Procedimiento para la inmovilización de una nueva penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae para la obtención de ácido 6- aminopenicilánico.

Sector de la técnica.

La presente invención se encuadra dentro del campo biotecnológico de la obtención de ácido 6-aminopenicilánico a partir de penicilinas naturales, y más concretamente, a partir de penicilina V.

La invención se refiere a un nuevo método de inmovilización covalente sobre Eupergit C de la penicilina V acilasa aislada de cultivos de Streptomyces lavendulae.

Estado de la técnica.

Actualmente existe una amplia gama de penicilina V acilasas inmovilizadas, de diversas fuentes microbianas, como se refleja en la Tabla 1. Se puede afirmar que no se conocen referencias relativas a la inmovilización de la penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae.

Explicación de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la inmovilización de una nueva penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae para la obtención de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA)

Concretamente esta invención permite la obtención industrial de 6- APA a partir de penicilina V mediante la utilización de una nueva preparación de penicilina V acilasa (penicilina amidohidrolasa, EC 3.5.1.11) inmovilizada. Este biocatalizador se ha preparado mediante la inmovilización covalente de la penicilina V acilasa (PVA) de Streptomyces lavendulae ATCC 13664 en el soporte comercial Eupergit C (Rhöm GmbH, Kirschenallee, Alemania).

La PVA es producida por el actinomiceto Streptomyces lavendulae ATCC 13664 según el protocolo descrito por Torres et al., 1998 (Torres, R., de la Mata, I., Castillón, M. P., Arroyo, M., Torres, J., Acebal, C. (1998) Purification and characterization of penicillin V acylase from Streptomyces lavendulae. Progress in Biotechnology 15.

Stability and Stabilization of Biocatalysts, A. Ballesteros, F. J. Plou, J. L. Iborra y P. J. Halling Eds. Elsevier. Amsterdam, pp. 719-724.), parcialmente purificada por precipitación con acetona y posteriormente liofilizada.

La inmovilización de la PVA se realiza sobre Eupergit C, un soporte constituido por un copolímero de metacrilamida, N, N'- metilen-bis-metacrilamida y grupos oxirano. La enzima se une covalentemente al soporte a través de sus grupos epóxido (grupos oxirano).

Este nuevo biocatalizador permite una notable mejora de la estabilidad de la enzima frente a la temperatura y el pH. A su vez, posibilita su reutilización lo que supone una ventaja económica a la hora de llevar a cabo reacciones industriales de obtención de 6-APA.

Se ha considerado una unidad de actividad (UI) como los gmoles de ácido 6-aminopenicilánico producidos en un minuto a 40°C

y pH 9,5 y valorados espectofotométricamente por reacción con p- dimetil-aminobenzaldehido (método del PDAB) según las especificaciones de Balasingham, K., Warburton, D., Dunnill, P. y Lilly, H. D. (The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 1972,276,250-256).

El preparado inmovilizado de PVA en Eupergit C ha mostrado una importante mejora en sus características cinéticas tras un tratamiento con seroalbúmina bovina (BSA), posterior a la unión de la enzima. Este tratamiento ha permitido incrementar la actividad del derivado inmovilizado en un 60% con respecto a la que presenta antes de la modificación con BSA.

El nuevo derivado inmovilizado de penicilina V acilasa en Eupergit C, modificado con BSA, se ha denominado ECPVA.

Si comparamos esta preparación inmovilizada de la PVA con otras descritas anteriormente, nuestra invención presenta una serie de ventajas : la Km (ap) (7,64 mM) más baja de las descritas en la bibliografía, una Vmáx (ap) de 0,393 UI/g derivado y un rendimiento del 80% de hidrólisis de penicilina V (5 mM) a 6-APA después de una hora de reacción.

ECPVA presenta además la máxima actividad en el intervalo de pH 9,5-10,5 y de temperatura 40-45°C, lo que permite su óptima utilización industrial en la obtención de 6-APA a partir de penicilina V.

En las condiciones óptimas de ensayo establecidas (pH 9,5 y 40°C), ECPVA presenta una vida media de 304 horas, mientras que incrementa su estabilidad considerablemente a 40°C y pH 7, aumentando su vida media hasta al menos 1150 horas.

Finalmente, ECPVA se puede utilizar en sucesivas reacciones de 1 hora durante al menos 50 ciclos, conservando el 100% del rendimiento exhibido en el primer ciclo de actividad.

Modo de realización de la invención El procedimiento para la inmovilización de una nueva penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae para la obtención de acide 6-aminopenicilanico, objeto de la invention, se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de su alcance.

Ejemplo 1.

Este ejemplo hace referencia al método de inmovilización de la PVA de Streptomyces lavendulae ATCC 13664 en el soporte Eupergit C.

Se disuelven 4,59 UI de liofilizado de PVA en tampón fosfato potásico 0.1 M pH 8 en un volumen final de 5 ml. A esta disolución, se le anade ácido fenoxiacético (inhibidor competitivo de la penicilina V acilasa) a una concentración 30 mM con el fin de evitar la posible unión de la enzima al soporte por su centro activo durante la inmovilización.

Se mantiene durante 5 minutos la disolución enzimática en presencia de ácido fenoxiacético, y posteriormente se añade 1 gramo de Eupergit C seco. La mezcla se incuba, con agitación en vaivén y a temperatura ambiente, en un matraz erlenmeyer de 25 ml.

Tras 24 horas, se obtiene 3,6 gramos de derivado inmovilizado húmedo de PVA en Eupergit C. A continuación, se lava 2 veces con 40 ml de agua destilada y otras 2 veces con 40 ml de tampón fosfato potásico 0,1 M y pH 8.

Ejemplo 2.

Hace referencia a los métodos empleados para determinar la eficacia de la unión de la penicilina V acilasa al soporte Eupergit C.

La eficacia de unión de la enzima al soporte se determina valorando la presencia de proteína por el método de Bradford (Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principe of protein-dye binding. Anal. Biotech. 1976,72,248-245) y de actividad enzimática (método del PDAB) en cada uno de los lavados del derivado inmovilizado. La finalidad es comprobar que toda la enzima que se ha puesto en contacto con el soporte ha quedado unida a él.

El resultado de la inmovilización muestra que el 100% de la PVA queda unida al Eupergit C.

Ejemplo 3.

El ejemplo nos muestra las condiciones de reacción en la hidrólisis de la penicilina V a ácido 6-aminopenicilánico catalizada por el derivado inmovilizado de penicilina V acilasa en Eupergit C.

Las condiciones son las siguientes :

1.0,36 gramos de derivado por cada mililitro de volumen de reacción.

2. Tampón : fosfato-citrato-borato (1 : 1 : 1) 0,1 M pH 9,5 3. Temperatura : 40°C 4. Agitación orbital : 190 r. p. m.

El seguimiento de la hidrólisis de la penicilina V se lleva a cabo valorando la cantidad de ácido 6-aminopenicilánico producido, para lo cual se toman alícuotas de 50 tel y se diluyen con 0,25 ml de agua destilada, para posteriormente añadir 0,9 ml de ácido acético al 20% (v/v). El 6-APA producido se valora mediante el método del PDAB.

El derivado inmovilizado según el ejemplo 1 muestra una actividad de 0,245 UI/g de derivado inmovilizado. El rendimiento de la reacción de hidrólisis de penicilina V (5mM) catalizada por este derivado es de un 76% tras una hora de reacción.

Ejemplo 4.

Se describe la modificación del derivado inmovilizado de PVA en Eupergit C, para dar lugar al biocatalizador ECPVA.

Tras la unión de la enzima al soporte, todavía quedan en el Eupergit C grupos oxirano sin reaccionar. Mediante un tratamiento con seroalbúmina bovina (BSA), proteina que contiene muchos residuos de lisina, se consigue neutralizar la matriz al reaccionar los grupos amino de estos aminoácidos con los grupos oxirano que no han reaccionado.

Esta modificación se lleva a cabo de la siguiente manera :

1.3,6 gramos del derivado preparado según el ejemplo 1 se incuban con 5 ml de una solución 5 mg/ml de BSA durante 25 horas a temperatura ambiente y agitación en vaivén.

2. Tras la incubación, con el fin de eliminar el exceso de seroalbúmina bovina, y así evitar posibles interferencias con la reacción de hidrólisis, el derivado se lava siguiendo el protocolo anteriormente descrito.

Se obtiene de esta forma un derivado inmovilizado de PVA modificado con BSA, al que denominamos ECPVA.

Ejemplo 5 Hace referencia a como se analiza si la modificación con BSA produce algún cambio en la eficacia de la unión de la PVA al Eupergit C. El método a seguir es el mismo que el expuesto en el ejemplo 2.

Los resultados obtenidos de este análisis muestran que el 100% de la PVA sigue unida al soporte.

Ejemplo 6.

Hace referencia a cuales son las condiciones de ensayo utilizadas en la hidrólisis de penicilina V catalizada por ECPVA.

Tiene lugar en un reactor en discontinuo, con las condiciones siguientes : 1.0,36 gramos de derivado por cada mililitro de volumen de reacción 2. Tampón : fosfato-citrato-borato (1 : 1 : 1) 0,1 M pH 9,5

3. Temperatura : 40°C 4. Agitación orbital : 190 r. p. m.

El seguimiento de la hidrólisis de la penicilina V catalizada por el ECPVA se lleva a cabo igual que como se indicó en el ejemplo 3.

El derivado inmovilizado y modificado (ECPVA) muestra una actividad de 0,393 UI/g de derivado. El rendimiento de la reacción de hidrólisis de penicilina V (5 mM) catalizada por ECPVA alcanza un 80% tras una hora de reacción.