[円順列変異体βラクタマーゼ(cpBLA)遺伝子の� �製]
 野生型βラクタマーゼ(野生型BLA)のDNA配列を 鋳型としたPCR法により、野生型BLAタンパク質 の24-170位のアミノ酸配列(配列番号5)をコード するDNA断片(配列番号6)と、168-286位のアミノ� �配列(配列番号7)をコードするDNA断片(配列番� ��8)を調製した。より詳細には以下のような� �法で調製を行った。

 まず、上記PCR法のプライマーとして、以下� ��4種類のプライマーを用意した。
BLA24rev(配列番号9:CATTGGGACAAGAGCCACCCAGAAACGCTGGTGAAA)
BLA170for(配列番号10:GGCGATATCGGCTTCATTCAGCTCCGGTTC)
BLA168rev(配列番号11:GGCGATATCAATGAAGCCATACCAAAC)
BLA286for(配列番号12:TGGGTGGCTCTTGTCCCAATGCTTAATCAGTGA)
 BLA24rev及びBLA286forの5’末端にはリンカー配� ��(配列番号9及び12の7~15番目の塩基配列)を配� ��し、BLA170for及びBLA168revの5’末端には作製し たDNA断片を挿入するための制限酵素切断部位 としてEcoRVの認識配列(配列番号10及び11の4~9� �目の塩基配列)を配置した。
 なお、これらの4種類のプライマーは、Guntas らの報告(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 11224-11 229 (2005))にならい、BLAの活性部位近傍の168位 と170位を新規末端とする遺伝子断片を最終的 に得るべく設計を行った。上記24-170位のアミ ノ酸配列をコードするDNA断片の増幅には、BLA 24rev及びBLA170forを用い、上記168-286位のアミノ 酸配列をコードするDNA断片の増幅には、BLA168 rev及びBLA286forを用いた。

 また、上記PCR法の鋳型として、野生型BLA� ��伝子をコードするベクターpET20b(+)(メルク社 製)を用い、酵素としてEx-Taq DNAポリメラーゼ (タカラバイオ社製)を用いた。具体的には、5 0pmolずつの2種類のプライマー、10ng pET20b(+)、 0.2mM(反応溶液の最終濃度)dNTPs、10μl Ex-Taq Buf fer、5unit Ex-Taq 1μlを混合して100μlの反応溶� �とし、94℃、5分間の後に、94℃で30秒間、56� �で30秒間、72℃で1分間からなるサイクルを25� ��イクル繰り返した後、72℃で10分間反応させ た。このPCRにより、野生型BLAタンパク質の24- 170位のアミノ酸配列をコードするDNA断片と、 168-286位のアミノ酸配列をコードするDNA断片� �調製した。次いで、これらの2種類のDNA断片� ��TAE緩衝液を含む1%アガロースゲルで電気泳� �した後、目的のバンドを含むゲルを切り出� �、Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up Syste m(プロメガ社製)を用いて精製した。

 得られた2種類のDNA断片を用いたoverlap extens ion PCRによって、本来のN末端(24位のアミノ酸 )とC末端(286位のアミノ酸)を、DKSリンカー配� �(アミノ酸配列:Asp-Lys-Ser; 塩基配列:gacaagagc)� �介して結合し、168位と170位がそれぞれ新た� �N末端及びC末端であるPCR断片(円順列変異体� �伝子)を調製した(図2の左上のコンストラク� �;cpBLA)。より詳細には、以下のような方法で� ��製を行った。
 約100ngずつの2種類のPCR産物(野生型BLAタンパ ク質の24-170位のアミノ酸配列をコードするDNA 断片と、168-286位のアミノ酸配列をコードす� �DNA断片)、0.2mM(反応溶液の最終濃度)dNTPs、10μ l Ex-Taq Buffer、5unit Ex-Taqを混合して100μlの反 応溶液とし、94℃、5分間の後に94℃で30秒間� �58℃で30秒間、72℃で1分間からなるサイクル� ��10サイクル繰り返した後、72℃で10分間反応� ��せた。このようにして作製した目的のBLA円� ��列変異体遺伝子をcpBLA(アミノ酸配列:配列番 号13; 塩基配列:配列番号14)と命名した。

 この後、cpBLAのDNAのみを増幅するため、� �きほど得られた反応溶液に2種類のプライマ� ��(BLA168rev及びBLA170for)を50pmolずつ、2.5unitEx-Taq� ��加え、94℃で5分間の後に、94℃で30秒間、56� ��で30秒間、72℃で1分間からなるサイクルを25 サイクル繰り返した後、72℃で10分間反応さ� �た。得られた反応溶液をアガロースゲルに� �電気泳動し、目的サイズのDNA断片が増幅さ� �ていることを確認した。さらに、その目的� �イズのバンド部分のゲルを切り出し精製し� �。

 精製して得られたDNA断片をpCR4-TOPO(Invitrogen� �製)に組み込み、その塩基配列を確認した。� ��り詳細な手順については以下に述べる。
 pCR4-TOPO Vectorを使ったキットであって、Taq� �リメラーゼで増幅した3’-dA突出末端を持つP CR産物をクローニング、シーケンスするのに� ��したTOPO TA Cloning Kit for Sequencing(Invitrogen� �製)を使用した。1μlのpCR4-TOPO Vectorに対し、� ��モル量の上記精製DNA断片を加え、さらにSalt  Solutionを1μl加えて室温で30分間放置した。� �のligation mixtureを氷上で溶かした大腸菌XL10-G old株(Tet ^r , δ(mcrA)183, δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44,  thi-1, recA1, gyrA96, relA, lac, The, [F’, proAB,  laclqZδM15, Tn10(Tet ^r ), Tn5(Kan ^r ), Amy)に加え氷上で30分間放置した後、42℃で 45秒ヒートショックを与え、200μlのSOC培地(1L� ��たり20g bacto tryptone、5g bacto yeast extract、0 .5g NaCl、0.2ml 5N NaOH、20ml 1M グルコース、10 ml 1M MgCl ₂ 、10ml 1M MgSO ₄ )を加え37℃で30分間キュアリングして形質転� ��し、予め10μlの0.4M IPTGと200μlの10mg/ml X-gal� �撒いておいた100μg/mlアンピシリン、1%グルコ ースを含むLB寒天培地プレート(1Lあたり10g ba cto tryptone、 5g bactoyeastextract、5g NaCl、0.2ml  5N NaOH、15g agar)にて37℃で一晩培養した。翌� ��、白いコロニー、青いコロニー各数個のう� ��白いコロニーを竹串でつつき、Taqポリメラ� ��ゼ(タカラバイオ)とT3、T7の2本のプライマー を用いてコロニーPCRを行なった。そのPCR産物 をアガロースゲルにて泳動し、目的の大きさ のバンドが確認できたコロニーのみを100μg/ml アンピシリンを含む滅菌LB液体培地(1Lあたり1 0g bacto tryptone、 5g bactoyeastextract、 5g NaCl� �0.2ml 5N NaOH)に植菌して、37℃で一晩培養し� �。培養して得られた菌体から、Wizard(登録商� ��) plus SV Minipreps(プロメガ社製)を用いてプ� ��スミドを抽出し、ABI3100DNAシーケンサーを用 いて、BLA円順列変異体遺伝子(cpBLA)の配列を� �認した。このcpBLAを有する上記プラスミドを 、cpBLA/TOPOと命名した。

[抗体-円順列変異体BLA混成タンパク質発現ベ� ��ターの作製]
 ネオニコチノイド系農薬イミダクロプリド( ICP)を認識する抗体(33C3-1-1:FERMP-17094で寄託さ� �たハイブリドーマから産生されるモノクロ� �ナル抗体:特開2000-191698号公報)の可変領域を� ��ァージミドベクターpIT2(Nature Biotechnol., 18,� �989-994 (2000))に組込み,これを用いて常法に従 い一本鎖抗体(scFv)提示ファージを調製しその 抗原結合能を確認した(scFv(ICP)/pIT2)。このscFv( ICP)/pIT2から、該抗体遺伝子をタンパク質大量 発現用プラスミドベクターに移し替え、scFv(I CP)/pET26を作製した。より詳細には以下のよう な方法で調製を行った。

 scFv(ICP)/pIT2中の抗体遺伝子を、目的タンパ� �をペリプラズムに分泌させ発現させること� �でき、かつカナマイシン耐性を示すプラス� �ドpET26b(+)(メルク社製)に組み込んだ。scFv(ICP) /pIT2と、pET26b(+)1μgに対し、10unit NcoI(New Englan d Biolabs社製)、10unit NotI(New England Biolabs社製 )、5μl 10×NEB Buffer3(New England Biolabs社製)、5� �lの0.1% BSA(New England Biolabs社製)に滅菌水を� �えて50μlにし、37℃で16時間制限酵素処理し� �。この制限酵素処理物をアガロースゲル電� �泳動を行い切り出し精製したscFv(ICP)遺伝子� �片3μlと、同様の制限酵素処理後に切り出し� ��製したベクター2μlと、Ligation high(東洋紡社 製)5μlを加え、16℃で30分間ライゲーション反 応を行った。ライゲーション反応により得ら れた反応液のうち5μlを用いて、100μlの大腸� �TOP10株(F-mcrA, δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZδM15, δ lacX74, deoR, recA1, araD139, δ(ara,leu)7697galU, galK , rpsL(Str ^R )endA1, nupG)を形質転換し、50μg/mlカナマイシ� �を含むLB寒天培地プレートにて37℃で一晩培� ��した。翌日、コロニー数個を竹串でつつき� ��Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)とT7 prom oterとT7 terminatorの2本のプライマーを用いて� �ロニーPCRを行った。そのPCR産物をアガロー� �ゲルにて泳動し、目的の大きさのバンドが� �認できたコロニーのみを50μg/mlカナマイシン を含むLB液体培地4mlに植菌し、37℃で一晩培� �した。培養して得られた菌体からscFv(ICP)/pET2 6を抽出した。

 cpBLAをコードするDNA断片を組み込むための� �限酵素サイトとして、DraIサイトをscFv(ICP)/pET 26中のリンカー領域にクイックチェンジ(スト ラタジーン社製:登録商標)を用いたPCRにより� ��入した(図2の右上のコンストラクト)。このD raIサイトで切断することによりscFv(ICP)/pET26は 平滑末端を持つリニアDNAとなり、EcoRV処理に� ��り同じく平滑末端を生じるcpBLA断片を組み� �むことができる。DraIサイトを導入するPCRは� ��下のように行った。
 15pmolずつの後述の2種類のプライマー、1ng s cFv(ICP)/pET26、0.2mM(反応溶液の最終濃度)dNTPs、2 .5unit PfuUltraHigh-Fidelity DNA Polymerase(ストラタ� ��ーン社製)、5μl 10×PfuUltra reaction Buffer(ス� �ラタジーン社製)を混合して50μlの反応溶液� �し、95℃、1分間の後に、95℃で30秒間、55℃� �30秒間、68℃で15分間からなるサイクルを18サ イクル繰り返した。用いたプライマーの配列 は以下のとおりである。Dra1rev(配列番号15:GGTG GAGGCGGTTCAGGCTTTAAAGGCAGTGGCGGTGGCGGG)Dra1for(配列番号1 6:CCCGCCACCGCCACTGCCTTTAAAGCCTGAACCGCCTCCACC)
(配列番号15及び16の19~24番目の塩基配列はそ� �ぞれDraI切断部位である)

 上記PCRにより得られた反応液に1μl DpnIを 加え、37℃で1時間処理してメチル化された鋳 型DNAを分解し、5μlを用いて、100μlの大腸菌TO P10株を形質転換した。これを50μg/mlカナマイ� ��ンを含むLB寒天培地にて37℃で一晩培養し、 翌日生成したコロニー数個を竹串でつついて 50μg/mlカナマイシンを含むLB寒天培地4mlに植� �し、37℃で一晩培養した。培養して得られた 菌体からプラスミドを抽出した後、ABI3100DNA� �ーケンサーを用いて配列を決定し、所定の� �置DraIサイトが導入されていることを確認し� ��。

 次いで、DraIサイトが導入されたscFv(ICP)/pET26 をDraIにて開裂したscFv(ICP)/pET26に、EcoRV処理し たcpBLA断片を組み込み、抗体-円順列変異体酵 素発現ベクターV _H -cpBLA-V _L /pET26(図2の中央下のコンストラクト)を作製し た。より詳細な手順については以下に述べる 。
 1μg scFv(ICP)/pET26に20unit DraI(New England Biolabs , NEB社製)、10unit Alkaline Phosphatase,Calf Intestin al(NEB社製)、10×NEB Buffer4(NEB社製)に滅菌水を� �えて50μlにし、37℃で16時間制限酵素処理し� �。ベクターのセルフライゲーションを防ぐ� �め、制限酵素処理と同時にアルカリフォス� �ァターゼにて末端の脱リン酸化も行った。� �た、cpBLA断片が組み込まれたpCR4-TOPOベクター 1μg、20unit EcoRV(NEB社製)、10×NEB Buffer3、5μlの 0.1% BSAに滅菌水を加えて50μlにし、37℃で16時 間制限酵素処理した。この制限酵素処理物を アガロースゲル電気泳動を行い切り出し精製 したscFv(ICP)/pET26ベクター3μlと、同様の制限� �素処理後に切り出し精製したcpBLA断片3μlと� �Ligation high6μlを加え、16℃で30分ライゲーシ� ��ン反応を行った。ライゲーション反応によ� ��得られた反応液のうち5μlを用いて100μlの大 腸菌TOP10株を形質転換し、50μg/mlカナマイシ� �を含むLB寒天培地プレートにて37℃で一晩培� ��した。翌日、コロニー数個を竹串でつつき� ��TaqポリメラーゼとT7プロモーターとBLA170for� �2本のプライマーを用いてコロニーPCRを行っ� ��。そのPCR産物をアガロースゲルにて泳動し� ��目的の大きさのバンドが確認できたコロニ� ��のみを50μg/mlカナマイシンを含むLB液体培地 4mlに植菌し、37℃で一晩培養した。培養して� ��られた菌体からV _H -cpBLA-V _L /pET26(抗体-円順列変異体BLA混成タンパク質発� ��ベクター)を抽出した。

[抗体-分割・円順列変異体BLA混成タンパク質� ��現ベクターの作製]
 本発明の融合タンパク質におけるリンカー� ��プチドの意義を調べるため、V _H -cpBLA-V _L 中のリンカーペプチドをコードする配列に代 えて、stopコドン及びRBSをコードする配列を� �する、V _H -split・cpBLA-V _L /pET26(抗体-分割・円順列変異体BLA混成タンパ� ��質発現ベクター)を作製した。該ベクターの コンストラクトを図3に示す。このV _H -split・cpBLA-V _L /pET26は、図3に示すように、V _H -BLAc(V _H 領域ポリペプチドと、野生型BLAタンパク質の 168-286位のアミノ酸配列との融合タンパク質)� ��、BLAn-V _L (V _L 領域ポリペプチドと、野生型BLAタンパク質の 24-170位のアミノ酸配列との融合タンパク質)� �発現するベクターである。V _H -split・cpBLA-V _L /pET26の作製は、図4に示すような概要にした� �って、以下のような方法で行なった。

 まず、図4に示すようなコンストラクトのpBR 322を用意した。このpBR322に対して、BLAsigBack(� ��列番号17:TCACCATCACTAAGAAGGAGATATCATATGAGTATTCAACATTTCC )(5’末端から1~18番目のヌクレオチドがBLAHisFo rとのオーバーラップ領域)及びBLAdraFor(配列番 号18:CGGCGACCGAGTTGCTCTTG)の2種類のプライマーを� �いてPCRを行い、pBR322のアンピシリン耐性遺� �子から、シグナル配列を経て、BLA前半部に� �在するDraIサイトまでを増幅してその断片(BLA -DraI断片)を得た。また、pBR322に対して、BLAbsa Back(配列番号19:ATGGAGGCGGATAAAGTTGC)及びBLAHisFor(配 列番号20:CCTTCTTAGTGATGGTGATGATGATGCCAATGCTTAATCAGTGAGGC) (5’末端から1~18番目のヌクレオチドがBLAsigBac kとのオーバーラップ領域)の2種類のプライマ ーを用いてPCRを行い、pBR322のBLA後半部に存在 するBsaIサイトからBLAタンパク質の296位まで� �増幅してその断片(BLA-BsaI断片)を得た。なお� ��BLAHisForの5’末端にはHis tag をコードする� �列の相補鎖が含まれており、これによってV _H -BLAcのC末端に、精製のためのHis tagが付加さ� ��る。BLA-DraI断片やBLA-BsaI断片を増幅するPCRは 以下のように行った。

 50pmolずつの2種類のプライマー(BLA-DraI断片 増幅用として、BLAsigBack及びBLAdraFor;BLA-BsaI断� �増幅用としてBLAbsaBack及びBLAHisFor)、10ng pBR322 、0.2mM(反応溶液の最終濃度)のdNTPs、10μl 10´E x-Taq buffer、5unit Ex-Taqを混合して100μlの反応� ��液とし、95℃、5分間の後に、95℃で30秒間、 50℃で30秒間、72℃で30秒間からなるサイクル� ��25サイクル繰り返した後、72℃で5分間反応� �せた。これらのPCRにより得られたBLA-DraI断片 やBLA-BsaI断片を、TAE緩衝液を含む1.5%アガロー スゲルでそれぞれ電気泳動した後、目的のバ ンドを含むゲルを切り出し精製した。

 次に、精製したBLA-DraI断片及びBLA-BsaI断片に ついて、オーバーラップ・エクステンション PCRを行なうことによって、BLA-DraI断片とBLA-Bsa I断片とを結合させた(図4の中央のコンストラ クト参照)。オーバーラップ・エクステンシ� �ンPCRは具体的に以下のような方法で行なっ� �。
 精製したBLA-DraI断片(約100ng)及びBLA-BsaI断片(� ��100ng)、0.2mM(反応溶液の最終濃度)のdNTPs、10ml  10´Ex-Taq buffer、5unit Ex-Taqを混合して100mlの� ��応溶液とし、95℃、5分の後に95℃で30秒間、 55℃で30秒間、72℃で45秒間からなるサイクル� ��15サイクル繰り返した後、72℃で5分間反応� �せて反応液を得た。次いで、目的DNA断片を� �らに増やすため、得られた反応溶液に、BLAbs aBackプライマー(50pmol)、BLAdraForプライマー(50pm ol)、2.5unit Ex-Taqを添加し、95℃で5分間の後に 、95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で45秒間か らなるサイクルを25サイクル繰り返した後、7 2℃で5分間反応させて反応液を得た。得られ� ��反応液をアガロースゲル電気泳動し、目的� ��イズのDNA断片が増幅されていることを確認� ��た。次いで、目的サイズ近辺のゲルを切り� ��し、目的サイズのDNA断片を精製した。

 精製して得られたDNA断片をpCR4-TOPO(Invitrogen� �製)に組み込み、その塩基配列を確認した。� ��り詳細な手順については以下に述べる。
 pCR4-TOPO Vectorを使ったキットであって、Taq� �リメラーゼで増幅した3’-dA突出末端を持つP CR産物をクローニング、シーケンスするのに� ��したTOPO TA Cloning Kit for Sequencing(Invitrogen� �製)を使用した。1μlのpCR4-TOPO Vectorに対し、� ��モル量の上記精製DNA断片を加え、さらにSalt  Solutionを1μl加えて室温で30分間放置した。� �のligation mixtureを氷上で溶かした大腸菌XL10-G old株(Tet ^r ,δ(mcrA)183, δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, th i-1, recA1, gyrA96, relA, lac, The, [F’, proAB, la clqZδM15, Tn10(Tet ^r ), Tn5(Kan ^r ), Amy)に加え氷上で30分間放置した後、42℃で 45秒ヒートショックを与え、200μlのSOC培地(1L� ��たり20g bacto tryptone、5g bacto yeast extract、0 .5g NaCl、0.2ml 5N NaOH、20ml 1M グルコース、10 ml 1M MgCl ₂ 、10ml 1M MgSO ₄ )を加え37℃で30分間キュアリングして形質転� ��し、予め10μlの0.4M IPTGと200μlの10mg/ml X-gal� �撒いておいた100μg/mlアンピシリン、1%グルコ ースを含むLB寒天培地プレート(1Lあたり10g ba cto tryptone、 5g bacto yeast extract、5g NaCl、0.2 ml 5N NaOH、15g agar)にて37℃で一晩培養した。 翌日、白いコロニー、青いコロニー各数個の うち白いコロニーを竹串でつつき、Taqポリメ ラーゼ(タカラバイオ)とT3、T7の2本のプライ� �ーを用いてコロニーPCRを行なった。そのPCR� �物をアガロースゲルにて泳動し、目的の大� �さのバンドが確認できたコロニーのみを100μ g/mlアンピシリンを含む滅菌LB液体培地(1Lあた り10g bacto tryptone、 5g bacto yeast extract、5g  NaCl、0.2ml 5N NaOH)に植菌して、37℃で一晩培� �した。培養して得られた菌体からプラスミ� �を抽出し、ABI3100DNAシーケンサーを用いて、� ��述の精製DNA断片の配列を決定し、その配列� ��、分割・円順列変異体BLA(split・cpBLA)(図4の� �央のコンストラクト参照)であることを確認� ��た。このsplit・cpBLAを有する上記プラスミド を、split・cpBLA/TOPOと命名した。

 1μgのsplit・cpBLA/TOPOに対し、10unitのDraI、5μl� ��NEBuffer2を添加し、さらにmilliQ水を添加して5 0μlに調整し、この溶液を37℃で6時間処理後� �5unitのBsaIを添加し、これを50℃で一晩静置し て制限酵素処理を行った。1μgのsplit・cpBLA/TOP Oに代えて、1μgのV _H -cpBLA-V _L /pET26を用いて、同様に、DraI及びBsaIで制限酵� ��処理を行なった。制限酵素処理して得られ� ��それぞれの溶液をアガロースゲルにて泳動� ��て精製したDNA溶液各5μlにLigation high ver.2(� �洋紡社製)をそれぞれ10μl添加し、16℃で30分� ��ライゲーション反応を行った。このライゲ� ��ション反応により得られた反応液のうち5μl を用いて、100μlの大腸菌TOP10株を形質転換し� ��50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地プレ ートにて37℃で一晩培養した。翌日、シング� ��コロニーを4mlのLBKにてさらに一晩培養後、� ��られた菌体からプラスミドを抽出し、その� ��ラスミドのDNA配列を確認した。DNA配列を確� ��した複数のプラスミドの中から、V _H -cpBLA-V _L /pET26におけるBsaIサイト・DraIサイト間の配列� ��、split・cpBLAにおけるBsaIサイト・DraIサイト� ��の配列に置換されたプラスミド(図4)を見い� ��し、このプラスミドをV _H -split・cpBLA-V _L /pET26と命名した(図3)。

[円順列変異体BLAタンパク質発現ベクターの� �製]
 本発明の融合タンパク質の1つであるV _H -cpBLA-V _L /pET26のコントロールとして、抗体遺伝子を持 たない、cpBLAのみの発現ベクター(円順列変異 体BLAタンパク質発現ベクター:cpBLA/pET26)(図5)� �作製した。より詳細には以下のような方法� �作製を行った。

 実施例1で作製したcpBLA/TOPOを鋳型とするPCR� �よって、末端にNcoIサイトとXhoIサイトが付加 されたcpBLA遺伝子を増幅し、pET26b(+)に組み込� ��だ。このPCRは以下のように行なった。
 50pmolのBLA168Ncorev(配列番号21:CATGCCATGGGCAATGAAGCC ATACCAAAC)(5’末端から5~10番目のヌクレオチド� �NcoIサイト)、50pmolのBLA170Xhofor(配列番号22:CCGCT CGAGGGCTTCATTCAGCTCCGGTTC)(5’末端から4~9番目のヌ� �レオチドがXhoサイト)、10ngのV _H -cpBLA-V _L /TOPO(V _H -cpBLA-V _L をpCR4-TOPOに組み込んだプラスミド)、0.2mM(反� �溶液の最終濃度)のdNTPs、10μlの10´Ex-Taq buffer 、5unitのEx-taqを混合して100mlの反応溶液とし� �94℃で5分間の後に、94℃で30秒間、65℃で30秒 間、72℃で1分間からなるサイクルを25サイク� ��繰り返した後、72℃で10分間反応させて反応 液を得た。得られた反応液をアガロースゲル 電気泳動して精製を行った後、NcoI及びXhoIに� ��制限酵素処理した。この制限酵素処理した� ��液をアガロースゲル電気泳動し、精製を行� ��た。精製したDNA断片を、同じくNcoI及びXhoI� �理並びに精製を行ったpET26b(+)に組み込んで� �cpBLA/pET26とした(図5)。

[ICPの大腸菌に対する毒性の確認]
 まず、後述の実施例6の増殖アッセイの前提 として、ICPが大腸菌に対して毒性あるいは増 殖促進活性がないことを調べるため、高濃度 のICPを含む培地中での野生型BL21(DE3,pLysS)株の 増殖を以下の方法により調べた。
 BL21(DE3,pLysS)株を、37μg/mlのクロラムフェニ� �ールを含むLB寒天培地プレートにおいて30℃� ��て一晩培養して生成したコロニーを竹串で� ��つき、37μg/mlのクロラムフェニコールを含� �LB液体培地4mlに植菌し、27℃で一晩培養した� ��この前培養液40μlを、37μg/mlのクロラムフェ ニコール、100ng/mlのICPを含むLB液体培地4mlに� �菌し、27℃で一晩培養しながら、Mini photo518R (タイテック社製)にて660nmにおける濁度の経� �変化を測定した。また、ICPを含まないこと� �外は同じLB液体培地を用いて、同様に濁度の 経時変化を測定した。その結果を図6に示す� �図6から分かるように、大腸菌BL21(DE3,pLysS)株� ��、ICPの有無に関わらずほぼ同様の増殖曲線� ��示した。したがって、ICPの大腸菌に対する� ��性および増殖促進活性はないと考えられる� ��

[V _H -cpBLA-V _L 発現株を用いた増殖アッセイ]
 V _H -cpBLA-V _L (抗体酵素混成タンパク質)の発現株が、目的� ��原の有無の検出に用い得るかどうかを調べ� ��ために、この抗体酵素混成タンパク質の目� ��抗原であるICP、およびICPの類似体でICPより� ��差反応性が低いことが確認されているチア� ��ロプリド(TCP)を用いて、目的抗原が抗体酵� �混成タンパク質に結合した場合に発揮され� �BLA活性の基質となり得るアンピシリンを用� �た増殖アッセイを行った。より詳細には以� �のような方法で行った。

 まず、V _H -cpBLA-V _L (抗体酵素混成タンパク質)の発現株の作製を� ��った。
0.5μg V _H -cpBLA-V _L /pET26を用いて100μlのBL21(DE3, pLysS)株(F-, ompT,  hsdSB, (rB-, mB-), dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cmr)を� ��質転換し、50μg/mlのカナマイシンと37μg/mlの クロラムフェニコールを含むLB寒天培地プレ� ��トにて30℃で一晩培養することにより、抗� �酵素混成タンパク質発現株(V _H -cpBLA-V _L /pET26/BL21株)を作製した。一晩培養した上記LB� ��天培地プレートに生じたコロニーを竹串で� ��つき、50μg/mlのカナマイシンと37μg/mlのクロ ラムフェニコールを含むLB液体培地4mlに植菌� ��、27℃で一晩培養した。この前培養液4μlを� ��50μg/mlのカナマイシン、37μg/mlのクロラムフ ェニコール、1mM IPTG、0又は100μg/mlのアンピ� �リン、0-10ng/mlのICP又はTCPを含むLB液体培地4ml に植菌し、27℃で33時間培養しながら、Mini ph oto 518Rにて660nmにおける濁度の経時変化を測� ��した。その結果を図7に示す。

 図7から分かるように、100μg/mlアンピシリ ンを含むLB培地において、測定開始後24時間� �後から5-10ng/mlで,また30時間前後から1ng/mlと� �う低濃度でICP濃度依存的な増殖が確認され� �。これに対し、TCPは同濃度のICPを添加した� �合よりも遅れて30時間前後から増殖がみられ 、10ng/mlTCPを添加した場合に、1ng/ml ICPを添加 した場合と同程度の有意な増殖がみられた。 一方、アンピシリンを含まない培地において は、アンピシリン含有培地よりも早く、抗原 の種類、濃度によらずほぼ同様の増殖が見ら れた(図7)。なお、日本の農作物における含有 農薬の基準値は20-5000ng/mlであり(http://m5.ws001.s quarestart.ne.jp/zaidan/agrdtl.php?a_inq=8800)、今回の� �果は、本発明の誘導タンパク質が対象抗原� �対して十分な感度を有しているといえる。

[V _H -split・cpBLA-V _L 発現株等を用いた増殖アッセイ]
 上記実施例6のアッセイにおいて、V _H -cpBLA-V _L /pET26に代えて、V _H -split・cpBLA-V _L /pET26を用い、また、BL21(DE3,pLysS)株に代えて、 毒性の高いタンパク質の過剰発現に適してい る大腸菌C43(DE3)株(Lucigen社製)を用いて、該株� ��の発現を試みた。具体的には、0.5μgのV _H -split・cpBLA-V _L /pET26を用いて、C43(DE3)株を形質転換し、50μg/m lのカナマイシンを含むLB寒天培地プレートに て30℃で一晩培養することにより、V _H -split・cpBLA-V _L 発現株(V _H -split・cpBLA-V _L /pET26/C43株)を作製した。一晩培養した上記LB� �天培地プレートに生じたコロニーを竹串で� �つき、50μg/mlのカナマイシン含むLB(LBC)液体� �地4mlに植菌し、27℃で一晩培養した。この前 培養液10μlを、1mMのIPTG、0又は10μg/mlのアンピ シリン、10ng/mlのICP又はTCPを含むLBKC液体培地1 mlに植菌し、27℃で45時間培養した後の660nmに� ��ける濁度をMini photo 518Rにて測定した。そ� �結果を図8に示す。図8から分かるように、ア ンピシリン非添加時には、増殖の差は見られ なかったものの、実施例6の場合より低い10μg /mlのアンピシリン添加時に、ようやくICP依存 的な増殖が確認された。しかし,100μg/mlのア� �ピシリン添加時,および10ng/ml未満のICPあるい はTCP添加時には有意な増殖を確認することが 出来なかった。更にBL21(DE3,pLysS)株を用いた場 合には増殖が見られなかったことから,V _H -split・cpBLA-V _L ではV _H -cpBLA-V _L に比べ低い抗原依存的酵素活性しか得られず ,その結果低い抗原検出感度しか得られない� �のと考えられた。

 なお、同様の増殖アッセイを、cpBLA発現� �(cpBLA/pET26/BL21株やcpBLA/pET26/C43株)を用いて行� �ったところ、いずれのcpBLA発現株においても 、抗原依存的な増殖は見られず、アンピシリ ン非添加時には、抗原の有無にかかわらず増 殖し、アンピシリン添加時にはすべてのサン プルにおいて増殖しなかった。

[Western blottingによる抗体酵素混成タンパク質 発現の確認]
 実施例6の増殖アッセイでは、培地中の抗原 の有無や違いによって、V _H -cpBLA-V _L (抗体酵素混成タンパク質)の発現量が変化し� ��ことにより増殖速度の違いが生じた可能性� ��否定することはできないため、抗BLA抗体を� ��いたWestern blottingにより、抗体酵素混成タ� �パク質発現株中の抗体酵素混成タンパク質� �発現量の確認を行った。より詳細には以下� �ような方法で行った。

 抗体酵素混成タンパク質発現株(V _H -cpBLA-V _L /pET26/BL21株)を50μg/mlカナマイシンと37μg/mlク� �ラムフェニコールを含むLB液体培地4mlに植菌 し、27℃で一晩培養した。この前培養液4μlを 、50μg/mlカナマイシン、37μg/mlクロラムフェ� �コール、1mM IPTG、10 ng/mlのICP又はTCPを含むLB 液体培地4mlに植菌し、27℃で一晩培養した。� ��た、ICP、TCPのいずれも含まないこと以外は� ��一の方法で一晩培養した。これらの培養に� ��りOD660が0.6程度にまで上昇した培養液100μl� �15000rpmにて5分間遠心して菌体を回収し、SDS-P AGEを行った。泳動後のゲル中のタンパク質の バンドをニトロセルロース膜(バイオラッド� �製)に転写した後、このニトロセルロース膜� ��イムノブロック(大日本住友製薬社製)にて4� ��で一晩静置してブロッキングを行った。こ� ��ニトロセルロース膜を、PBS-T(10mM リン酸、1 45mM NaCl、5mM KCl、pH7.2、0.1%Tween-20)にて5分間� �洗浄することを3回繰り返した後、1/5000希釈� ��たウサギ抗BLAポリクローナル抗体(Chemicon社� ��)を含む5%イムノブロック溶液にて室温で1時 間反応させた。反応後のニトロセルロース膜 を、PBS-Tにて3回洗浄した後、1/5000希釈したHRP -Goat anti Rabbit 1gを含む5%イムノブロック溶� �に浸して室温で1時間反応させた。反応後の� ��トロセルロース膜をPBS-Tにて3回洗浄した後� ��そのHRP活性をSuperSignal WestPico Chemiluminescent� �Substrate(Pierce社製)にて検出した。その結果を 図9に示す。レーン1はICP存在下で培養した菌� ��サンプルを、レーン2はTCP存在下で培養した 菌体サンプルを、レーン3はICP、TCPのいずれ� �抗原(Ag)も含まない培地で培養した菌体サン� ��ルを表す。

 図9から分かるように、抗原の種類を問わず 、すべてのサンプルにおいて58kD付近にほぼ� �量のタンパク質(V _H -cpBLA-V _L )の発現が確認された(図9)。したがって、抗� �(特にICP)添加による増殖速度の上昇は、抗体 酵素混成タンパク質(V _H -cpBLA-V _L )の発現量の増加によるものではなく、抗原� �合による抗体酵素混成タンパク質の構造安� �化がもたらす酵素活性上昇によるものと考� �られる。

[SDS-PAGEやWestern blottingによる抗体酵素混成タ� ��パク質発現の確認]
 抗体酵素混成タンパク質発現株(V _H -cpBLA-V _L /pET26/BL21株)において、抗体酵素混成タンパク 質(V _H -cpBLA-V _L )が実際に発現されているかを確認するため� �、抗体酵素混成タンパク質発現株からの抗� �酵素混成タンパク質の部分精製を行った。� �り詳細には以下のような方法で行った。

 抗体酵素混成タンパク質発現株(V _H -cpBLA-V _L /pET26/BL21株)を50μg/mlカナマイシンと37μg/mlク� �ラムフェニコールを含むLB液体培地4mlに植菌 し、27℃で一晩培養した。この培養液を50μg/m lカナマイシン、37μg/mlクロラムフェニコール を含むLB液体培地(LBKC液体培地)250mlに植菌し� �O.D ₆₀₀ が約0.6に達したとき1M IPTGを250μl加えて発現� ��誘導後、27℃でさらに16時間培養した。その 後、培養液を4℃条件下6000gで10分間遠心して� ��収した上清に107.5gの硫酸アンモニウムを加� ��4℃で一晩静置し、可溶性タンパク質を沈殿 させた。この溶液を4℃条件下10000gで20分間遠 心して上清を廃棄し、沈殿を10ml TALON Buffer(5 0mM リン酸、300mM NaCl、pH7.0)にて懸濁した。� �れに200μlのTALON金属アフィニティーカラム(� �ロンテック社製)を加え、説明書に従いバッ� ��/重力方式カラム精製法によりタンパク質を 精製した。タンパク質の溶出にはElution Buffer (125mM イミダゾール、50mM リン酸、300mM NaCl� �pH7.0)を用いた。この濃縮タンパク質を用い� �SDS-PAGEを行った結果を図10に示す。

 図10から分かるように、レーン5の58kD付近に おいて、目的タンパク質である抗体酵素混成 タンパク質(V _H -cpBLA-V _L )の分子量に相当するバンドを確認した。

 また、BL21(DE3,pLysS)株を、V _H -cpBLA-V _L /pET26、V _H -split・cpBLA-V _L /pET26、cpBLA/pET26のそれぞれのベクターにて形� ��転換して得られたV _H -cpBLA-V _L /pET26/BL21株、V _H -split・cpBLA-V _L /pET26/BL21株、cpBLA/pET26/BL21株を、前述のLBKC液� �培地4mlにそれぞれ植菌し、27℃で一晩培養し た。この培養液をLBKC液体培地250mlに植菌し、 O.D ₆₀₀ が約0.6に達したとき1M IPTGを250μl加えて発現� ��誘導後、27℃でさらに16時間培養した。その 後、培養液を4℃条件下6000gで10分間遠心して� ��収した上清に107.5gの硫酸アンモニウムを加� ��4℃で一晩静置し、可溶性タンパク質を沈殿 させた。この溶液を4℃条件下10000gで20分間遠 心して上清を廃棄し、沈殿を10ml TALON Buffer(5 0mM リン酸、300mM NaCl、pH7.0)にて懸濁した。� �れに200μlのTALON金属アフィニティーカラム(� �ロンテック社製)を加え、説明書に従いバッ� ��/重力方式カラム精製法によりタンパク質を 精製した。タンパク質の溶出にはElution Buffer (125mM イミダゾール、50mM リン酸、300mM NaCl� �pH7.0)を用いた。この濃縮タンパク質溶液10μl を用いてSDS-PAGEを行なった後、上記実施例8と 同様の方法でWestern blottingを行なった結果、� ��的タンパク質の理論値付近の位置にそれぞ� ��バンドを確認することができた。すなわち� ��V _H -cpBLA-V _L /pET26/BL21株については、58kD付近にV _H -cpBLA-V _L と考えられるバンドが確認され、V _H -split・cpBLA-V _L /pET26/BL21株については、28kD付近にV _H -BLAc、31kD付近にBLAn-V _L と考えられるバンドが確認され、cpBLA/pET26/BL2 1株については、30kD付近にcpBLAと考えられる� �ンドが確認された。

[抗体酵素混成タンパク質(V _H -cpBLA-V _L )等の抗原結合能の確認]
 抗体酵素混成タンパク質(V _H -cpBLA-V _L )が実際に抗原(ICP)に結合する能力を有してい るかどうか確認するために、以下のELISA実験� ��行った。
 10μg/mlのICP-BSA又はBSAを含むPBS溶液をFalcon3912 マイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で16 時間静置した。マイクロプレートから溶液を 廃棄した後、そこに25%イムノブロックを含む PBSを200μl加え、室温で2時間置いてブロッキ� �グを行った。次いで、マイクロプレートをPB S-Tで洗浄した後、上記実施例9で得られた50μg /mlの精製抗体酵素混成タンパク質(V _H -cpBLA-V _L )と5%イムノブロックを含むPBSを100μl加え室温 で、90分間静置した。ここまでの操作で固相� ��された抗体酵素混成タンパク質(V _H -cpBLA-V _L )を検出するために、マイクロプレートをPBS-T 洗浄後、5%イムノブロックを含むPBSで1/2000に� ��釈したHRP標識PentaHis(QIAGEN社製、東京)を加え 室温で1時間静置した。その後マイクロプレ� �トをPBS-Tで三回洗浄した後、あらかじめ調製 した酵素反応溶液(50ml ELISA buffer、TMBZ(in DMSO )500μl、H2O2 10μl)を各wellへ100μlずつ添加して� ��応を開始した。暗所で5分間反応させた後、 3.2N H ₂ SO ₄ を50μlずつ添加して反応を止め、プレートリ� ��ダーで吸光度を測定した(450nm)。

 また、上記のELISA実験の方法において、V _H -cpBLA-V _L に代えて、V _H -split・cpBLA-V _L (V _H -BLAc及びBLAn-V _L )又はcpBLAを用いて、同様のELISA実験を行い、� ��様に吸光度を測定したその結果を図11に示� �。図11から分かるように、cpBLAの場合と比較� ��ると、V _H -cpBLA-V _L 、V _H -split・cpBLA-V _L のいずれの場合も、有意なICP-BSA特異的な結� �が確認されたが、V _H -cpBLA-V _L の場合はV _H -split・cpBLA-V _L の場合と比較しても顕著なICP-BSA特異的結合� �が認められた。なお、V _H -split・cpBLA-V _L においてはV _H -BLAcとBLAn-V _L の両方にHis tagが存在することを考慮すると� ��V _H -split・cpBLA-V _L と比較したV _H -cpBLA-V _L のシグナルの高さは、図11に示されている以� ��のものがある。また、cpBLAにおいては、ICP(� ��原)の有無にかかわらず、同程度の低いシグ ナルを示していることから、BLAのコンフォメ ーションが崩れ、非特異に結合している可能 性がある。

[抗体酵素混成タンパク質(V _H -cpBLA-V _L )の抗原結合による活性変化]
 抗体酵素混成タンパク質(V _H -cpBLA-V _L )が抗原に結合することによって、実際に酵� �活性の変化(上昇)が生じているかどうか確認 するために、発色基質Nitrocefin(Calbiochem社製)� �は蛍光基質Fluorocillin (Invitrogen社製)、及び、 実施例9で濃縮したV _H -cpBLA-V _L を用いて以下の実験を行った。

 まず、実施例9で濃縮したV _H -cpBLA-V _L タンパク質溶液 5μl、10μg/mlのICP又はTCP 5μl� ��及び、1mM Nitrocefinを含むPBS 90μlを混合し、 室温で18時間暗所に静置した。その後、その� ��応液について490nmの吸光度を測定すること� �よって、βラクタマーゼの活性の変化を調べ た。また、ICPやTCPに代えてPBSを用いた場合(� �12中の「PBS」の項目)や、V _H -cpBLA-V _L タンパク質溶液を添加しなかった場合(図12中 の「Nitrocefin」の項目)についても同様に490nm� �吸光度を測定した。その結果を図12に示す。 図12から分かるように、ICPを添加したサンプ� ��において、これを加えなかったサンプル(「 TCP」、「PBS」、「Nitrocefin」)と比較して有意� ��シグナル上昇が観察された。すなわち、ICP� ��存的なβラクタマーゼ活性の上昇が認めら� �た。また、TCPを添加したサンプルにおいて� �、ICP、TCPのいずれも添加しなかったサンプ� �(「PBS」)に比較してわずかながら有意な信号 増加が観察された(n=2)。これにより、抗原添� ��により混成タンパク質の酵素活性が活性化� ��れたと考えられる。

 次に、発色基質Nitrocefinに代えて蛍光基質Flu orocillinを用いて同様の実験を行なった。具体 的には、実施例9で濃縮したV _H -cpBLA-V _L タンパク質溶液 5μl、10μg/mlのICP又はTCP 5μl� ��混合し、4℃にて30分間インキュベーション� ��た後に、10μM Fluorocillinを含むPBS 90μlを添� �し、室温で30分間反応を行なった後に、マイ クロプレートリーダーGenios Pro(TECAN社製)を用 いて、485nmで励起し、535nmの蛍光を測定した� �V _H -cpBLA-V _L タンパク質溶液を添加しなかった場合の測定 値をバックグラウンドとして引いた値を図13� ��示す。図13から分かるように、ICPを添加し� �サンプルにおいて、これを加えなかったサ� �プル(「TCP」、「PBS」)と比較して有意なシグ ナル上昇が観察された。すなわち、ICP依存的 なβラクタマーゼ活性の上昇が認められた。

[抗ペプチド抗体酵素混成タンパク質を用い� �ペプチドの検出例]
 本発明の融合タンパク質(抗体酵素混成タン パク質)を用いた抗原検出システムの汎用性� �確かめるため、上記のFvとは異なる抗体Fvを� ��する抗体酵素混成タンパク質を用いた検出� ��を構築し、同様の抗原依存的酵素活性変化� ��見られるかどうか検証した。すなわち、実� ��例3で作製したV _H -cpBLA-V _L /pET26におけるVHおよびVL遺伝子を、抗オステ� �カルシンC末ペプチド抗体KTM219(Anal. Chem. 79,� �6197 (2007))由来のものに置き換えた抗体酵素� ��成タンパク質を用いて、抗原ペプチドの検� ��実験を行なった。この実験は具体的には以� ��のような方法で行なった。

 まずV _H -cpBLA-V _L /pET26のVL遺伝子の交換、および3‘側に存在す る不要なXhoIサイトの除去のため、KTM219のVL遺 伝子を以下のプライマーを用いて増幅した。 50pmolのMKback2A(配列番号23:GCGCAAGCTCAGTCGACGGAYATTGTG MTSACMCARWCTMCA)(5’末端から12~17番目のヌクレオ� ��ドがSalIサイト)、50pmolのVkNotFor(配列番号24:AT GGTGCTCGACTGCGGCCGCCCGTTTTAT)、10ngのpKST2(KTM219;Anal. C hem. 79, 6197 (2007))、0.2mM(反応溶液の最終濃度 )のdNTPs、10μlの10´Ex-Taq buffer、5unitのEx-Taqを� �合して100mlの反応溶液とし、94℃で5分間の後 に、94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で1分間� ��らなるサイクルを25サイクル繰り返した後� �72℃で10分間反応させて反応液を得た。更に� ��られた反応液をアガロースゲル電気泳動に� ��り精製した。次に同様にして50pmolのNotdXback( 配列番号25:GCAGTCGAGCACCATCACCACCACCAC)、50pmolのpETDr a3For(配列番号26:TGAGTGTTGTTCCAGTTTGG)、10ngのV _H -cpBLA-V _L /pET26を用いてpET26のNotI-DraIII領域を含む断片� �増幅し、得られた反応液を同様に精製した� �

 精製して得られたこれらのDNA断片、および� ��プライマーとしてMKback2AとpETDra3Forを用いて� ��実施例1と同様にオーバーラップ・エクステ ンションPCRを行い、得られたPCR産物を精製し た後、該PCR産物を制限酵素SalIおよびDraIIIで� �理して精製し、SalI-DraIII断片を得た。このSal I-DraIII断片を、同じくSalIおよびDraIII処理並び に精製を行なったV _H -cpBLA-V _L /pET26に組み込み、該プラスミドをV _H (ICP)-cpBLA-V _L (219)/pET26とした。このプラスミドの配列を確� ��後、同様にしてプライマーM13RV(配列番号27:C AGGAAACAGCTATGAC)およびJH1(配列番号28:ACTGCTCGAGACGGT GACCGTGGTCCC)、およびテンプレートとしてpKST2(KT M219)を用いてKTM219VH遺伝子をPCR増幅し、得ら� �たPCR産物をNcoI及びXhoIにて制限酵素処理して 精製し、NcoI-XhoI断片を得た。このNcoI-XhoI断片 を、同じくNcoI及びXhoI処理並びに精製を行っ� ��V _H (ICP)-cpBLA-V _L (219)/pET26に組み込み、該プラスミドをV _H -cpBLA-V _L /pET26(219)とした。

[不溶性タンパク質の発現と精製、およびリ� �ォールディング]
 V _H -cpBLA-V _L /pET26(219)でBL21(DE3, pLysS)株を形質転換し、50μg /mlのカナマイシンと37μg/mlのクロラムフェニ� ��ールを含むLB寒天培地プレートにて30℃で一 晩培養し、抗体酵素混成タンパク質発現株(V _H -cpBLA-V _L /pET26(219)/BL21株)を作製した。コロニーを竹串� ��つつき、50μg/mlのカナマイシンと37μg/mlのク ロラムフェニコールを含むLB液体培地(LBCK培� �)4mlに植菌し、37℃で一晩培養した。この前� �養液250μlをLBCK培地250mlに植菌して37℃で培養 し、OD ₆₀₀ が0.6に達した時点で終濃度1mMのIPTGを添加し� �37℃で更に一晩培養した。その後、培養液を 4℃条件下6000gで10分間遠心して回収し、25mlの TALON Bufferに懸濁、氷上での超音波処理によ� �菌体を破砕し、2.5μlのBenzonase(Novagen社製)お� �び終濃度1mMのMgCl ₂ を加え氷上30分反応させてDNAを分解した後、6 000g10分間遠心して上清をとり除いた。その後 残ったペレットに25mlの1%TritonX-100、1mM EDTAを� ��えボルテックスし、6000g10分遠心する操作を 3回繰り返して不溶性画分を洗浄した。

 洗浄した沈殿(不溶性画分)を10ml 6M塩酸グ アニジン(GdnHCl)を含むTALON Bufferにて懸濁した 。この懸濁液に200μlのTALON金属アフィニティ� ��カラム(メルク社製)を加え、説明書に従っ� �変性条件でのバッチ/重力方式カラム精製法� ��よりタンパク質を精製した。タンパク質の� ��出にはElution Buffer(200mM イミダゾール、50mM� �リン酸、300mM NaCl、5.4M GdnHCl,pH7.0)を用いた� �

 溶出液中のタンパク質量をUVで定量し、溶� �液のうち150μl(約320μgのタンパク質を含む)を 分取し、終濃度10mMの2メルカプトエタノール� ��同1mM EDTAを加え、30℃で30分間おいたのち、 Slide-A-Lyzer透析カセット(MW 10kcutoff, Pierce 社� ��)に移した。透析は、J. Immunol. Methods 219, 1 19 (1998)記載の透析外液(後述の透析外液1~5)な らびに方法に従って、500mLの透析外液に対し� ��4℃で24時間ずつ計5回行い、最後に、4℃、15 krpmにて10min遠心して最終的に約1.7mlの可溶化� ��ンプルを得た。この可溶化サンプルには、3 .7μMの抗体酵素混成タンパク質(V _H -cpBLA-V _L (219))が含まれていた。
透析外液1:50mM TrisHCl,3M GdnHCl,200mM NaCl,1mM EDTA ,pH8.0;
透析外液2:50mM TrisHCl,2M GdnHCl,200mM NaCl,1mM EDTA ,pH8.0;
透析外液3:50mM TrisHCl,1M GdnHCl,200mM NaCl,1mM EDTA ,180μM GSSG,400mM L-アルギニン,pH8.0;
透析外液4:50mM TrisHCl,0.5M GdnHCl,200mM NaCl,1mM ED TA,pH8.0;
透析外液5:50mM TrisHCl,200mM NaCl,1mM EDTA,pH8.0;

 [抗体酵素混成タンパク質の活性測定]
 上記により調製した抗体酵素混成タンパク� ��(V _H -cpBLA-V _L (219))を用い、Fluorocillinを用いて活性測定を行 った。50μlのPBS中に終濃度0-2000ng/mlの抗原ペ� �チドBGP-C7、および終濃度300nMの抗体酵素混成 タンパク質を混合し、黒色マイクロプレート ウェルに分注した。これに50μL PBS中の2μM Fl uorocillinを加えて28℃で60分反応させ、反応液� ��蛍光強度(485nmの励起光照射による535nmの蛍� �強度)を測定した。なおこの際、抗体酵素混� ��タンパク質を加えない対照実験を行い、こ� ��らのウェルの蛍光強度をバックグラウンド� ��して減算した。この結果、図14に示すよう� �BGP-C7濃度依存的に有意な蛍光強度の増加が� �られた。なお、本実験の測定は3連で行なっ� ��。図14中の黒丸は測定値の平均値を表し、� �ラーバーは1SDを示す。

 また、抗原としてBGP-C7以外のもの(BGP-C8,BG P-C10,ICP,TCP各終濃度1μg/ml)を用いて、同様の実 験を行った。その結果を図15に示す。図15の� �果から分かるように、KTM219を用いたオープ� �サンドイッチELISAで検出が可能なBGP-C8、BGP-C1 0(Anal. Chem. 79, 6197 (2007))では信号強度が増� �したのに対し、特異的に認識されないICP、TC PではPBSと同じ信号強度しか得られなかった� �なお、本実験の測定も3連で行なった。図15� �のグラフの値は測定値の平均値を表し、エ� �ーバーは1SDを示す。

 以上の実験結果より、本発明の融合タン� ��ク質(抗体酵素混成タンパク質)を用いた抗� �検出システムの汎用性と、目的抗原に対す� �特異性が示された。