59 449<BR> Corynebacterium boagii)<BR> Rhodococcus equi CIP 5472T AF490539 120 3320 119 449<BR> Turicella otitidis CIP 104075T X 73976 116 3250 60 446 Tableau 2.

Nom de Séquence Position Tm l'amorce (°C) C240F GGAAGGAYGCATCTTGGCAGTCT-13 68 C150F GGYACGCCYGAGTGGC 133 56 C35F GGAAGGACCCATCTTGGCAGT-13 66 C41F CAGTCTCCCGCCAGACCA 5 60 C445R CATYGGGAARTCRCCGATGA 401 60 C40F CAGTCTCCCGCCAGACCAA 5 62 C390F ATCAAGTCYCAGACKGTYTTCATC 322 68 C390R GATGAARACMGTCTGRGACTTGAT 322 68 C630F GACCGCAAGCGYCGCCAG 621 64 C600f TGGYTBGARTTYGACGT 574 50 C600r ACGTCRAAYTCVARCCA 574 50 C640R GGCTGRCGRCGCTTGCGGT 623 66 C890F TACAAGRTCAACCGCAAG 883 52 C820R GGRCGYTGCTTGCGGTAGA 772 62 C1050F CGAYGACATYGACCACTT 1040 54 C1050R GGTTRCCRAAGTGGTCRATGTC 1045 68 C1295F CAGTTYMTGGACCAGAACAAC 1254 62 C1410F GAGCGYATGACCACBCAGGA 1144 64 C1410R TCCTGVGTGGTCATRCGCTC 1144 64 C1415F CBCACTACGGMCGYATGTG 1373 62 C1740F ACGATGCTAACCGTGCACTGAT 1739 66 C1740R CCCATCAGTGCACGGTTAGCAT 1742 68 C1765R GTGCTCSAGGAAYGGRATCA 1718 62 C1770F TGATGGGYGCSAACATGCAG 1757 64 C1800f ATGGGYGCSAACATGCAG 1759 56 C1800r CTGCATGTTSGCRCCCAT 1759 56 C2160R GRCCYTCCCAHGGCATGAA 2107 60 C2130F GGARGGCCACAACTACGAGGA 2118 64 C2130R GTGGCCYTCCCAHGGCATGAA 2107 68 C2350F ACATCCTGGTCGGTAAGGTCAC 2339 68 C2350R GTGACCTTACCGACCAGGATGT 2339 68 C2385F CATCCTSGTSGGYAAGGTCA 2340 64 C2410R ATGATCGCRTCCTCGTAGTTGTG 2125 68 C2410F CACAACTACGAGGAYGCGATCAT 2125 68 C2470R CGATCTCGTGCTCCTCGATGT 2192 66 C2590F CARAAGCGCAAGATCCARGA 2563 60 C2625F AGATCCARGAYGGCGAYAAG 2572 60 C3190F ATGGAGGTGTGGGCAATGCAG 3154 66 C3190R CTGCATTGCCCACACCTCCAT 3154 66 C3200t CTGCATBGCCCACACCTCCAT 3154 68 C3215R GCCTGCATBGCCCACACCT 3158 64 C3300F GAAGGGCGADAAYATYCCGGAT 3264 66 C3300R TCCGGRATRTTHTCGCCCTTCA 3263 66 C3350R CCTTGAASGACTCHGGRATAC 3290 64 C3490R CACGGGACAGGTTGATGCC 3430 62 C3630R GAGMACCTCSACGTTSAGGCACA 3335 70 C3500R TCGTCDCGBGACAGGTTGATG 3433 66 C2700F CGWATGAACATYGGBCAGGT 2714 60 C3130R TCCATYTCRCCRAARCGCTG 3140 62 Tableau 3<BR> Couples d'espèces proches 16S ADNr ropB complète ropB partielle<BR> C. diphtheriae / C. ulcerans 98.5 86 87.9<BR> C. diphtheriae / C. pseudoiuberculosis 98.5 84.9 87.9<BR> C. ulcerans / C. pseudotuberculosis 99.7 93.6 93<BR> C.pseudodiphtheriticum / C. propinquum 99.3 89.7 93.9<BR> C. aurimucosum / C. singulare 99 94.2 93.9<BR> C. aurimucosum / c. minutissimum 98.7 94.6 93.9<BR> C. singulare/ C. minutissimum 98.9 93.8 95.5<BR> C. xerosis / C. freneyi 98.7 96.6 95.9<BR> C. macginleyi / C. accolns 98.7 93.3 91.7<BR> C. sundsvallens / C. thomassenii 98.9 90.4 91<BR> C. mucifaciens / C. afermantans 98.5 94 92.4<BR> Moyenne 98.85 91.91 92.45<BR> Analyse statistique par comparaison au 16S ADNr p = 0.03 p = 0.01<BR> (Student's t-test)<BR> C. afermentans subspecies. afermentas / 99.8 98.2 96.6<BR> C. afermentans subspecies lipophilum