Ein klassisches Verfahren zur Herstellung von Pyruvat (das Salz der Brenztraubensäure) ist die Pyrolyse (d. h. das Brenzen) von Traubensäure. Dabei werden Schwerme- talle sowie Temperaturen von etwa 200°C benötigt (Römp Chemie Lexikon, 1995). Weiterhin sind folgende mikro- bielle Verfahren zur Pyruvat Synthese aus Lactat be- kannt : Produktion von Pyruvat aus Lactat mit permeabi- lisierten Zellen der methylotrophen Hefen Hansenula polymorpha oder Pichia pastors, die das Gen für die (S) -Hydroxysäure-Oxidase aus Spinat exprimieren (DiCosimo, R. ; Eisenberg, A. ; Seip, J. E. ; Gavagan J.

E. ; Payne, M. S. ; Anton D. L. (1997) : Pyruvic acid pro- duction using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Cat. B : Enzymatic Volume 2,223-232 ; US-Patent 5538875). Das bei der Lactat-Oxidation gebil- dete H202 wird durch endogene Katalase zu H2O und 02 um- gesetzt. Mit diesem Prozess konnte eine 1 M Lösung von Natrium-oder Ammonium-Lactat zu über 98% in Pyruvat umgesetzt werden. Daneben ist auch die Möglichkeit zur zellfreien oxidation von Lactat zu Pyruvat mit immobi- <BR> <BR> lisierter (S) -Hydroxysäure-Oxidase und Katalase bekannt (Burdick, B. A. ; Schaeffer, J. R. (1987) : Co-immobilized coupled enzyme systems on nylon mesh capable of gluco- nic and pyruvic acid production. Biotechnol. Lett. 9 : 253-258). Ein weiteres Verfahren stellt die Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit ruhenden, anaerob gezüchteten Zellen von Proteus mirabilis oder Proteus vulgaris dar (Simon, H. ; Schinschel, C. (1993) : Preparation of pyru- vate from (R) -lactate with Proteus species. J. Biotech- nol. 31 : 191-203). Mit diesem System konnte eine 0,65 M Lactat-Lösung in 1 h zu 94% in Pyruvat umgesetzt wer- den.

Alternativ zu Lactat wird Glucose als Substrat für die Pyruvatproduktion mittels Ganzzell-Biotransformation durch Hefen oder Bakterien eingesetzt, wobei Pyruvat primär durch die Reaktionen der Glycolyse gebildet wird. Es wurden beispielsweise Torulopsis glabrata Stämme mit einer multiplen Vitamin-Auxotrophie be- schrieben, die 1,17 Mol Pyruvat/Mol Glucose produzier- ten (Yonehara, T. ; Miyata, R. (1994) : Fermentative pro- duction of pyruvate from glucose by Torulopsis glabra- ta. J. Ferm. Bioeng. 78 : 155-159). Die mit diesen Stäm- men maximal erreichte Pyruvat-Konzentration bei Fed- Batch-Fermentationen betrug 67,8 g/L (0,77 M). Eine vergleichbare Methode zur Pyruvat-Produktion aus Gluco- se wurde auch für Liponsäure-auxotrophe Stämme von En- terobacter aerogenes (Yokota A. (1989) : Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 53 : 705-711) und Escheri- chia coli beschrieben (Yokota A. ; Shimizu, H. ; Terasawa Y. ; Takaoka, N. ; Tomita. F. (1994b) : Pyruvic acid pro- duction by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 : 638-643). Bei Anzucht auf Glucose unter Liponsäure-Mangelbedingungen produzierten die Enterobacter aerogenes Stämme maximal 0,8 Mol Pyruvat pro Mol Glucose, die Escherichia coli Stämme bis zu 1,2 Mol Pyruvat/Mol Glucose (Yokata A.

Shimizu, H. ; Terasawa Y. ; Takaoka, N. ; Tomita. F.

(1994a) : Pyruvic acid production by an Fl-ATPase- defective mutant of Escherichia coli W14851ip2. Biosci.

Biotechnol. Biochem. 58 : 2164-2167 ; Yokota, A. ; Henmi, M. ; Takaoka, N. ; Hayashi, C. ; Takezawa Y. ; Fukumori, Y. ; Tomita, F. (1997) : Enhancement of glucose metabo- lism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in Fl-ATPase activity. J. Ferm.

Bioeng. 83 : 132-138). Die Herstellung von Pyruvat durch Pyrolyse der Traubensäure hat den Nachteil, daß 1. für den Prozeß ein hoher Energieverbrauch (Siedepunkt der Traubensäure : ca. 200°C) anfällt sowie 2. Schwermetalle benötigt werden und 3. Traubensäure nur begrenzt zur Verfügung steht. Der Nachteil der mikrobiellen Herstel- lung von Pyruvat aus Lactat liegt darin, daß das Sub- strat zunächst produziert werden muß, z. B. mit Hilfe von Milchsäurebakterien aus Glukose. Bei den Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose ist der Nachteil, daß die erreichten Ausbeuten signifikant un- ter der maximal theoretisch erreichbaren Ausbeute lie- gen. Außerdem muss eine aufwendige Optimierung der Vi- tamin-Konzentrationen erfolgen (Li, Y. ; Chen, J. ; Lun, S. -Y. ; Rui, X. -S. (2001) Efficient pyruvate production by a multi-vitamin auxotroph of Torulopsis glabrata : key role and optimization of vitamin levels. Appl.

Microbiol. Biotechnol. 55 : 680-685). Von den Erfindern wurde bereits in der DE 101 29 711.4 ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat mit Hilfe eines Escherichia coli Stammes YYC202 entwickelt, welches un- ter geeigneten Versuchsbedingungen eine nahezu voll- ständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erlaubt (sol, 9 Mol Pyruvat/Mol Glucose).

Dieses Verfahren basiert auf einem Escherichia coli Stamm YYC202, der eine Deletion der Gene aceEF für die Proteine E1 und E2 der Pyruvat-Dehydrogenase besitzt sowie Mutationen in den Genen poxB für die Pyruvat- Oxidase, pflB für die Pyruvat-Formiatlyase und pps für die PEP-Synthetase. Die Pyruvat-Dehydrogenase ist ver- antwortlich für die Oxidation von Pyruvat zu Acetyl-CoA unter aeroben Bedingungen. Die Pyruvat-Formiat-Lyase katalysiert die Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA und Formiat unter anaeroben Bedingungen und wird bereits bei geringen Sauerstoff-Konzentrationen vollständig in- aktiviert. Die Pyruvat-Oxidase katalysiert die Oxidati- on von Pyruvat zu Acetat und überträgt die Elektronen dabei auf Ubichinon. Das Enzym wird verstärkt in der stationären Phase gebildet und seine Synthese ist ab- hängig von einem Sigma-Faktor S (RpoS). Die PEP-Syn- thetase katalysiert die Bildung von Phosphoenolpyruvat, AMP und PPi aus Pyruvat und ATP. Der Stamm YYC202 ist bei aerobem Wachstum in Glucose-Minimalmedim Acetat- auxotroph (Ace-). Dieser Ace--Phänotyp beruht darauf, dass vor allem durch das Fehlen der Pyruvat-Dehydro- genase keine Acetyl-Gruppen für Biosynthesen mehr be- reitgestellt werden können. E. coli-Mutanten, denen nur die Pyruvat-Dehydrogenase fehlt, zeigen einen ähnlichen Phänotyp, können allerdings nach 6-8 Tagen Inkubation auf Glucose-Minimalmedium-Platten Mikrokolonien bilden.

Verantwortlich für die geringe Acetat-Produktion, die die Bildung dieser Mikrokolonien ermöglicht, ist die Pyruvat-Oxidase. Inaktiviert man in einer Pyruvat- Dehydrogenase-Mutante zusätzlich das poxB-Gen, werden keine Mikrokolonien mehr gebildet. Der Stamm E. coli YYC202 bildete ebenfalls nach 6-8 Tagen keine Mikro- kolonien auf Glucose-Minimalmedium-Platten ohne Acetat.

Bei aerobem Wachstum in Minimalmedium mit Glucose und Acetat setzt E. coli YYC202 einen großen Teil der Glu- cose zu Pyruvat um (bis zu 1.7 Mol Pyruvat/Mol Glucose) und scheidet es ins Medium aus. Unter nicht wachsenden Bedingungen konnte mit E. coli YYC202 sogar 21. 9 Mol Pyruvat/Mol Glucose gebildet werden. Sowohl unter wach- senden wie auch unter nicht wachsenden Bedingungen wird das in der Glykolyse gebildete NADH durch die Atmungs- kette mit Sauerstoff als terminalem Elektronenakzeptor zu NAD+ reoxidiert. Unter anaeroben, gärenden Bedingun- gen ist dagegen eine Umsetzung von Glucose zu Pyruvat aufgrund der fehlenden Möglichkeit zur Reoxidation von NADH nicht möglich.

Durch Transformation von E. coli YYC202 mit dem Plasmid pGS87 (erhalten von J. R. Guest, University of Shef- field, Great Britain), das die Gene aceEF und lpd (ko- dierend für die 3. Untereinheit der Pyruvat- Dehydrogenase) von E. coli trägt, konnte die Acetat- Auxotrophie aufgehoben werden und der Stamm produzierte kein Pyruvat mehr. Dies bestätigt, dass insbesondere die Deletion der Gene aceE und aceF für die Pyruvat- Bildung durch E. coli YYC202 verantwortlich ist.

Alle bisher beschriebenen Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose mit Ausnahme von DE 101 297 11.4 basieren auf Vitamin-auxotrophen, ins- besondere Thiamin-auxotrophen Stämmen, z. B. von Toru- lopsis glabrata oder von E. coli. Dabei wird die Akti- vität der Pyruvat-umsetzenden Enzyme, z. B. der Pyru- vat-Decarboxylase oder der Pyruvat-Dehydrogenase, durch die Verfügbarkeit der Vitamine kontrolliert. Im Gegen- satz dazu besitzt der Stamm E. coli YYC202 gemäß DE 101 297 11.4 keine Vitamin-Auxotrophien und benötigt ausschließlich Acetat als Supplement zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium.

Aus US 5,869, 301 ist bekannt, daß die E. coli Mutante AFP-111 mit einem Defekt in den Genen, die für die Py- ruvat-Formiat Lyase und die Lactat Dehydrogenase codie- ren, sowie einer weiteren, unbekannten Mutation, in verstärktem Maße unter anaeroben Bedingungen Malat, Fu- marat und Succinat bildet, nicht aber Pyruvat. Es wird in US 5,869, 301 allgemein darauf hingewiesen, daß Maß- nahmen, die zum Ausschalten von Enzymsystemen des Pyru- vatabbaus führen, theoretisch auch eine Anreicherung des Pyruvats verursachen. Ein Hinweis, welche Enzyme speziell ausgeschaltet werden müssen, um gezielt eine Steigerung der Pyruvatproduktion zu erzielen, wird je- doch nicht offenbart. Insbesondere wird aber nicht be- rücksichtigt, dass eine kontinuierliche Pyruvat-Bildung aus Glucose unter anaeroben, gärenden Bedingungen nicht möglich ist, da die Reoxidation des in der Glykolyse gebildeten NADH nur unter Umsetzung von Pyruvat zu an- deren, reduzierteren Verbindungen, wie z. B. Lactat möglich ist.

Wie in DE 101 297 11.4 beschrieben, konnte durch Aus- schaltung Pyruvat abbauender Enzyme eine nahezu voll- ständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erreicht wer- den (21, 9 Mol Pyruvat/Mol Glucose). Bei aerober Kulti- vierung von E. coli YYC202 in Gegenwart hoher Glucose- Konzentrationen wurde neben Pyruvat jedoch auch Lactat gebildet. Dies reduziert die Ausbeute an Pyruvat und erschwert zusätzlich dessen Aufreinigung.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, welches die oben genannten Nachteile nicht mehr aufweist.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf- gabe erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin gelöst, ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 12, mit den im kennzeichnenden Teil des An- spruchs 12 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe, ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 13, gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 13 angegebenen Merkmalen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und den erfindungs- gemäßen Mikroorganismen ist es nunmehr möglich, gegen- über herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pyruvat zu produzieren. Die Erfinder fanden überra- schenderweise heraus, daß bei Verwendung von Mikroorga- nismen, in denen die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phos- phoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase in- aktiviert sind oder eine verringerte Aktivität aufwei- sen, das zusätzliche Ausschalten der Enzymaktivität der NAD+-abhängigen D-Lactat-Dehydrogenase zu einer weite- ren Steigerung der Pyruvatproduktion führt. Diese D-Lactat-Dehydrogenase wird im folgenden auch unter der Bezeichnung LDH zusammengefaßt. Der im folgenden ver- wendete Begriff"Ausschalten"beinhaltet die völlige Hemmung der Synthese von LDH bzw. die Inaktivierung des für die D-Lactat-Dehydrogenase kodierenden Gens oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der genannten Enzyme.

Die für die LDH kodierende Gensequenz ist aus der Lite- ratur bereits bekannt (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli.

Microbiology 143 : 187-195. ). Dieses Gen wird im folgen- den unter der Bezeichnung"ldhA-Gensequenz"zusammenge- faßt. Mit Hilfe gerichteter rekombinanter DNA-Techiken können für eine LDH codierende Nukleotidsequenzen ent- fernt oder in ihrer Expression reduziert werden. Mit Hilfe dieser Methoden kann zum Beispiel die für die LDH kodierende ldhA-Gensequenz im Chromosom deletiert wer- den. Geeignete Methoden dazu sind dem Fachmann z. B. aus Link A. J., Philips D., Church G. M. (1997) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-Type Escherichia coli : application to open reading frame charaterization. J. Bacteriol. 179 : 6228-6237, oder auch aus Datsenko K. A., Wanner W. L.

(2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 97 : 6640-6645, bekannt. Auch können nur Teile der ldhA-Gensequenz deletiert werden, oder auch mutierte Fragmente der ldhA-Gensequenz ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so ein Ver- lust oder eine Reduktion der LDH-Aktivität erreicht.

Durch Transduktion mit dem Phagen P1 konnte das intakte ldhA-Gen von E. coli YYC202 durch ein defektes ldhA-Gen aus dem Stamm E. coli NZN117 (erhalten von D. P. Clark, Dep. of Microbiology, Southern Illinois University, Carbondale, USA) ersetzt werden. Die entsprechenden Protokolle sind für E. coli gut etabliert (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.). Durch Inaktivierung des ldhA-Gens wird ein völliger Verlust der LDH-Aktivität erreicht.

Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der Esche- richia coli Stamm YYC2021dhA, hinterlegt am 12.03. 2002 unter der Bezeichnung DSM 14863, der eine Insertion in der ldhA-Gensequenz trägt.

Eine weitere Möglichkeit die Aktivität der LDH abzu- schwächen oder auszuschalten sind Mutageneseverfahren.

Hierzu gehören ungerichtete Verfahren, die chemische Reagenzien wie z. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder auch UV-Bestrahlung zur Mutagenese benutzen. Ver- fahren zur Mutationsauslösung und Mutantensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Ma- nual and Handbook for Escherichia coli and Related Bac- teria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch"Manual of Methods for General Bacteriolo- gy"der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden.

Darüber hinaus kann auch die Expression der IdhA-Gen- sequenz reduziert werden. So kann die Promoter-und Re- gulationsregion, die sich stromaufwärts des Struktur- gens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionsregulationskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch regulierbare Pro- motoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen Pyruvatproduktion zu redu- zieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabili- tät der m-RNA reduziert wird. Des weiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym mit geringer Aktivität kodieren. Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression der ldhA-Gensequenz durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Die LDH katalysiert die Reduktion von Pyruvat zu Lactat mit NADH als Coenzym und wird durch Pyruvat alloste- risch aktiviert (Tarmy, E. M. and Kaplan, N. O. (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in confor- mation. J. Biol. Chem. 243 : 2587-2596). Der apparente Km-Wert für Pyruvat liegt je nach pH-Wert zwischen 4.4 mM (pH 6.7) und 7.2 mM (pH 7.5) (Tarmy, E. M. and Kap- lan, N. O. (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate- controlled change in conformation. J. Biol. Chem. 243 : 2587-2596. ). Diese Konzentrationen werden in E. coli- Wildtyp-Stämmen unter aeroben Bedingungen normalerweise nicht erreicht. Die Expression des ldhA-Gens wird unter anaeroben Bedingungen durch einen niedrigen pH-Wert in- duziert, unter aeroben Bedingungen gibt es eine pH-un- abhängige Expression (Jiang, G. R., Nikolova, S. and Clark D. P. (2001) Regulation of the ldhA gene, encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 147 : 2437-2446. ). Pyruvat stimuliert die Expression des ldhA-Gens 2-bis 4-fach (Jiang et al. 2001). Die signifikante Bildung von Lactat bei Kul- tivierung von E. coli YYC202 mit hohen Glucose- Konzentrationen kann wie folgt erklärt werden : Durch die Blockade des Pyruvat-Abbaus kommt es zu einer Akku- mulation von Pyruvat, die einerseits eine verstärkte Expression des ldhA-Gens bewirkt und andererseits die Aktivität des Enzyms stimuliert. Eine signifikante Lac- tat Bildung wird in Schüttelkolben-Ansätzen ab einer Glucose-Konzentration von 50 mM beobachtet, während sie bei Fermentationen bereits ab Glucose-Konzentrationen von ca. 5 mM beobachtet wird. Um die Lactat-Bildung zu unterbinden, wurde in der vorliegenden Erfindung bei- spielsweise ein Derivat des Stammes Escherichia coli YYC202 konstruiert, bei dem das ldhA-Gen durch Inserti- on eines Kanamycin-Resistenzgens in den offenen Lese- rahmen der ldhA-Gensequenz inaktiviert wurde.

Escherichia coli YYC202 ist in der Literatur hinsicht- lich seiner genetischen Eigenschaften beschrieben (Chang, Y-Y. ; Cronan, J. E. (1982) : Mapping nonselec- table genes of Escherichia coli by using transposon TnlO : location of a gene affecting pyruvate oxidase. J.

Bacteriol. 151 : 1279-1289 ; Chang, Y-Y. ; Cronan, J. E.

(1983) : Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 169 (5) : 756-762 ; Georgiou, D. Ch. ; Fang, H. ; Gennis, R. B.

(1987) : Identification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrom d terminal oxidase complex in Escherichia coli. J. Bacte- riol. 169 : 2107-2112). Für das Verfahren geeignet sind Bakterien und Hefen, insbesondere gram-negative Bakte- rien, bevorzugt aus der Familie der Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia coli. Als besonders geeignet hat sich der Stamm Escherichia coli YYC2021dhA, hinterlegt am 12.03. 2002 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorga- nismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der DSM-Nummer 14863, erwiesen, der wie in oben beschriebener Weise verändert wurde.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte die Bildung von Lactat als Stoffwechselendprodukt verhindert und durch Ausschalten der Enzyme Pyruvat-Dehydrogenase, Py- ruvat-Oxidase, und Phosphoenolpyruvat-Synthetase und zusätzlichem Ausschalten der LDH die Umsetzung hoher Glucose-Konzen-trationen in Pyruvat signifikant verbes- sert werden. Die Mikroorganismen, die bei dem erfin- dungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können Pyruvat beispielsweise aus Kohlenhydraten wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stär- ke, Cellulose, oder aus Alkoholen wie z. B. Glycerin herstellen. Diese Stoffe können einzeln oder als Mi- schung verwendet werden.

Als Kultivierungsmethoden können kontinuierliche oder diskontinuierliche im batch-Verfahren (Satzkultivie- rung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pyruvat-Produktion durchgeführt werden.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der Mikroorganismen genügen. Die Fermen- tationen werden aerob durchgeführt.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprü- chen angegeben.

Die Figuren zeigen eine Übersicht des Pyruvat-Stoff- wechselweges sowie experimentelle Ergebnisse des erfin- dungsgemäßen Verfahrens.

Es zeigt : Fig. 1 : Schema der Umsetzung von Glucose in Pyruvat in E. coli YYC2021dhA. Nach Aufnahme von Glucose durch das Phosphoenolpyruvat-abhängige Phosphotransferase-System (PTS) wird Glucose-6-phosphat in den Reaktionen der Glykolyse zu Pyruvat umgesetzt. Aufgrund der geneti- schen Defekte in den Genen aceEF, pflB, poxB, und ldhA kann Pyruvat nicht weiter umgesetzt werden und wird ins Medium ausgeschieden.

Fig. 2 : Southern-Blot-Analyse (Southern, E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98 : 503-517. ) von E. coli YYC2021dhA.

Die Spuren 1, 5 und 6 enthalten je 75 ng Digoxigenin- markierten DNA-Standard. Die Spuren 2 und 7 enthalten chromosomale DNA von E. coli YYC202, die Spuren 3 und 8 chromosomale DNA von E. coli YYC202 ldhA und die Spuren 4 und 9 chromosomale DNA von E. coli NZN117. Es wurden jeweils 15 yg chromosomale DNA, die mit EcoRI und Hin- dIII verdaut worden war, pro Spur aufgetrennt. Der Blot mit den Spuren 1-5 wurde mit einem Digoxigenin- markierten 2153-bp DNA-Fragment mit dem E. coli ldhA- Gen hybridisiert, der Blot mit den Spuren 6-10 mit ei- nem Digoxigenin-markierten 668-bp Fragment mit dem Ka- namycin-Resistenzgen aus E. coli NZN117. Die DNA- Fragmente wurden auf einem 1%-igen Agarose-Gel aufge- trennt und nach Denaturierung auf eine Nylon-Membran geblottet. Die Markierung der Sonden mit Digoxigenin, Hybridisierung, Waschen und Detektion der Sonden mit CDP-Star erfolgten mit dem DIG-Chemlink-Labeling-and- Detektion-Kit (Roche Diagnostics) entsprechend den An- weisungen des Herstellers. Wie erwartet, wurde mit der ldhA-Sonde in E. coli YYC202 ein 11 kb EcoRI-HindIII- Fragment detektiert, in E. coli YYC202 ldhA und E. coli NZN117 dagegen Fragmente von 6.2 kb und 6.8 kb. Mit der kan-Sonde wurde erwartungsgemäss kein Signal in E. coli YYC202 detektiert, in YYC202 ldhA und NZN117 dagegen wiederum Fragmente von 6.2 kb und 6.8 kb.

Fig. 3 : Umsetzung von Glucose (u) zu Pyruvat (A) und ggf. Lactat (g) durch Zellsuspensionen von E. coli YYC202 (A) und E. coli YYC2021dhA (B).

Die Abszisse X gibt die Zeit in Stunden an und die Or- dinate Y die Konzentration von Glucose, Pyruvat, bzw.

Lactat in mM.

Die Zellen wurden in M9-Minimalmedium mit Glucose und Acetat vorkultiviert, dann mit 0.9%-iger NaCl-Lösung gewaschen und anschließend zu einer OD600 von 7.4 (YYC202) bzw. 3.1 (YYC202 ldhA) in 500 mM MOPS-Puffer pH 7.0 mit 100 mM bzw. 88 mM Glucose resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in Schüttelkolben bei 37 °C und 140 Upm inkubiert. Die Glucose-Konzentration wurde in einem gekoppelten enzymatischen Test mit Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bestimmt (Bergmeyer, H. U. (1984) Methods of enzymatic analysis, 3rd edition.

Vol. VI : Metabolites 1 : Carbohydrates, Seiten 163-172.

Verlag Chemie, Weinheim. ). Pyruvat und Lactat wurden durch HPLC-Analyse mit einer Aminex HPX-87H-Säule (Bio- Rad) und UV-Detektion bei 215 nm bestimmt.

Fig. 4 : Fed-batch-Fermentation von E. coli YYC202 und E. coli YYC2021dhA.

Die Abszisse X gibt die Fermentationszeit in Stunden an und die Ordinate Y in A die optische Dichte OD600 bzw. in B die Konzentration von Pyruvat bzw. Lactat in mM.

Die Stämme wurden in einem 7.5 1-Laborfermenter unter aeroben Bedingungen (p02 >40% Sättigung) bei 37°C und konstant pH 7 (pH-Regulation) in einem synthetischen Medium kultiviert. Die Glucose-Konzentration wurde mit Hilfe eines On-line General Analyzer"konstant bei etwa 5 mM gehalten. Die Acetat-Zufütterung erfolgte im Überschuss, wobei zur Regulation die C02-Konzentration im Abgas eingesetzt wurde. In A ist das Wachstum von E. coli YYC202 (-) und E. coli YYC202 ldhA () darge- stellt. In B wird die Pyruvat-Bildung durch E. coli YYC202 () und E. coli YYC202 ldhA (u) sowie die Lac- tatbildung durch E. coli YYC202 (O) und E. coli YYC202 ldhA (z) dargestellt.

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrie- ben werden.

Durch Verwendung von Mikroorganismen, deren Aktivität der LDH verringert bzw. komplett inaktiviert wurde, konnte bei Umsetzung hoher Glucose-Konzentrationen ei- nem gegenüber z. B. aus DE 101 29 711.4 bekannten Ver- fahren, erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden. Mit ruhenden Zellen konnte die Ausbeute an Pyruvat bei Um- setzung von 100 mM Glucose um 20% gesteigert werden.

Bei Fermenationen im fed-batch-Verfahren konnte die nach 37 h erreichte Pyruvat-Konzentration um 40% ge- steigert werden. Als Mikroorganismen können sowohl He- fen als auch Bakterien eingesetzt werden. Mikroorganis- men aus der Familie der Enterobacteriaceae, insbesonde- re aus der Gattung Escherichia haben sich als besonders geeignet erwiesen. Dabei hat sich insbesondere der Or- ganismus Escherichia coli YYC202 als sehr geeignet er- wiesen. Dieser Bakterienstamm weist gegenüber dem Wild- typstamm (WT) einige genetische Veränderungen auf. So ist z. B. aus DE 101 29 711.4 bekannt, dass folgende Gensequenzen verändert wurden : aceEF-kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 der Pyruvat-Dehydrogenase, poxB-kodierend für die Pyruvat-Oxidase ; pps-kodie- rend für die Phosphoenolpyruvat-Synthetase ; pflB-ko- dierend für die Pyruvat-Formiat-Lyase. In überraschen- der Weise erzielte das zusätzliche Ausschalten der LDH in Form von z. B. einer Insertion eines Resistenzgens in den offenen Leserahmen der IdhA-Gensequenz, wie für Escherichia coli YYC2021dhA beschrieben, eine weitere deutliche Steigerung der Pyruvatproduktion. Das Aus- schalten der Gensequenzen kodierend für die Pyruvat- Dehydrogenase, die Pyruvat-Oxidase die Phosphoenolpyru- vat-Synthetase sowie die LDH, wird für eine verbesserte Pyruvatproduktion als besonders vorteilhaft angesehen.

Mit ruhenden Zellen konnte eine Umsetzung des Substra- tes in Pyruvat erreicht werden, die erheblich über den mit bisher bekannten Verfahren erzielten Ausbeuten lag.

Auf Grund des Genotyps sind die Organismen nicht in der Lage, Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat oder Phosphoenol- pyruvat umzusetzen. Diese Acetat-Auxotrophie erlaubt es, Wachstum und Produktbildung durch die Dosierung des essentiellen Co-Substrats Acetat zu regulieren. Dabei konnte in DE 101 29 711.4 gezeigt werden, dass die Ace- tat-Verbrauchsrate identisch ist mit der C02-Bildungs- rate. Über diese Korrelation lässt sich anhand der on- line-messbaren CO2-Konzentration im Abgas die Acetat- Verbrauchsrate bestimmen und regulieren. In Anwesenheit von Acetat und weiterer Nährstoffe wie z. B. Stickstoff im Fermentationsmedium kann stoffwechselbedingt Zell- teilung/Wachstum stattfinden. Da bei Wachstum aber auch ein Teil der Kohlenstoffquelle zur Biosynthese neuen Zellmaterials eingesetzt wird, ist eine maximale Pyru- vat-Ausbeute mit wachsenden Zellen nicht zu erwarten.

Dies ist mit Zellen möglich, die auf Grund der Medien- bedingungen keine Biosynthese zum Zweck der Bildung neuen Zellmaterials betreiben, d. h."ruhende"Zellen.

Diese Zellen werden durch Kultivierung in einem Medium erhalten, im dem eine hohe Zellkonzentration gebildet werden kann. Danach werden die Zellen z. B. durch Zentrifugation geerntet und in ein Medium gegeben, wel- ches kein Acetat und keine weiteren für Wachstum erfor- derlichen Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff enthält. Un- ter diesen Bedingungen kann eine noch höhere Pyruva- tausbeute erreicht werden. Als Kohlenstoffquellen eig- nen sich Kohlenhydrate, insbesondere Hexosen, sowie Alkohole. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu gewährleisten werden Substrate bevorzugt, die als Ab- fallstoffe anfallen bzw. direkt verfügbar sind, d. h. nicht in besonderer Weise zur weiteren Verarbeitung für das erfindungsgemäße Verfahren vorbehandelt oder produ- ziert werden müssen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin beispielsweise markiertes Pyruvat in hohen Ausbeuten hergestellt werden, indem z. B. 13C-markierte Kohlen- stoffquellen eingesetzt werden. Die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens wird durch die hohen Produktausbeuten erheblich verbessert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich zusätzlich positiv auf die Produktion weite- rer vom Pyruvat abgeleiteter Stoffwechselprodukte aus- wirken. So kann z. B. durch das Einbringen eines Gens für die L-Alanin-Dehydrogenase und in Gegenwart hoher Ammonium-Konzentrationen unter anaeroben Bedingungen eine Homoalanin-Gärung etabliert werden, bei der 1 Mol Glucose und 2 Mol Ammonium zu 2 Mol L-Alanin umgesetzt wird.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

1. Konstruktion eines Derivats von E. coli YYC202 mit defektem ldhA-Gen Zur Inaktivierung des ldhA-Gens wurde das offene Le- seraster durch ein Kanamycin-Resistenzgen unterbrochen.

Die entsprechende Mutation wurde durch Pl-Transduktion (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Expe- riments with gene fusions. Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, New York.) aus dem Donorstamm E. coli NZN117 (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermenta- tive lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Micro- biology 143 : 187-195. ) in E. coli YYC202 transferiert.

Die erfolgreiche Transduktion wurde durch Southern- Blot-Analyse bestätigt (Fig. 2). Die Lactat-Dehydro- genase-Aktivität (LDH-Aktivität) im Ausgangsstamm YYC202 und im Derivat YYC2021dhA wurde nach 6-stündiger Kultivierung in LB-Medium mit 0.4 % (w/v) Glucose be- stimmt. Dazu wurden zellfreie Extrakte hergestellt, die Membranfraktion durch Ultrazentrifugation entfernt und die lösliche Fraktion in einen Enzymtest eingesetzt, bei dem die pyruvatabhängige Oxidation von NADH zu NAD+ spektrophotometrisch anhand der Abnahme der Extinktion bei 340 nm gemessen wurde (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143 : 187-195). E. coli YYC202 besaß eine hohe Lactat-Dehydrogenase-Aktivität von 3.1 Umol min-1 mg Protein-1, während E. coli YYC2021dhA eine Ak- tivität von <0.01 ymol min~l mg Protein~l zeigte.

2. Glucose-Umsetzung durch ruhende Zellen von E. coli YYC202 und E. coli YYC2021dhA Die Stämme E. coli YYC202 und E. coli YYC2021dhA wurden in Minimalmedium mit Glucose und Acetat vorkultiviert.

Anschließend wurden die Zellen gewaschen, in einem Puf- fer (500 mM MOPS, pH 7.0) mit circa 100 mM Glucose re- suspendiert, und in Schüttelkolben bei 37 °C und 140 Upm inkubiert. Wie in Fig. 3A dargestellt, wurde die Glucose im Stamm YYC202 anfänglich mit annähernd glei- cher Rate zu Pyruvat und Lactat umgesetzt. Nach dem Verbrauch der Glucose wurde das gebildete Lactat lang- sam zu Pyruvat reoxidiert. Im Stamm YYC202 ldhA wurde dagegen die Glucose mit konstanter Rate zu Pyruvat um- gesetzt, aber kein Lactat gebildet (Fig. 3B).

3. Wachstum und Produktbildung bei fed-batch-Kultivie- rung von E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA in Glucose-Minimalmedium Für die fed-batch-Fermentation wurden die Stämme in einem 7.5 1-Laborfermenter unter aeroben Bedingungen (p02 >40% Sättigung) bei 37°C und pH 7 (geregelt) in einem synthetischen Medium kultiviert (pro Liter 1.5 g NaH2P04 x H2O ; 3.25 g KH2PO4 ; 2.5 g K2HPO4 ; 0.2 g NH4Cl ; 2 g (NH4) SO4 ; 0. 5 g MgS04 ; 10 mg CaCl2 x 2HzO ; 0. 5 mg ZnSO4 x 7H2O 1-1 ; 0.25 mg CuCl2 x 2H20 ; 2.5 mg MnS04 x H20 ; 1.75 mg CoCl2 x 6H20 ; 1.25 mg H3BO3 ; 2.5 mg A1C13 x 6H20 ; 0.5 mg Na2MoO4 x 2H : 20 ; 10 mg FeS04). Die Glucose- Konzentration wurde mit Hilfe eines"On-line General Analyzer"konstant bei etwa 5 mM gehalten. Die Acetat- Zufütterung erfolgte im Überschuss, wobei zur Regulati- on die CO2-Konzentration im Abgas eingesetzt wurde. Es war zuvor gezeigt worden, dass die Acetat-Verbrauchs- rate gleich der CO2-Bildungsrate ist (Deutsche Patent- Anmeldung 101 29 711.4). Bei den in Fig. 4A und 4B dar- gestellten Experimenten zeigten beide Stämme annähernd gleiches Wachstumsverhalten, unterschieden sich aber deutlich hinsichtlich Pyruvat-und Lactat-Bildung. Der Ausgangsstamm YYC202 hatte nach 37 h 487 mM Pyruvat und 341 mM Lactat gebildet, während der Stamm YYC2021dhA nach 37 h 673 mM Pyruvat, aber kein Lactat gebildet hatte.

4. Kontrollexperiment mit E. coli NZN117 Um auszuschließen, dass die ldhA-Mutation im Stamm E. coli YYC202-ldhA für die Pyruvat-Bildung verantwortlich ist, wurde der Donorstamm E. coli NZN117 (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143 : 187-195. ) in Mini- malmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat bei 37 °C und 140 Upm inkubiert. Zu keinem Zeitpunkt während des Wachstums und in der stationären Phase konnte Pyruvat im Kulturüberstand detektiert werden. Dies zeigt, dass eine ldhA-Mutation unter den genannten Bedingungen nicht zur Exkretion von Pyruvat führt. In E. coli YYC2021dhA ist dafür vielmehr die Deletion der aceEF- Gene für zwei Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase sowie die Inaktivierung des Gens poxB für die Pyruvat- Oxidase verantwortlich.