Verfahren zur Isolierung von Zellen und Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Separationssystemen für Zellen und/oder Krankheitserregern auf der Grundlage von Untereinheiten aus zirkulierenden Immunkomplexen (CIC).

Wissensstand

Die funktionelle Grundlage für die Immunreaktion beruht auf dem fein abgestimmten Zusammenwirken von lokalen und systemisch wirksamen zellulären und humoralen Komponenten der angeborenen und erworbenen Immunität. CIC sind das Produkt stattgefundener Aktionen und Reaktionen zwischen diesen Komponenten, wie z.B. Antikörpern und Antigenen, Rezeptoren und dazugehörigen Liganden, Komplementfaktoren, Albumin und anderen Plasmabestandteilen. Im Ergebnis formen sich partikuläre Agglomerate, die von Phagozyten aufgenommen und abgebaut werden. Im immunpathologischen Geschehen sind sie mitverantwortlich für das Entstehen und die Aufrechterhaltung einer Vielzahl von akuten und chronischen, mit Entzündung einhergehenden Erkrankungen.

CIC sind das morphologische Endprodukt und damit Spiegelbild stattfindender oder abgelaufener Prozesse der Immunregulation. Das trifft für die physiologische, lebenserhaltende Immunantwort ebenso zu, wie für immunpathologische Vorgänge, die zu Krankheit und Tod führen können. In jedem Individuum können CIC im Blut nachgewiesen werden. überhöhte Werte werden z.B. in Zusammenhang gebracht mit Rheumatoider Arthritis.

Die Analytik der Zusammensetzung der CIC durch Aufspaltung und Bestimmung derer Untereinheiten wäre eine Momentaufnahme der immunregulatorischen Vorgänge in einem Individuum.

Die Untereinheiten können schonend gewonnen werden. Sie bewahren dabei ihre Funktion, den jeweiligen Reaktionspartner zu binden. Die Untereinheiten können auf

eine feste Matrix gekoppelt werden. Dieses Verfahren ist in DE 19538641 beschrieben. Es ermöglicht im Sinne einer Affinitätschromatographie die Entfernung von CIC und deren Untereinheiten aus dem Blut von den Individuen, von dem die CIC gewonnen wurden. Im Tierexperiment mit Ratten des Inzuchtstammes BB/OK konnte eine Beeinflussung der Immunregulation durch Plasmapherese nachgewiesen werden. BB/OK-Ratten entwickeln einen auto-agressive ß-Zellzerstörung ähnlich der des humanen juvenilen Diabetes (Diabetes Typ 1). Die aus Sammelplasmen gewonnene CIC wurden dissoziiert und kovalent an Sepharose gekoppelt. Es gelang durch eine extra-korporale und temporäre Behandlung von Ratten im prädiabetischen Zustand mit nachweisbarer Insulitis (Voraussetzung für eine Diagnostik im humanen System) der Prozess der ß-Zellzerstörung aufzuhalten (Berg, S. et al. Diab. Stoffwechsel 11 (2002) Suppl. 1. S. 55).

Pathogenetische Grundlagen, Autoimmunität, Allergien und Tumore

Sowohl an der effizienten Abwehr infektiöser Agenzien und toxischer Substanzen als auch an der Homeostase der gesunden körpereigenen Zellen sind eine Reihe von immunkompetenten Zellen und Signalsystemen beteiligt. Antikörper, Rezeptoren und lösliche Mediatoren spielen in diesem komplizierten Prozess eine wesentliche Rolle. Antikörper sind spezifisch gegen Fremd- und Selbstantigene gerichtet und tragen über verschiedene Mechanismen (z.B. Komplementaktivierung) zu deren Eliminierung bei. Die Balance und korrekte Funktion des Immunsystems hängt dabei von einer Reihe von Faktoren ab.

Autoimmunität ist durch den Verlust der Toleranz gegen körpereigenes Gewebe charakterisiert. Multiple endogene und exogene Faktoren sind an der Dysregulation des Immunsystems beteiligt. Viele Mechanismen, die in die Pathogenese der Autoimmunkrankheiten involviert sind, werden diskutiert. Kreuzreagierende Antikörper oder eine antigengetriebene spezifische Immunantwort sind zwei der vielen Möglichkeiten. Die inadäquate Kontrolle der potenziell autoreaktiven Zellen und die Präsentation von Autoantigenen führen schließlich zur Formation autoreaktiver Zellen und zur Produktion pathogener Antikörper mit der Folge einer erheblichen Schädigung und nicht selten lebensbedrohenden Konsequenzen.

Autoantikörper vermittelte Störungen bilden ein breites Spektrum, das von der funktionellen Beeinträchtigung eines Rezeptors bis zur destruktiven systemischen Erkrankung reicht.

Das klinische Bild hängt von der Spezifität der Autoimmunreaktion ab. Organspezifische Erkrankungen wie Morbus Basedow bilden die eine Seite des Spektrums. Auf der anderen Seite findet man die systemischen Autoimmunerkrankungen, denen auch die rheumatischen Erkrankungen (z. B. Rheumatoide Arthritis) zugeordnet werden. Hierbei sind sowohl Läsionen als auch Antikörper nicht auf nur ein Organ beschränkt. Des weiteren werden Misch- und übergangsformen beschrieben, wie z.B. Myasthenia gravis.

In der Konsequenz ist die Entfernung der pathogenetisch bedeutsamen Autoantikörper bzw. der CIC, die Autoantikörper enthalten, notwendig, um die pathologischen Prozesse günstig zu beeinflussen und die assoziierten Symptome zu kontrollieren.

Allergien entstehen ebenfalls auf der Basis einer Fehlsteuerung des Immunsystems.

Der Erstkontakt mit bestimmten Antigenen (Allergenen) induziert bei genetisch prädisponierten Personen eine Fehlsteuerung im Gleichgewicht zwischen Ig-

Subklassen, IgE-Rezeptorverteilung, TH1 :TH2-Verhältnis (und damit Cytokinsynthese) und IgE-Synthese. Ergebnis dieser Fehlsteuerung sind die bekannten akuten bzw. chronischen Symptome nach wiederholtem Allergenkontakt.

Das Ergebnis der Dysregulation ist neben der erhöhten IgE- und IgE-Rezeptorsynthese ebenfalls eine signifikante, mit dem Serum-lgE-Spiegel korrelierende Erhöhung von IgG- anti-lgE-Autoantikörpern, die sich in zirkulierenden Immunkomplexen nachweisen lassen (so konnten bis zu 32% des Gesamt-Serum-lgE bei Patienten mit atopischer Dermatitis in Form von IgG-anti-lgE-lmmunkomplexen nachgewiesen werden). Es besteht jedoch keine Korrelation zwischen der Konzentration von IgG-anti-lgE- Immunkomplexen und der Schwere der Erkrankung, begründet in der bekannten Heterogenität der Autoantikörper in ihrer Fähigkeit, die Histaminfreisetzung aus Basophilen zu induzieren.

Autoantikörper spielen zweifellos eine immunmodulatorische Rolle, die nicht näher bekannt ist. Darüber hinaus könnten IgG-anti-lgE durch die hohe Affinität von C1q zu

IgGI und dem Fc gamma-Rezeptor eine IgE-Allergen-Komplex eliminierende Funktion haben.

Bisherige Ansatzpunkte einer (mehr oder minder) kausalen Therapie bestehen in der Inaktivierung von freien IgE, mit Ausnahme des Einsatzes von Nedocromil, das wahrscheinlich während der B-Zellreifung den Subklassen-Switch zum IgE unterbindet. Neben der Applikation hoher Dosen von Spender-IgG, was in Einzelfällen überzeugende Resultate erbringt, hat die Anwendung eines rekombinanten humanisierten monoklonalen Antikörpers (rhuMAb-E25, eine gemeinsame Entwicklung der Firmen Genentech, Novatis Pharma und Tanox Biosystems) den weitesten Weg bis zur Zulassung zurückgelegt. Dieser Antikörper bindet an der Fc-Rezeptorbindungs- Region des freien IgE und verhindert deren Andocken an die unterschiedlichen IgE- Rezeptoren. Das ermöglicht es, erfolgreich die Konzentration freien IgE um mehr als 95 % zu senken. Die Eliminierung des Mab-lgE-Komplexes geschieht über den oben beschriebenen Weg des IgG-FcR-Bindung.

Ein Nachteil der Anwendung dieses Antikörpers wird das Kostenproblem sein, was insbesondere bei Patienten zu Buche schlägt, deren IgE-Spiegel stark erhöht ist.

Neben der Inaktivierung freien IgE's durch Antikörper könnte die extrakorporale Entfernung eine weitere, zumindest bei bestimmten Patienten erfolgversprechende Therapiemethode sein.

Versuche dazu wurden in der ehemaligen Sowjetunion und Japan mit Immunadsorbern durchgeführt, die als Liganden spezifische anti-lgE-Antikörper kovalent gebunden hatten. Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet. Die Konzentration freien IgE wurde um 83-98 % gesenkt und über einen Beobachtungszeitraum von 6 Monaten konnte ein therapeutischer Effekt nachgewiesen werden. Differenzierte Behandlungsprotokolle sind leider nicht zugänglich.

Tumore entgehen der immunologischen Abwehr durch das Freisetzen verschiedener Faktoren, die eine Immuntoleranz induzieren, in deren Folge der unbegrenzt wachsende Tumor von der Körperabwehr wie ein „Embryo" betrachtet wird. Gegen die als Neoantigene bezeichneten Tumorproteine werden spezifische Antikörper gebildet bzw.

sind spezifisch bindende Liganden vorhanden. Antikörper wie Liganden führen zur Komplexierung der Neoantigene. Die immunologische Reaktion wird u. a. unterdrückt durch folgende Mechanismen:

• Freisetzung immunsuppressiver Faktoren (wie löslicher Tumornekrosefaktor-

5 Rezeptor (sTNFRs) und Neoantigene wie CEA, MUC1 , CA15-3 u.a.). Bei einigen

Neubildungen hat die Blutkonzentration von Neoantigen-lmmunkomplexen prognostische Bedeutung.

• Beeinflussung regulativer T-Zellen (TGFß- Anstieg führt zur Abfall zytotoxischer T-Zellen)

I O • Erhöhung der ILT3- und ILT4- Expression auf dentritischen Zellen induziert

Immuntoleranz

• Antigenmodulation

• Cytophile Antikörper maskieren Tumor-Antigene

] 5 Der Verlust der Gewebeintegration im Ergebnis einer erhöhten Expression von NFATtumorceiis (nuclear factor of activated T cells) und α-6-ß-4-lntegrin; die Unterdrückung der Apoptose (TOR - Sir3 - hsp; Reaper - DIAP; Dbc2 Protein - apoptosis; - ) und/oder erhöhte Zellteilung (HER-network - EGFR; ras - IL24/IL24Receptor) und Vaskularisierunq solider Tumore (CUGBP2 - COX2 -

20 Prostaglandine) generieren dem wachsenden Tumor zusätzliche Vermehrungsvorteile.

Die Kondensationsprodukte von Tumor-Aktion und Körper-Gegenaktion zirkulieren als CIC im Blut.

Seit mehr als 20 Jahren werden Plasmaaustausch und Protein-A-Immunadsorption als therapeutische Maßnahme in der Tumorbehandlung erprobt. Ein temporärer, positiver 5 Effekt war in bestimmten Fällen nachweisbar.

Virusinfektionen

Die Interaktion von Virus und Antikörper führt normalerweise zur Neutralisierung des Virus. Diese Virusimmunkomplexe werden von Phagozyten aufgenommen und

abgebaut. Von einigen Viren, wie z.B. Dengue Virus, ist jedoch bekannt, dass in Immunkomplex gebundenes Virus sogar eine höhere Infektiosität habe kann als das freie. Neutralisierte Herpesvirus-lgG-lmmunkomlexe induzieren die gleiche IL6- Freisetzung in Makrophagen, wie freie Virus-DNA. In Hunden wurde eine Korrelation nachgewiesen zwischen Staupevirus-Immunkomplexen und rheumatoider Artrithis (MAY et al. Rheumatology.1994; 33: 27-31). Virus-Immunkomplexe spielen eine pathogetische Rolle für die virusinduzierten Immunkomplex-Krankheiten (z.B. Glomerulonephritis, Appel, G. B.etz al. NEJM, 18 Feb, 1993). Fast alle Patienten, die an einer chronischen Hepatitis C Infektion leiden, tragen Immunkomplex gebundenes HCV (MORITA T. et al., Hepato-gastroenterology, 1996, 43, 582-585), was zur ständigen Reinfektion führen kann. Eine therapeutische Beeinflussung von, meist chronischen Virusinfektionen mit extra-korporalen Blutbehandlungsverfahren muss also auch immer das im Immunkomplex gebundene Virus entfernen.

Aufgabenstellung

Während die Analytik einzelner Faktoren und deren Rolle in der physiologischen und pathologischen Immunreaktion Dank molekularbiologische Untersuchungsmethoden einen raschen Erkenntnisgewinn generieren, ist die Untersuchung regulatorischer Zusammenhänge auf zellulärer Ebene noch immer methodisch anspruchsvoll.

Die Erfindung hat das Ziel ein Verfahren, eine Anordnung und ihre Verwendung bereitzustellen, auf deren Grundlage mit unterschiedlichen Trennverfahren Zellen, einschließlich Krankheitserreger aus Körperflüssigkeiten isoliert oder untersucht werden können. Dabei ist es im ersten Schritt notwendig die Zielzellen zu erkennen.

Grundlage der Erfindung sind CIC. Sie sind nicht nur das zum Abbau vorgesehene Endprodukt in der biologischen Reaktionskette. CIC sind auch Schlüssel für die Isolierung von Zellen aus dem Blut von Individuen, die in Beziehung stehen zum aktuellen Status zellulärer Immunregulation. überraschenderweise hat sich gezeigt, dass Untereinheiten aus CIC auf der Oberfläche von Zellen binden.

Die Aufgabenstellung wird gemäß der Ansprüche 1 -20 gelöst.

Beschreibung der Erfindung

Die CIC werden mit bekannten Verfahren, z.B. Fällungsverfahren oder mittels Protein A - Adsorbem aus dem Plasma von Individuen gewonnen. Nach solcher Isolierung werden die CIC in ihre biologisch aktiven Bestandteile zerlegt. Das geschieht vorzugsweise durch Absenken des pH auf <3,0. Jetzt können die Untereinheiten durch bekannte Verfahren, z.B. Gel-Chromatographie, getrennt und einzeln und einzeln oder als Gemisch an entsprechende Trägermaterialien, vorzugsweise Mikropartikel, gekoppelt werden, wobei als feste Träger alle verfügbaren festen Materialen geeignet sind, insbesondere Polystyrol oder besonders bevorzugt Sepharose. Mit Hilfe dieser „Fängerpartikel" können aus Blut und anderen Körperflüssigkeiten unter Verwendung unterschiedlicher Trennverfahren Zellen separiert werden. In einem zweiten Schritt können die Zellen charakterisiert, in vitro kultiviert, in Subpopulationen aufgetrennt, manipuliert, und für weitere diagnostische oder therapeutische Zwecke angewendet werden.

Auch eine Zellabreicherung mittels eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen extrakorporalen Verfahren zur therapeutischen Anwendung kann mit der erfindungsgemäßen Methode durchgeführt werden. Solche Systeme sind durch bekannte Verfahren auch reaktivierbar und zum vielfachen Gebrauch möglich.

Die Erfindung wird mit folgenden Beispielen näher beschrieben:

Beispiel 1 :

Gewinnung von antikoagulierten Blut von Spender JM mittels üblichen Entnahmesystems. 4 ml Vollblut zentrifugieren (10 min 600xg), 2 ml Plasma abnehmen und mit 2 ml 0,1 M Borat-Puffer versetzen. 4 ml 7% PEG in Borat-Puffer zugeben und für 30 sec vortexen. Fällungsreaktion über Nacht im Kühlschrank.

Fällung 30 min 4°C 1600xg zentrifugieren, überstand abnehmen und verwerfen und das Sediment mit 10 ml 3,5 % PEG in Borat-Puffer waschen. 2x 1 min vortexen und 30 min 4°C 1600xg zentrifugieren.

überstand abnehmen und verwerfen, Sediment in 1 ml PBS pH 7.4 aufnehmen und Lösung homogenisieren.

pH des CIC-Gemisch mit HCl auf pH 3,0 absenken.

5 Proteinkopplung:

Polystyrolpartikel mit NHS und EDC in MES Puffer aktivieren, aktivierte Partikel mit MES pH 3,0 waschen und in MES-Puffer pH 3,0 aufnehmen, Proteinlösung dazugeben, Lösung bewegen, dabei binden die Proteine an die PS-Partikel. Abstoppen freier Bindungsstellen durch Glycin oder Ethanolamine. Waschen der PS-Partikel mit PBS und I O Aufnehmen in PBS.

Inkubation der Partikel mit Zellen:

a) Mono Nuclear CeIIs (MNC) von Spender JM nach Ficollgradient

3 Mio. MNC in 300 μl PBS/BSA Puffer pH 7,4 aufnehmen und mit 20.000 mit CIC 5 gekoppelte Partikel in ein Reaktionsröhrchen geben. Auf einem Kipprollmischer für 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Danach Lösung im Reaktionsröhrchen mit 3 ml PBS-BSA Puffer auffüllen. Partikel über Sieb isolieren und mit 5 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 waschen und mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 Partikel in eine Multiwellplatte zurückspülen 0 b) Vollblut:

2 ml Vollblut 350xg 10 min zentrifugieren und Plasma abnehmen und verwerfen. Blutpellet mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 mischen und 350xg 10 min zentrifugieren. Schritte 2-3 4 mal wiederholen, überstand abnehmen und aufkonzentriertes Vollblut aufwirbeln. 1 ml gewaschenes Vollblut und 20.000 mit CIC gekoppelte Partikel in das 5 Probenröhrchen geben und auf Kipprollmischer 45 min bei RT inkubieren. Lösung im Mischcontainer mit 3 ml PBS7BSA Puffer auffüllen und Partikel über Sieb isolieren und

mit 10 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 waschen. Mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 Partikel in eine Multiwellplatte zurückspülen

Calcein AM und Propidiumjodid zugeben und am Fluoreszenzmikroskope auswerten.

Beispiel 2:

4 ml Vollblut zentrifugieren (10 min 600xg), 2 ml Plasma abnehmen und mit 2 ml 0,1 M Borat-Puffer versetzen. 4 ml 7% PEG in Borat-Puffer zugeben und für 30 sec vortexen. Fällungsreaktion über Nacht im Kühlschrank.

Fällung 30 min 4 ⁰ C 1600xg zentrifugieren, überstand abnehmen und verwerfen und das Sediment mit 10 ml 3,5 % PEG in Borat-Puffer waschen. 2x 1 min vortexen und 30 min 4°C 1600xg zentrifugieren.

überstand abnehmen und verwerfen, Sediment in 1 ml PBS pH 7.4 aufnehmen und Lösung homogenisieren.

pH des CIC-Gemisch mit HCl auf pH 3,0 absenken.

Abtrennung einer 3OkDa - 100kDa-Fraktion:

Zur Proteinlösung in Amicon Ultra 100K mit 4 ml PBS pH 2,7 geben, 20 min 4000xg 4°C zentrifugiert. Durchfluss wird in ein Amicon Ultra 3OK Röhrchen überführt zentrifugiert 30 min bei 4000xg 4 ⁰ C. Schritt 17 und 18 wiederholen und Proteinlösung in Amicon Ultra 3OK 2x waschen mit 4 ml PBS pH 3,0. Fraktionen 3OkDa-IOOkDa vereinen und Proteingehalt bestimmen.

Proteinkopplung:

Polystyrolpartikel mit NHS und EDC in MES Puffer aktivieren, aktivierte Partikel mit MES pH 3,0 waschen und in MES-Puffer pH 3,0 aufnehmen, Proteinlösung dazugeben, Lösung bewegen, dabei binden die Proteine an die PS-Partikel. Abstoppen freier Bindungsstellen durch Glycin oder Ethanolamine. Waschen der PS-Partikel mit PBS und Aufnehmen in PBS.

Inkubation der Partikel mit Zellen:

a) Mono Nuclear CeIIs (MNC) von Spender HW nach Ficollgradient

3 Mio. MNC in 300 μl PBS/BSA Puffer pH 7,4 aufnehmen und mit 20.000 mit CIC gekoppelte Partikel in ein Reaktionsröhrchen geben. Auf einem Kipprollmischer für 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Danach Lösung im Reaktionsröhrchen mit 3 ml PBS-BSA Puffer auffüllen. Partikel über Sieb isolieren und mit 5 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 waschen und mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 Partikel in eine Multiwellplatte zurückspülen

b) Vollblut:

2 ml Vollblut 350xg 10 min zentrifugieren und Plasma abnehmen und verwerfen. Blutpellet mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 mischen und 350xg 10 min zentrifugieren. Schritte 2-3 4 mal wiederholen, überstand abnehmen und aufkonzentriertes Vollblut aufwirbeln. 1 ml gewaschenes Vollblut und 20.000 mit CIC gekoppelte Partikel in das Probenröhrchen geben und auf Kipprollmischer 45 min bei RT inkubieren. Lösung im Mischcontainer mit 3 ml PBS7BSA Puffer auffüllen und Partikel über Sieb isolieren und mit 10 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 waschen. Mit 1 ml PBS/BSA Puffer pH 7.4 Partikel in eine Multiwellplatte zurückspülen

Calcein AM und Propidiumjodid zugeben und am Fluoreszenzmikroskope auswerten.

In den Abbildungen 1-4 ist ersichtlich, das sowohl mit der gesamt CIC-Proteinfarktion, wie auch mit der 30-100kDa-Fraktion, MNC des gleichen Spenders isoliert werden können. Zumindest ein Teil dieser spezifischen Zellen werden nicht durch Antikörper gebunden, sondern von Proteinen mit einer relativen Molmasse zwischen 30 und 10OkDa.

Legende zu den Abbildungen

Abbildung 1.: Gesamtfraktion dissoziierter CIC gekoppelt an Partikel und inkubiert mit Mono Nuclear CeIIs (MNC) von Spender JM nach Ficollgradient.

Abbildung 2.: Gesamtfraktion dissoziierter CIC gekoppelt an Partikel und inkubiert mit Vollblut von Spender JM .

Abbildung 3.: 30-100kDa-Fraktion dissoziierter CIC gekoppelt an Partikel und inkubiert mit Mono Nuclear CeIIs (MNC) von Spender JM nach Ficollgradient

Abbildung 4.: 30-100kDa-Fraktion dissoziierter CIC gekoppelt an Partikel und inkubiert mit Vollblut von Spender JM.

Alle in der vorangehenden Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und den Abbildungen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.