La présente invention concerne un procédé pour obtenir des intermédiaires utiles pour la préparation par des procédés semi-synthétiques du taxol, du Taxotère ou de leurs analogues à partir des différentes parties de plantes contenant ces intermédiaires.

Plus particulièrement, l'invention concerne l'obtention sélective de la désacétyl-10 baccatine III à partir de l'écorce, du tronc, des racines ou des feuilles de différentes espèces d'ifs.

Le taxol et le Taxotère ainsi que leurs analogues de formule générale :

^{O CO} 6 ^H 5 qui manifestent des propriétés anticancéreuses et antileucémiques remarquables, constituent des agents chimiothérapeutiques remarquables pour le traitement d'un certain nombre de cancers tels que par exemple les cancers du sein, de la prostate, du colon, de l'estomac, du rein ou des testicules et plus spécialement le cancer de l'ovaire.

Notamment, dans la formule générale (I), Ar peut représenter un radical phényle éventuellement substitué, R peut représenter un atome d'hydrogène ou un radical acétyle ou un radical carbamoyle N-substitué, R' représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle N-substitué et Rj peut représenter un radical phényle ou un radical R2-O- dans lequel R2 représente un radical alcoyle, alcényle, alcynyle, cycloalcoyle, cycloalcényle, bicycloalcoyle, phényle ou hétérocyclyle.

Le taxol correspond au produit de formule générale (I) dans laquelle Ar et R représentent un radical phényle et R représente un radical acétyle et R' représente un atome d'hydrogène et le Taxotère corespond au produit de formule générale (I) dans laquelle Ar représente un radical phényle, R et R' représentent un atome d'hydrogène et R représente un radical t.butoxy.

Le taxol, qui existe à l'état naturel dans différentes espèces d'ifs dans lesquelles il se trouve en faibles quantités, est difficile à isoler sans procéder à la

destruction complète de la plante. Par exemple, le taxol peut être isolé selon la méthode de C.H.O. HUANG et coll. J. Natl. Prod., 49, 665 (1986) qui consiste à traiter l'écorce broyée de Taxus brevifolia par le méthanol, à concentrer l'extrait, extraire le concentrât par le dichlorométhane, à concentrer à nouveau, à disperser le résidu dans un mélange hexane-acétone (1-1 en volumes), à purifier la partie soluble par chromatographie sur une colonne de Florisil pour obtenir le taxol brut qui est purifié par recristallisations successives dans des mélanges méthanol-eau et hexane- acétone puis par chromatograpfcie et nouvelle cristallisation. Les quantités de taxol ainsi extraites peuvent représenter de 0,005 à 0,017 % de la partie de la plante mise en oeuvre.

Le Taxotère qui n'existe pas à l'état naturel peut être préparé par hémi¬ synthèse à partir de la désacétyl-10 baccatine III de formule :

OCOC ₆ H ₅

selon les procédés qui sont décrits, par exemple, dans les brevets américains US 4,814,470 ou US 4,924,012 ou dans la demande internationale PCT WO 92/09589.

Le taxol peut aussi être préparé par des procédés qui font intervenir la mise en oeuvre de la désacétyl-10 baccatine III soit par passage par l'intermédiaire du Taxotère dans les conditions décrites dans le brevet américain US 4,857,653 soit par estérification de la baccatine III dans les conditions décrites dans les brevets européens EP 400,971 ou EP 428,376 soit par estérification de la désacétyl-10 baccatine III et acétylation dans les conditions décrites dans les brevet américain US 4,924,011.

Les différentes variétés d'ifs (Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus média, Taxus wallichiana) contiennent des dérivés du taxane dont les principaux sont essentiellement le taxol et la désacétyl-10 baccatine III, les autres dérivés étant plus particulièrement la

céphalomannine, la désacétyl-10 céphalomannine ou la baccatine III éventuellement liés à des sucres.

Alors que le taxol se trouve principalement dans le tronc et l'écorce, la désacétyl-10 baccatine III est présente essentiellement dans les feuilles. Par ailleurs, la teneur en désacétyl-10 baccatine III dans les feuilles est généralement très supérieure à celle du taxol, que celui-ci soit présent dans l'écorce, le tronc ou dans les feuilles.

Il en résulte qu'il est particulièrement important de pouvoir disposer de désacétyl-10 baccatine III qui est essentielle à la préparation de quantités de taxol beaucoup plus importantes que par extraction directe à partir des ifs ainsi qu'à la préparation du Taxotère.

En extrayant la désacétyl-10 baccatine III à partir des feuilles d'ifs, on n'est pas conduit à une destruction totale de la plante dont les feuilles peuvent être utilisées à nouveau après chaque cycle de croissance. Généralement, les méthodes connues d'extraction des dérivés du taxane contenus dans les différentes parties de l'if (écorce, tronc, racines, feuilles, ....) nécessitent la mise en oeuvre de techniques chromatographiques longues et coûteuses qui ne permettent pas une séparation totale et quantitative des dérivés du taxane présents initialement dans la plante. La désacétyl-10 baccatine III peut être obtenue, avec des rendements voisins de 300 mg par kg de feuilles (Taxus baccata), par un procédé qui met en oeuvre une macération des aiguilles dans l'éthanol, une extraction par un solvant organique tel que le chlorure de méthylène et des chromatographies successives selon le procédé qui est décrit dans le brevet américain US 4,814,470. Les différents constituants dérivés du taxane présents dans les différentes parties de l'if peuvent aussi être séparés par des méthodes mettant en oeuvre la chromatographie en phase liquide "reverse" qui sont décrites, en particulier dans la demande international PCT WO 92/07842. Ces procédés consistent essentiellement à traiter les extraits bruts d'ifs par chromatographie en phase liquide "reverse" sur un adsorbant sur lequel se fixent les dérivés du taxane, à éluer les dérivés du taxane et à les isoler. Selon ce procédé, il est possible d'isoler 200 mg de désacétyl-10 baccatine m à partir de 1 kg de feuilles broyées et séchées.

Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que la désacétyl-10 baccatine III peut être extraite très sélectivement, et avec un excellent rendement, à partir des différentes parties de l'if, et plus particulièrement

des feuilles, par un procédé simple ne mettant pas en oeuvre des techniques chromatographiques. Par exemple, il est possible d'extraire environ 800 mg de désacétyl-10 baccatine III par kg de feuilles d'if (Taxus baccata).

Le procédé selon l'invention consiste à isoler la désacétyl-10 baccatine III à partir d'un extrait aqueux de feuilles d'if.

Plus particulièrement le procédé selon l'invention consiste,

- ou bien

1) à traiter par l'eau les parties broyées de l'if (Taxus sp.),

2) à séparer la solution aqueuse, contenant la désacétyl-10 baccatine III, de la masse végétale en suspension,

3) à extraire la désacétyl-10 baccatine III de la solution aqueuse par un solvant organique,

4) à séparer l'extrait organique, contenant la désacétyl-10 baccatine III, de la phase aqueuse, 5) à éliminer le solvant organique de l'extrait organique ainsi séparé,

6) à faire cristalliser sélectivement la désacétyl-10 baccatine III à partir du résidu ainsi obtenu dans un solvant organique,

7) à isoler la désacétyl-10 baccatine III sous forme purifiée.

- ou bien 1) à traiter par l'eau les parties broyées de l'if (Taxus sp.),

2) à séparer la solution aqueuse, contenant la désacétyl-10 baccatine III, de la masse végétale en suspension,

3) à adsorber la solution aqueuse contenant la désacétyl-10 baccatine III sur un support convenable 4) à désorber la désacétyl-10 baccatine III au moyen d'un solvant organique

5) à éliminer le solvant organique du désorbat

6) à faire cristalliser sélectivement la désacétyl-10 baccatine III à partir du résidu ainsi obtenu dans un solvant organique

7) à isoler la désacétyl-10 baccatine lu sous forme purifiée Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre sur toute partie appropriée de l'if telle que l'écorce, le tronc, les racines ou les feuilles. L' if utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention appartient de préférence à la variété Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata Taxus floridana, Taxus média ou Taxus wallichiana. Il est particulièrement avantageux d'utiliser les feuilles d'if (Taxus baccata, Taxus brevifolia) qui généralement sont plus

riches en désacétyl-10 baccatine III. Les fragments utilisés peuvent avoir des dimensions variant de 0,5 à quelques millimètres. Pour des questions de commodité, il peut être avantageux d'utiliser des fragments dont les dimensions moyennes sont inférieures à 1 mm. Les parties broyées, et éventuellement séchées, de l'if peuvent être obtenues par des opérations de broyage, et éventuellement de séchage, qui, éventuellement, précèdent ou suivent des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante ou s'intercalent dans des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante.

Le traitement par l'eau des parties broyées de l'if est effectué selon les techniques connues de l'homme de l'art. En particulier, la solution aqueuse contenant la désacétyl-10 baccatine III est généralement obtenue par agitation, à une température comprise entre 20 et 65°C, des parties broyées de l'if dans de l'eau pendant 30 minutes à 2 heures. La quantité d'eau utilisée peut varier dans de larges limites, cependant il est convenable d'utiliser une quantité d'eau de 2 à 10 litres calculée par kg de partie de plante broyée et séchée et de préférence environ 5 litres d'eau par kg de partie de plante à traiter. Il peut être avantageux d'utiliser de l'eau déminéralisée pour effectuer ce traitement et d'opérer sous ultra-sons.

Dans le but d'améliorer le rendement, il peut être avantageux d'effectuer plusieurs traitements à l'eau de la masse végétale afin d'obtenir des solutions aqueuses dont on extrait la désacétyl-10 baccatine III dans les conditions décrites ci-après.

La solution aqueuse obtenue contenant la désacétyl-10 baccatine III est séparée de la masse végétale par les techniques habituelles telles que la filtration, la centrifugation ou la décantation. La solution aqueuse résultante, éventuellement refroidie, peut être traitée selon l'une des manières suivantes : 1) la désacétyl-10 baccatine III est extraite, en une ou plusieurs fois, par un solvant organique. Les solvants organiques qui conviennent particulièrement bien sont choisis parmi les éthers tels que le méthyl tbutyléther, l'éthyl t.butyléther, le méthyl n.butyléther, le méthyl n.amyléther, l'éthyl tamyléther, le tbutyl isopropyléther, l'éthyl isobutyléther, le t.butyl n.propyléther ou l'éthyl n.hexyléther et les esters aliphatiques tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n.butyle, l'acétate de t.butyle, le t.butylacétate de méthyle, le propionate de t.butyle ou l'acétate de t__amyle. D'un intérêt tout particulier sont le méthyl t.butyléther, l'éthyl tbutyléther, l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n.butyle.

L'extraction par un solvant organique est généralement effectuée sur une solution aqueuse dont le pH est inférieur à 7 et de préférence inférieur à 6.

Les extraits organiques, contenant la désacétyl-10 baccatine III, sont séparés de la phase aqueuse par application des techniques habituelles telles que la décantation.

Les extraits organiques sont éventuellement lavés au moyen d'une solution aqueuse d'une base faible (solution aqueuse de carbonate de sodium par exemple) et/ou à l'eau. Après séchage, le solvant organique de l'extrait est éliminé selon les méthodes habituelles et en particulier par distillation éventuellement sous pression réduite, pour donner un résidu généralement solide dont on isole la désacétyl-10 baccatine III. 2) la solution aqueuse est adsorbée sur un support convenable afin de fixer la désacétyl-10 baccatine III. Comme support, on utilise un résine adsorbante qui est choisie de préférence parmi les résines polystyrène-divinylbenzène.

La désorption de la désacétyl-10 baccatine III est effectuée par lavage du support par un solvant approprié. Comme solvant, on utilise de préférence un alcool aliphatique contenant 1 à 3 atomes de carbone et plus particulièrement le méthanol.

La solution organique est séparée du support, généralement par filtration, puis est concentrée à sec généralement par distillation éventuellement sous pression réduite pour donner un résidu généralement solide dont on isole la désacétyl-10 baccatine III. La cristallisation sélective de la désacétyl-10 baccatine III brute, obtenue selon l'une ou l'autre voie, est effectuée à partir d'une solution du résidu obtenu dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques. Comme solvants permettant la cristallisation sélective de la désacétyl-10 baccatine III peuvent être avantageusement utilisés les nitriles tels que l'acétonitrile, le propionitrile ou l'isobutyronitrile éventuellement en mélange avec un alcool aliphatique tel que le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol ou le n.butanol ou un ester aliphatique tel que l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n.butyle ou l'acétate de tbutyle ou une cétone aliphatique telle que l'acétone, la méthyl éthylcétone, la méthyl propylcétone, la méthyl n.butylcétone ou la méthyl isobutylcétone. Il est particuliè- rement avantageux d'effectuer la cristallisation sélective dans l'acétonitrile éventuellement en présence d'éthanol et/ou d'acétate d'éthyle ou de n.butyle et/ou d'acétone.

La désacétyl-10 baccatine III qui précipite peut être séparée par filtration, décantation ou centrifugation.

Le procédé selon l'invention permet d'obtenir la désacétyl-10 baccatine III pratiquement pure avec des rendements généralement très supérieurs à ceux obtenus par la mise en oeuvre des procédés antérieurement connus. Le procédé selon l'invention permet d'extraire de façon quasiment quantitative la totalité de la désacétyl-10 baccatine III contenue dans les parties de la plante utilisées et en particulier des feuilles.

La désacétyl-10 baccatine III obtenue selon le procédé d'extraction de la présente invention peut être utilisée pour préparer le taxol ou le Taxotère ou leurs dérivés dans les conditions qui sont décrites plus particulièrement dans les brevets EP 0 253 738, EP 0 253 739, EP 0 336 841, EP 0 336 840, WO 92 09589, EP 0 400 971 et EP 0 428 376.

Les exemples suivants illustrent le procédé selon l'invention.

EXEMPLE 1

A 2,5 litres d'eau déminéralisée chauffés à 50°C, on ajoute 500 g de feuilles d'ifs (Taxus baccata) broyées et séchées dont la taille moyenne des particules est inférieure à 1 mm et dont le titre en désacétyl-10 baccatine III, déterminé par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), est de 0,08 % (soit 400 mg de désacétyl-10 baccatine III dans 500 g de feuilles). On agite pendant 1 heure à 50°C puis on filtre. Le filtrat (1,8 litre), dont le pH est de 5,4, est extrait par 3 fois 0,9 litre d'acétate d'éthyle. Les phases organiques réunies (2,7 litres) sont lavées 2 fois par 1 litre d'une solution de carbonate de sodium 0,1M puis par 2 fois 1 litre d'eau déminéralisée et enfin séchées sur sulfate de sodium. Après filtration et concentration à sec, on obtient un solide (3,2 g) que l'on reprend par 9 cm3 d'acétonitrile à une température voisine de 70°C. Après refroidissement pendant une nuit à une température voisine de +4°C, le précipité est séparé par filtration. On obtient ainsi, après séchage, 245 mg de cristaux contenant, d'après l'analyse par HPLC, 75 % de désacétyl-10 baccatine III pure, soit 183 mg. Les eaux-mères, d'après l'analyse par HPLC, contiennent 40 mg de désacétyl-10 baccatine III. La masse végétale, qui a retenu 0,7 litre d'eau, est extraite 2 fois dans les conditions décrites ci-dessus. Les filtrats aqueux réunis sont traités comme précédemment. On obtient ainsi 2,5 g d'un produit solide que l'on reprend dans 5 cm3 d'acétonitrile à une température voisine de 70°C. Après refroidissement pendant une nuit à une température voisine de +4°C, on sépare par filtration 169 mg de cristaux

contenant, d'après l'analyse par HPLC, 75 % de désacétyl-10 baccatine III pure soit 127 mg. Les eaux-mères contiennent, d'après l'analyse par HPLC, 47 mg de désacétyl-10 baccatine III.

La quantité totale de désacétyl-10 baccatine III extraite par l'eau est de 183 + 40 + 127+ 47 = 397 mg.

Le rendement est pratiquement quantitatif.

EXEMPLE 2

On chauffe 3 litres d'eau déminéralisée à 50°C puis on ajoute 500 g de feuilles d'ifs broyées et séchées et dont le diamètre moyen des particules est de 1 mm et dont le titre en désacétyl-10 baccatine III, déterminé par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), est de 0,08 % (soit 400 mg de désacétyl-10 baccatine III dans 500 g de feuilles). On agite pendant 1 heure à 50°C puis on filtre. Le filtrat (1,97 litre), dont le pH est de 5,15, est ajusté à pH = 4,6 par addition d'acide chlorhydrique concentré puis il est filtré sur une membrane de carton amiante dans un filtre Seitz. On recueille 1,8 litre de filtrat.

On extrait 300 cm3 de filtrat par 2 fois 150 cm3 puis 4 fois 60 cm3 de méthyl tert.butyl éther (MTBE). Les extraits réunis et concentrés fournissent 620 mg de solides qui sont repris par 3 cm3 d'acétonitrile à 70°C.

Après refroidissement pendant une nuit à +4°C, on sépare par filtration 28 mg de désacétyl-10 baccatine III cristallisé dont le titre déterminé par HPLC est de 90 %. Les eaux-mères contiennent 12,8 mg de désacétyl-10 baccatine III (dosage par HPLC).

EXEMPLE 3

On broyé 1 kg de feuilles d'if (Taxus baccata) fraîchement coupées dont la teneur en eau est de 69% et dont la teneur en désacétyl-10 baccatine III est de 651 mg/kg (détermination par HPLC) dans un mixer de 2 litres en présence d'eau déminéralisée à raison de 10 opérations successives identiques en mettant en oeuvre chaque fois 100 g de feuilles et 500 cm3 d'eau à une température voisine de 20°C. Le mélange obtenu est filtré sur toile de coton puis sur papier en rinçant avec au total 200 cm3 d'eau. On recueille 5.000 cm3 de filtrat soit 84,9 % du volume total d'eau (eau mise en oeuvre et eau contenue dans les feuilles). D'après le dosage par HPLC, la solution aqueuse ainsi obtenue contient 72 g de matières sèches dont 550 mg de désacétyl-10 baccatine III soit pratiquement la quantité théorique de 552,7 mg

(84,9 % de 651 mg). Le reste de la désacétyl-10 baccatine III contenue dans l'eau imprégnant la matière végétale peut être résupéré par lavage à l'eau de la matière végétale.

La solution aqueuse (5.000 cm3) est percolée sur une colonne de 5 cm de diamètre remplie sur une hauteur de 10 cm avec une résine polystyrène- divinylbenzène (Amberchrom CG 161 md ® (Tosohaas, Stuttgart, Allemagne).

La résine est rincée à l'eau, séchée puis mise ensuspension dans du méthanol.

Après filtration et concentration à sec du filtrat, on obtient un résidu (15,5 g) que l'on reprend par 100 cm3 d'acétate d'éthyle. On sépare par filtration 8,7 g d'un produit insoluble puison concentre le filtrat jusqu'à un volume de 5 cm3. On ajoute 30 cm3 d'acétonitrile. On obtient une solutution limpide dans laquelle, très rapidement, apparaissent des cristaux blancs. Après une nuit de repos à 4°C, les cristaux blancs sont séparés par filtration et séchés.On obtient ainsi 548 mg de désacétyl-10 baccatine III solvatée par une mole d'acétonitrile avec un rendement de 92 %.

Un dosage par HPLC avec normalisation interne montre que ces cristaux contiennent 82 % de désacétyl-10 baccatine III.

Le rendement en désacétyl-10 baccatine III est donc de 75,4 %.