Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Veränderung der Proteinstruktur von Prionen PrpSC oder infektiösen PrPSC- Ketten in tierischen, zum Verzehr oder zur Weiterverarbeitung vorgesehenen Rohprodukten, insbesondere Fleisch, Unterhäute, Bindegewebe, Hirn und Knochen und/oder zur Sterilisation von Schlachthausgerätschaften, Operationsbestecken oder dergleichen mit infektiösen PrpSC kontaminierten Gegenständen, gemä# Ober- begriff des Patentanspruchs 1.

Es hat sich durch umfangreiche Untersuchungen gezeigt, daß die Erreger von Scrapie und BSE außerordentlich resistent gegen physikalische und chemische Einflüsse sind. Prionen sind keine Krankheitserreger im klassischen Sinne. Sie unterscheiden sich wesentlich von Bakterien oder Viren. Hitze von 100 Grad Celsius, Chemikalien oder viele Desinfektionsmittel können Ihnen nichts anhaben. Prionen sind auch die Erreger weiterer Krankheiten bei Tieren, wie der Traberkrankheit (Scrapie) bei Schafen, und Menschen, wie dem sehr seltenen Gerstmann- Sträussler-Syndrom. Man nimmt an, dass die Erkrankung vom Tier auf den Menschen übertragen werden kann.

Aus. neuen Untersuchungen über die Strukturen des Prionproteins wurden Kenntnisse über die Entstehung von CJD, GSS, BSE, Scrapie und CWD gewonnen. Nach diesen Kenntnissen geht krank- heitsdeterminierend das Prion-Protein in eine geänderte dreidi- mensionale Faltung über, wobei dieses umgefaltete Protein PrpSC der krankheitsauslösende Faktor ist. Kommt nun ein natürliches Prion PrPC in Kontakt mit einem entarteten, gefalteten Protein, verändert es seine Form und regt weitere Prionen zur Umfaltung an. Auf der Oberfläche der Zelle häufen sich dann die infizier- ten Prionen an und die Nervenzelle stirbt ab.

Zur Bedeutung der BSE-Problematik allein in. Deutschland sei auf folgende Fakten verwiesen.

Nach vorliegenden amtlichen Berechnungen wurden im Jahr 2000 in Deutschland über 3,8 Millionen Rinder mit einem durchschnitt- lichen Schlachtgewicht von 323kg und über 410.000 Kälber mit einem durchschnittlichen Schlachtgewicht von 125kg geschlach- tet. Unter den geschlachteten Rindern waren über 630.000 Färsen mit einem durchschnittlichen Schlachtgewicht von 287kg, 1,5 Millionen Kühe mit einem durchschnittlichen Schlachtgewicht von 297 kg und 1,6 Millionen Bullen mit einem durchschnittli- chen Schlachtgewicht von etwa 361kg. Weiterhin wurden allein im Jahr 2000 in Deutschland mindestens 42.000 Ochsen im Alter von 2 bis 3 Jahren geschlachtet. Mit Ausnahme von etwa 20.000 Zuchtbullen und etwas mehr als der Hälfte der geschlachteten Kälber werden fast alle männlichen Rinder als Jungbullen im Alter von 18 bis 24 Monaten geschlachtet. Bei den Kälbern muß man im allgemeinen noch nicht mit relevanten Mengen von Infek- tiosität rechnen. Bei den 18 bis 24 Monaten alten Jungbullen und den selten älteren Färsen ist selbst im Fall einer BSE- Infektion zumindest das Zentralnervengewebe sehr wenig infek- tiös. Hochinfektiös sind hingegen Hirn und Rückenmark von BSE- infizierten Kühen und Bullen. In der relevanten Altersklasse werden also in Deutschland jährlich etwa 1,566 Millionen Kühe, Ochsen und Bullen geschlachtet.

Bis zum 11.2.2001 wurden rund 209.000 BSE-Tests nach dem Fleischhygienerecht durchgeführt. Zu diesen Tests kommen noch die BSE-Tests bei gefallenen und notgeschlachteten Tieren hinzu. Bei bisher 17 (Stand 28.02.2001) bestätigten BSE-Fällen bei im normalem Schlachthof oder beim Metzger geschlachteten Rindern muß etwa ungefähr mit 1 hochinfektiösen Rind pro 249.000/17 = 14.647 normal geschlachteten Tieren gerechnet werden. Hochgerechnet auf die jährlichen Schlachtzahlen sind dies ungefähr 100, das Abwasser deutscher Schlachthöfe bela- stende Rinder. Weil bis ins Jahr 2000 Schlachtabfallprodukte einer zunehmenden Anzahl BSE-infizierter Rinder an Rinder und insbesondere Kälber verfüttert wurden, wird der Anteil der infizierten Tiere in den kommenden Jahren wahrscheinlich noch deutlich zunehmen.

Allein in den Schlachthöfen werden durch den Bolzenschuß, das Absetzen und Reinigen der Köpfe und das Aufsägen der Wirbel- säulen pro Rind etwa 10g Hirn und Rückenmark aus dem Schlacht- körper gepreßt oder gerissen. Dieser feine Gewebebrei wird mit Wasser von den Schlachtkörpern und Köpfen gespült und gelangt ins Abwasser. Bei 100 geschlachteten BSE-Rindern wären das 1000g hochinfektiöses Zentralnervengewebe, welches bei Aufnahme über die Nahrung jährlich etwa 5000 Rinder tödlich infizieren könnte. Diese recht große Ausgangsmenge infektiösen Gewebebreis gelangt unsterilisiert in die Kanalisation und aufgrund der hohen Fließgeschwindigkeiten größtenteils in die Kläranlagen.

Würde man davon ausgehen, daß der Klärschlamm auf Rinderweiden zu verteilen ist, dann müßte mit einer noch erheblicheren Gefährdung der Rinder gerechnet werden, weil diese mit dem Gras auch täglich etwa 5kg Erde aufnehmen. Experimente haben gezeigt, daß der vollständige Abbau der Infektiosität im Boden einige bis viele Jahre dauern kann. Daher muß man damit rechnen, daß die Infektiosität teilweise in humusbildende Strukturen fest eingebunden und darin sehr stabil gelagert wer- den kann. Auf jeden Fall kann es während der Zeit des langsamen Abbaus, beispielsweise durch Bodenbakterien, dazu kommen, daß die Prionen über die Nahrungsketten des Bodens von der Aufnahme durch Kleinstlebewesen bis in kleine Säugetiere gelangen, die dann infiziert werden könnten.

Aus den vorgenannten Darlegungen ergibt sich die klare Relevanz dafür, daß medizinische Geräte und tierische Rohstoffe für Nah- rungsmittel, Medikamente und Kosmetika so zu sterilisieren sind, daß auch infektiöse Prionproteine inaktiviert werden.

Eine Inaktivierung ist nur dann dauerhaft wirksam, wenn sie wirklich vollständig war, wie experimentelle Untersuchungen zeigten.

Aus der Lebensmitteltechnologie ist seit Anfang der 80er Jahre die Hochdruckbehandlung für Nahrungsmittel bekannt, einerseits um diese zu entkeimen und andererseits um Effekte zu erzielen, die wie bei der Nahrungszubereitung durch Kochen mit hoher Tem- peratur erreicht werden. Hierbei kommt es zu einer Denaturie- rung von Eiweiß, zur Inaktivierung von Enzymen und zur Gelati-

nierung der Stärke neben der Abtötung von Mikroorganismen.

Durch die Hochdruckbehandlung werden große Moleküle beeinflußt, während kleinere, wie Aminosäuren, Vitamine oder Geschmacks- stoffe erhalten bleiben.

Die Hochdruckbehandlung selbst stellt einen nichtthermischen Prozeß dar, der mit hydrostatischen Drücken im Bereich von meh- reren 1000 bar arbeitet. Nach der Behandlung finden elastische Produkte beim Entspannen wieder in ihre ursprüngliche Form und Größe zurück. Bekannt ist es, in flexible Folien verpackte Lebensmittel in Chargiergestelle oder-körper einzulegen, die dann in eine mit Wasser als Druckträger gefüllten Behälter ein- geführt werden. Der Druckbehälter wird nach dem Beladen ge- schlossen und der Druck aufgebaut, indem ein Kolben in den Druckbehälter eingefahren wird, bis der voreingestellte Druck erreicht ist. Grundsätzlich gilt, daß der Druck der wichtigste Parameter ist, wobei Zeit und Temperatur nur eine untergeord- nete Rolle spielen, da die notwendige Behandlungsenergie über den Druck in das System eingebracht wird.

Durch den Druck entsteht Kompressionswärme deren Verlauf von der Zusammensetzung des Behandlungsgutes abhängig ist.

Produkte mit einem hohen Fettanteil erreichen durch die Kom- pressionswärme ein höheres Temperaturniveau als reines Wasser.

Der druckabhängige Temperaturanstieg kann zur gezielten Behand- lung des Gutes eingesetzt werden. Nach Beendigung der Druckbe- handlung sinkt die Temperatur, auch des Behandlungsgutes, zeitgleich wieder auf das Ausgangstemperaturniveau zurück.

Aus dem Vorgenannten ist es daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur gezielten Veränderung der Proteinstruktur von Prionen Pro suc in tierischen, zum Verzehr oder zur Weiterverar- beitung vorgesehenen Rohprodukten, aber auch zur Sterilisation von medizinischen Geräten, Schlachthausgerätschaften oder der- gleichen anzugeben, wobei die Behandlung selbst die übrigen, gewünschten Eigenschaften der Rohprodukte nicht oder nur in ge- ringem Maße beeinflussen soll bzw. der insgesamt anfallende Be- handlungsaufwand reduziert ist.

Die Lösung der Aufgabe der Erfindung erfolgt mit einem Verfah- ren gemäß den Merkmalen des Patentanspruchs 1, wobei die

Unteransprüche mindestens zweckmäßige Ausgestaltungen und Weiterbildungen umfassen.

Erfindungsgemäß wird die überraschende Erkenntnis genutzt, daß durch eine Hochdruckbehandlung, welche an sich bekannt ist, die Proteinstruktur von Prionen so verändert werden kann, daß eine Deaktivierung dieser zur Vermeidung von BSE, CJD, GSS, CWD oder Scrapie eintritt.

Bezüglich der tatsächlichen überraschenden Wirkungen sei auf den nachveröffentlichten Artikel in"Biochemical and Biophysical Research Communications"287,147 bis 152 (2001) : Pressure Denaturation of the Yeast Prion Protein Ure2, dort insbesondere Seite 149, linke Spalte Mitte, verwiesen.

Es wird also erfindungsgemäß über ein Übertragungsmedium das jeweilige flüssigkeitsumspülte oder in einer feuchten Umgebung befindliche Rohprodukt einer intensiven, von allen Seiten wir- kenden Hochdruckbehandlung unterzogen, wobei auch eine spezifi- zierte Temperaturbehandlung erfolgt.

Bei der Behandlung wird das Rohprodukt verdichtet, gasgefüllte Hohlräume werden entfernt und entartete gefaltete Proteine wer- den deaktiviert, so daß die Gefahr ausgeschlossen ist, daß beim Inkontaktkommen des entarteten gefalteten Proteins mit einem Prion PrSC weitere Prionen zur Umfaltung angeregt werden.

Bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wurden verschiedene Rohprodukte mit thermoplastischem Material umhüllt, in einen Druckbehälter überführt und dort auf ca. 80° C erhitzt. Es er- folgte dann ein Druckaufbau bis hin zu einem Maximaldruck von etwa 8000 bar. Durch die Kompressionswärme erfolgte eine Tempe- raturerhöhung auf ca. 110°C. Die Behandlung dauerte insgesamt 15 Minuten. Mit dem Abbau des Drucks reduzierte sich die Tempe- ratur wieder auf den Ausgangswert von 80° C.

Es konnte dann festgestellt werden, daß aufgrund der Behandlung eine BSE-Infektivität nicht mehr gegeben war.

Der Nachweis der Prioneninaktivierung wurde mittels eines bio- chemischen Testkits zur Feststellung der Prionenresistenz ge-

genüber Proteinase K durchgeführt. Bei dieser Methode wird da- von ausgegangen, daß nur die infektiöse Form des Prion Proteins die Verdauerung durch das Enzympräparat übersteht. Die Detek- tion der verbleibenden Prionen erfolgt durch speziell entwickelte Antikörper und Nachweisverfahren wie z. B. Western Blot oder LIA.

Zur Quantifizierung der Inaktivierungsergebnisse mittels LIA- Test müssen Vergleichstests vorgenommen werden. Hierzu wurde eine positiv beurteilte Probe (Gehirnhomogenisat einer BSE-Kuh) mit Material von negativen Proben in definierten Stufen ver- dünnt, wodurch sich die Konzentration der Prionen im gleichen Verhältnis reduziert. Diese Reduktion wird üblicherweise logarithmisch aufgetragen. Die Normierung der bei den Verdün- nungen erhaltenen LIA-Werte erfolgte mittels Division durch den jeweiligen LIA-Anfangswert LIA/LIAo. Die Fig. 1 und die ange- gebene Gleichung dient für die Inaktivierungsversuche als Kali- brierung. Im logarithmischen Maßstab ergibt sich ein linearer Zusammenhang. Mit dieser Gleichung wurden nun die LIA-Werte vor der kinetischen Analyse in Verdünnungsfaktoren umgerechnet (- 1=1 : 10 ;-2=1 : 100 ;-3=1 : 1000 etc).

Die Ermittlung des Druckeffekts auf die Prioneninaktivierung erfolgte durch die Analyse der Reduktion des LIA-Parameters im zeitlichen Verlauf der Einwirkung konstanten hydrostatischen Drucks bei konstanter Temperatur auf in Kunststoffampullen ver- packtes Homogenisat von BSE-positiv getesteten Rinderhirn. Der- artige Untersuchungen wurden auf verschiedenen Druck-und Tem- peraturniveaus und bei ausgewählten zeitlichen Stützstellen durchgeführt.

Die Auftragung der in Verdünnungsfaktoren umgerechneten LIA- Werte im halblogarithmischen Maßstab ergab die für die weiter- gehende kinetische Analyse benötigten Inaktivierungskurven. Am Beispiel des Temperaturniveaus 80°C ist der zeitliche Inakti- vierungsverlauf bei Umgebungsdruck (0,1 MPa), 500 MPa, 600 MPa und 700 MPa in der Fig. 2 dargestellt. Typischerweise werden auf allen Druckniveaus stark gekrümmte Kurven mit stetig abneh- mender Steilheit erhalten.

Die zur Konkavität führende Abnahme der Inaktivierungsge- schwindigkeit kann auf druck-bzw. thermoresistente Subpopula- tionen der Prionengesamtheit zurückgeführt werden.

Die in der Fig. 2 gezeigte Extrapolation der experimentellen Ergebnisse wurde mittels einer kinetischen Analyse durchge- führt, die auf der Annahme einer Proportionalität zwischen der Inaktivierungsgeschwindigkeit dC/dt und der exponentiell korri- gierten Prionenkonzentration Cn beruht. n wird bei diesem Kon- zept als Reaktionsordnung bezeichnet. Nach Einführung des Pro- portionalitätsfaktors k (=Geschwindigkeitskonstante) ergibt sich folgende Differentialgleichung : <BR> <BR> <BR> <BR> dC -k. Cn Gleichung 1<BR> <BR> dt In integrierter Form ergibt sich folgendes Zeitgesetz : Gleichung 2 Die linke Seite dieser Gleichung entspricht der relativen Ab- nahme der Prionenkonzentration ausgedrückt in Verdünnungsfak- toren gemäß der oben beschriebenen Kalibrierung. Die Geschwin- digkeitskonstante k kann regressiv ermittelt werden.

Die Bestimmung der Reaktionsordnung erfolgte durch die Mini- mierung des aufsummierten Standardfehlers aller verfügbaren In- aktivierungsdaten auf verschiedenen Temperatur-und Druckni- veaus.

Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, durchläuft die Standardfehler- funktion bei einer Reaktionsordnung von n=2 ein Minimum.

Somit können unter einheitlicher Verwendung der Reaktionsord- nung von n=2, 0 die Parameter des Zeitgesetzes der Inaktivie-

rungsreaktion zur Beschreibung des Druck-und Temperaturein- flusses auf die Geschwindigkeitskonstante k reduziert werden.

Für die vollständige Beschreibung muß für k eine Funktion der Temperatur und des Drucks gefunden werden. In Fig. 4 sind die aus den Regressionsanalysen der Inaktivierungskinetiken ermit- telten Geschwindigkeitskonstanten k dargestellt (Punkte). Aus der logarithmischen Auftragung von k gegen den Behandlungsdruck kann ein linearer Zusammenhang abgeleitet werden. Üblicherweise wird dies folgendermaßen formuliert (siehe z. B. Morild, E.

(1981) The Theory of Pressure Effects on Enzymes. Advances in Protein Chemistry 34 : 93-167) : Gleichung 3 Als charakteristischer Parameter tritt in dieser Gleichung das sogenannte Aktivierungsvolumen AV&num , das meist in [mL/mol] ange- geben ist. R ist die molare Gaskonstante : 8,314 J/(mol K). ko kann näherungsweise als die Geschwindigkeitskonstante bei Umge- bungsdruck (0,1 MPa) auf dem jeweiligen Temperaturniveau be- trachtet werden. Die Approximierung der experimentellen Ergeb- nisse erfolgte mittels eins Polynoms 2. Ordnung. Die resulier- tende Gesamtgleichung lautet daher : Gleichung 4 Nach regressiver Ermittlung der Parameter ergibt sich : Gleichung 5 Für die Temperaturniveaus : 30,40,60,80 und 100°C ist die Funktion in der Fig. 4 grafisch dargestellt.

Auf der Grundlage der bisher verfügbaren experimentellen Ergeb- nisse kann somit als charakteristische Größe der Druckab- hängigkeit der Inaktivierungkinetik ein Aktivierungsvolumen von AV&num =-36, 79 2,88 mL/mol bei einem Signifikanzniveau von 0,95 angegeben werden.

Zur Berechnung der zu erwartenden Prioneninaktivierung (ange- geben in Zehnerpotenzen) für die ermittelte Reaktionsordnung von n=2 können zusammenfassend folgende Funktionen angegeben werden : a) Für den Fall einer Behandlung der Dauer t (in Minuten) bei gleichbleibendem Temperatur-und Druckniveau, wobei die Kom- pressions-und Dekompressionszeiten gegenüber der Einwirkungs- zeit vernachlässigt werden : Gleichung 6 Die für das jeweilige Temperatur und Druckniveau gültige Ge- schwindigkeitskonstante kann aus Gleichung 8 errechnet werden. b) Die bis zum Zeitpunkt t (in Minuten) erreichte Inaktivierung für den Fall, daß Änderungen von Druck und Temperatur während der Behandlungszeit berücksichtigt werden müssen : Gleichung 7 Da die Geschwindigkeitskonstante k eine Funktion der zeitlich variablen Größen Druck und Temperatur ist, müssen in Gleichung 8 Temperatur und Druck als die bei der Behandlung verwendeten Zeitfunktionen eingesetzt und wie in Gleichung 7 dargestellt integriert werden.

Gleichung 8 mit : Ct/Co : Reduktion der Prionenkonzentration k : Geschwindigkeitskonstante [1/min] R : molare Gaskonstante : 8,314 J/ (mol K) p : Druck [MPa] T : Temperatur [K] In der Literatur sind Richtwerte für die erforderliche Behand- lungsintensität zur sicheren Hitzeinaktivierung CJD infizierter Materialien angegeben (siehe z. B. Casolari, A. (1998) Heat Resistance of Prions and Food Processing, Food Microbiology 15 : 59-63) : 18 Minuten bei 134°C laut Department of Health and Social Security (DHSS) * 60 Minuten bei 132°C laut American Neurobiological Association (ANA) Bei diesen Temperaturen liegt bei feuchter Hitze ein Dampfdruck von ca. 0,4 MPa vor. Setzt man diese Bedingungen in die obige Gleichung für die auf LIA-Basis ermittelte Prioneninaktivierung ein, so ergeben sich 5,42 bzw. 5,67, im Mittel also 5,56 Zeh- nerpotenzen Reduktion. Für diese als ausreichend angesehene Re- duktion können nun aus der oben entwickelten Gleichung für je- weils konstante Behandlungszeiten bestimmte Druck-Temperatur- Bedingungen ermittelt werden, die zu identischen Prioneninak- tivierungen führen (siehe auch Fig. 5).

Ausgebend von den in der Literatur angegebenen Behandlungsbe- dingungen für die Hitzeinaktivierung bei Umgebungsdruck (p=0, 1 MPa) zeigt sich auf Basis des vorhandenen Datenmaterials, daß durch Druckerhöhung ein identischer Effekt auf niedrigerem Ein- gangstemperaturniveau erreichbar ist.

Die erforderliche Behandlungstemperatur wird unter Berücksich- tigung der entstehenden Kompressionswärme erreicht. Zeitgleich

mit der Druckreduzierung sinkt das Temperaturniveau nach Ab- schluss der Druckbehandlung wieder auf den Ausgangswert zurück.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird also zunächst die Art bzw. die Eigenschaften des zu behandelnden Produkts oder Gegen- stands bestimmt. Wenn hier ein Produkt vorliegt, das z. B. ein Rohprodukt ist, dessen Eigenschaften durch die Behandlung nicht nachteilig beeinflußt werden sollen, dann wird unter Berück- sichtigung der vorstehenden Beziehungen überprüft, bei welchem Druckwert auf niedrigerem Temperaturniveau der gewünschte Inak- tivierungserfolg eintritt. Die Druck-bzw. Druck-Temperatur-Be- handlung erfolgt dann in einer feuchten Umgebung, d. h. unter Nutzung einer reaktiven Flüssigkeit.

Eine weitere Größe im Entscheidungssystem neben der anzustre- benden minimalen Temperatur in Abhängigkeit von den Eigenschaf- ten der Produkte ist eine möglichst kurze bzw. nicht zu lange Behandlungsdauer, um ein Einordnen des Verfahrens in übliche Produktionszyklen ohne nennenswerte Verringerung der Effektivi- tät zu ermöglichen.

Bei Materialien bzw. Gegenständen besonderer Art, wie bei- spielsweise Schlachthausmessern, Operationsbestecken oder der- gleichen kann selbstverständlich eine gleichzeitige Temperatur- behandlung auf höherem Temperaturniveau gewählt werden.