本発明による検体中のLDL-Cの測定法は、� �心分離などの物理的方法によるリポ蛋白の� �画操作を必要としない方法である。また、LD L-Cの測定に先立って検体中のLDL以外のリポ蛋 白中のコレステロールを消去することなく、 検体中のLDL-Cを測定する方法である。またLDL- Cの測定に先立ってLDL以外のリポ蛋白中のコ� �ステロールを測定することなくLDL-Cを測定す る方法である。

 本発明の検体中のLDL-C測定方法は、以下の� �程を順次行うことを特徴とする方法である� �
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵 素とを、コレステロール酸化酵素を含有しな い水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエ チレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエ チレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキル エーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシ アルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ ポリオキシアルキレンアルキルアリールエー テルからなる群より選ばれる1種又は2種以上� ��界面活性剤及びコレステロール酸化酵素、� ��すれば、さらにコレステロールエステル加� ��分解酵素を添加して共存させ、該反応液中� ��コレステロールを、コレステロール酸化酵� ��、要すればコレステロールエステル加水分� ��酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程 [2]の反応により消費される物質を測定する工 程。

 また、本発明の検体中のLDL-C測定方法は、� �下の工程を順次行うことを特徴とする方法� �ある。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵 素とを、コレステロール脱水素酵素を含有せ ず、要すれば酸化型補酵素を含有する水性媒 体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエ チレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエ チレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキル エーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシ アルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ ポリオキシアルキレンアルキルアリールエー テルからなる群より選ばれる1種又は2種以上� ��界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及� ��酸化型補酵素、要すれば、さらにコレステ� ��ールエステル加水分解酵素及び酸化型補酵� ��からなる群より選ばれる少なくとも1つを添 加して共存させ、該反応液中のコレステロー ルを、コレステロール脱水素酵素及び酸化型 補酵素、要すればコレステロールエステル加 水分解酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程 [2]の反応により消費される物質を測定する工 程。

 検体中のLDL-Cの測定に際しては、既知濃� �のLDL-Cを含む試料を標準品として使用して作 成した検量線と実際の測定値とから、検体中 のLDL-C濃度を決定する。

 本発明の測定方法において用いられるLDL� ��含有する検体としては、例えば全血、血漿� ��血清等が挙げられるが、血漿及び血清が好� ��しい。

 本発明におけるコレステロールエステル� ��水分解酵素としては、コレステロールエス� ��ルを加水分解する能力を有する酵素であれ� ��特に限定はなく、例えば動物、植物又は微� ��物由来のコレステロールエステラーゼ、リ� ��プロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な� ��法により製造されるコレステロールエステ� ��ーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いる� ��とができる。

 コレステロールエステル加水分解酵素と� ��ては、無修飾のコレステロールエステル加� ��分解酵素も、化学的に修飾されたコレステ� ��ールエステル加水分解酵素も使用すること� ��できる。また、コレステロールエステル加� ��分解酵素としては市販品を使用することも� ��きる。

 市販されているコレステロールエステル� ��水分解酵素としては、コレステロールエス� ��ラーゼ(COE-311;東洋紡績社製)、リポプロテイ ンリパーゼ(LPL-311;東洋紡績社製)、コレステ� �ールエステラーゼIII(CHEIII;天野製薬社製)等� �挙げられる。また、本発明においては、2種� ��以上のコレステロールエステル加水分解酵� ��を組み合わせて用いることもできる。

 コレステロールエステル加水分解酵素の� ��学修飾において当該酵素を修飾する基(化学 修飾基)としては、例えばポリエチレングリ� �ールを主成分とする基、ポリプロピレング� �コールを主成分とする基、ポリプロピレン� �リコールとポリエチレングリコールの共重� �体を有する基、水溶性多糖類を含有する基� �スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリ� �レタン基、キレート機能を有する基等が挙� �られるが、ポリエチレングリコールを主成� �とする基が好ましい。水溶性多糖類として� �、例えばデキストラン、プルラン、可溶性� �ンプン等が挙げられる。

 コレステロールエステル加水分解酵素を� ��学的に修飾するための試薬(化学修飾剤)と� �ては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ� �、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と� �応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合� �等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応� �得る官能基又は構造としては、例えばカル� �キシル基、活性エステル基(N-ヒドロキシサ� �シンイミド基等)、酸無水物、酸塩化物、ア� ��デヒド、エポキシド基、1,3-プロパンスルト ン、1,4-ブタンスルトン等が挙げられる。酵� �中のカルボキシル基と反応し得る官能基又� �構造としては、例えばアミノ基等が挙げら� �る。酵素中のスルフヒドリル基と反応性が� �る基又は構造としては、例えばマレイミド� �、ジスルフィド、α-ハロエステル(α-ヨード� ��ステル等)等が挙げられる。

 化学修飾剤として、市販品を使用するこ� ��もできる。市販されている化学修飾剤とし� ��は、ポリエチレングリコールを主成分とす� ��基とN-ヒドロキシサクシンイミド基とを有� �るサンブライトVFM-4101、サンブライトME-050AS� ��サンブライトDE-030AS(いずれも日本油脂社製) 、ポリアルキレングリコールを主成分とする 基と酸無水物構造とを有するサンブライトAKM シリーズ(例えば、サンブライトAKM-1510等)、� �ンブライトADMシリーズ、サンブライトACMシ� �ーズ(いずれも日本油脂社製)、ポリエチレン グリコールを主成分とする基とエポキシド基 とを有するEPOX-3400、M-EPOX-5000(いずれもSheawater  Polymers社製)、キレート機能を有する基と酸� ��水物構造とを有するジエチレントリアミン- N,N,N’,N’’,N’’-ペンタ無水二酢酸(DTPA anhy dride;同仁化学研究所社製)等が挙げられる。

 コレステロールエステル加水分解酵素の� ��学修飾は、例えば以下の方法で行うことが� ��きるが、本方法に限定されるものではない� ��まず、コレステロールエステル加水分解酵� ��をpH8.0以上の緩衝液(例えばHEPES緩衝液)に溶� ��し、0~55℃で0.01~500倍モル量の化学修飾剤を� ��加し、5分間~5時間攪拌する。実際の酵素反� ��においては、化学的に修飾されたコレステ� ��ールエステル加水分解酵素として、この反� ��液そのもののみならず、必要に応じて限外� ��過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去� ��たものも、使用することもできる。

 本反応の方法に用いられるコレステロール� ��ステル加水分解酵素の濃度としては、本発� ��のLDL-Cの測定を可能とする濃度であれば特� �制限はないが、反応液中で0.001~800U/mLの濃度� ��あることが好ましく、0.01~300U/mLであること� ��より好ましい。
 本発明におけるコレステロール酸化酵素と� ��ては、コレステロールを酸化して過酸化水� ��を生成する能力を有する酵素であれば特に� ��限はなく、例えば動物、植物又は微生物由� ��のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝� ��工学的な手法により製造されるコレステロ� ��ルオキシダーゼ等も用いることができ、コ� ��ステロールオキシダーゼ(CHODI;協和発酵工業 社製)、コレステロールオキシダーゼ(CHODI;キ� ��コーマン社製)、コレステロールオキシダー ゼ(CO-CE;キッコーマン社製)、コレステロール� ��キシダーゼ(COO-321;東洋紡績社製)等の市販品 を用いることもできる。また、本発明におい ては、2種類以上のコレステロール酸化酵素� �組み合わせて用いることもできる。

 コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素� ��あっても、化学的に修飾された酵素であっ� ��もよい。化学的に修飾されたコレステロー� ��酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用� ��て、前述の化学修飾方法により作製するこ� ��ができる。
 本発明に用いられるコレステロール酸化酵� ��の濃度としては、本発明のLDL-Cの測定を可� �とする濃度であれば特に制限はないが、反� �液中で0.001~800U/mLの濃度であることが好まし� ��、0.01~300U/mLの濃度であることがより好まし� ��。

 本発明におけるコレステロール脱水素酵� ��としては、酸化型補酵素の存在下にコレス� ��ロールを酸化して還元型補酵素を生成する� ��力を有する酵素であれば特に制限はなく、� ��えば動物、植物又は微生物由来のコレステ� ��ールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的� ��手法により製造されるコレステロールデヒ� ��ロゲナーゼ等も用いることができる。コレ� ��テロールデヒドロゲナーゼ“Amano” 5 (CHDH5 ;天野エンザイム社製)等の市販品を用いるこ� ��もできる。また、本発明においては、2種類 以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わ せて用いることもできる。コレステロール脱 水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学 的に修飾された酵素であってもよい。化学的 に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、 例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化 学修飾方法により作製することができる。

 本発明に用いられるコレステロール脱水素� ��素の濃度としては、本発明のLDL-Cの測定を� �能とする濃度であれば特に制限はないが、� �応液中で0.001~800U/mLの濃度であることが好ま� ��く、0.01~300U/mLの濃度であることがより好ま� ��い。
 本発明のコレステロール脱水素酵素を用い� ��測定法においては、酸化型補酵素が使用さ� ��る。酸化型補酵素としては、例えばNAD、NADP 、チオ(thio)-NAD、チオ(thio)-NADP等が挙げられる 。

 本発明において用いられる界面活性剤と� ��ては、ポリオキシエチレン分岐アルキルエ� ��テル(以下POE分岐アルキルエーテルと略記す る)、ポリオキシエチレンポリオキシアルキ� �ン分岐アルキルエーテル(以下、POE・POA分岐� ��ルキルエーテルと略記する)、ポリオキシエ チレン・ポリオキシアルキレン縮合物(以下� �POE・POA縮合物と略記する)及びポリオキシエ� ��レン・ポリオキシアルキレンアルキルアリ� ��ルエーテル(以下、POE・POAアルキルアリール エーテルと略記する)が挙げられる。以下、� �れらの界面活性剤からなる群より選ばれる� �面活性剤を化合物Aと略記する。

 POE分岐アルキルエーテルにおける分岐ア� ��キルとしては炭素数6~30の例えば、イソヘキ シル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノ ニル、イソデシル、イソウンデシル、イソド デシル、イソトリデシル、イソテトラデシル 、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イ ソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノ ナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル 、イソヘネイコシル、イソドデシル、イソト リコシル、イソテトラコシル、デシルテトラ デシル、イソペンタコシル、イソヘキサコシ ル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシ ル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イ ソトリアコンシル等が挙げられるが、炭素数 10以上の分岐アルキルが好ましい。炭素数10� �上の分岐アルキルとしては、例えばイソデ� �ル、イソウンデシル、イソドデシル、イソ� �リデシル、イソテトラデシル、イソペンタ� �シル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシ� �、イソオクタデシル、イソノナデシル、イ� �イコシル、オクチルドデシル、イソヘネイ� �シル、イソドデシル、イソトリコシル、イ� �テトラコシル、デシルテトラデシル、イソ� �ンタコシル、イソヘキサコシル、ドデシル� �トラデシル、イソヘプタコシル、イソオク� �コシル、イソノナコシル、イソトリアコン� �ル等が挙げられる。

 POE分岐アルキルエーテルのポリオキシエチ� ��ンのオキシエチレンの重合度としては、好� ��しくは2~60であり、より好ましくは4~40であ� �。
 POE分岐アルキルエーテルの具体例としては� ��ノイゲンTDS200D、ノイゲンTDS-500F、ノイゲンS D150、ノイゲンSD300(以上、第一工業製薬社製)� ��ノニオンIC235、ノニオンIC230、ノニオンIC235� ��ノニオンOD225、ノニオンOD230、ノニオンOD235( 以上、日本油脂社製)、EMALEX 1615、EMALEX 1625� �EMALEX 1815、EMALEX 1820、EMALEX 1825、EMALEX OD-10� ��EMALEX OD-16、EMALEX OD-20、EMALEX OD-25、EMALEX OD -25JJ、EMALEX 2420、EMALEX 2425(以上、日本エマル ジョン社製)等が挙げられる。

 POE・POA分岐アルキルエーテルにおける分� ��アルキルとしては炭素数6~30の例えば、イソ ヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イ ソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イ ソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデ シル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル 、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イ ソノナデシル、オクチルドデシル、イソイコ シル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル 、イソドコシル、イソトリコシル、イソテト ラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタ コシル、デシルペンタデシル、イソヘキサコ シル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコ シル、イソオクタコシル、イソノナコシル、 イソトリアコンシル等が挙げられるが、炭素 数12以上の分岐アルキルが好ましい。炭素数1 2以上の分岐アルキルとしては、例えばイソ� �デシル、イソトリデシル、イソテトラデシ� �、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、� �ソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソ� �ナデシル、オクチルドデシル、イソイコシ� �、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、� �ソドコシル、イソトリコシル、イソテトラ� �シル、デシルテトラデシル、イソペンタコ� �ル、デシルペンタデシル、イソヘキサコシ� �、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシ� �、イソオクタコシル、イソノナコシル、イ� �トリアコンシル等が挙げられる。

 POE・POA分岐アルキルエーテルにおけるポリ� ��キシアルキレン(POA)としては、ポリオキシ� �チレン以外のポリオキシプロピレン、ポリ� �キシブチレン等が挙げられる。
 POE・POA分岐アルキルエーテルのポリオキシ� ��チレンのオキシエチレンの重合度としては� ��好ましくは2~60であり、より好ましくは4~40� �あり、ポリオキシアルキレンのオキシアル� �レンの重合度としては、好ましくは1~40であ� ��、より好ましくは1~20である。

 なお、本発明に用いられるPOE・POA分岐アル� ��ルエーテルにおけるPOE・POAの重合様式とし� ��はとくに制限はなく、例えば、ブロック重� ��型、ランダム重合型の重合様式のものが挙� ��られる。ブロック重合型としては、例えば� ��ブロックコポリマー、トリブロックコポリ� ��ー、テトラブロックコポリマー等が挙げら� ��る。
 POE・POA分岐アルキルエーテルの具体例とし� ��は、ユニルーブMIL-0822B(以上、日本油脂社製 )等が挙げられる。

 POE・POA縮合物におけるポリオキシアルキレ� ��(POA)としては、ポリオキシエチレン以外の� �リオキシプロピレン、ポリオキシブチレン� �が挙げられる。
 POE・POA縮合物におけるポリオキシアルキレ� ��(POA)の分子量としては、好ましくは500~6000で あり、より好ましくは1500~4000である。
 なお、本発明に用いられるPOE・POA縮合物に� ��けるPOE・POAの重合様式としてはとくに制限� ��なく、例えば、ブロック重合型、ランダム� ��合型の重合様式のものが挙げられる。ブロ� ��ク重合型としては、例えばジブロックコポ� ��マー、トリブロックコポリマー、テトラブ� ��ックコポリマー等が挙げられる。

 POE・POA縮合物としては、ポリオキシアルキ� ��ンの分子量が1,500~4,000であるPOE・POA縮合物� �好ましい。POE・POA縮合物を用いる場合は、� �述のPOE・POAアルキルアリールエーテルと組� �合わせて用いることが好ましい。
 POE・POA縮合物の具体例としては、プルロニ� ��クL-121、プルロニックP-103、プルロニックF-1 08(以上、旭電化社製)、プロノンB-204、プロノ ンB-208(以上、日本油脂社製)等が挙げられる� �

 POE・POAアルキルアリールエーテルにおける� ��ルキルとしては例えばオクチル、ノニル、� ��デシルなどが挙げられ、POE・POAアルキルア� ��ールエーテルにおけるアリールとしてはフ� ��ニル等が挙げられる。
 POE・POAアルキルアリールエーテルにおける� ��リオキシアルキレン(POA)としては、ポリオ� �シエチレン以外のポリオキシプロピレン、� �リオキシブチレン等が挙げられる。

 なお、本発明に用いられるPOE・POAアルキル� ��リールエーテルにおけるPOE・POAの重合様式� ��してはとくに制限はなく、例えば、ブロッ� ��重合型、ランダム重合型の重合様式のもの� ��挙げられる。ブロック重合型としては、例� ��ばジブロックコポリマー、トリブロックコ� ��リマー、テトラブロックコポリマー等が挙� ��られる。
 POE・POAアルキルアリールエーテルの具体例� ��しては、エマルゲンL40等(花王社製)等が挙� �られる。

 本発明のLDL-Cの測定においては、界面活性� �として、化合物Aを1種用いることも、2種以� �用いることもできる。
 化合物Aの濃度としては、本発明のLDL-Cの測� ��方法を可能とする濃度であれば特に制限は� ��いが、反応液中の濃度が0.0001~20%であること が好ましく、0.001~5%がより好ましい。

 本発明において用いられるポリアニオン� ��しては、本発明のLDL-Cの測定を可能とする� �リアニオンであれば特に制限はなく、例え� �デキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリ� �もしくはその塩、リンタングステン酸又は� �の塩、硫酸化シクロデキストリン又はその� �、硫酸化オリゴ糖又はその塩等が挙げられ� �が、デキストラン硫酸もしくはその塩が好� �しい。デキストラン硫酸としては、例えば� �子量が4万、8万、20万、50万、100万、200万等� �デキストラン硫酸が挙げられる。硫酸化オ� �ゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、� �酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等� �挙げられる。塩としては、例えばナトリウ� �塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウ� �塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また� �本発明においては、ポリアニオンを2種以上� ��いてもよい。本発明のLDL-Cの測定における� �リアニオンの濃度としては、本発明のLDL-Cの 測定を可能とする濃度であれば特に制限はな いが、反応液中の濃度が0.0005~10%であること� �好ましく、0.005~1%がより好ましい。

 本発明において用いられる水性媒体は、本� ��明のLDL-Cの測定を可能とする水性媒体であ� �ば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸� �水、緩衝液等を含み、緩衝液が好ましい。
 本発明のLDL-Cの測定方法におけるpHはLDL-Cの� ��量を妨げない範囲であればいずれでもよい� ��、設定するpHに応じた緩衝剤を用いること� �望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては� �例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタ ン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グ ッドの緩衝剤等が挙げられる。

 グッドの緩衝剤としては、例えば2-モル� �リノエタンスルホン酸(MES)、ビス(2-ヒドロキ シエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メ タン(Bis-Tris)、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢� �(ADA)、ピペラジン-N,N’-ビス(2-エタンスルホ� ��酸)(PIPES)、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタ� �スルホン酸(ACES)、3-モルホリノ-2-ヒドロキシ プロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N-ビス(2-ヒドロ� ��シエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、3 -モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N-〔ト リス(ヒドロキシメチル)メチル〕-2-アミノエ� ��ンスルホン酸(TES)、2-〔4-(2-ヒドロキシエチ� ��)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)� �3-〔N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ〕-2-� ��ドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N-〔ト� ��ス(ヒドロキシメチル)メチル〕-2-ヒドロキ� �-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラ� ��ン-N,N’-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホ� �酸)(POPSO)、3-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペ� ��ジニル〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸( HEPPSO)、3-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジ ニル〕プロパンスルホン酸〔(H)EPPS〕、N-〔ト リス(ヒドロキシメチル)メチル〕グリシン(Tri cine)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(B icine)、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-� �ミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N-シクロヘキ シル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、N-シク� ��ヘキシル-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンス� ��ホン酸(CAPSO)、N-シクロヘキシル-3-アミノプ� ��パンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。

 緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば� ��に制限はされないが、0.001~2.0mol/Lが好まし� �、0.005~1.0mol/Lがより好ましい。
 本発明のLDL-Cの測定方法のための反応温度� �、本発明のLDL-Cの測定方法を可能とする温度 であれば特に制限はないが、10~50℃が好まし� ��、30~40℃がより好ましい。汎用の自動分析� �置での設定は通常37℃である。

 本発明のLDL-Cの測定方法のための反応時間� �、本発明のLDL-Cの測定を可能とする反応時間 であれば特に制限はないが、1~60分間が好ま� �く、2~30分間がより好ましい。
 本発明のLDL-Cの測定においては、工程[1]は� �例えば10~50℃、好ましくは30~40℃で、1~60分間 、好ましくは2~30分間行う。工程[2]は、例え� �10~50℃、好ましくは30~40℃で、1~60分間、好ま しくは2~30分間行う。

 本発明のLDL-Cの測定において、工程[3]は� �例えば反応により生成した過酸化水素や還� �型補酵素を測定することにより行う。また� �反応において消費される酸素量を測定する� �とにより行ってもよい。

 生成した過酸化水素の量は、例えば過酸� ��水素電極や過酸化水素測定用試薬を用いて� ��定することができる。過酸化水素測定用試� ��は、生成した過酸化水素を検出可能な物質� ��変換するための試薬である。検出可能な物� ��としては、例えば色素、発光等が挙げられ� ��が、色素が好ましい。検出可能な物質が色� ��の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸� ��発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過� ��化活性物質を含有する。酸化発色型色原体� ��しては、例えば後述の酸化発色型色原体が� ��げられる。検出可能な物質が発光の場合に� ��、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質� ��含有する。化学発光物質としては、例えば� ��ミノール、イソルミノール、ルシゲニン、� ��クリジニウムエステル等が挙げられる。

 過酸化水素測定用試薬として、酸化発色� ��色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活� ��物質を含有する試薬を用いる場合には、過� ��化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化� ��色型色原体と反応して色素を生成し、生成� ��た色素を測定することにより、定量するこ� ��ができる。また、化学発光物質を含有する� ��酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過� ��化水素は、化学発光物質と反応してフォト� ��を生じ、生じたフォトンを測定することに� ��り、定量することができる。

 酸化発色型色原体としては、例えばロイ� ��型色原体、酸化カップリング発色型色原体� ��が挙げられる。ロイコ型色原体は、過酸化� ��素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物� ��の存在下、単独で色素へ変換される物質で� ��る。具体的には、テトラメチルベンジジン� ��o-フェニレンジアミン、10-N-カルボキシメチ ルカルバモイル-3,7-ビス(ジメチルアミノ)-10H- フェノチアジン(CCAP)、10-N-メチルカルバモイ� ��-3,7-ビス(ジメチルアミノ)-10H-フェノチアジ� ��(MCDP)、N-(カルボキシメチルアミノカルボニ� ��)-4,4’-ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルア� �ン ナトリウム塩(DA-64)、10-N-(カルボキシメ� �ルアミノカルボニル)-3,7-ビス(ジメチルアミ� ��)-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)、4 ,4’-ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン� ��ビス〔3-ビス(4-クロロフェニル)メチル-4-ジ� ��チルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げ� ��れる。

 酸化カップリング発色型色原体は、過酸化� ��素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物� ��の存在下、2つの化合物が酸化的カップリン グして色素を生成する物質である。2つの化� �物の組み合わせとしては、カプラーとアニ� �ン類との組み合わせ、カプラーとフェノー� �類との組み合わせ等が挙げられる。
 カプラーとしては、例えば4-アミノアンチ� �リン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒ ドラゾン等が挙げられる。

 アニリン類としては、N-(3-スルホプロピ� �)アニリン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スル� �プロピル)-3-メチルアニリン(TOOS)、N-エチル-N -(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチ� �アニリン(MAOS)、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-ス ルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、 N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-3-メチルアニリ ン(TOPS)、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3, 5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N-ジメチル-3-� �チルアニリン、N,N-ジ(3-スルホプロピル)-3,5-� ��メトキシアニリン、N-エチル-N-(3-スルホプ� �ピル)-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-(3-ス� �ホプロピル)アニリン、N-エチル-N-(3-スルホ� �ロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、N-(3-スルホ プロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル- N-(3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン、N -エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-� ��トキシアニリン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3 -スルホプロピル)アニリン、N-エチル-N-(3-メ� �ルフェニル)-N’-サクシニルエチレンジアミ� ��(EMSE)、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N’-ア� ��チルエチレンジアミン、N-エチル-N-(2-ヒド� �キシ-3-スルホプロピル)-4-フルオロ-3,5-ジメ� �キシアニリン(F-DAOS)、N-[2-(サクシニルアミノ )エチル]-2-メトキシ-5-メチルアニリン(MASE)、N -エチル-N-[2-(サクシニルアミノ)エチル]-2-メ� �キシ-5-メチルアニリン(Et-MASE)等が挙げられ� �。

 フェノール類としては、フェノール、4-ク� �ロフェノール、3-メチルフェノール、3-ヒド� ��キシ-2,4,6-トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げ られる。
 過酸化水素の測定において、過酸化活性物� ��の濃度は、測定に適した濃度であれば特に� ��限はないが、過酸化活性物質としてペルオ� ��シダーゼを用いる場合は、1~100kU/Lが好まし� ��。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定� ��適した濃度であれば特に制限はないが、0.01 ~10g/Lが好ましい。

 還元型補酵素の測定方法としては、例え� ��生成した還元型補酵素の吸光度を測定する� ��法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法� ��が挙げられる。還元型補酵素の吸光度を測� ��する方法における吸光度としては、300~500nm� ��好ましく、330~400nmがより好ましく、340nm付� �が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬� �、生成した還元型補酵素を検出可能な物質� �変換するための試薬である。検出可能な物� �としては、例えば色素等が挙げられる。検� �可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測� �用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電� �キャリアー及び還元発色型色原体を含有す� �試薬が挙げられる。電子キャリアーとして� �、例えば1-メトキシ-5-メチルフェナジウムメ チルサルフェート等が挙げられる。還元型補 酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子 キャリアー及び還元発色型色原体を含有する 試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が 変換されて生成した色素を測定することによ り、定量することができる。

 還元発色型色原体としては、例えば3-(4,5- ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テ� �ラゾリウム ブロミド(MTT)、2-(4-ヨードフェ� �ル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェ� ��ル)-2H-テトラゾリウム モノナトリウム塩(WS T-1)、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェ ニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリ� ��ム モノナトリウム塩(WST-3)等が挙げられる� ��

 (LDL-C測定用キット)
 本発明のLDL-C測定用キットは、本発明のLDL-C 測定方法に用いることができ、保存、流通及 び使用適した形態である。本発明のLDL-C測定� ��キットとしては、例えば2試薬系のキット、 3試薬系のキット等が挙げられるが、第一試� �と第二試薬とからなる2試薬系が好ましい。

 第一試薬と第二試薬とからなる2試薬系の LDL-C測定用キットにおいては、コレステロー� ��エステル加水分解酵素は、第一試薬に含有� ��れ、要すれば第二試薬にも含有される。コ� ��ステロールエステル加水分解酵素及びコレ� ��テロール酸化酵素を用いるLDL-C測定に用い� �れる2試薬系のLDL-C測定用キットにおいては� �コレステロール酸化酵素は第一試薬に含有� �れず、第二試薬に含有される。また、コレ� �テロールエステル加水分解酵素、コレステ� �ール脱水素酵素及び酸化型補酵素を用いるLD L-C測定に用いられる2試薬系のLDL-C測定用キッ トにおいては、コレステロール脱水素酵素は 第一試薬に含有されず、第二試薬に含有され 、酸化型補酵素は第一試薬、第二試薬のいず れか又は両方に含有される。

 第二試薬に配置される化合物Aとしては、炭 素数10以上の分岐アルキルを持つPOE分岐アル� ��ルエーテル、炭素数12以上の分岐アルキル� �持つPOE・POA分岐アルキルエーテル又はPOE・PO A縮合物とPOE・POAアルキルアリールエーエル� �の組み合わせが好ましい。
 ポリアニオンは第一試薬、第二試薬のいず� ��か又は両方に含有されてもよい。

 過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第� ��試薬のいずれか又は両方に含有されてもよ� ��が、当該試薬が酸化カップリング型色原体� ��含有する場合には、酸化カップリング型色� ��体の2つの化合物、すなわち、カプラーとア ニリン類、又は、カプラーとフェノール類は それぞれ別々の試薬に含有される態様が好ま しい。還元性補酵素測定用試薬は、第一試薬 、第二試薬のいずれか又は両方に含有されて もよいが、第一試薬、第二試薬の両方に含有 されることが好ましい。

 本発明のLDL-C測定用キットには、必要に� �じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響� �質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよ� �。水性媒体としては、例えば前述の水性媒� �等が挙げられる。安定化剤としては、例え� �エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロ� �ス、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐� �としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生� �質等が挙げられる。影響物質消去剤として� �、例えばアスコルビン酸の影響を消去する� �めのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げ� �れる。反応促進剤としては、例えばコリパ� �ゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリ� �ム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられ� �。

 本発明のLDL-C測定用キットは、凍結乾燥さ� �た状態でも、水性媒体に溶解された状態で� �よい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて� �体中のLDL-Cを測定する場合には、当該試薬は 水性媒体に溶解して使用される。該水性媒体 としては、例えば前述の水性媒体等が挙げら れる。
 本発明のLDL-C測定用キットとしては、例え� �以下の態様のキットが挙げられるがこれら� �本発明の範囲を何ら限定するものではない� �

  キット1
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、過� ��化水素測定用試薬
第二試薬
 コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定� ��試薬、化合物A(要すれば、コレステロール� �ステル加水分解酵素)
キット2
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、過� ��化水素測定用試薬、ポリアニオン
第二試薬
 コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定� ��試薬、化合物A(要すれば、コレステロール� �ステル加水分解酵素)
キット3
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、過� ��化水素測定用試薬
第二試薬
 コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定� ��試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、� �レステロールエステル加水分解酵素)
キット4
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、過� ��化水素測定用試薬、ポリオニオン
第二試薬
 コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定� ��試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、� �レステロールエステル加水分解酵素)

キット5
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
 コレステロール酸化酵素、化合物A(要すれ� �、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット6
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、ポ� ��アニオン
第二試薬
 コレステロール酸化酵素、化合物A(要すれ� �、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット7
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
 コレステロール酸化酵素、化合物A、ポリア ニオン(要すれば、コレステロールエステル� �水分解酵素)
キット8
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、ポ� ��オニオン
第二試薬
 コレステロール酸化酵素、化合物A、ポリア ニオン(要すれば、コレステロールエステル� �水分解酵素)
キット9
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素� ��定試薬、化合物A(要すれば、コレステロー� �エステル加水分解酵素)
キット10
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素� ��定試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば� �コレステロールエステル加水分解酵素)
キット11
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリア� ��オン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素� ��定試薬、化合物A(要すれば、コレステロー� �エステル加水分解酵素)
キット12
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリア� ��オン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素� ��定試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば� �コレステロールエステル加水分解酵素)

キット13
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、還� ��型補酵素測定試薬
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば� �コレステロールエステル加水分解酵素)
キット14
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、還� ��型補酵素測定試薬
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニ オン(要すれば、コレステロールエステル加� �分解酵素)
キット15
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、還� ��型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば� �コレステロールエステル加水分解酵素)
キット16
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、還� ��型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニ オン(要すれば、コレステロールエステル加� �分解酵素)

キット17
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば� �コレステロールエステル加水分解酵素)
キット18
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニ オン(要すれば、コレステロールエステル加� �分解酵素)
キット19
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリア� ��オン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば� �コレステロールエステル加水分解酵素)
キット20
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリア� ��オン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニ オン(要すれば、コレステロールエステル加� �分解酵素)

キット21
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、化合物A(要す� �ば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット22
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、化合物A、ポリ アニオン(要すれば、コレステロールエステ� �加水分解酵素)
キット23
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、化合物A(要す� �ば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット24
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、化合物A、ポリ アニオン(要すれば、コレステロールエステ� �加水分解酵素)

キット25
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��化合物A(要すれば、コレステロールエステ� �加水分解酵素)
キット26
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレス� �ロールエステル加水分解酵素)
キット27
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、ポ� ��アニオン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��化合物A(要すれば、コレステロールエステ� �加水分解酵素)
キット28
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、ポ� ��アニオン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレス� �ロールエステル加水分解酵素)

キット29
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��化合物A(要すれば、コレステロールエステ� �加水分解酵素)
キット30
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレス� �ロールエステル加水分解酵素)
キット31
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��化合物A(要すれば、コレステロールエステ� �加水分解酵素)
キット32
第一試薬
 コレステロールエステル加水分解酵素、酸� ��型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
 コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素� ��化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレス� �ロールエステル加水分解酵素)

 以下、実施例により本発明をより詳細に説� ��するが、これらは本発明の範囲を何ら限定� ��るものではない。尚、本実施例、比較例及� ��試験例においては、下記メーカーの試薬、� ��素及び界面活性剤を使用した。
試薬
 MOPS(同仁化学研究所社製)
 MES(同仁化学研究所社製)
 EMSE(ダイトーケミックス社製)
 硫酸ナトリウム(関東化学社製)
 デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万)(� �ルカ社製)
 4-アミノアンチピリン(埼京化成社製)
 イントラリピッド20%(TERUMO社製)
酵素
 ペルオキシダーゼ(東洋紡績社製)
 CHODI(コレステロール酸化酵素;キッコーマン 社製)
 LPL-311(コレステロールエステル加水分解酵� �;東洋紡績社製)

界面活性剤
 ノニオンK220(POEラウリルエーテル;日本油脂� ��製)
 ニッコールBC-20TX(POEセチルエーテル;ニッコ� ��ル社製)
 ノニオンS220(POEステアリルエーテル;日本油� ��社製)
 ニッコールBB-20(POEベヘニルエーテル;ニッコ ール社製)
 ナイミーンL207(POEドデシルアミン;日本油脂� ��製)
 ポリスターA1060(高分子型陰イオン;日本油脂 社製)
 ノニオンLT-211(POEソルビタンモノラウレート ;日本油脂社製)
化合物A
POE分岐アルキルエーテル
 ノイゲンTDS200D(第一工業製薬社製)
 ノイゲンSD150 (第一工業製薬社製)
 ノニオンIC235(日本油脂社製)
 EMALEX OD25(日本エマルジョン社製)
 EMALEX OD25JJ(日本エマルジョン社製)
 ノニオンOD235(日本油脂社製)
 EMALEX 2425(日本エマルジョン社製)
 EMALEX 1625(日本エマルジョン社製)
POE・POA分岐アルキルエーテル
 ユニルーブMIL-0822B(日本油脂社製)
POE・POP縮合物
 プルロニックL121(旭電化社製)
POE・POAアルキルアリールエーテル
 エマルゲンL40(花王社製)