La présente invention concerne un procédé pour obtenir sélectivement des intermédiaires utiles pour la préparation par des procédés semi-synthétiques du taxol, du Taxotère ou de leurs analogues à partir des différentes parties de plantes contenant ces intermédiaires.

Plus particulièrement, l'invention concerne l'obtention de la désacétyl-10 baccatine III à partir de l'écorce, du tronc, des racines ou des feuilles de différentes espèces d'ifs.

Le taxol et le Taxotère ainsi que leurs analogues de formule générale :

qui manifestent des propriétés anticancéreuses et antileucémiques remarquables, constituent des agents chimiothérapeutiques remarquables pour le traitement d'un certain nombre de cancers tels que par exemple les cancers du sein, de la prostate, du colon, de l'estomac, du rein ou des testicules et plus spécialement le cancer de l'ovaire.

Notamment, dans la formule générale (I), Ar peut représenter un radical phényle éventuellement substitué, R peut représenter un atome d'hydrogène ou un radical acétyle ou un radical carbamoyle N-substitué, R' représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle N-substitué et R peut représenter un radical phényle ou un radical R2-O- dans lequel R2 représente un radical alcoyle, alcényle, alcynyle, cycloalcoyle, cycloalcényle, bicycloalcoyle, phényle ou hétérocyclyle.

Le taxol correspond au produit de formule générale (I) dans laquelle Ar et Ri représentent un radical phényle et R représente un radical acétyle et R' représente un atome d'hydrogène et le Taxotère corespond au produit de formule générale (I) dans laquelle Ar représente un radical phényle, R et R' représentent un atome d'hydrogène et Ri représente un radical tbutoxy.

Le taxol, qui existe à l'état naturel dans différentes espèces d'ifs dans lesquelles il se trouve en faibles quantités, est difficile à isoler sans procéder à la

destruction complète de la plante. Par exemple, le taxol peut être isolé selon la méthode de C.H.O. HUANG et coll. J. Natl. Prod., 49, 665 (1986) qui consiste à traiter l'écorce broyée de Taxus brevifolia par le méthanol, à concentrer l'extrait, extraire le concentrât par le dichlorométhane, à concentrer à nouveau, à disperser le résidu dans un mélange hexane-acétone (1-1 en volumes), à purifier la partie soluble par chromatographie sur une colonne de Florisil pour obtenir le taxol brut qui est purifié par recristallisations successives dans des mélanges méthanol-eau et hexane- acétone puis par chromatographie et nouvelle cristallisation. Les quantités de taxol ainsi extraites peuvent représenter de 0,005 à 0,017 % de la partie de la plante mise en oeuvre.

Le Taxotère qui n'existe pas à l'état naturel peut être préparé par hémi¬ synthèse à partir de la désacétyl-10 baccatine III de formule :

OCOC ₆ H ₅

selon les procédés qui sont décrits, par exemple, dans les brevets américains US 4,814,470 ou US 4,924 ,012 ou dans la demande internationale PCT WO 92/09589.

Le taxol peut aussi être préparé par des procédés qui font intervenir la mise en oeuvre de la désacétyl-10 baccatine III soit par passage par l'intermédiaire du Taxotère dans les conditions décrites dans le brevet américain US 4,857,653 soit par esterification de la baccatine m dans les conditions décrites dans les brevets européens EP 400,971 ou EP 428,376 soit par esterification de la désacétyl-10 baccatine III et acétylation dans les conditions décrites dans les brevet américain US 4,924,011.

Les différentes variétés d'ifs (Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata.Taxus floridana, Taxus média et Taxus wallichiana) contiennent des dérivés du taxane dont les principaux sont essentiellement le taxol et la désacétyl-10 baccatine III, les autres dérivés étant plus particulièrement la

céphalomannine, la désacétyl-10 céphalomannine ou la baccatine III éventuellement liés à des sucres.

Alors que le taxol se trouve principalement dans le tronc et l'écorce, la désacétyl-10 baccatine III est présente essentiellement dans les feuilles. Par ailleurs, la teneur en désacétyl-10 baccatine III dans les feuilles est généralement très supérieure à celle du taxol, que celui-ci soit présent dans l'écorce, le tronc ou dans les feuilles.

Il en résulte qu'il est particulièrement important de pouvoir disposer de désacétyl-10 baccatine III qui est essentielle à la préparation de quantités de taxol beaucoup plus importantes que par extraction directe à partir des ifs ainsi qu'à la préparation du Taxotère.

En extrayant la désacétyl-10 baccatine III à partir des feuilles d'ifs, on n'est pas conduit à une destruction totale de la plante dont les feuilles peuvent être utilisées à nouveau après chaque cycle de croissance. Généralement, les méthodes connues d'extraction des dérivés du taxane contenus dans les différentes parties de l'if (écorce, tronc, racines, feuilles, ....) nécessitent la mise en oeuvre de techniques chromatographiques longues et coûteuses qui ne permettent pas une séparation totale et quantitative des dérivés du taxane présents initialement dans la plante. Selon le procédé décrit dans le brevet américain US 4,814,470 qui met en oeuvre une macération des aiguilles dans l'éthanol, une extraction par un solvant organique tel que le chlorure de méthylène et des chromatographies successives, il est possible d'isoler environ 40 % de la désacétyl-10 baccatine III contenue dans les feuilles. Les différents constituants dérivés du taxane présents dans les différentes parties de l'if peuvent aussi être séparés par des méthodes mettant en oeuvre la chromatographie en phase liquide "reverse" qui sont décrites, en particulier dans la demande international PCT WO 92/07842. Ces procédés consistent essentiellement à traiter les extraits bruts d'ifs par chromatographie en phase liquide "reverse" sur un adsorbant sur lequel se fixent les dérivés du taxane, à éluer les dérivés du taxane et à les isoler. Selon ce procédé, il est possible d'isoler environ 25 % de la désacétyl-10 baccatine III contenue dans les feuilles.

Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que la désacétyl-10 baccatine III peut être extraite sélectivement à partir des différentes parties de l'if, et plus particulièrement des feuilles, par un procédé simple

ne mettant pas en oeuvre des techniques chromatographiques. Par exemple, il est possible d'extraire environ 75 % de la désacétyl-10 baccatine III présente dans les feuilles.

Plus particulièrement, le procédé selon l'invention consiste : - ou bien

1) à traiter les parties broyées de l'if (Taxus sp.) par un alcool aliphatique de façon à obtenir un extrait alcoolique contenant la désacétyl-10 baccatine III,

2) à diluer à l'eau l'extrait alcoolique éventuellement concentré,

3) à séparer par filtration, décantation ou centrifugation les insolubles présents dans la solution hydro-alcoolique obtenue,

4) à éliminer la quasi totalité de l'alcool de la solution hydro-alcoolique,

5) à extraire la désacétyl-10 baccatine III de la phase aqueuse ainsi obtenue par un solvant organique convenable,

6) à éliminer le solvant de l'extrait organique ainsi obtenu contenant la désacétyl-10 baccatine III,

7) à faire cristalliser sélectivement la désacétyl-10 baccatine III, à partir du résidu ainsi obtenu, dans un solvant organique,

8) à isoler la désacétyl-10 baccatine III purifiée.

- ou bien 1) à traiter les parties broyées de l'if (Taxus sp.) par un alcool aliphatique de façon à obtenir un extrait alcoolique contenant la désacétyl-10 baccatine m,

2) à extraire l'extrait alcoolique par un solvant organique,

3) à séparer la phase hydro-alcoolique obtenue par décantation,

4) à diluer par l'eau la phase hydro-alcoolique,

5) à séparer par filtration, décantation ou centrifugation les insolubles présents dans la solution hydro-alcoolique obtenue,

6) à extraire la désacétyl-10 baccatine III de la phase hydro-alcoolique filtrée par un solvant organique,

7) à éliminer totalement ou partiellement le solvant de l'extrait organique contenant la désacétyl-10 baccatine m,

8) à faire cristalliser sélectivement la désacétyl-10 baccatine III, à partir de la solution ou du résidu obtenu, dans un solvant organique,

9) à isoler la désacétyl-10 baccatine in purifiée

Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre sur toute partie appropriée de l'if telle que l'écorce, le tronc, les racines ou les feuilles. L'if utilisé pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention appartient de préférence à la variété Taxus baccata, Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cupidata, Taxus floridana, Taxus média ou Taxus wallichiana. Il est particulièrement avantageux d'utiliser les feuilles d'if (Taxus baccata, Taxus brevifolia) qui généralement sont plus riches en désacétyl-10 baccatine III. Pour une meilleure mise en oeuvre du procédé, il est préférable d'utiliser les différentes parties de l'if sous forme broyée et éventuellement séchée. Les fragments utilisés peuvent avoir des dimensions variant de 0,5 à quelques millimètres. Pour des questions de commodité, il peut être avantageux d'utiliser des fragments dont les dimensions moyennes sont inférieures à 1 mm. Les parties broyées et éventuellement séchées de l'if peuvent être obtenues par des opérations de broyage et éventuellement de séchage qui, éventuellement, précèdent ou suivent des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante ou s'intercalent dans des opérations de congélation et de décongélation des parties fraîches de la plante.

L'extrait alcoolique est obtenu en agitant un mélange, éventuellement chauffé, des parties broyées et éventuellement séchées de l'if avec un alcool généralement choisi parmi le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol et le tbutanol. Il est particulièrement avantageux d'utiliser le méthanol.

L'extrait alcoolique contenant la .désacétyl-10 baccatine III peut être traité selon l'une des méthodes suivantes :

1) l'extrait alcoolique contenant la désacétyl-10 baccatine III est dilué par addition d'eau pour donner une solution hydro-alcoolique.

Pour la mise en oeuvre du procédé, il est avantageux de se placer dans des conditions particulières de dilution et de teneur en alcool dans la phase aqueuse, de façon à éviter les pertes en désacétyl-10 baccatine III et à éliminer la plus grande quantité possible de produits insolubles. Dans ces conditions, il peut être nécessaire de concentrer l'extrait alcoolique contenant la désacétyl-10 baccatine III préalablement à la dilution par l'eau.

Plus particulièrement, la dilution par addition d'eau dans l'extrait alcoolique éventuellement concentré par distillation, de préférence sous pression réduite, doit être faite de telle manière que le rapport entre le poids du mélange diluant et le poids de la matière sèche contenue dans l'extrait alcoolique soit compris entre 4 et 8, le mélange diluant eau-alcool contenant 10 à 30 % en poids d'alcool.

Les produits insolubles dans la solution hydro-alcoolique ainsi obtenue sont éliminés selon les techniques habituelles et de préférence par filtration, par décantation ou par centrifugation. Lorsque l'élimination est effectuée par filtration, il peut être avantageux d'opérer en présence d'un agent de filtration tel que la terre d'infusoire (célite) et d'un agent floculant.

De préférence, l'élimination de l'alcool de la solution hydro-alcoolique ainsi obtenue est effectuée par distillation, de préférence sous pression réduite, éventuellement en présence d'un agent antimousse, de façon à éviter ou à limiter la dégradation thermique des constituants du milieu.

Généralement, la désacétyl-10 baccatine III contenue dans solution aqueuse ainsi obtenue, dans laquelle la teneur en alcool est généralement inférieure à 1 %, est extraite, en une ou plusieurs fois, par un solvant organique choisi parmi les éthers tels que le méthyl tbutyléther, l'éthyl tbutyléther, le méthyl n.butyléther, le méthyl n.amyléther, l'éthyl tamyléther, le butyl isopropyléther, l'éthyl isobutyléther, le tbutyl n.propyléther ou l'éthyl n.hexyléther et les esters aliphatiques tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n.butyle, l'acétate de t.butyle, le t.butylacétate de méthyle, le propionate de butyle ou l'acétate de t.amyle. D'un intérêt tout particulier sont le méthyl tbutyléther, l'éthyl tbutyléther, l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n.butyle. Plus spécialement encore, il est avantageux d'utiliser l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n.butyle,

2) l'extrait alcoolique, qui contient de l'eau provenant des feuilles d'if mises en oeuvre, est extrait par un solvant organique approprié choisi parmi les hydrocarbures aromatiques tels que le toluène ou le xylène.

L'extrait hydro-alcoolique est dilué par addition d'eau, de façon que l'extrait contienne de 20 à 40 % d'alcool, puis il est filtré ou décanté ou centrifugé pour séparer les insolubles présents. La solution hydro-alcoolique obtenue qui contient la désacétyl-10 baccatine III est extraite en une ou plusieurs fois, par un solvant organique choisi parmi les éthers tels que le méthyl tbutyléther, l'éthyl tbutyléther, le méthyl n.butyléther, le méthyl n.amyléther, l'éthyl tamyléther, le tbutyl isopropyléther, l'éthyl isobutyléther, le tbutyl n.propyléther ou l'éthyl n.hexyléther et les esters aliphatiques tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n.butyle, l'acétate de tbutyle, le tbutylacétate de méthyle, le propionate de tbutyle ou l'acétate de tamyle. D'un intérêt tout particulier sont le méthyl tbutyléther, l'éthyl tbutyléther, l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n.butyle. Plus spécialement encore, il est avantageux d'utiliser l'acétate d'éthyle ou l'acétate de n.butyle,

Les extraits organiques, obtenus selon l'une ou l'autre voie, sont éventuellement lavés au moyen d'une solution aqueuse d'une base faible (solution aqueuse de carbonate de sodium par exemple) et/ou à l'eau. Après séchage éventuel, le solvant organique de l'extrait est éliminé, totalement ou partiellement, selon les méthodes habituelles et en particulier par distillation éventuellement sous pression réduite, pour donner une solution ou résidu généralement solide dont on isole la désacétyl-10 baccatine m.

La cristallisation sélective de la désacétyl-10 baccatine III est effectuée à partir d'une solution dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques. Comme solvants permettant la cristallisation sélective de la désacétyl-10 baccatine III peuvent être avantageusement utilisés les nitriles tels que l'acétonitrile ou le propionitrile, éventuellement en mélange avec un alcool aliphatique tel que le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol ou le n.butanol ou un ester aliphatique tel que l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isopropyle, l'acétate de n.butyle ou l'acétate de tbutyle ou une cétone telle que l'acétone, la méthyl éthylcétone, la méthyl propylcétone, la méthyl n.buylcétone et la méthyl isobutylcétone. Il est particulièrement avantageux d'effectuer la cristallisation sélective dans l'acétonitrile éventuellement en présence d'éthanol et/ou d'acétone et/ou d'acétate d'éthyle et/ou d'acétate de n.butyle.

La désacétyl-10 baccatine III qui précipite peut être isolée par filtration, décantation ou centrifugation.

La désacétyl-10 baccatine III obtenue selon la procédé d'extraction de la présente invention peut être utilisée pour préparer le taxol ou le Taxotère ou leurs dérivés dans les conditions décrites plus particulièrement dans les brevets

EP 0253 738, EP 0 253 739, EP 0 336 840, EP 0 336 841, WO 92 09589, EP 0400 971 et EP 0428 376.

Les exemples suivants illustrent le procédé selon l'invention.

EXEMPLE 1

Dans un percolateur, on place 200 litres de méthanol, 1,4 kg de laine de verre et 250 kg de feuilles d'if (Taxus baccata) broyées dont la taille moyenne des particules est voisine de 0,8 mm. On ajoute 400 litres de méthanol pur. La percolation est effectuée en alimentant le percolateur en solvant frais par le haut, au débit de 870 litres/heure, et en recueillant l'extrait méthanolique au bas du percolateur. La percolation dure 5 heures à 20°C. La solution méthanolique recueillie est évaporée sous pression réduite (70-80 kPa) à 40°C dans un évaporateur pour obtenir un concentrât dont la teneur en matière sèche est comprise entre 40 et 80 % en poids.

On utilise un extrait méthanolique (préparé dans les conditions décrites ci- dessus) contenant 353 g d'extrait sec, 420 g de méthanol et 40 g d'eau, la quantité de désacétyl-10 baccatine III présente étant de 1130 mg.

Dans un réacteur de 2 litres, on introduit l'extrait méthanolique puis, en agitant, 1590 cm3 d'eau. Le mélange est agité pendant 1 heure puis on ajoute successivement 35 g de célite en agitant pendant 1 heure et 25 cm3 de floculant "ZETAG 87". La suspension finale obtenue est filtrée sur verre fritte N°4 de 130 mm de diamètre. Les produits insolubles et la célite sont lavés par 100 g d'un mélange eau-méthanol (8-2 en poids). Le filtrat est placé dans un réacteur de 2 litres puis on ajoute 2 cm3 de

SILICONE 426R. Le mélange est distillé sous pression réduite (7,3-11 kPa) à une température comprise entre 35 et 42°C, la température du bain extérieur étant comprise entre 45 et 50°C. On obtient un distillât (909 g) et un concentrât (1432 g) contenant 0,5 % de méthanol. Le concentrât est extrait 1 fois par 700 cm3 d'acétate d'éthyle puis 2 fois par

350 cm3 d'acétate d'éthyle. Les phases organiques réunies sont lavées 2 fois par 700 cm3 d'une solution 0,1 M de carbonate de sodium puis par 1 fois 350 cm3 d'eau.

Le pH est égal à 8. La phase organique (1049 g) est concentrée à sec sous pression réduite (1,33-21,3 kPa) à 40°C. On obtient ainsi 16,2 g d'extrait sec.

EXEMPLE 2

Dans un ballon de 500 cm3, on introduit 45,5 g d'extrait sec contenant 9,3 % de désacétyl-10 baccatine III obtenu dans les conditions décrites dans l'exemple 1 puis on ajoute 18 cm3 d'acétate d'éthyle. Le mélange homogène est agité et chauffé à 50°C. On ajoute alors 136 cm3 d'acétonitrile en 15 minutes à 50°C. La suspension est agitée pendant environ 1 heure puis elle est refroidie à une température voisine de 20°C en environ 3 heures. Le précipité est séparé par filtration sur verre fritte N°3 (diamètre : 35 mm) puis il est lavé par 20 cm3 d'acétonitrile puis par 2 fois 20 cm3 de diisopropyléther. Le produit est séché sous pression réduite (1,33 kPa) à 40°C pendant 20 heures. On obtient ainsi 5,2 g d'un produit blanc contenant 75,8 % de désacétyl-10 baccatine III.

Le rendement de la cristallisation est de 93,6 %.

EXEMPLE 3

Dans un ballon de 1 litre, on introduit 275,2 g d'une solution dans l'acétate d'éthyle de 39,6 g de matière sèche contenant 3,48 g de désacétyl-10 baccatine III. Cette solution est concentrée sous pression réduite (6,0 kPa). On recueille 164 g d'acétate d'éthyle. Au concentrât, on ajoute 36 cm3 d'éthanol puis on refroidit à 10°C. On ajoute alors lentement (1/2 heure environ) en agitant (30 tours/minute) 60 cm3 d'acétonitrile. La suspension est agitée pendant 1 heure à 10°C puis on ajoute rapidement 84 cm3 d'acétonitrile. On agite pendant 15 heures à 10°C. Le précipité est séparé par filtration sur verre fritte N° 3 (diamètre : 35 mm) puis il est lavé par 2 fois 20 cm3 d'acétonitrile puis par 2 fois 20 cm3 de diisopropyléther. Le produit est séché pendant 12 heures sous pression réduite (0,27 kPa) à 40°C. On obtient ainsi 2,85 g d'une poudre blanche cristallisée contenant 93,8 % de désacétyl-10 baccatine III.

Les eaux-mères de cristallisation et les lavages (247 g) sont concentrés sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C. On obtient ainsi 36 g de substance sèche qui est reprise par 18 cm3 d'éthanol. On ajoute alors lentement 72 cm3 d'acétonitrile. Le mélange est agité pendant 15 heures à un température voisine de 20°C. Le précipité est séparé par filtration et est lavé par 2 fois 5 cm3 d'acétonitrile et par 2 fois 5 cm3 de diisopropyléther. Après séchage, on obtient 0,662 g d'une poudre fine contenant 62,7 % de désacétyl-10 baccatine III.

EXEMPLE 4

On utilise un extrait méthanolique préparé dans les conditions décrites dans l'exemple 1 constitué de 1840 g d'extrait sec, de 1117 g de méthanol et de 329 g d'eau et contenant 7,17 g de désacétyl-10 baccatine III. Dans un réacteur de 10 litres, on introduit l'extrait méthanolique puis on l'extrait 3 fois par 1,5 litre de toluène sous forte agitation. La phase hydro- méthanolique est séparée (3020 g) par décantation, diluée par addition d'eau (3800 g) puis filtrée. On sépare ainsi 42 g de résidu.

La solution hydro-méthanolique filtrée est extraite 3 fois par 1540 cm3 d'acétate de n.butyle. Les phases organiques réunies sont concentrées sous pression réduite (1,33 kPa) à 40°C de façon à obtenir une solution contenant 30 % d'extrait sec puis filtrées. Le résidu obtenu (4 g) est lavé par 50 cm3 d'acétate de n.butyle. Les filtrats organiques sont réunis et concentrés à nouveau sous pression réduite (1,33 kPa) à 40°C de façon à obtenir une solution contenant 65 % d'extrait sec (soit 95 g). Le concentrât ainsi obtenu est introduit dans un ballon de 500 cm3. On ajoute 45 cm3 d'éthanol. Le mélange homogène est agité et chauffé à 40°C. On ajoute alors en 1 heure, à 40°C, 270 cm3 d'acétonitrile. La suspension est refroidie à -10°C, tout en agitant, en 2 heures puis maintenue à -10°C pendant une nuit. Le précipité est séparé parr filtration sur verre fritte, lavé 2 fois par 35 cm3 d'acétonitrile puis par 2 fois 35 cm3 de diisopropyléther puis séché pendant une nuit sous pression réduite

(l,33 kPa) à 40°C.

On obtient ainsi 5,92 g d'un produit blanc contenant 84,2 % de désacétyl-10 baccatine III.

Le rendement, par rapport à la désacétyl-10 baccatine III contenue dans l'extrait méthanolique initial , est de 69,5 %.