인공피부 제조방법 및 인공피부

【기술분야】

본 기재는 인공피부를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 기재는 구체적으로 노화 현상을 나타내는 인공피부의 제조방법을 제공한다. 또한， 본 기재는 노화 현상을 나타내는 인공피부 모델을 제공한다.

【배경기술】

피부는 신체의 외부를 덮고 있는 기관으로 바깥쪽에서부터 표피, 진피 및 피하지방층의 세 개의 층으로 구성되어 있다. 표피는 중층 편평상피의 각질형성세포가 대부분을 차지하고 있다. 콜라겐 섬유와 탄력 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어진 진피는 표피 아래에 위치하며， 진피에는 혈관， 신경， 땀샘 등이 있다. 피하지방층은 지방세포로 구성되어 있다. 피부는 상기와 같은 다양한 세포들과 구성물질들이 상호작용하여 그 형태를 유지하며 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로의 기능 등 다양한 기능을 나타낸다.

인공피부 (art i f i cial skin)는 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐， 엘라스틴 등을 이용하여 3차원적으로 상기와 같은 피부를 재구성한 것으로서， 살아있는 섬유아세포와 각질형성세포로 구성되어 실제 피부와 유사한 구조적， 기능적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체 (skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다. 인공피부는 주로 피부와 탄력， 강도， 물질 투과 등에 있어 비슷한 물성을 나타내는 고분자 복합체로， 피부와 같은 생명현상을 나타내지 않는다는 점에서 차이점이 있다. 인공피부는 화상， 외상 등 손상을 입은 피부의 대체 (영구생착형) 또는 재생 (일시 피복형)을 위해 이용될 뿐만 아니라， 피부 생리연구， 피부 자극 평가， 피부 효능평가등 다양한 영역에서 이용되고 있다.

노화현상을 나타내는 인공피부 모델은 예컨대 화장품의 항 노화 (ant i -aging) 평가에 이용될 수 있다. 기존에 알려진 인공피부 노화 모델은 노화된 사람으로부터 유래된 섬유아세포 사용하여 인공피부를 제조하거나， 유전자 조작을 통해 인공피부 섬유아세포를 노화시켜 인공피부를 제조하는 방법 콜라겐을 노화된 사람의 환경으로 만드는 방법

(glycat ion 유도) , 또는 조로증 환자의 세포 또는 유전자 조작을 이용하여 인공피부를 제조하는 방법이 이용되었다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

그러나 상술한 인공피부 노화 모델은 실험결과가 일관되지 않는 문제점을 나타내었으며， 특히 유전자 변이를 통한 모델을 이용할 경우 항 노화 물질의 발굴에 제한적이라는 한계가 있었다.

일 구현예에 따른 인공피부 제조방법은 파이루베이트 (Pyruvate) 를 결핍시킨 배지를 이용하여 인공피부의 노화를 유도함으로써 제작 공정이 간소화된 인공피부 노화모델의 제조방법을 제공하려는 것이다.

【기술적 해결방법】

일 구현예에 따르면， 섬유아세포 및 콜라겐을 흔합하여 진피 모사층을 형성하는 단계， 상기 진피 모사층 위에 각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계， 그리고 상기 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 파이루베이트 성분이 제거된 표피 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인공피부 제조방법을 제공한다.

상기 파이루베이트 성분이 제거된 표피 배양 배지는 파이루베이트 성분이 제거된 각질형성세포 배지일 수 있다.

상기 파이루베이트 성분이 제거된 표피 배양 배지는 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지일 수 있다.

상기 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서의 배양 단계 이전에， 상기 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 각질형성세포 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 각질형성세포 배지에서의 배양 기간 그리고 상기 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서의 배양 기간의 합산은 총 20일 이내일 수 있다.

상기 각질형성세포 배지에서의 배양 기간은 상기 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서의 배양 기간과 비교하여 길거나 동일할 수 있다.

상기 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지는 상기 DMEM배지 및 상기 F12 배지를 1 : 1 내지 4: 1의 비율로 흔합하여 제조된 흔합 배지에서 파이루베이트 성분을 제거하여 제조되는 것일 수 있다.

상기 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지는 하이드로코르티손 (hydrocort i sone) , 트리요오드티로닌 (Tr i iodothyronine) , 콜레라 독소 (Cholera toxin) , 아스코르빈산 (ascorbic acid) 및 염화칼슘 (CaCl ₂ ) 중에서 선택되는 하나또는 2 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 각질형성세포 배지에서의 배양 단계는 공기에 노출된 상태에서 진행될 수 있다.

다른 구현예에 따르면， 상술한 제조방법에 따라 제조된 인공피부를 제공한다.

또 다른 구현예에 따르면， 항노화 물질의 효능 평가방법으로서, 상술한 제조방법에 따라 제조된 인공피부, 또는 상술한 인공피부에 상기 항노화 물질을 적용하는 단계， 그리고 상기 항노화 물질이 적용된 인공피부와 상기 항노화 물질이 적용되지 않은 인공피부의 노화 정도를 비교하는 단계를 포함하는 항노화 물질의 효능 평가방법을 제공한다.

상기 항노화 물질은 상기 인공피부와 직접 접촉에 의해 적용될 수 있다.

【유리한 효과】

일 구현예에 따른 인공피부 제조방법은 파이루베이트를 결핍시킨 배지를 이용하여 인공피부의 노화를 유도함으로써 노화 정도를 보다 정교하게 제어 가능하다. 이에 따라 상기 제조방법에 따른 인공피부 모델을 항노화 평가에 이용할 경우 신뢰성이 향상된 평가 데이터를 제공할 수 있다. 또한， 상기 인공피부 제조방법에 따르면 공정을 보다 간소화할 수 있을 뿐만 아니라 항 노화 물질의 종류에 무관하게 당해 물질의 효능을 평가할수 있다.

【도면의 간단한 설명】 도 1은 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법을 설명하기 위한 순서도이고,

도 2는 다른 구현예에 따른 인공피부 제조방법을 설명하기 위한 순서도이고，

도 3은 실시예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 H&E조직 염색한 후의 현미경 사진이고，

도 4는 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 H&E조직 염색한 후의 현미경 사진이고，

도 5는 실시예 1에서 얻어진 인공피부에서 beta-gal 염색 한 후의 진피 모사층 단면을 관찰한 현미경 사진이고，

도 6은 비교예 1에서 얻어진 인공피부에서 beta-gal 염색 한 후의 진피 모사층 단면을 관찰한 현미경 사진이고，

도 7은 실시예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 케라틴 1 (kerat in 1)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고，

도 8은 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 케라틴 1

(kerat in 1)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고，

도 9는 실시예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 케라틴 10 (Kerat in 10)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고,

도 10은 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 케라틴 10 (Kerat in 10)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고，

도 11은 실시예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 콜라겐 IV (Col lagen IV)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고，

도 12는 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 콜라겐 IV (Col lagen IV)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고，

도 13은 실시예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 필라그린 (Fi laggr in)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고，

도 14는 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 필라그린 (Fi laggr in)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】 이하， 본 발명의 구현예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 "인공피부 (art i f ici al skin) "라 함은 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐 등을 이용하여 3차원적으로 피부를 재구성한 것을 의미하며， 실제 피부와 유사한 구조적， 기능적 특성을 나타내는 고분자 복합체라면 모두 포함하는 최광의의 의미이다.

본 명세서에서 층，막， 영역，판등의 부분이 다른 부분 "위에"있다고 할 때, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 어떤 부분이 다른 부분 "바로 위에" 있다고 할 때에는 중간에 다른 부분이 없는 것을 뜻한다.

이하 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법에 관하여 도 1을 참고하여 설명한다.

도 1은 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다.

도 1을 참고하면， 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법은 섬유아세포 및 콜라겐을 흔합하여 진피 모사층을 형성하는 단계 (S1) , 진피 모사층 위에 각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계 (S2) , 그라고 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 파이루베이트 성분이 제거된 표피 배양 배지에서 배양하는 단계 (S3)를 포함한다.

먼저 진피 모사층을 형성하는 단계 (S1)를 설명한다.

진피 (dermi s)는 연결 조직으로 이루어진 표피 밑의 피부 층으로， 완충작용을 하여 신체를 압력과 장력 (stress and strain)으로부터 보호한다. 진피는 기저막 (basement membrane)을 통해 표피와 단단히 연결되어 있다. 진피는 그 구조에 내재해 있는 혈관， 신경 등의 다양한 부속물들을 지지해주는 기질을 공급한다.

상기 진피 모사층은 실제 피부와의 인체 상관성의 관점에서 섬유아세포 및 콜라겐을 흔합한 재료를 사용하여 형성한다. 상기 진피 모사층은 2층 이상으로 구성할 수 있으며， 예컨대 콜라겐을 함유하는 제 1 진피층 및 섬유아세포를 함유하는 제 2 진피층으로 나누어 구성할 수 있다. 이 경우 인공피부의 진피 수축 현상을 더 완화할 수 있다.

상기 제 1진피충은 콜라겐을 함유할 수 있으며， 엘라스틴 (Elast in) , 키토산 (Chi tosan) , 글리코사미노글루칸 (GAGs ; glycosaminoglycans) , 히알루론산 (HA; hyaluronic acid)과 같은 진피를 구성하는 세포외기질 (extracel lular matr ix)을 더 함유할 수 있다.

상기 게 2진피층은 상기 계 1진피층의 상부에 위치할 수 있으며， 섬유아세포를 함유하고， 엘라스틴 (Elast in) , 키토산 (Chi tosan)， 글리코사미노글루칸 (GAGs ; glycosaminoglycans) , 히알루론산 (HA; hyaluronic acid)과 같은 진피를 구성하는 세포외기질 (extracel lular matr ix)을 더 함유할수 있다.

사용되는 콜라겐은 소 기원， 레트 꼬리로부터 또는 어류로부터， 또는 천연 콜라겐 또는 유전 공학에 의해 생성된 콜라겐 중 임의의 다른 기원의 콜라겐일 수 있는데, 이는 섬유아세포의 존재 하에서 수축할 수 있다.

진피 모사층의 두께는 일반적으로 0.05 cm이상, 특히 대략 0.05내지 2 cm이지만，본 발명에 따른 인공피부의 유리한 특성에 손상을 주지 않는 한 증가또는 감소될 수 있다.

상술한 바와 같이 섬유아세포 및 콜라겐을 흔합한 재료를 사용하여 진피 모사층을 제작한 후 예컨대 약 5일 내지 9일， 약 6일 내지 약 8일， 또는 약 7일간 배양할 수 있다.

진피 모사층이 형성되면 그 위에 각질형성세포를 적용한후 배양하는 단계 (S2)를 거친다.

각질형성세포 (kerat inocyte)는 표피충 세포의 약 80¾> 내지 90%를 구성하며 표피층의 가장 깊은 층인 기저층에서의 유사분열을 통해 형성된 후 피부 표면을 향해 상층으로 올라온다.

각질형성세포를 적용한 후 배양하는 단계 (S2)는 인공피부의 표피 모사층을 형성하기 위한 첫번째 단계로서， 여기서 사용되는 각질형성세포는 예컨대 인간으로부터 유래한 각질형성세포일 수 있다. 상기 각질형성세포는 상용되는 어떠한 각질세포라도 사용될 수 있으며， 인간으로부터 직접 분리 또는 분리된 후 배양된 각질형성세포뿐만 아니라 다른 세포로부터 유도된 각질형성세포도 사용 가능하다. 상업적으로 입수 가능한 인간 각질형성세포로는 Lonza 에서 제공하는 NHEK-Neo , Poo led (Neonatal Normal Human Epidermal Kerat inocytes , Pooled: 제품번호 00192906 , 조직 취득 번호 P867, 백인들)， NHEK-Neo (제품번호 00192907， 조직 취득 번호: 20647， 백인) , NHEK-Adul t (제품번호 00192627， 조직 취득 번호: 21155 , 백인) , NHEK-Neo (제품번호 00192907， 조직 취득 번호: 18080， 흑인)를 들 수 있다. 또한 ThermoFi sher에서 제공하는 HEKn (Human Epidermal kerat inocytes , neonatal : 제품번호 C0015C, 조직 취득 번호 1781129 , 백인) , HEKn (제품번호 C0015C, 조직 취득 번호 1803827， 흑인)을 들 수 있다. 각질형성세포가 기저막 (base membrane)에 붙어서 증식하는 성질을 유지하기 위해서， 디쉬는 0. 1~0.2% 젤라틴 혹은 1~10 / g/ml 콜라겐 타입 I으로 코팅해서 사용하는 것이 바람직하다. 상기 세포는 35~37°C , 5~10% C0 ₂ 인큐베이터에서 배양될 수 있으며 약 70~80% 의 밀도가 되었을 때 계대 배양을 할 수 있다.

상기 각질형성세포는 예컨대 시딩 (seeding)에 의해 상기 진피 모사층 위에 적용될 수 있으며， 배양 기간은 예컨대 1일 내지 4일， 1일 내지 3일, 또는 1일 내지 2일일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

각질형성세포의 적용 및 배양 단계 (S2)를 거친 후 상기 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 파이루베이트 성분이 제거된 표피 배양 배지에서 배양하는 단계 (S3)를 거친다.

여기서 "표피 배양 배지"는 인간의 피부에서 표피층을 배양하기 위한 배지로서， 이는 상기 인간 피부의 표피층을 구성하는 성분 중 하나 또는 2 이상포함하는 배지라면 당업계에 공지된 어떤 배지라도 사용될 수 있다. 예를 들어， 상기 표피 배양 배지는 각질형성세포 배지일 수도 있고， DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지일 수도 있다.

상기 "각질형성세포 배지' '는 인간 피부의 각질형성세포를 배양하기 위한 배지로서， 예컨대 소 뇌하수체 추출물 (Bovine Pi tutary Extract , BPE) , 인간의 상피성장인자 (human epidermal growth factor, hEGF), 소의 인술린 (bovine Insulin),하이드로코티손 (Hydrocortisone)， 및 젠타마이신 및 암포테리신 -B(GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B))을 포함하는 배지일 수 있다. 또한， 상기 각질형성세포 배지는 상기 성분에 에피네프린 (Epinephrine) 및 트랜스페린 (Transferrin)이 더 포함된 배지일 수도 있다. 상기 배지의 상업적 입수 가능한 예로서 CnT-3D-PR (CellnTEC사)를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지는 상용되는 DMEM 배지 및 ^' F12 배지를 이용하여 제조할 수 있으며， 예컨대 1:1 내지 4:1 의 비율로 흔합될 수 있고， 보다 구체적으로 1.5:1 내지 3:1， 또는 2:1 내지 3:1의 비율로 흔합될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 DMEM(Dubelco's modified Eagle medium) 배지는 일반적으로 사용되는 동물 세포 배양용 배지로서, 아미노산， 비타민， 무기염분， 포도당， 지질， 지시약， 혈청 등을 포함할 수 았다.

상기 DMEM배지 및 F12배지의 흔합배지는 DMEM배지 및 F12배지를 총 배양액 기준으로 100¾>로 포함하되， 이에 추가로 하이드로코르티손 (hydrocort isone)， 트리요오드티로닌 (Tr i iodothyronine)， 콜레라 독소 (Cholera toxin), 아스코르빈산 (ascorbic acid) 및 염화칼슘 (CaCl ₂ ) 중에서 선택되는 하나 또는 2 이상을 더 포함할 수 있다. 일 예에 따르면，상기 S3단계에서 "파이루베이트 성분이 제거된 표피 배양 배지' '는 파이루베이트 성분이 제거된 각질형성세포 배지일 수 있다. 즉 각질형성세포 배지에서 파이루베이트를 제거한 후 당해 배지에서 상기 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 배양할 수 있다.

다른 일 예에 따르면，상기 S3단계에서 "파이루베이트 성분이 제거된 표피 배양 배지"는 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지일 수도 있다. 즉， DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서 파이루베이트를 제거한 후 당해 배지에서 상기 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 배양할 수 있다. 이 경우 상기 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 배양하는 단계 이전에, 상기 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 각질형성세포 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이에 관해 도 2를 참고하여 더 설명한다.

도 2는 다른 일 구현예에 따른 인공피부 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다.

도 2에 도시된 인공피부 제조방법은 도 1에 도시된 인공피부 제조방법과 S1 및 S2 단계는 동일하되， S3 단계가 S3-1 및 S3-2 단계로 구체화되어 있다. 즉， 본 구현예에 따른 인공피부 제조방법은 각질형성세포의 적용 및 배양 단계 (S2)를 거친 후 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 각질형성세포 배지에서 배양하는 단계 (S3-1) 및 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 배양하는 단계 (S3-2)를 거친다.

여기서 각질형성세포 배지 및 상기 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에 관한 내용은 상술한 바와 같다. 여기서， 상기 각질형성세포 배지는 상기 진피 모사층의 아래 면에 닿도록 설치되고， 상기 각질형성세포 배지가 설치된 면의 반대 면은 공기에 노출되도록 할 수 있다. 이러한 각질형성세포 배지 에서의 배양은 예컨대 3일 내지 10일， 4일 내지 10일， 5일 내지 9일, 또는 4일 내지 8일의 기간 동안 진행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서의 배양 단계 (S3-2)는 S-1 단계와 마찬가지로 공기에 노출된 상태에서 진행될 수 있다.

상기 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서의 배양 단계 ( _S3 — 2)는 상기 각질형성세포 배지에서의 배양 단계 (S3-1)가 종결된 후 바로 이어서 진행할수 있으며， 배양 기간은 예컨대 4일 내지 15일， 5내지 13일， 6일 내지 10일, 또는 6일 내지 9일의 기간 동안 진행될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 다만， 상기 S3-1 및 S3-2 단계에서의 배양기간의 총 합은 예컨대 20일 이내로 조절할 수 있다. 예를 들어 상기 각질형성세포 배지에서의 배양 기간은 상기 파이루베이트 성분이 제거된 DMEM 배지 및 F12 배지의 흔합 배지에서의 배양 기간과 비교하여 길거나 동일하게 설정할 수 있다.

상기 S-2 , S3-1 및 S3-2 단계를 거침에 따라 진피 모사층 위에 표피 모사층이 형성된 인공피부 구조를 얻는다.

일 구현예에 따른 인공피부 제조방법은 상기 각질형성세포가 적용된 진피 모사층을 파이루베이트 성분이 제거된 표피 배양 배지에서 배양하는 단계를 거침으로써 인공피부의 노화 모델， 특히 진피 모사층이 노화가 증가 되며 표피 모사층이 분화가 억제되는 노화 현상을 나타내는 인공피부를 구현할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면， 진피 모사충 및 상기 진피 모사층 위에 위치하는 표피 모사층을 포함하는 인공피부로서， 상기 표피 모사층은 정상 피부의 표피층 두께의 약 30% 내지 90% 수준의 두께를 가지는 인공피부를 제공한다.

통상 정상 피부에서 표피 층의 두께는 약 50μ ^η ι내지 300μ ^η ι인데，상기 인공피부의 표피 모사층 두께가 정상 피부에서의 표피층 두께와 비교하여 상대적으로 작은 값을 가지는 이유는 상기 인공피부가 노화된 현상을 나타냄을 의미하는 것이다

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 항노화 물질의 효능 평가방법으로서， 상술한 인공피부， 또는 상술한 제조방법으로부터 얻어진 인공피부에 상기 항노화 물질을 적용하는 단계 그리고 상기 항노화 물질이 적용된 인공피부와 상기 항노화 물질이 적용되지 않은 인공피부의 노화 정도를 비교하는 단계를 포함하는 항노화 물질의 효능 평가방법을 제공한다.

상기 인공피부의 노화 정도를 비교하는 단계에서 비교법은 다양한 방법에 의할 수 있으며， 예컨대 표피 모사층 두께를 비교하여 각질형성세포의 증식 /분화 이상， 표피층의 두께가 감소한 경우 노화되었다고 판단할 수 있다. 또는， 진피층에서 노화 마커로 사용되는 beta-gal staining된 세포가 증가할 경우 노화되었다고 판단할 수 있다. 또는， 표피 분화 마커인 Kerat in 1 , 10과 표피—진피 junct ion마커인 Col l agen IV, 각질 분화 마커인 Fi l aggr in의 발현이 감소될 경우 노화되었다고 판단할 수 있다.

상기 항노화 물질은 상기 인공피부와 직접 접촉에 의해 적용되는 것일 수 있다. 상기 항노화 물질은 예컨대 항노화 화장품일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

【발명의 실시를 위한 형태】

gen, Advanced Biomatr ix사)을 섞어서 진피 모사층을 제작한 후 에 LSGS (ThermoFi sher사)와 100 g/ml ascorbic acid가 포함된 M106배지

(TermoFisher사)에서 1주일간 배양하였다.

(2) 2단계: 각질형성세포 적용 및 배양 단계

상기 1단계 이후 단계 이후， 상기 진피 모사층 위에 각질형성세포

(HEKn, ThermoFi sher사)를 얹고 2일간 배양하였다.

(3) 3단계: 기본 배지에서의 배양단계

상기 2단계 이후 상기 진피 모사체의 아랫 부분에 기본 배지 (CnT— 3D-PR, Cel lnTEC사)가 닿도록 설치하고， 표피층 부분은 공기에 노출시켜 일주일간 배양하였다.

(4) 4단계: 특수배지에서의 배양 단계

상기 3단계 이후 단계 이후， 특수 배지로 추가 공기노출 6일간 배양 진행하여 인공피부 모델을 얻었다. 특수 배지의 조성은 DMED배지 (Welgene , LM001-05)와 F12 배지 (Welgene , LM010-01)를 2 : 1 비율로 흔합한 배지에 하이드로코르티손 (hydrocort i sone) , 트리요오드티로닌 (Tr i iodothyronine) , 및 콜레라독소 (Cholera toxin) , 아스코르빈산를 투입한 후 여기서 파이루베이트 성분을 제거한 것이다. 비교예 1

상기 4단계의 배지 조성에서 파이루베이트를 제거하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 하여 인공피부를 제작하였다. 평가 1: 인공피부 모델의 H&E staining관찰

실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 인공피부 모델의 조직 단면을 현미경으로 관찰한다 .

도 3및 4는 실시예 1및 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 H&E조직 염색한후의 현미경 사진이다.

도 3 및 4를 참고하면， 파이루베이트가 결핍된 배지에서 배양된 실시예 1에 따른 인공피부는 나이든 사람에서 나타나는 피부 현상， 즉 각질형성세포의 증식 /분화 이상， 표피층의 두께 감소를 보임을 알 수 있다. 평가 2: 인공피부모델의 beta-gal staining관찰

실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 인공피부 모델의 진피 모사층 단면을 현미경으로 관찰한다.

도 5및 6은 실시예 1및 비교예 1에서 얻어진 인공피부에서 beta-gal 염색 한후의 진피 모사층 단면이다. 도 5및 6을 참고하면 파이루베이트가 결핍된 배지에서 배양된 실시예 1에 따른 인공피부는 비교예 1에 따른 인공피부와 비교하여 진피층에서 노화 마커로 사용되는 beta-gal 염색된 세포가 상대적으로 증가하였음을 알 수 있다. 평가 3: 인공피부모델의 표피 분화관찰

실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 인공피부 모델의 표피 분화를 관찰한다.

도 7및 8은 실시예 1및 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 케라틴 1 (kerat in 1)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고， 도 9 및 10은 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 케라틴 10 (Kerat in 10)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고， 도 11 및 12는 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 콜라겐 IV (Col lagen IV)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이고, 도 13 및 14는 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 인공피부의 단면으로서 필라그린 (Fi laggr in)의 발현 정도를 보여주는 현미경 사진이다.

도 9 내지 14를 참고하면, 파이루베이트가 결핍된 배지에서 배양된 실시예 1에 따른 인공피부는 비교예 1에 따른 인공피부와 비교하여， 표피 분화 마커인 Kerat in 1， 10과 표피 -진피 junct ion마커인 Col lagen IV, 각질 분화 마커인 Fi laggrin의 발현이 상대적으로 감소되었음을 알 수 있다. 이상에서 본 발명의 바람직한 실시예들에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리 범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구 범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리 범위에 속하는 것이다.