本発明の測定方法は、前述のように、試� ��片に適用することが好ましいが、本発明は� ��これに限定されず、液系に適用してもよい� ��

 本発明の測定方法において、前記(B)工程� ��よび前記(C)工程の順番は特に制限されず、� ��ずれの工程を先に実施してもよいし、同時� ��実施してもよい。

 本発明の測定方法において、
前記(A)工程において、前記総コレステロール 測定部が、コレステロール測定用酵素試薬を 有し、
前記非LDLコレステロール測定部が、コレステ ロール測定用酵素試薬と、非LDLコレステロー ル可溶化用界面活性剤と、LDLコレステロール 溶解阻止用界面活性剤とを有し、
前記(B)工程において、前記コレステロール測 定用酵素試薬により前記総コレステロールを 測定し、
前記(C)工程において、非LDLコレステロール可 溶化用界面活性剤および前記LDLコレステロー ル溶解阻止用界面活性剤の作用により、前記 コレステロール測定用酵素試薬により前記非 LDLコレステロールを選択的に測定するという 構成が好ましい。従来技術ではLDLコレステロ ールとVLDLコレステロールとの分別測定が困� �であったが、本構成によれば、前記分別測� �が可能となり、LDLコレステロール測定の精� �および信頼性が向上する。

 本発明の測定方法において、
前記非LDLコレステロール可溶化用界面活性剤 は、ポリオキシエチレンアルキレンフェニル エーテルおよびポリオキシエチレンアルキレ ントリベンジルフェニルエーテルの少なくと も一方の界面活性剤を含み、
前記LDLコレステロール溶解阻止用界面活性剤 は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ ル、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピ� �ン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエ� �テル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホ� �酸塩からなる群から選択される少なくとも� �つの界面活性剤を含むことが好ましい。

 本発明の測定方法において、前記酵素試� ��は、コレステロールエステラーゼおよびコ� ��ステロールオキシダーゼを含むという態様� ��あってもよい。

 本発明の測定方法において、前記酵素試� ��は、コレステロールエステラーゼおよびコ� ��ステロールデヒドロゲナーゼを含むという� ��様であってもよい。

 本発明の測定方法において、前記(A)工程� ��おいて、前記非LDLコレステロール測定部が� ��さらに、LDLコレステロール凝集剤を有し、� ��記(C)工程において、前記非LDLコレステロー� ��可溶化用界面活性剤、前記LDLコレステロー� ��溶解阻止用界面活性剤および前記LDLコレス� ��ロール凝集剤の作用により、前記コレステ� ��ール測定用酵素試薬により前記非LDLコレス� ��ロールを選択的に測定するという構成がよ� ��好ましい。従来技術ではLDLコレステロール� ��VLDLコレステロールとの分別測定が困難であ ったが、本構成によれば、前記分別測定が可 能となり、LDLコレステロール測定の精度およ び信頼性が、さらに向上する。前記LDLコレス テロール凝集剤は、ポリビニル硫酸塩である ことが好ましい。

 本発明の測定方法において、前記非LDLコ� ��ステロールが、高密度リポタンパク質(HDL)� �レステロールおよび超低密度リポタンパク� �(VLDL)コレステロールであってもよい。

 前述と同様の理由により、本発明の試験片� ��おいて、
前記総コレステロール測定部が、コレステロ ール測定用酵素試薬を有し、
前記非LDLコレステロール測定部が、コレステ ロール測定用酵素試薬と、非LDLコレステロー ル可溶化用界面活性剤と、LDLコレステロール 溶解阻止用界面活性剤とを有するという構成 が好ましい。

 本発明の試験片において、
前記酵素試薬が、コレステロールエステラー ゼおよびコレステロールオキシダーゼを含む という形態であってもよい。

 本発明の試験片において、
前記酵素試薬が、コレステロールエステラー ゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを 含むという形態であってもよい。

 本発明の試験片において、
前記非LDLコレステロール可溶化用界面活性剤 が、ポリオキシエチレンアルキレンフェニル エーテルおよびポリオキシエチレンアルキレ ントリベンジルフェニルエーテルの少なくと も一方の界面活性剤を含み、
前記LDLコレステロール溶解阻止用界面活性剤 が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ ル、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピ� �ン縮合体、ポリオキシエチレンアルキルエ� �テル硫酸塩およびアルキルベンゼンスルホ� �酸塩からなる群から選択される少なくとも� �つの界面活性剤を含むことが好ましい。

 前述と同様の理由により、本発明の試験片� ��おいて、
前記非LDLコレステロール測定部が、さらに、 LDLコレステロール凝集剤を有するという構成 がより好ましい。前記LDLコレステロール凝集 剤は、ポリビニル硫酸塩であることが好まし い。

 本発明の試験片において、
前記非LDLコレステロールが、高密度リポタン パク質(HDL)コレステロールおよび超低密度リ� ��タンパク質(VLDL)コレステロールであっても� ��い。

 本発明の試験片は、
支持体と、第一の試薬層および第二の試薬層 とを有し、
前記支持体の上に、前記第一の試薬層および 前記第二の試薬層が配置され、
前記第一の試薬層が、前記総コレステロール 測定部であり、
前記第二の試薬層が、前記非LDLコレステロー ル測定部である
という形態であってもよい。

 本発明の試験片は、
第一の支持体および第二の支持体と、第一の 試薬層および第二の試薬層とを有し、
前記第一の支持体の上に前記第一の試薬層が 配置され、
前記第二の支持体の上に前記第二の試薬層が 配置され、
前記第一の試薬層が、前記総コレステロール 測定部であり、
前記第二の試薬層が、前記非LDLコレステロー ル測定部である
という形態であってもよい。

 つぎに、本発明について、例をあげて詳� ��に説明する。なお、本発明において、試料� ��用時における全成分中の配合割合とは、試� ��(検体)を前記総コレステロール測定部(例え� ��、前記第一の試薬層)または前記非LDLコレス テロール測定部(例えば、前記第二の試薬層)� ��適用した場合の全成分中の割合であり、全� ��分とは、前記試料、前記コレステロール測� ��用酵素試薬、前記非LDLコレステロール可溶� ��用界面活性剤、前記LDLコレステロール溶解� ��止用界面活性剤および前記LDLコレステロー� ��凝集剤等の、試料適用時に存在する成分全� ��をいう。通常、一検体の量は、その種類に� ��り予測可能若しくは決定可能である。

 本発明の試験片は、例えば、1つの支持体 上に、前記総コレステロール測定部および前 記非LDLコレステロール測定部を配置した構成 であってもよい。また、本発明の試験片は、 第一の支持体の上に、前記総コレステロール 測定部を配置し、第二の支持体の上に前記非 LDLコレステロール測定部を配置したという構 成であってもよい。

 本発明の試験片において、前記総コレス� ��ロール測定部は、例えば、支持体の上に第� ��の試薬層が形成され、前記第一の試薬層が� ��コレステロール測定用酵素試薬を含むとい� ��構成をとることができる。前記第一の試薬� ��は、さらに、コレステロール可溶化用界面� ��性剤を含むことが好ましい。前記第一の試� ��層は、反応層と検出層を有し、前記反応層� ��前記コレステロール可溶化用界面活性剤を� ��し、前記検出層が前記コレステロール測定� ��酵素試薬を有するという構成であってもよ� ��。また、前記反応層が前記コレステロール� ��定用酵素試薬の一部、前記コレステロール� ��溶化用界面活性剤を有し、前記検出層が、� ��記コレステロール測定用酵素試薬の残部を� ��することも好ましい。

 本発明の試験片において、前記非LDLコレ� ��テロール測定部は、例えば、支持体の上に� ��二の試薬層が形成され、前記第二の試薬層� ��、コレステロール測定用酵素試薬、前記非L DLコレステロール可溶化用界面活性剤および� ��記LDLコレステロール溶解阻止用界面活性剤� ��有するという構成をとることができる。前� ��第二の試薬層は、反応層と検出層を有し、� ��記反応層が、前記非LDLコレステロール可溶� ��用界面活性剤および前記LDLコレステロール� ��解阻止用界面活性剤を有し、前記検出層が� ��レステロール測定用酵素試薬を有するとい� ��構成であってもよい。さらに、前記反応層� ��部において、その上部(上層)に前記LDLコレ� �テロール溶解阻止用界面活性剤を有し、そ� �下部(下層)に前記非コレステロール可溶化用 界面活性剤を有するという構成であることが 好ましい。また、前記反応層が前記コレステ ロール測定用酵素試薬の一部、前記非LDLコレ ステロール可溶化用界面活性剤および前記LDL コレステロール溶解阻止用界面活性剤を有し 、前記検出層が、前記コレステロール測定用 酵素試薬の残部を有するという構成も好まし い。

 前記第二の試薬層は、さらに、前記LDLコ� ��ステロール凝集剤を有することが好ましい� ��前記第二の試薬層は、反応層と検出層を有� ��、前記反応層が、前記非LDLコレステロール� ��溶化用界面活性剤、前記LDLコレステロール� ��解阻止用界面活性剤および前記LDLコレステ� ��ール凝集剤を有し、前記検出層がコレステ� ��ール測定用酵素試薬を有するという構成で� ��ってもよい。さらに、前記反応層内部にお� ��て、その上部(上層)に前記LDLコレステロー� �溶解阻止用界面活性剤および前記LDLコレス� �ロール凝集剤を有し、その下部(下層)に前記 非LDLコレステロール可溶化用界面活性剤を有 するという構成であることが、より好ましい 。また、前記反応層が前記コレステロール測 定用酵素試薬の一部、前記非LDLコレステロー ル可溶化用界面活性剤、前記LDLコレステロー ル溶解阻止用界面活性剤および前記LDLコレス テロール凝集剤を有し、前記検出層が、前記 コレステロール測定用酵素試薬の残部を有す るという構成も、より好ましい。

 本発明において、前記非LDLコレステロー� ��可溶化用界面活性剤は、LDLコレステロール� ��比べ、非LDLコレステロール(HDLコレステロー ルやVLDLコレステロール等)に対する可溶化性� ��が高いものであれば、特に制限されない。� ��記非LDLコレステロール可溶化用界面活性剤� ��、非LDLリポタンパク質に内包されるコレス� ��ロール若しくはコレステロールエステルを� ��溶化する働きを有し、その結果として、コ� ��ステロール若しくはそのエステルと前記酵� ��試薬の反応を促進することになる。前述の� ��うに、前記非LDLコレステロール可溶化用界� ��活性剤は、ポリオキシエチレンアルキレン� ��ェニルエーテルおよびポリオキシエチレン� ��ルキレントリベンジルフェニルエーテルが� ��ましく、これらは単独で使用してもよいし� ��併用してもよい。この中でより好ましいの� ��、ポリオキシエチレンアルキレントリベン� ��ルフェニルエーテルである。ポリオキシエ� ��レンアルキレンフェニルエーテルの市販品� ��しては、例えば、商品名「エマルゲンA-60」 (花王株式会社製)や商品名「ノニポール40」(� ��洋化成工業株式会社製)等があり、ポリオキ シエチレンアルキレントリベンジルフェニル エーテルの市販品としては、商品名「エマル ゲンB66」(花王株式会社製)や商品名「ブラウ� ��ン TBP-15-95」(青木油脂工業株式会社製)等が ある。

 本発明において、前記総コレステロール� ��定部で用いるコレステロール可溶化用界面� ��性剤としては、全てのリポタンパク質を可� ��化するものであれば特に制限はされず、例� ��ば、デオキシコール酸ナトリウム、ポリオ� ��シエチレン(n)オクチルフェニルエーテル(例 えば、商品名「Triton X-100」(和光純薬社製))� �使用できる。

 本発明において、前記LDLコレステロール� ��解阻止用界面活性剤は、LDLコレステロール� ��溶解を阻害するものであれば、特に制限さ� ��ない。前記LDLコレステロール溶解阻止用界� ��活性剤が、LDLコレステロールの溶解を阻害� ��ることにより、LDLコレステロール若しくは� ��のエステルと前記酵素試薬との反応を阻害� ��ることになる。前述のように、前記LDLコレ� ��テロール溶解阻止用界面活性剤は、ポリオ� ��シエチレンアルキルエーテル、ポリオキシ� ��チレンアルキルフェニルエーテル、ポリオ� ��シエチレン-ポリオキシプロピレン縮合体、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩 およびアルキルベンゼンスルホン酸塩が好ま しく、これらは単独で使用してもよく、2種� �以上併用してもよい。この中でより好まし� �のは、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロ� ��レン縮合体である。ポリオキシエチレンア� ��キルエーテルとしては、ポリオキシエチレ� ��セチルエーテル(例えば、商品名「エマルゲ ン220」(花王株式会社製))が好ましい。ポリオ キシエチレンアルキルフェニルエーテルとし ては、ポリオキシエチレンノニルフェニルエ ーテル(例えば、商品名「ブラウノン N-502」( 青木油脂工業株式会社製))が好ましい。ポリ� ��キシエチレン-ポリオキシプロピレン縮合体 としては、商品名「プルロニックF-88」(株式� ��社ADEKA社製)が好ましい。ポリオキシエチレ� ��アルキルエーテル硫酸塩としては、ポリオ� ��シエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウ� ��(例えば、商品名「エマール20C」(花王株式� �社製))が好ましい。アルキルベンゼンスルホ ン酸塩としては、ドデシルベンゼンスルホン 酸ナトリウムが好ましい。これらは単独で、 若しくは二種類以上を併用できる。

 本発明の試験片における前記総コレステ� ��ール測定部(例えば、第一の試薬層)におい� �、試料適用時における全成分中の前記コレ� �テロール可溶化用界面活性剤の割合は、例� �ば、0.05~3.0重量%の範囲であり、好ましくは� �0.1~1.0重量%の範囲であり、より好ましくは、 0.3~0.7重量%の範囲である。

 本発明の試験片における前記非LDLコレス� ��ロール測定部(例えば、第二の試薬層)にお� �て、試料適用時における全成分中の前記非LD Lコレステロール可溶化用界面活性剤の配合� �合は、例えば、1~15重量%の範囲であり、好ま しくは、2~10重量%の範囲であり、より好まし� ��は4~8重量%の範囲である。また、試料適用時 における全成分中の前記LDLコレステロール溶 解阻止用界面活性剤の配合割合は、例えば、 1~15重量%の範囲であり、好ましくは、1.5~10重� ��%の範囲であり、より好ましくは、2~6重量%� �範囲である。前記非LDLコレステロール可溶� �用界面活性剤(A)と前記LDLコレステロール溶� �阻止用界面活性剤(B)の重量比(A/B)は、例えば 、1/1~4/1の範囲であり、好ましくは、1.1/1~3/1� �範囲であり、より好ましくは、1.2/1~2.5/1の範 囲である。

 本発明において、前記LDLコレステロール� ��集剤としては、特に制限されないが、例え� ��、ポリビニル硫酸塩、アニオン性水溶性ポ� ��マー、植物由来のレクチン、ポリエチレン� ��リコール(PEG)、リンタングステン酸、デキ� �トラン硫酸、デキストラン硫酸塩、ヘパリ� �等が挙げられ、好ましくは、前述のように� �ポリビニル硫酸塩である。

 前記ポリビニル硫酸塩としては、例えば� ��ポリビニル硫酸カリウム、ポリビニル硫酸� ��トリウム、ポリビニル硫酸リチウム、ポリ� ��ニル硫酸アンモニウム等が挙げられ、これ� ��は単独で使用してもよいし、二種類以上を� ��用してもよい。この中で好ましいのは、ポ� ��ビニル硫酸カリウムである。前記ポリビニ� ��硫酸塩は、側鎖に硫酸基を70%以上有するも� ��が好ましい。また、前記ポリビニル硫酸塩� ��エステル化度は、80%以上が好ましく、より� ��ましくは90%以上である。また、前記ポリビ� ��ル硫酸塩にポリグリコールメチルエーテル� ��たはポリビニルピロリドンを添加すると、L DLの凝集反応がさらに良くなり好ましい。

 前記アニオン性水溶性ポリマーとしては� ��特に限定されないが、例えば、アクリル酸( 2-ホスホ-1,1-ジメチルエチルアミド)、2-アク� �ルアミドグリコール酸、2-アクリルアミド-2- メチル-1-プロパンスルホン酸、2-アクリルア� ��ド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸-CO-2-アク� ��ルアミドグリコール酸等のモノマーのホモ� ��リマー、前記モノマーのコポリマー、ポリ( メタ)アクリル酸エステル等が挙げられる。� �記アニオン性水溶性ポリマーの具体例とし� �は、例えば、ポリアクリル酸-(2-ホスホ-1,1-� �メチルエチルアミド)(PAP)、ポリ-2-アクリル� �ミドグリコール酸(PAAG)、ポリ-(2-アクリルア� ��ド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸)(PAMPS)、� �リ-(2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンス� ��ホン酸-CO-2-アクリルアミドグリコール酸)[P( AMPS-AAG)]等が挙げられる。

 前記植物由来のレクチンとしては、特に限� ��されないが、例えば、ヒマ( Ricinus   communis )の実、ダイズ等由来のレクチンが挙げられ� �。

 前記ポリエチレングリコール(PEG)、リン� �ングステン酸、デキストラン硫酸およびヘ� �リンは、単独で用いてもよく、例えば、マ� �ネシウムイオン、マンガンイオン、カルシ� �ムイオン、リチウムイオン、ニッケルイオ� �等のカチオンと併用してもよい。

 本発明の試験片において、試料適用時に� ��ける全成分中の前記LDLコレステロール凝集� ��の配合割合は、例えば、0.01~0.30重量%の範囲 であり、好ましくは、0.02~0.20重量%の範囲で� �り、より好ましくは、0.04~0.15重量%の範囲で� ��る。本発明の試験片において、試料適用時� ��おける全成分中の前記ポリグリコールメチ� ��エーテルの配合割合は、例えば、3~12重量%� �範囲であり、好ましくは、3.5~11重量%の範囲� ��あり、より好ましくは、4~10重量%である。

 前述のように、前記コレステロール測定� ��酵素試薬としては、コレステロールエステ� ��ーゼおよびコレステロールオキシダーゼの� ��み合わせ、またはコレステロールエステラ� ��ゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼ� ��組み合わせが好ましい。より好ましいのは� ��前者の組み合わせである。

 本発明の試験片において、試料適用時に� ��ける全成分中のコレステロールエステラー� ��の割合は、例えば、5~1000U/mLの範囲であり、 好ましくは、10~100U/mLの範囲であり、より好� �しくは30~70U/mLの範囲である。また、本発明� �試験片において、試料適用時の全成分中の� �レステロールオキシダーゼの割合は、例え� �、5~1000U/mLの範囲であり、好ましくは10~100U/mL の範囲であり、より好ましくは20~50U/mLの範囲 である。そして、本発明の試験片において、 試料適用時における全成分中のコレステロー ルデヒドロゲナーゼの割合は、例えば、5~1000 U/mLの範囲であり、好ましくは10~100U/mLの範囲� ��あり、より好ましくは30~70U/mLの範囲である� ��

 前記コレステロール測定用酵素試薬とし� ��は、例えば、市販品を使用することができ� ��一連の反応を阻害する夾雑物等を含まない� ��正品や、遺伝子組換え製品等を好ましく使� ��することができる。

 前記コレステロールエステラーゼとしては� ��特に限定されないが、例えば、シュードモ� ��ス属( Pseudomonas   sp. )、トリコデルマ属( Trichoderma   sp. )等の微生物由来の酵素が挙げられる。前記� �素は、特に限定されないが、例えば、下記� �に示す基質特異性を有するものが挙げられ� �。また、前記酵素には、例えば、BSA等が添� �されていてもよく、特に制限されない。

(酵素の基質特異性)
基質               比活性 (%)の範囲 
コレステロールアセテート     0.1~50
コレステロールプロピオネート    0~50
コレステロールブチレート       1~50
コレステロールパルミテート      1~200
コレステロールステアレート      0~50
コレステロールオレエート       1~200
コレステロールリノレート        100
コレステロールカプリネート      0~100
コレステロールラウリネート      0~200
コレステロールミリステート       0~200

 通常、生体内において、コレステロール� ��、遊離型状態と、脂肪酸とエステル結合し� ��いる状態の2種類に分類される。そこで、後 者をコレステロールエステラーゼにより、コ レステロールと脂肪酸とに加水分解する。そ して、生じたコレステロールと前者遊離型コ レステロールを、コレステロールオキシダー ゼで処理すれば、コレステノンと過酸化水素 を生じる。この過酸化水素を測定すれば、コ レステロール量を求めることができる。過酸 化水素の測定は、電気化学的測定若しくは化 学的測定があるが、パーオキシダーゼ(POD)と� ��酸化されると発色する基質(以下「酸化発色 性基質」という)を用いた化学的測定が好ま� �い。この場合、前記コレステロール測定用� �素試薬に、PODおよび前記酸化発色性基質が� �まれることになる。本発明の試験片におい� �、試料適用時における全成分中のPODの割合� �、例えば、50~5000U/mLの範囲、好ましくは100~15 00U/mLの範囲、より好ましくは700~800U/mLの範囲� ��ある。本発明の試験片において、試料適用� ��における全成分中の前記酸化発色性基質の� ��合は、その種類により適宜決定されるが、� ��えば、10~1000mmol/Lの範囲、好ましくは20~200mmo l/Lの範囲、より好ましくは30~70mmol/Lの範囲で� ��る。

 前記酸化発色性基質としては、例えば、A LPS[N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline,sodium salt]、DAOS[N- Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline,sodiu m salt]、MAOS[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dime thylaniline,sodium salt,monohydrate]、TOOS[N-Ethyl-N-(2-hy droxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline,sodium salt,dihydrate] 、フェノール等があり、この中から、測定機 器が用いる波長に合う発色を呈する基質を適 宜選択することができる。

 本発明の試験片において、前記総コレス� ��ロール測定部および非LDLコレステロール測� ��部は、試料適用時におけるpHがpH6~9の範囲に なるように調整されていることが好ましい。 前記pHの好ましい範囲はpH7~8の範囲であり、� �適には、前記総コレステロール測定部がpH7.5 、前記非LDLコレステロール測定部がpH7.7であ� ��。前記pHに調整するために、前記総コレス� �ロール測定部(例えば、第一の試薬層)および 非LDLコレステロール測定部(例えば、第二の� �薬層)は、緩衝液(バッファー)を含むことが� �ましい。前記緩衝液としては、例えば、後� �のものが挙げられる。

 本発明の測定対象となる試料は、特に制� ��されず、例えば、全血、血漿、血清等のLDL� ��レステロールを含有する可能性のある検体� ��料(特に生物学的液体)である。

 つぎに、本発明の試験片の一例を図1に示 す。図1(A)は、本例の試験片の斜視図であり� �図1(B)は、図1(A)のA-A方向にみた断面図である 。本例の試験片は、細長い長方形板状の支持 体1の一端上に、二つの試薬層2および試薬層3 が配置されているという構成である。前記二 つの試薬層2および3のうち、一方が、前記総� ��レステロール測定部(第一の試薬層)であり� �他方が、前記非LDLコレステロール測定部(第� ��の試薬層)である。

 前記支持体1は、例えば、ポリエチレンテ レフタレート(PET)、ポリスチレン、ポリエス� ��ル、酢酸セルロース等の樹脂を用いて製造� ��き、この中でもPETが好ましい。支持体1の厚 みは、特に制限されないが、例えば、0.1~1mm� �範囲であり、好ましくは0.1~0.5mmの範囲であ� �、より好ましくは0.2~0.3mmの範囲である。

 前記非LDLコレステロール測定部となる前� ��試薬層には、例えば、前記コレステロール� ��定用酵素試薬、前記非LDLコレステロール可� ��化用界面活性剤および前記LDLコレステロー� ��溶解阻止用界面活性剤等が含まれ、好まし� ��は、さらに、前記LDLコレステロール凝集剤� ��含まれる。前記総コレステロール測定部で� ��る前記試薬層には、例えば、前記コレステ� ��ール測定用酵素試薬、前記コレステロール� ��溶化用界面活性剤等が含まれる。

 試薬層2および3は、例えば、前記コレス� �ロール測定用酵素試薬、前記各種界面活性� �、前記LDLコレステロール凝集剤等の各種試� �および親水性ポリマーを溶媒に溶解して混� �した溶液を、繊維質構造体等に含浸または� �布し、その後乾燥して作製することができ� �。

 前記親水性ポリマーとしては、例えば、� ��リビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル� ��ルロース、メチルセルロース、アルギン酸� ��トリウム、ポリアクリル酸、ゼラチン、酸� ��水分解ゼラチン、ポリアクリルアミド、ア� ��ロース等が挙げられる。

 また、前記溶媒としては、例えば、リン� ��緩衝液、グッドの緩衝液、トリス塩酸緩衝� ��等が挙げられる。前記総コレステロール測� ��部における前記溶媒としては、リン酸緩衝� ��が、前記非LDLコレステロール測定部におけ� ��前記溶媒としては、グッドの緩衝液がそれ� ��れ好ましい。グッドの緩衝液としては、例� ��ば、PIPES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、MES等が好� �しく、より好ましくはTESである。試料適用� �におけるpHが前記所定の範囲になるように、 前記緩衝液のpHは、pH6~9の範囲に調整するこ� �が好ましく、より好ましくはpH7~8の範囲に調 整することであり、最適には、前記総コレス テロール測定部はpH7.5、前記非LDLコレステロ� ��ル測定部はpH7.7に調整することである。前� �親水性ポリマーの配合割合は、塗布溶液全� �に対し、例えば、0~40重量%の範囲であり、好 ましくは10~30重量%の範囲であり、その種類に より適宜調整できる。前記コレステロール測 定用酵素試薬、前記各種界面活性剤および前 記LDLコレステロール凝集剤は、前述の割合に なるように予め調整して前記溶媒に配合する 。

 前記繊維質構造体は特に制限されず、繊� ��の種類は測定に障害とならない材質であれ� ��よく、構成は編物あるいは不織布のいずれ� ��もよい。前記繊維としては、例えば、レー� ��ン、ナイロン、ポリエステル等の繊維が挙� ��られ、またこれらの複合繊維でもよい。

 前記塗布の方法としては、特に制限され� ��、例えば、刷毛等を用いる方法、スプレー� ��ート法、ロールコーターを用いる方法、デ� ��ッピング法等を用いることができる。

 前記試薬層2および3の厚みは、例えば、50 ~250μmの範囲であり、好ましくは80~200μmの範� �であり、より好ましくは100~150μmの範囲であ� ��。なお、前記試薬層2および3の厚みとは、� �布乾燥後の厚みではなく、塗布時の塗布厚� �である。前記試薬層2および3は、前記成分の 他に、必要に応じ、酸化防止剤等の添加剤を 含んでいてもよい。前記試薬層2および3を、� ��持体1の所定の位置に、貼着することにより 、本例の試験片を作製できる。なお、本発明 において、試験片の形状は、特に制限されな いが、例えば、板状もしくは短冊状である。 短冊状の場合の大きさは、例えば、全長50~150 mmの範囲で幅3~15mmの範囲、好ましくは、全長6 0~100mmの範囲で幅5~10mmの範囲である。

 本例の試験片は、例えば、次のようにし� ��使用する。なお、以下において、前記試薬� ��2が、非LDLコレステロール測定部であり、前 記試薬層3が、総コレステロール測定部であ� �。すなわち、まず、前記試薬層2および前記� ��薬層3の上から、血液等の検体を滴下する。 前記試薬層2において、滴下された検体は、� �記試薬層2に含まれる前記非LDLコレステロー� ��可溶化用界面活性剤および前記LDLコレステ� ��ール溶解阻止用界面活性剤の作用により、� ��LDLコレステロールのみが前記コレステロー� ��測定用酵素試薬と反応する。前記試薬層2に 、さらに、前記LDLコレステロール凝集剤が含 まれると、その作用が付加され、非LDLコレス テロールのみが、前記コレステロール測定用 酵素試薬とさらに効果的に反応する。一方、 前記試薬層3の場合、滴下された検体は、試� �層に含まれる前記コレステロール可溶化用� �面活性剤の作用により、全てのコレステロ� �ルが前記コレステロール測定用酵素試薬と� �応する。そして、前記試薬層2および前記試� ��層3にPODと前記酸化発色性基質が含まれてい る場合は、分光光度計や反射率計等の光学的 測定機器により、前記基質の発色を測定する 。血漿や血清の試料について発色を測定する 場合、前記支持体1が光透過性であれば、前� �支持体1側から光照射してもよいし、前記試� ��層2および前記試薬層3側から光照射しても� �く、光照射による透過率や反射率等を測定� �る。また、前記支持体1が光透過性でない場� ��は、前記試薬層2および前記試薬層3側から� �照射して反射率を測定する。なお、後述の� �うに、全血を試料とする場合には、赤血球� �着色による測光妨害の防止のため、前記検� �層と前記反応層との間に血球遮断層および� �反射層を設け、光透過性支持体を用い、こ� �前記支持体1側から測定することが好ましい� ��

 図2に、本発明の試験片のその他の例の断 面図を示す。本例の試験片では、支持体1の� �に、前記非LDLコレステロール測定部の試薬� �2と、前記総コレステロール測定部の試薬層3 が形成されており、前記両試薬層2および3は� ��同図に示すように、反応層4と検出層5を備� �ている。これ以外は、前述の図1に示す試験� ��と同様であり、使用方法も同様である。前� ��試薬層2において、前記反応層4は、前記非LD Lコレステロール可溶化用界面活性剤、前記LD L溶解阻止用界面活性剤および前記LDLコレス� �ロール凝集剤を含み、前記反応層5は、前記� ��レステロール測定用酵素試薬を含む。前記� ��薬層3において、前記反応層4は、前記コレ� �テロール可溶化用界面活性剤を含み、前記� �出層5は、前記コレステロール測定用酵素試� ��を含む。

 さらに、前記試薬層2において、前記反応 層4は、上層41および下層42に分かれ、前記上� ��41に、前記LDLコレステロール溶解阻止用界� �活性剤および前記LDLコレステロール凝集剤� �含有し、前記下層42に前記非LDLコレステロー ル可溶化用界面活性剤を含有していてもよい 。このようにすれば、試料は、まず、前記上 層41において、前記LDLコレステロール溶解阻� ��用界面活性剤および前記LDLコレステロール� ��集剤に接触し、その後、前記下層42に移動� �て前記非LDLコレステロール可溶化用界面活� �剤に接触した後に、前記検出層5において前� ��酵素試薬と接触する。このように試料の移� ��順に応じて反応層を上層と下層の二層に分� ��ることにより、さらにLDLコレステロールの� ��溶化を効果的に阻止することができ、非LDL� ��レステロールの測定精度が向上する。この� ��うな前記反応層4は、例えば、繊維質構造体 に、前記コレステロール測定用酵素試薬の溶 液を塗布して乾燥して前記検出層5を形成し� �後、この上に、前記非LDLコレステロール可� �化用界面活性剤と親水性ポリマーを溶媒に� �解した溶液を塗布して乾燥し、この上に、� �記LDLコレステロール溶解阻止用界面活性剤� �前記LDLコレステロール凝集剤および親水性� �リマーを溶媒に溶解した溶液を塗布して乾� �すれば形成できる。この場合の親水性ポリ� �ーおよび溶媒の種類や濃度等は、前述と同� �であり、塗布の方法も前述と同様である。� �た、二層構造の前記試薬層3は、前述の試薬� ��2の溶液を重層する方法に準じて、形成する ことができる。また、溶液を重層して多層構 造の試薬層を形成する方法の他に、複数の繊 維質構造体に、各試薬溶液を塗布して乾燥さ せ、これらを積層することによっても、多層 構造の試薬層を形成できる。

 図3に、本発明の試験片のさらにその他の 例の断面図を示す。本例の試験片では、支持 体を有さず、前記非LDLコレステロール測定部 の試薬層2と前記総コレステロール測定部の� �薬層3が、それぞれ異なる試験片として形成� ��れている。前記両試薬層2および3は、同図� �示すように、反応層4と検出層5を備えている 。前記試薬層2において、前述のように、前� �反応層4は、上層41および下層42に分かれ、前 記上層41に、前記LDLコレステロール溶解阻止� ��界面活性剤および前記LDLコレステロール凝� ��剤を含有し、前記下層42に前記非LDLコレス� �ロール可溶化用界面活性剤を含有していて� �よい。これ以外は、前述の図1に示す試験片� ��同様であり、使用方法も同様である。前記� ��薬層2において、前記反応層4は、前記非LDL� �レステロール可溶化用界面活性剤、前記LDL� �解阻止用界面活性剤および前記LDLコレステ� �ール凝集剤を含み、前記検出層5は、前記コ� ��ステロール測定用酵素試薬を含む。前記試� ��層3において、前記反応層4は、前記コレス� �ロール可溶化用界面活性剤を含み、前記検� �層5は、前記コレステロール測定用酵素試薬� ��含む。

 図4に、本発明の試験片のさらにその他の 例の断面図を示す。本例の試験片では、試料 適用面に対して試験片を垂直に半分に区切り 、半区画それぞれを前記非LDLコレステロール 測定部の試薬層2と前記総コレステロール測� �部の試薬層3としたものである。前記両試薬� ��2および3は、図に示すように、反応層4と検� ��層5を備えている。前記試薬層2において、� �述のように、前記反応層4は、上層41および� �層42に分かれ、前記上層41に、前記LDLコレス� ��ロール溶解阻止用界面活性剤および前記LDL� ��レステロール凝集剤を含有し、前記下層42� �前記非LDLコレステロール可溶化用界面活性� �を含有していてもよい。これ以外は、前述� �図1に示す試験片と同様であり、使用方法も� ��様である。前記試薬層2において、前記反応 層4は、前記非LDLコレステロール可溶化用界� �活性剤、前記LDL溶解阻止用界面活性剤およ� �前記LDLコレステロール凝集剤を含み、前記� �出層5は、前記コレステロール測定用酵素試� ��を含む。前記試薬層3において、前記反応層 4は、前記コレステロール可溶化用界面活性� �を含み、前記検出層5は、前記コレステロー� ��測定用酵素試薬を含む。

 図5(A)に、本発明の試験片のさらにその他 の例の断面図を示し、図5(B)に、その例の平� �図を示す。本例の試験片では、図4に示す試� ��片と同様に、境界面7により、試料適用面に 対して試験片を垂直に半分に区切り、半区画 それぞれを前記非LDLコレステロール測定部の 試薬層2と前記総コレステロール測定部の試� �層3としたものである。また、本例の試験片� ��外周縁は、外枠6の溝に嵌入した状態になっ ている。前記両試薬層2および3は、図4の試験 片と同様に、反応層と検出層を備えていても よい。前記試薬層2において、前述のように� �前記反応層は、上層および下層に分かれ、� �記上層に、前記LDLコレステロール溶解阻止� �界面活性剤および前記LDLコレステロール凝� �剤を含有し、前記下層に前記非LDLコレステ� �ール可溶化用界面活性剤を含有していても� �い。これ以外は、前述の図1に示す試験片と� ��様であり、使用方法も同様である。前記試� ��層2の前記検出層は、前記コレステロール測 定用酵素試薬を含む。前記試薬層3において� �前記反応層は、前記コレステロール可溶化� �界面活性剤を含み、前記検出層は、前記コ� �ステロール測定用酵素試薬を含んでいても� �い。

 さらに、本発明の試験片は、必要に応じ� ��前記試薬層の上に、血球分離層を形成して� ��よい。これは、血球をろ過できるような多� ��性部材と、場合により反射層を配置すれば� ��い。前記多孔性部材としては、例えばガラ� ��フィルターなどの公知の血球分離素材が使� ��できる。このように血球分離層を備えてい� ��ば、全血をそのまま供給するだけで、血漿� ��しくは血清中のLDLコレステロールを測定で� ��る。

 前述のように、本発明の測定方法は、液� ��の測定方法にも適用できる。前記液系の測� ��方法は、例えば、総コレステロール測定部� ��ある第1の反応容器と、非LDLコレステロール 測定部である第2の反応容器とを用いて実施� �きる。前記反応容器としては、特に限定さ� �ないが、例えば、キュベット、試験管等が� �げられる。

 前記液系の測定方法において、
前記(A)工程において、前記第1の反応容器が� �前記コレステロール測定用酵素試薬を有し� �
前記第2の反応容器が、前記コレステロール� �定用酵素試薬と、前記非LDLコレステロール� �溶化用界面活性剤と、前記LDLコレステロー� �溶解阻止用界面活性剤とを有し、
前記(B)工程において、前記コレステロール測 定用酵素試薬により前記総コレステロールを 測定し、
前記(C)工程において、前記非LDLコレステロー ル可溶化用界面活性剤および前記LDLコレステ ロール溶解阻止用界面活性剤の作用により、 前記コレステロール測定用酵素試薬により非 LDLコレステロールを選択的に測定するという 構成が好ましい。そして、前記第2の反応容� �が、さらに、前記LDLコレステロール凝集剤� �有するという構成が、より好ましい。前記� �系の測定方法において、前記コレステロー� �測定用酵素試薬、前記非LDLコレステロール� �溶化用界面活性剤、前記LDLコレステロール� �解阻止用界面活性剤および前記LDLコレステ� �ール凝集剤等の測定試薬としては、前述と� �様のものを使用できる。そして、測定手法� �しては、特に限定されないが、例えば、前� �酵素試薬を用いた際に生じる過酸化水素を� �電気化学的手法または化学的手法により測� �する手法等が挙げられる。なお、前記LDLコ� �ステロール凝集剤を用いる場合等、反応液� �濁りが生じて化学的測定法が適用できない� �合には、酵素電極等を用いた電気化学的測� �法を適用することが好ましい。